EP1294925A2 - Phosphoribosyl-pyrophosphat synthetase 1 als herbizides target - Google Patents

Phosphoribosyl-pyrophosphat synthetase 1 als herbizides target

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EP1294925A2
EP1294925A2 EP01905708A EP01905708A EP1294925A2 EP 1294925 A2 EP1294925 A2 EP 1294925A2 EP 01905708 A EP01905708 A EP 01905708A EP 01905708 A EP01905708 A EP 01905708A EP 1294925 A2 EP1294925 A2 EP 1294925A2
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EP
European Patent Office
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plant
pyrophosphate synthetase
phosphoribosyl pyrophosphate
seq
plants
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01905708A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Andreas Reindl
Jens Lerchl
Uwe Sonnewald
Ralf Badur
Ralf Boldt
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BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Filing date
Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1235—Diphosphotransferases (2.7.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/9124—Diphosphotransferases (2.7.6)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2430/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving synthetic organic compounds as analytes
    • G01N2430/20—Herbicides, e.g. DDT
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems

Definitions

  • Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 as a herbicidal target
  • the present invention relates to the identification of plant phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 (E.C. 2.7.6.1) as a new target for herbicidal active compounds.
  • the present invention further relates to the use of the DNA sequence SEQ-ID No. 1, SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 5 or parts or derivatives thereof coding for a polypeptide with phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 Activity for the preparation of a test system for identifying inhibitors of phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 with herbicidal activity.
  • the invention also relates to a method or a test system for finding substances which inhibit the activity of the plant phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1, and inhibitors of plant phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 identified using these methods or this test system.
  • Plants are able to synthesize their cell components from carbon dioxide, water and inorganic salts.
  • Nucleotides are synthesized de novo in plants. They are of particular importance as part of the nucleic acids. In a covalent bond, nucleotides activate carbohydrates for the biosynthesis of polysaccharides. They also activate head groups for the biosynthesis of lipids. Nucleotides are involved in almost all metabolic pathways. Nucleoside triphosphates, especially ATP, drive most of the cell's energy-intensive reactions. Adenine nucleotides are also a component of essential factors such as coenzyme A, as well as nicotinamide and flavin coenzymes that are involved in many cellular responses.
  • GTP guanosine 5'-triphosphate
  • ASA adenylosuccinate synthetase
  • PRPP Phosphoribosyl pyrophosphate
  • the phosphobosyl pyrophosphate synthetase of some organisms also require Mg 2+ .
  • Eukaryotes often have more than one phosphoribosyl pyrophosphate synthetase. For example, people have three isoforms with redundant functions.
  • Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2 is imported into the chloroplasts (Krath and Hove-Jensen, Plant Physiology 119 (1999), 497-505). This is consistent with results that have been demonstrated by several enzymes of purine de novo biosynthesis in the chloroplasts of Arabidopsis (Senecoff and Meager, Plant Physiology 102 (1993), 387-399; Ito et al., Plant Mol Biol 26 (1994) , 529-533; Schnorr et al., Plant Journal 6 (1994), 113-121).
  • the suitability of an enzyme as a target for herbicides can be demonstrated by reducing the enzyme activity, for example using antisense technology in transgenic plants. If reduced growth is brought about by introducing an antisense DNA for a specific gene into a plant, this indicates the suitability of the enzyme whose activity is reduced as a site of action for herbicidal active ingredients.
  • the antisense inhibition of acetolactate synthase (ALS) in transgenic potato plants leads to comparable phenotypes, such as the treatment of control plants with ALS-inhibiting herbicides (Höfgen et al., Plant Physiology 107 (1995), 469-477).
  • the object of the present invention was to demonstrate that
  • Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 is a suitable herbicidal target in plants, and the preparation of an efficient and simple phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 test system for carrying out inhibitor-enzyme binding studies.
  • the object was achieved by isolating genes which code for the plant enzyme phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1, the production of antisense constructs of the plant phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 and their expression in plants, and the functional expression of the plant phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 in bacterial or eukaryotic cells.
  • cDNAs coding for plant phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 from Nicotiana tabacum and Arabidopsis thaliana and a partial cDNA from Physcomitrella patens were first isolated and sequenced, see Example 1 and Example 6, sequence listing SEQ-ID No. 1, SEQ ID No. 3 and SEQ-ID No. 5th
  • Another object of the invention relates to methods for identifying inhibitors of plant phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 by high-throughput methods.
  • the invention therefore relates to the functional expression of plant phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1, in particular phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 from tobacco and Arabidopsis thaliana in suitable expression systems, and to the use of the enzymes thus produced in an in vitro test system for measuring the phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 activity ,
  • the cDNA sequence of the phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 or suitable fragments of the cDNA sequence of the phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 from tobacco or Arabidopsis thaliana is cloned into an expression vector (pQE, Qiagen) and overexpressed in E. coli.
  • the expression cassette containing a DNA sequence or partial DNA sequence of SEQ-ID No. 1 or SEQ ID NO. 3 or derivatives of these sequences can be expressed, for example, in other bacteria, in yeasts, fungi, algae, plant cells, insect cells or mammalian cells.
  • Another object of the invention is the use of DNA sequences from SEQ ID NO. 1 or SEQ ID NO. 3 are derived or hybridize with one of these sequences and which code for a protein which has the biological activity of a phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1.
  • the vegetable phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 protein expressed with the aid of an expression cassette is particularly suitable for the detection of inhibitors specific for phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1.
  • the plant phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 can be used, for example, in an enzyme test in which the activity of the phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 is determined in the presence and absence of the active substance to be tested. By comparing the two activity determinations, a qualitative and quantitative statement can be made about the inhibitory behavior of the active substance to be tested, see Example 7.
  • a large number of chemical compounds can be checked quickly and easily for herbicidal properties. The method makes it possible to selectively reproducibly select those with great potency from a large number of substances, in order to subsequently carry out further in-depth tests known to the person skilled in the art.
  • Another object of the invention is a method for the identification of inhibitors of plant phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1, with potentially herbicidal activity by cloning the gene of a plant phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1, in a suitable expression cassette - for example in insect cells - to overexpress the cells opens and the cell extract is used directly or after enrichment or isolation of the enzyme phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 in a test system for measuring the enzyme activity in the presence of low molecular weight chemical compounds.
  • Another object of the invention is a method for identifying substances with herbicidal activity which inhibit the phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 activity in plants, consisting of
  • transgenic plants, plant tissues or plant cells which contain an additional DNA sequence coding for an enzyme with phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 activity and are able to overexpress an enzymatically active phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1;
  • the suppression of the growth or survivability of the non-transformed plants, plant cells, plant tissues or plant parts without, however, strongly suppressing the growth or survivability of the transgenic plants, plant cells, plant tissues or plant parts shows that the substance from b) shows herbicidal activity and the phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 inhibits enzyme activity in plants.
  • the invention further relates to compounds with herbicidal activity which can be identified using the test system described above.
  • Inhibitors of phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 with herbicidal activity can be used as defoliants, desiccants, herbicides and in particular as weed killers. Weeds in the broadest sense are understood to mean all plants that grow up in places where they are undesirable. Whether the active ingredients found with the aid of the test system according to the invention act as total or selective herbicides depends, inter alia, on the one used Amount off.
  • Inhibitors of phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 with herbicidal activity can be used, for example, against the following weeds:
  • the invention also relates to the use of expression cassettes, the sequence of which codes for a phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 from Arabidopsis thaliana or Nicotiana tabacum or the functional equivalent thereof for the production of a test assay for finding compounds with herbicidal activity.
  • the nucleic acid sequence can e.g. be a DNA or a cDNA sequence.
  • an expression cassette according to the invention comprises a promoter upstream, ie at the 5 'end of the coding sequence, and a polyadenylation signal and downstream, ie at the 3' end, and, if appropriate, further regulatory elements which are associated with the coding sequence for the phosphoribosyl intermediate Pyrophosphate synthetase 1 gene are operatively linked.
  • An operative link is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and, if appropriate, further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function as intended when expressing the coding sequence.
  • Such an expression cassette is produced by fusing a suitable promoter with a suitable phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 DNA sequence and a polyadenylation signal according to common recombination and
  • the invention also relates to the use of functionally equivalent DNA sequences which code for a phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 gene and which, based on the total length of the DNA sequence, have sequence homology with the DNA sequence SEQ-ID NO. 1, SEQ ID NO. 3 or SEQ-ID No. 5 have from 40 to 100%.
  • the preferred object of the invention is the use of functionally equivalent DNA sequences which code for a phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 gene and which, based on the total length of the DNA sequence, have sequence homology with the DNA sequence SEQ-ID NO. 1, SEQ ID NO. 3 or SEQ-ID No. 5 have from 60 to 100%.
  • a particularly preferred object of the invention is the use of functionally equivalent DNA sequences which code for a phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 gene and which, based on the total length of the DNA sequence, have sequence homology with the DNA sequence SEQ-ID NO. 1, SEQ ID No. 3 or SEQ-ID No. 5 have from 80 to 100%.
  • Functionally equivalent sequences which code for a phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 gene are those sequences which, despite a different nucleotide sequence, still have the desired functions. Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described herein as well as artificial, e.g. Artificial nucleotide sequences obtained by chemical synthesis and adapted to the codon use of a plant.
  • a functional equivalent is also understood to mean, in particular, natural or artificial mutations of an originally isolated sequence coding for a phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1, which furthermore shows the desired function. Mutations include substitutions, additions, deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues.
  • the present invention also encompasses those nucleotide sequences which are obtained by modifying this nucleotide sequence. The aim of such a modification can, for example, further narrow down the coding sequence contained therein or, for example, also insert further ones Restriction enzyme interfaces.
  • Functional equivalents are also those variants whose function is weakened or enhanced compared to the original gene or gene fragment.
  • the expression cassette can also be used to transform bacteria, cyanobacteria, yeast, filamentous fungi and algae and eukaryotic cells (e.g. insect cells) with the aim of producing sufficient amounts of the enzyme phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1.
  • Another object of the invention is the use of a protein from Nicotiana tabacum or Arabidopsis thaliana characterized by the amino acid sequence SEQ-ID NO. 2, SEQ ID No. 4 or derivatives or parts of this protein with phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 activity for the preparation of a test system for finding compounds with herbicidal activity.
  • the invention also relates to the use of plant proteins with phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 activity with an amino acid sequence homology to the phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 from Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana or Physcomitrella patens with the SEQ-ID NO. 2, SEQ ID NO. 4 or SEQ ID No. 6 of 20 - 100% identity for the production of a test system for finding compounds with herbicidal activity.
  • plant proteins with phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 activity with an amino acid sequence homology to the phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 from Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana or Physcomitrella patens with the sequences SEQ-ID NO. 2, SEQ ID NO. 4 or SEQ-ID No. 6 of 50 - 100% identity for the production of a test system for the discovery of compounds with herbicidal activity.
  • the effectiveness of the expression of the transgenically expressed phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 gene can be determined, for example, in vitro by proliferation or by a germination test.
  • a change in the type and level of expression of the phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 gene and its effect on the resistance to inhibitors of phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 can be tested on test plants in greenhouse experiments.
  • the invention also relates to transgenic plants transformed with an expression cassette containing the DNA sequence SEQ-ID No. 1 or SEQ-ID No. 3, by additional expression of the DNA sequence SEQ-ID No. 1 or SEQ-ID No. 3 have become tolerant of inhibitors of phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1, as well as transgenic cells, tissues, parts and propagation material of such plants.
  • Transgenic crop plants such as barley, wheat, rye, corn, soybean, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, potato, tobacco, tomato, rape, are particularly preferred.
  • Endoplasmic reticulum ER or, due to the lack of corresponding operative sequences, ensure that it remains in the compartment of formation, the cytosol (Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285-423).
  • the plant expression cassette can be built into the plant transformation vector pBinAR.
  • any promoter which can control the expression of foreign genes in plants is suitable as promoters of the expression cassette.
  • a plant promoter or a plant virus-derived promoter is preferably used.
  • the CaMV 35S promoter from the cauliflower mosaic virus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294) is particularly preferred.
  • This promoter contains different recognition sequences for transcriptional effectors, which in their entirety lead to permanent and constitutive expression of the introduced gene (Benfey et al., EMBO J., 8 (1989), 2195-2202).
  • the expression cassette can also contain a chemically inducible promoter which can be used to control the expression of the exogenous phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 gene in the plant at a particular point in time.
  • a chemically inducible promoter which can be used to control the expression of the exogenous phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 gene in the plant at a particular point in time.
  • promoters such as the PRP1 promoter (Ward et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), a salicylic acid-inducible promoter (WO 95/19443), a benzene-sulfonamide-inducible (EP 388186 ), one that can be induced by tetracycline (Gatz et al., Plant J.
  • promoters are particularly preferred which ensure expression in tissues or parts of plants in which the biosynthesis of purines or their precursors takes place. Promoters that ensure leaf-specific expression should be mentioned in particular.
  • the promoter of the cytosolic FBPase from potatoes or the ST-LSI promoter from potatoes should be mentioned (Stockhaus et al., EMBO J., 8 (1989) 2445-245).
  • a foreign protein can be stably expressed up to a proportion of 0.67% of the total soluble seed protein in the seeds of transgenic tobacco plants (Fiedler and Conrad, Bio / Technology 10 (1995), 1090-1094).
  • the expression cassette according to the invention can therefore, for example, be a seed-specific promoter (preferably the phaseolin promoter, the USP or LEB4-
  • the inserted nucleotide sequence coding for a phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 can be produced synthetically or naturally be won or contain a mixture of synthetic and natural DNA components.
  • synthetic nucleotide sequences with codons are generated which are preferred by plants. These codons preferred by plants can be determined from codons with the highest protein frequency, which are expressed in most interesting plant species.
  • various DNA fragments can be manipulated in order to obtain a nucleotide sequence which expediently reads in the correct direction and which is equipped with a correct reading frame.
  • adapters or linkers can be attached to the fragments.
  • artificial DNA sequences are suitable as long as, as described above, for example, they impart the desired property of expression of the phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 gene.
  • Such artificial DNA sequences can be determined, for example, by back-translation of proteins constructed using molecular modeling, which have phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 activity, or by in-v / o selection. Coding DNA sequences which are particularly suitable are those obtained by back-translating a
  • Polypeptide sequence was obtained according to the codon usage specific for the host plant.
  • the specific codon usage can easily be determined by a person skilled in plant genetic methods by computer evaluations of other, known genes of the plant to be transformed.
  • Suitable equivalent nucleic acid sequences are sequences which code for fusion proteins, part of the fusion protein being a plant phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 polypeptide or a functionally equivalent one Is part of it.
  • the second part of the fusion protein can be, for example, a further polypeptide with enzymatic activity or an antigenic polypeptide sequence with the aid of which detection of phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 expression is possible (for example myc-tag or histag).
  • it is preferably a regulatory protein sequence, such as a signal or transit peptide, that the
  • Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 protein to the desired site.
  • the promoter and terminator regions should expediently be provided in the transcription direction with a linker or polylinker which contains one or more restriction sites for the insertion of this sequence.
  • the linker has 1 to 10, usually 1 to 8, preferably 2 to 6, restriction sites.
  • the linker has a size of less than 100 bp, often less than 60 bp, but at least 5 bp within the regulatory ranges.
  • the promoter according to the invention can be both native or homologous and foreign or heterologous to the host plant.
  • the expression cassette according to the invention contains, in the 5'-3 'transcription direction, the promoter according to the invention, any sequence and a region for the transcriptional termination. Different termination areas are interchangeable.
  • Preferred polyadenylation signals are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially correspond to T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid pTiACH ⁇ (Gielen et al., EMBO J., 3rd (1984), 835) or functional equivalents.
  • Expression cassette inserted as an insert in a recombinant vector whose vector DNA contains additional functional regulation signals, for example sequences for replication or integration.
  • Suitable vectors are described, inter alia, in “Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology” (CRC Press, chapters 6/7, 71-119).
  • transformation The transfer of foreign genes into the genome of a plant is called transformation.
  • the methods described for the transformation and regeneration of plants from plant tissues or plant cells for transient or stable transformation are used. Suitable methods are the protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic approach with the gene gun, the electroporation, the incubation of dry embryos in DNA-containing solution, the microinjection and the gene transfer mediated by Agrobacterium. The methods mentioned are described, for example, in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, published by SD Kung and R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 and in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec.Biol.
  • the construct to be expressed is cloned into a vector which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens, for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).
  • Agrobacteria transformed with an expression cassette can also be used in a known manner to transform plants, in particular crop plants, such as cereals, corn, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, potato, tobacco, tomato, rapeseed, alfalfa, Salad and the various tree, nut and wine species and legumes can be used, for example by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • crop plants such as cereals, corn, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, potato, tobacco, tomato, rapeseed, alfalfa, Salad and the various tree, nut and wine species and legumes can be used, for example by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • the biosythesis site of purines is generally the leaf tissue, so that leaf-specific expression of the phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 gene is useful.
  • the purine biosynthesis need not be restricted to the leaf tissue, but can also be tissue-specific in all other parts of the plant - for example in fatty seeds.
  • constitutive expression of the exogenous phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 gene is advantageous.
  • inducible expression may also appear desirable.
  • Cloning techniques allow the expression cassettes to be cloned into suitable vectors that allow them to multiply, for example in E. coli.
  • suitable cloning vectors include pBR332, pUC series, M13mp series and pACYC184.
  • Binary vectors which replicate both in E. coli and in agrobacteria are particularly suitable can.
  • Another object of the invention relates to the use of an expression cassette according to the invention for the transformation of plants, plant cells, plant tissues or parts of plants.
  • the aim of the use is preferably to increase the phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 content in the plant.
  • the expression can take place specifically in the leaves, in the seeds or in other parts of the plant.
  • Such transgenic plants, their reproductive material and their plant cells, tissue or parts are a further subject of the present invention.
  • Cloning methods such as: restriction cleavage, DNA isolation, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of E. coli cells, cultivation of bacteria, sequence analysis of recombinant DNA were carried out according to Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); ISBN 0-87969-309-6.
  • the transformation of Agrobacterium tumefaciens was carried out according to the method of Höfgen and Willmitzer (Nucl. Acid Res. 16 (1988), 9877).
  • the cultivation of the Agrobacteria occurred in YEB medium (Vervliet et al., Gen. Virol. 26 (1975), 33).
  • Total plant RNA was determined according to the method of Logemann et al., Analytical Biochem. 163 (1987), 16) isolated and separated in formaldehyde-containing agarose gels (Lehrach et al., Biochem. 16 (1977), 4743). Capillary transfer to nylon membranes (Gene Screen, NEN) was carried out in 20 ⁇ SSC (1.5 M NaCl, 150 mM sodium citrate) overnight. After two hours of prehybridization in hybridization buffer (500 mM sodium phosphate (pH 7.2), 7% SDS, 0.5% bovine serum albumin, 1 mM EDTA), the hybridization was carried out with a radiolabelled NtPrsI probe at 65 ° C. for 16 hours. The filters were then washed under the following conditions: 10 minutes at 65 ° C in 6 x SSC, 0.1% SDS and 5 minutes at 65C in 4 x SSC, 0.1% SDS.
  • hybridization buffer 500 mM sodium phosphate (pH
  • DNA-modifying enzymes and molecular biological kits were developed by the companies AGS (Heidelberg), Amersham (Braunschweig), Biometra (Göttingen), Röche (Mannheim), Genomed (Bad Oeynnhausen), New England Biolabs (Schwalbach / Taunus), Novagen ( Madison, Wisconsin, USA), Perkin-Elmer (Weiterstadt), Pharmacia (Freiburg) Qiagen (Hilden) and Stratagene (Heidelberg). Unless otherwise stated, they were used according to the manufacturer's instructions.
  • E. coli (XL-1 Blue) bacteria were purchased from Stratagene.
  • the Agrobacterium strain used for plant transformation (C58C1 with the plasmid pGV 3850kan) was developed by Debleare et al., Nucl. Acid Res. 13 (1985), 4777).
  • RBPRPP3 5'-aag aat tcg gat cca cca tgg tct tga agt tgt tct ctg gta ctg c-3 'RBPRPP4 5'-aag aat tcg gat cct caa agg aa atg cta ctg ac-3'
  • a cDNA fragment from Arabidopsis thaliana (Var. Landsberg erecta) leaf cDNA was amplified using these oligonucleotides (35 Cycles, 30sec 94DC, 45 sec 45DC, 2 min 72DC) and then bluntly cloned into a pGEM-T vector (Promega) using EcoRV.
  • the identity of the Arabidopsis Prs1 cDNA clone was confirmed by sequencing, see SEQ-ID No. Third
  • This clone was used to screen a source leaf cDNA bank from Nicotiana tabacum variety Samsun NN in DDZAPII.
  • the cDNA bank was plated with a titer of 2.5D10 5 plaque-forming units and analyzed using the plaque screening method (T. Maniatis, EF Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor , NY 1989).
  • 12 phage populations were isolated, with which a second screening was carried out, whereby genetically uniform phage populations could be isolated which were used for in vivo excision. Restriction analysis showed no differences between the cDNA clones and four clones with the largest insertions were selected for sequencing.
  • the sequence data show that cDNA clones are coding for the 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate synthetase.
  • the cDNA clone NtPrsI - see SEQ-ID No. 1 - is 1251 bp long and has a start codon at position 21 and a termination codon TAG at position 1089.
  • the open reading frame codes for a 356 amino acid protein with a molecular weight of 38.3 KDa.
  • the 152 bp 3'-untranslated region contains no polyadenylation signal.
  • the binary vector pBinAR (Höfgen and Willmitzer, Plant Science 66 (1990), 221-230) was cleaved in the polylinker with BamHI.
  • the orientation of the ligated NtPrsI cDNA fragment was checked by restriction with HindIII.
  • the resulting Hindlll fragment of 300 bp confirmed the antisense orientation.
  • the plasmid pBinAR-NtPrsI antisense ( Figure 2) consists of 3 fragments A, B and C.
  • fragment A contains the 35S promoter of the Cauliflower Mosaic Virus (CaMV), which is a constitutive expression in transgenic Plants. This fragment comprises nucleotides 6909 to 7437 of the CaMV (Franck, Cell 21 (1980), 285).
  • CaMV Cauliflower Mosaic Virus
  • Fragment B contains a 1226 bp NtPrsI cDNA fragment which was isolated as a BamHI fragment from the plasmid pBluescriptSK- ⁇ / fPrs7 and was cloned into the BamHI site of the polylinker of the vector pBinAR.
  • Fragment C contains the polyadenylation signal of gene 3 (octopine synthase, OCS) of the T-DNA of the Ti plasmid pTiACH ⁇ (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835), which comprises nucleotides 11749-11939.
  • the individual fragments were provided with EcoRI / Notl linkers during the generation of the cDNA bank and then cloned into the EcoRI restriction sites of the polylinker of pBluescript. Accordingly, the Notl interfaces are not Original part of the pBluescript polylinker.
  • Figure 2 shows the expression cassette for the expression of the NtPrsI cDNA (1226 bp) in antisense orientation in transgenic tobacco plants
  • A 35S promoter of the Cauliflower Mosaic Virus (CaMV), 529 bp nucleotides 6909 to 7437 of the CaMV.
  • CaMV Cauliflower Mosaic Virus
  • B NtPrsI cDNA (1226 bp) in antisense orientation, which was isolated as a BamHI fragment from the plasmid pBluescript SK-NtPrs1 and comprises the bases 1-1208 of the coding region of NtPrsI.
  • C Polyadenylation signal of gene 3 (octopine synthase, OCS) of the T-DNA of the Ti plasmid pTiACH ⁇ (192 bp).
  • Tobacco plants (Nicotiana tabacum cv.Samsun NN) were used 10 ml of an overnight culture of a positively transformed agrobacterial colony in YEB medium (Vervliet et al., Gen. Virol. 26 (1975), 33).
  • Leaf disks of sterile plants (each about 1 cm 2 ) were incubated in a Petri dish with this solution for 5-10 min. There was a two day incubation in Darkness at 25 ° C on MS medium (Murashige-Skoog medium,
  • Transgenic plants that are transformed with the construct pBinAR-NtPrsI Antisense are characterized by large chlorotic areas in the leaves and by a strong fading of the leaves compared to untransformed wild-type plants.
  • transgenic pBinAR-NtPrsl antisense plants are those that are severely impaired in their growth.
  • RNA analysis was carried out by strand-specific labeling of an NtPrsI cDNA fragment.
  • the plasmid pBluescript SK-NtPrs1 was digested with EcoRI and a 1251 bp fragment, which has the coding region of the NtPrsI gene, was isolated.
  • a 3 'oligonucleotide with the following sequence was used for the reaction: 5' CTT CAA GTT CCA GAC AAC AGT GTC-3 '.
  • a kit from the company came for the reaction
  • the reaction mixture contained approx. 10 ng fragment DNA, 0.1 mM of the oligonucleotide, 5 ml of 10 ⁇ buffer, 1.5 mM MgCl 2 , 5 mM deoxy nucleotides (dGTP, dATP, dTTP), 50 mCi a- 32 P-dCTP (Amersham ) and 1 ml DyNazyme polymerase.
  • the amplification conditions were chosen as follows:
  • Denaturation temperature 95 ° C, 5 sec annealing temperature: 45 ° C, 30 sec elongation temperature: 72 ° C, 1 min number of cycles: 40
  • RNA was isolated from about 0.5-1.0 cm large sink leaves, 20 Dg RNA were separated in a formaldehyde-containing agarose gel and transferred to a nylon membrane by capillary blotting. This was hybridized with the strand-specifically labeled NtPrsI gene probe.
  • Figure 3 shows the hybridization signals for wild-type (WT) and transgenic plants. The hybridization signals were then quantified using a phosphoimager. According to the phenotype of the plants, the transcript accumulation of the ⁇ / fPrs7 synthetase mRNA in line 45-1 is dramatically reduced. Plants 33.4, 14.5 and 30.4 only show a reduced mRNA accumulation and, analogously, a less pronounced growth phenotype.
  • the strain 16/14 used was by H.L.K. Whitehouse collected in Gransden Wood, Huntingdonshire (England) and subcultured by Engel spores (Am. J. Bot. 55 (1968), 438-446).
  • the moss plants were proliferated via spores and regeneration of gametophores.
  • the protonema tissue developing from the haploid spore consists of chloroplast-rich chloronema and chloroplast-poor caulonema, on which buds form after approx. 12 days. These buds grow into gametophores and contain antheridia and archegonia. After fertilization, the diploid sporophyte, short Seta and spore capsule result, in which the maturing spores develop.
  • RNAse H digest 12D C (2h), 16D C (1 h) and 22D C (1 h). The reaction was stopped by incubation at 65DC (10 min) and transferred to ice.
  • Double-stranded DNA was filled in using T4-DNA polymerase (Röche, Mannheim) at 37DC (30 min) and nucleotides were separated off by phenol / chloroform extraction and Sephadex G50 chromatography. EcoRI adapters (Pharmacia, Freiburg, Germany) were ligated to the cDNA ends using T4-DNA ligase (Röche, 12D C, 16h) and phosphorylated using polynucleotide kinase (Röche, 37DC, 30 min). The DNA was separated by means of gel electrophoresis and those of more than 300 base pairs were isolated by means of phenol extraction and concentrated by means of Elutip-D columns (Schleicher and Schuell, Dassel, Germany).
  • the double-stranded DNA obtained was ligated in lambda ZAPII and proceeded using the Gigapack Gold Kit (Stratagene, Amsterdam, Netherlands) according to the manufacturer's instructions. Plasmid DNA was obtained by in vivo excision and was used for the transformation of E. coli XLI blue bacteria. Clones were grown in liquid culture from individual colonies, plasmid DNA was isolated and these were used for sequence reactions. An EST coding for 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate synthesis could be identified by homology comparison, see SEQ-ID No. 5th
  • the fragment of Prs1 from Arabidopsis thaliana is obtained from the vector pGEM-T AtPrsI ( Figure 2) with the restriction enzymes BamHI and EcoRI (interfaces inserted via primers RBPRPP3 and RBPRPP4) and cut identically Transfer vector pFastBacHTb (GibcoBRL) cloned.
  • the construct pFASTBAC Tb-AtPrs1 obtained is used according to the manufacturer's instructions (GibcoBRL) to generate recombinant baculovirus.
  • this virus is used to infect Sf21 insect cells in order to generate active 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate synthetase 1 enzyme.
  • the specific enzymatic phosphoribosyl pyrophosphate synthesis 1 activity is measured photometrically after ultrasound digestion of the cells.
  • the following components are used for each 90DI approach:
  • cordycepin-5'-triphosphate an inhibitor of 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate synthetase from other higher eukaryotes - also inhibits plant-based 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate synthetase 1 in its enzymatic activity.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von DNA-Sequenzen pflanzlichen Ursprungs codierend für ein Polypeptid mit Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 (E.C. 2.7.6.1) Aktivität zur Herstellung eines Testsystems zum Auffinden von Inhibitoren der Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1. Erstmals wurde mit Hilfe der antisense-Technologie gezeigt, dass Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 ein herbizides Target darstellt.

Description

Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 als herbizides Target
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung pflanzlicher Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 (E.C. 2.7.6.1 ) als neues Ziel für herbizide Wirkstoffe. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1, SEQ-ID No. 3 oder SEQ- ID No. 5 oder Teilen oder Derivaten davon kodierend für ein Polypeptid mit Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Aktivität zur Herstellung eines Testsystems zur Identifizierung von Inhibitoren der Phosphoribosyl- Pyrophosphat Synthetase 1 mit herbizider Wirkung. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren bzw. ein Testsystem zum Auffinden von Substanzen, die die Aktivität der pflanzlichen Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 inhibieren, sowie Inhibitoren pflanzlicher Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 identifiziert unter Verwendung dieser Verfahren bzw. dieses Testsystems.
Pflanzen sind in der Lage, aus Kohlendioxid, Wasser und anorganischen Salzen ihre Zellkomponenten zu synthetisieren.
Dieser Prozeß ist nur möglich, indem biochemische Reaktionen zum Aufbau organischer Substanzen genutzt werden. Nukleotide werden in Pflanzen de novo synthetisiert. Als Bestandteil der Nukleinsäuren kommt ihnen besondere Bedeutung zu. In kovalenter Bindung aktivieren Nukleotide Kohlenhydrate für die Biosynthese von Polysacchariden. Ferner aktivieren sie Kopfgruppen für die Biosynthese von Lipiden. Nukleotide sind in nahezu alle Stoffwechselwege eingebunden. Nukleosidtriphosphate, vor allem ATP, treiben die meisten energieaufwändigen Reaktionen der Zelle. Adeninnukleotide sind darüber hinaus auch als Komponente in essentiellen Faktoren wie Coenzym A, sowie Nicotinamid- und Flavin-Coenzymen zu finden, die an vielen zellulären Reaktionen beteiligt sind. Die gekoppelte Hydrolyse von Guanosin-5'-triphosphat (GTP) definiert für diverse zelluläre Prozesse, wie Proteintranslation, Microtubuli-Assemblierung, vesikulären Transport, Signaltransduktion und Zellteilung eine Reaktionsrichtung. Ferner stellen Nukleotide die Ausgangsmetabolite zur Biosynthese von Methylxanthinen wie Coffein und Theobromin in Pflanzenfamilien der Rubiaceae und Theaceae dar.
Da Pflanzen auf einen effektiven Nukleotidstoffwechsel angewiesen sind, läßt sich vermuten, daß sich Enzyme, die an der Nucleotidbiosynthese beteiligt sind, als Zielprotein (Target) für Herbizide eignen. So wurden bereits Wirkstoffe beschrieben, welche die pflanzliche de novo Purinbiosynthese inhibieren. Beispielhaft ist der Naturstoff Hydanthocidin zu nennen, welcher nach Phosphorylierung in planta die Adenylosuccinat- Synthetase (ASS), inhibiert (Siehl et al., Plant Physiol. 110(1996), 753- 758).
Phosphoribosyl-Pyrophosphat (PRPP) ist ein essentieller Baustein des pflanzlichen Metabolismus. Es ist notwendig bei der de-novo Synthese von Purin- und Pyrimidin-Nukleotiden, dem Pyridin Nukleotid Coenzym NAD, sowie für die Wiederverwertung von bereits synthetisierten Purinen, Pyrimidinen und Pyridinen. Außerdem wird PRPP bei der Synthese von Histidin und Tryptophan benötigt (siehe Krath und Hove-Jensen, Plant Physiology 119(1999), 497-505). Für die Synthese von PRPP ist das Enzym PRPP Synthetase verantwortlich, welches Ribose-5-Phosphat und MgATP zu AMP und PRPP umsetzt. Die Phosphoπbosyl-Pyrophosphat Synthetase einiger Organismen benötigen darüber hinaus Mg2+. Eukaryoten besitzen oftmals mehr als eine Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase. So besitzen Menschen beispielsweise drei Isoformen mit redundanter Funktion. Pflanzliche Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase, von denen zum Beispiel in Spinat vier Isoformen vorhanden sind, fallen in zwei Klassen und haben unterschiedliche Lokalisation und Funktion oder unterliegen unterschiedlichen entwicklungsabhängigen Regulationen der pflanzlichen Zelle. Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 2 zum Beispiel wird in die Chloroplasten importiert (Krath und Hove-Jensen, Plant Physiology 119(1999), 497-505). Dies deckt sich mit Ergebnissen, die mehrere Enzyme der Purin de-novo Biosynthese in den Chloroplasten von Arabidopsis nachgewiesen haben (Senecoff und Meager, Plant Physiology 102(1993), 387-399; Ito et al., Plant Mol Biol 26(1994), 529-533; Schnorr et al., Plant Journal 6(1994), 113-121 ). In der Hefe konnte eine unterschiedliche Funktion der vier Phosphoribosyl- Pyrophosphat Synthetase Isoformen gezeigt werden (Carter et al, Yeast 10(1994), 1031-1044). Im Gegensatz zu Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase aus Menschen, anderen höheren Eukaryonten und Saccharomyces cerevisiae sind pflanzliche Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase nur wenig erforscht. Allgemeine Methoden zum Auffinden von Inhibitoren des pflanzlichen Purinstoffwechsels wurden in den US Patenten 5,780,253 und 5,780,254 beschrieben.
Gene, die für Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 kodieren, wurden aus verschiedenen Organismen isoliert. Aus Pflanzen liegen Vollängen-DNA-Sequenzen aus Arabidopsis thaliana (Accession No. X 83764) und Tabak (Dissertation Dr. Badur, Universität Göttingen, 1998) vor.
Der Nachweis der Eignung eines Enzyms als Target für Herbizide kann durch Verringerung der Enzymaktivität zum Beispiel mittels Antisensetechnik in transgenen Pflanzen erfolgen. Wird durch Einbringen einer Antisense-DNA für ein bestimmtes Gen in eine Pflanze ein verringertes Wachstum bewirkt, so deutet dies auf die Eignung des in seiner Aktivität reduzierten Enzyms als Wirkort für herbizide Wirkstoffe hin. Beispielsweise führt die Antisense-Inhibierung der Acetolactat-Synthase (ALS) in transgenen Kartoffelpflanzen zu vergleichbaren Phänotypen, wie die Behandlung von Kontrollpflanzen mit ALS-inhibierenden Herbiziden (Höfgen et al., Plant Physiology 107(1995), 469-477).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es zu belegen, daß
Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 in Pflanzen ein geeignetes herbizides Target ist, sowie die Herstellung eines effizienten und einfachen Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Testsystems für die Durchführung von Inhibitor-Enzym-Bindungsstudien.
Die Aufgabe wurde gelöst durch Isolierung von Genen, die für das pflanzliche Enzym Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 kodieren, der Herstellung von Antisensekonstrukten der pflanzlichen Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 und deren Expression in Pflanzen, sowie der funktionellen Expression der pflanzlichen Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 in bakteriellen oder eukaryontischen Zellen.
Zur Lösung der Aufgabe wurden zunächst cDNAs codierend für pflanzliche Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 aus Nicotiana tabacum und Arabidopsis thaliana sowie eine partielle cDNA aus Physcomitrella patens isoliert und sequenziert, siehe Beispiel 1 und Beispiel 6, Sequenzprotokoll SEQ-ID No. 1 , SEQ-ID No. 3 und SEQ-ID No. 5.
Arabidopsis thaliana Pflanzen und Tabakpflanzen der Linie Nicotiana tabacum cv. Samsun NN, die ein Sense- oder Antisensekonstrukt der Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 tragen, wurden näher charakterisiert. Die Antisense-Pflanzen zeigen in unterschiedlichem Maße eine Wachstumsretardierung. Die transgenen Linien, sowie die Nachkommen der 1. und 2. Generation, wiesen ein verringertes
Wachstum in Erde auf. In Pflanzen mit verringertem Wachstum konnte eine im Vergleich zum Wildtyp reduzierte Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 RNA-Menge in der Northern-Hybridisierung detektiert werden, siehe Beispiel 5 und Abbildung 3. Ferner konnte durch Messung der Enzymaktivität eine im Vergleich mit Wildtyppflanzen verringerte Menge der Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Aktivität in den transgenen Antisense-Linien detektiert werden. Das Expressionsniveau sowie die Reduktion der Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Aktivität korrelieren mit der Wachstumsretardierung. Obwohl in Pflanzen mit hoher Wahrscheinlichkeit mehrere Isoformen der Phosphoribosyl- Pyrophosphat Synthetase vorkommen, wurde überraschenderweise gefunden, daß durch Einbringen eines Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase-Antisensekonstruktes eine Verringerung des Wachstums der Pflanze zu beobachten ist. Dieser klare Zusammenhang weist Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 erstmals eindeutig als geeignetes Zielprotein (Target) für herbizide Wirkstoffe aus.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren der pflanzlichen Phosphoribosyl- Pyrophosphat Synthetase 1 durch Hochdurchsatzmethoden. Die Erfindung betrifft daher die funktionale Expression pflanzlicher Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 insbesondere von Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 aus Tabak und Arabidopsis thaliana in geeigneten Expressionssystemen sowie die Verwendung der so hergestellten Enzyme in einem in vitro Testsystem zur Messung der Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 -Aktivität.
Um effiziente Hemmstoffe der pflanzlichen Phosphoribosyl-Pyrophosphat
Synthetase 1 finden zu können, ist es notwendig, geeignete Testsysteme, mit denen Inhibitor-Enzym-Bindungsstudien durchgeführt werden können, zur Verfügung zu stellen. Hierzu wird beispielsweise die cDNA-Sequenz der Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 oder geeignete Fragmente der cDNA Sequenz der Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 aus Tabak oder Arabidopsis thaliana in einen Expressionsvektor (pQE, Qiagen) kloniert und in E. coli überexprimiert.
Alternativ kann jedoch die Expressionskassette enthaltend eine DNA- Sequenz bzw. DNA-Teilsequenz der SEQ-ID No. 1 oder SEQ-ID NO. 3 oder Derivate dieser Sequenzen beispielsweise in anderen Bakterien, in Hefen, Pilzen, Algen, Pflanzenzellen, Insektenzellen oder Säugetierzellen exprimiert werden.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von DNA- Sequenzen, die von SEQ-ID NO. 1 oder SEQ-ID NO. 3 abgeleitet sind oder mit einer dieser Sequenzen hybridisieren und die für ein Protein kodieren, das die biologische Aktivität einer Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 besitzt.
Das mit Hilfe einer Expressionskassette exprimierte pflanzliche Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Protein eignet sich besonders zur Auffindung von für die Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 spezifischen Hemmstoffen.
Dazu kann die pflanzliche Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 beispielsweise in einem Enzymtest eingesetzt werden, bei dem die Aktivität der Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 in An- und Abwesenheit des zu testenden Wirkstoffs ermittelt wird. Aus dem Vergleich der beiden Aktivitätsbestimmungen läßt sich eine qualitative und quantitative Aussage über das Hemmverhalten des zu testenden Wirkstoffes machen, siehe Beispiel 7. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Testsystems kann eine Vielzahl von chemischen Verbindungen schnell und einfach auf herbizide Eigenschaften überprüft werden. Das Verfahren gestattet es, reproduzierbar aus einer großen Anzahl von Substanzen gezielt solche mit großer Wirkstärke auszuwählen, um mit diesen Substanzen anschließend weitere, dem Fachmann geläufige vertiefte Prüfungen durchzuführen.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren pflanzlicher Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 , mit potentiell herbizider Wirkung indem man das Gen einer pflanzlichen Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 kloniert, in einer geeigneten Expressionskassette - beispielsweise in Insektenzellen - zur Überexpression bringt, die Zellen öffnet und den Zellextrakt direkt bzw. nach Anreicherung oder Isolierung des Enzyms Phosphoribosyl- Pyrophosphat Synthetase 1 in einem Testsystem zur Messung der Enzymaktivität in Gegenwart von niedermolekularen chemischen Verbindungen einsetzt.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung, die die Phosphoribosyl- Pyrophosphat Synthetase 1 Aktivität in Pflanzen hemmen, bestehend aus
a) der Herstellung von transgenen Pflanzen, Pflanzengeweben, oder Pflanzenzellen, die eine zusätzliche DNA-Sequenz codierend für ein Enzym mit Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Aktivität enthalten und in der Lage sind eine enzymatisch aktive Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 überzuexprimieren;
b) das Aufbringen einer Substanz auf transgene Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile sowie auf nicht- transformierten Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder
Pflanzenteile;
c) das Bestimmen des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit der transgenen und der nicht-transformierten Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile nach der Aufbringung der chemischen Substanz; und
d) dem Vergleich des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit der transgenen und der nicht-transformierten Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile nach der Aufbringung der chemischen Substanz;
wobei die Unterdrückung des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit der nicht-transformierten Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile ohne jedoch das Wachstum oder die Überlebensfähigkeit der transgenen Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile stark zu unterdrücken, belegt, daß die Substanz aus b) herbizide Aktivität zeigt und die Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Enzymaktivität in Pflanzen inhibiert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen mit herbizider Wirkung, die mit dem oben beschriebenen Testsystem identifizierbar sind.
Inhibitoren der Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 mit herbizider Wirkung können als Defoliants, Desiccants, Krautabtötungsmittel und insbesondere als Unkrautvernichtungsmittel verwendet werden. Unter Unkraut im weitesten Sinne sind alle Pflanzen zu verstehen, die an Orten aufwachsen, an denen sie unerwünscht sind. Ob die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Testsystems gefundenen Wirkstoffe als totale oder selektive Herbizide wirken, hängt unter anderem von der angewandten Menge ab.
Inhibitoren der Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 mit herbizider Wirkung können beispielsweise gegen folgende Unkräuter verwendet werden:
Dikotyle Unkräuter der Gattungen:
Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium,
Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Gaieopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus, Taraxacum.
Monokotyle Unkräuter der Gattungen: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus, Apera.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von Expressionskassetten, deren Sequenz für eine Phosphoribosyl- Pyrophosphat Synthetase 1 aus Arabidopsis thaliana oder Nicotiana tabacum oder deren funktionelles Äquivalent kodieren zur Herstellung eines Testsaystems zum Auffinden von Verbindungen mit herbizider Wirkung. Die Nukleinsäuresequenz kann dabei z.B. eine DNA- oder eine cDNA-Sequenz sein.
Derartige Expressionskassetten beinhalten außerdem regulative Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine erfindungsgemäße Expressionskassette stromaufwärts, d.h. am 5'-Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d.h. am 3'-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden kodierenden Sequenz für das Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Gen operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.
Die Herstellung einer derartigen Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten Phosphoribosyl- Pyrophosphat Synthetase 1 DNA Sequenz und einem Polyadenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und
Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in TJ. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung auch funktioneil äquivalenter DNA-Sequenzen, die für ein Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Gen kodieren und die bezogen auf die Gesamtlänge der DNA-Sequenz eine Sequenzhomologie mit der DNA-Sequenz SEQ-ID NO. 1 , SEQ-ID NO. 3 oder SEQ-ID No. 5 von 40 bis 100 % aufweisen. Bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung funktionell äquivalenter DNA-Sequenzen, die für ein Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Gen kodieren und die bezogen auf die Gesamtlänge der DNA-Sequenz eine Sequenzhomologie mit der DNA-Sequenz SEQ-ID NO. 1 , SEQ-ID NO. 3 oder SEQ-ID No. 5 von 60 bis 100 % aufweisen.
Besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung funktionell äquivalenter DNA-Sequenzen, die für ein Phosphoribosyl- Pyrophosphat Synthetase 1 Gen kodieren und die bezogen auf die Gesamtlänge der DNA-Sequenz eine Sequenzhomologie mit der DNA- Sequenz SEQ-ID NO. 1 , SEQ-ID No. 3 oder SEQ-ID No. 5 von 80 bis 100 % aufweisen.
Funktionell äquivalente Sequenzen, die für ein Phosphoribosyl- Pyrophosphat Synthetase 1 Gen kodieren, sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon- Gebrauch einer Pflanze angepaßte, künstliche Nukleotid-Sequenzen.
Unter einem funktioneilen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten für eine Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 kodierende Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigt. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation dieser Nukleotidsequenz erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodierenden Sequenz oder z.B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnittstellen sein.
Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt oder verstärkt ist.
Die Expressionskassette kann darüberhinaus auch zur Transformation von Bakterien, Cyanobakterien, Hefen, filamentösen Pilzen und Algen und eukaryontischen Zellen (z.B. Insektenzellen) mit dem Ziel der Herstellung von ausreichenden Mengen des Enzyms Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 eingesetzt werden.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Proteins aus Nicotiana tabacum oder Arabidopsis thaliana gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz SEQ-ID NO. 2, SEQ-ID No. 4 bzw. Derivate oder Teile dieses Proteins mit Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Aktivität zur Herstellung eines Testsystems zum Auffinden von Verbindungen mit herbizider Wirkung.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung pflanzlicher Proteine mit Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Aktivität mit einer Aminosäuresequenzhomologie zu der Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 aus Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana oder Physcomitrella patens mit den SEQ-ID NO. 2, SEQ-ID NO. 4 oder SEQ- ID No. 6 von 20 - 100 % Identität zur Herstellung eines Testsystems zum Auffinden von Verbindungen mit herbizider Wirkung.
Bevorzugt ist auch die Verwendung pflanzlicher Proteine mit Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Aktivität mit einer Aminosäuresequenzhomologie zu der Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 aus Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana oder Physcomitrella patens mit den Sequenzen SEQ-ID NO. 2, SEQ-ID NO. 4 oder SEQ-ID No. 6 von 50 - 100 % Identität zur Herstellung eines Testsystems zum Auffinden von Verbindungen mit herbizider Wirkung.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung pflanzlicher Proteine mit Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Aktivität mit einer
Aminosäuresequenzhomologie zu der Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 aus Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana oder Physcomitrella patens mit den Sequenzen SEQ-ID NO. 2, SEQ-ID NO. 4 oder SEQ-ID No. 6 von 80 - 100 % Identität zur Herstellung eines Testsystems zum Auffinden von Verbindungen mit herbizider Wirkung.
Durch Überexpression der für eine Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 kodierenden Gensequenz SEQ-ID NO. 1 oder SEQ-ID NO. 3 in einer Pflanze wird eine erhöhte Resistenz gegenüber Inhibitoren der Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 erreicht. Die derart hergestellten transgenen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Die Wirksamkeit der Expression des transgen exprimierten Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Gens kann beispielsweise in vitro durch Sproßmeristemvermehrung oder durch einen Keimungstest ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression des Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Gens und deren Auswirkung auf die Resistenz gegenüber Hemmstoffen der Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.
Gegenstand der Erfindung sind außerdem transgene Pflanzen, transformiert mit einer Expressionskassette, enthaltend die DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder SEQ-ID No. 3, die durch zusätzliche Expression der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder SEQ-ID No. 3 tolerant gegenüber Inhibitoren der Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 geworden sind, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Vermehrungsgut solcher Pflanzen. Besonders bevorzugt sind dabei transgene Kulturpflanzen, wie z.B. Gerste, Weizen, Roggen, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps,
Alfalfa, Salat und die verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies, sowie Leguminosen.
Insbesondere bevorzugt sind Sequenzen, die ein Targeting in den Apoplasten, in Piastiden, die Vakuole, das Mitochondrium, das
Endoplasmatische Retikulum (ER) oder durch ein Fehlen entsprechender operativer Sequenzen einen Verbleib im Kompartiment des Entstehens, dem Zytosol, gewährleisten (Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285-423).
Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in den Pflanzen- Transformationsvektor pBinAR eingebaut werden.
Als Promotoren der Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Pflanzen steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus (Franck et al., Cell 21(1980), 285-294). Dieser Promotor enthält unterschiedliche Erkennungssequenzen für transkriptionale Effektoren, die in ihrer Gesamtheit zu einer permanenten und konstitutiven Expression des eingeführten Gens führen (Benfey et al., EMBO J., 8 (1989), 2195- 2202). Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren wie z.B. der PRP1 -Promotor (Ward et al., Plant.Mol. Biol. 22(1993), 361-366), ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzenesufonamid-induzierbarer (EP 388186), ein durch Tetrazyklin- induzierbarer (Gatz et al., Plant J. 2(1992), 397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP0335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor sind in der Literatur beschrieben und können u.a. verwendet werden.
Weiterhin sind insbesonders solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen die Biosynthese von Purinen bzw. deren Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J., 8 (1989) 2445-245).
Mit Hilfe eines samenspezifischen Promotors kann ein Fremdprotein stabil bis zu einem Anteil von 0,67% des gesamten löslichen Samenproteins in den Samen transgener Tabakpflanzen exprimiert werden (Fiedler und Conrad, Bio/Technology 10 (1995), 1090-1094). Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann daher beispielsweise einen samenspezifischen Promotor (bevorzugt den Phaseolin-Promotor, den USP- oder LEB4-
Promotor), das LEB4-Signalpeptid, das zu exprimierende Gen und ein ER- Retentionssignal enthalten.
Die inserierte Nukleotid-Sequenz kodierend für eine Phosphoribosyl- Pyrophosphat Synthetase 1 kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten. Im allgemeinen werden synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons erzeugt, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA- Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beispielsweise beschrieben, die gewünschte Eigenschaft der Expression des Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Gens vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine, die Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Aktivität aufweisen, oder durch in v/ o-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer
Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen Kodon- Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln.
Als weitere geeignete äquivalente Nukleinsäure-Sequenzen sind zu nennen Sequenzen, welche für Fusionsproteine kodieren, wobei Bestandteil des Fusionsproteins ein pflanzliches Phosphoribosyl- Pyrophosphat Synthetase 1 Polypeptid oder ein funktionell äquivalenter Teil davon ist. Der zweite Teil des Fusionsproteins kann z.B. ein weiteres Polypeptid mit enzymatischer Aktivität sein oder eine antigene Polypeptidsequenz mit deren Hilfe ein Nachweis auf Phosphoribosyl- Pyrophosphat Synthetase 1 Expression möglich ist (z.B. myc-tag oder his- tag). Bevorzugt handelt es sich dabei jedoch um eine regulative Proteinsequenz, wie z.B. ein Signal- oder Transitpeptid, das das
Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Protein an den gewünschten Wirkort leitet.
Zweckmäßigerweise sollten die Promotor- und die Terminator-Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der erfindungsgemäße Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die erfindungsgemäße Expressionskassette beinhaltet in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung den erfindungsgemäßen Promotor, eine beliebige Sequenz und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.
Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z.B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in wϊro-Mutagenese, "primerrepair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen, wie z.B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T- DNA-Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHδ entsprechen (Gielen et al., EMBO J., 3 (1984), 835) oder funktionelle Äquivalente.
Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einer für eine Phosphoribosyl- Pyrophosphat Synthetase 1 kodierenden DNA wird eine
Expressionskassette als Insertion in einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzliche funktionelle Regulationssignale, beispielsweise Sequenzen für Replikation oder Integration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press, Kapitel 6/7, 71- 119) beschrieben.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, der biolistische Ansatz mit der Genkanone, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec.Biol. 42 (1991 ), 205-225 beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).
Mit einer Expressionskassette transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies sowie Leguminosen verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Der Biosytheseort von Purinen ist im allgemeinen das Blattgewebe, so daß eine blattspezifische Expression des Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Gens sinnvoll ist. Es ist jedoch naheliegend, daß die Purin- Biosynthese nicht auf das Blattgewebe beschränkt sein muß, sondern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze - beispielsweise in fetthaltigen Samen - gewebespezifisch erfolgen kann.
Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Gens von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare Expression wünschenswert erscheinen.
Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und
Klonierungstechniken können die Expressionskassetten in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvektoren sind u.a. pBR332, pUC- Serien, M13mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette zur Transformation von Pflanzen, Pflanzenzellen, -geweben oder Pflanzenteilen. Vorzugsweise ist Ziel der Verwendung die Erhöhung des Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Gehaltes in der Pflanze.
Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression spezifisch in den Blättern, in den Samen oder anderen Teilen der Pflanze erfolgen. Solche transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt.
Gentechnische Verfahren, die den Ausführungsbeispielen zugrunde liegen:
Allgemeine Klonierungsverfahren
Klonierungsverfahren wie z.B.: Restriktionsspaltungen, DNA-Isolierung, Agarose-Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden nach Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Transformation von Agrobacterium tumefaciens wurde entsprechend der Methode von Höfgen und Willmitzer (Nucl. Acid Res. 16(1988), 9877) ausgeführt. Die Anzucht der Agrobacterien erfolgte in YEB Medium (Vervliet et al., Gen. Virol. 26(1975), 33).
Sequenzanalyse rekombinanter DNA
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem
Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74(1977), 5463-5467). Fragmente resultierend aus einer Polymerase Kettenreaktion wurden zur Vermeidung von Polymerasefehlem in zu exprimierenden Konstrukten sequenziert und überprüft.
Analyse von Gesamt-RNA aus pflanzlichen Geweben
Pflanzliche Gesamt-RNA wurde nach der Methode von Logemann et al., Analytical Biochem. 163(1987), 16) isoliert und in Formaldehyd-haltigen Agarosegelen aufgetrennt (Lehrach et al., Biochem. 16(1977), 4743). Ein Kapillar-Transfer auf Nylon-Membranen (Gene Screen, NEN) erfolgte in 20 x SSC (1.5 M NaCI, 150 mM Natriumeitrat) über Nacht. Nach zweistündiger Prähybridisierung in Hybridisierungspuffer (500 mM Natriumphosphat (pH 7.2), 7 % SDS, 0,5 % Rinderserumalbumin, 1 mM EDTA), erfolgte die Hybridisierung mit einer radioaktiv-markierten NtPrsI Sonde bei 65°C für 16 Stunden. Anschließend wurden die Filter unter folgenden Bedingungen gewaschen: 10 Minuten bei 65°C in 6 x SSC, 0.1 % SDS und 5 Minuten bei 65C in 4 x SSC, 0.1 % SDS.
Die verwendeten Chemikalien wurden, sofern nicht anders erwähnt, in p.a. Qualität von den Firmen Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) sowie Sigma (Deisenhofen) bezogen. Lösungen wurden mit aufbereitetem, pyrogenfreiem Wasser, im weiteren Text als H20 bezeichnet, aus einer Milli-Q Water System Wasseraufbereitungsanlage (Millipore, Eschborn) angesetzt. Restriktionsendonukleasen, DNA-modifizierende Enzyme und molekularbiologische Kits wurden von den Firmen AGS (Heidelberg), Amersham (Braunschweig), Biometra (Göttingen), Röche (Mannheim), Genomed (Bad Oeynnhausen), New England Biolabs (Schwalbach/Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Perkin-Elmer (Weiterstadt), Pharmacia (Freiburg) Qiagen (Hilden) und Stratagene (Heidelberg) bezogen. Sie wurden, soweit nicht anders erwähnt, nach Herstellerangaben verwendet.
E. coli (XL-1 Blue) Bakterien wurden durch die Firma Stratagene bezogen. Der zur Pflanzentransformation eingesetzte Agrobacterium Stamm (C58C1 mit dem Plasmid pGV 3850kan) wurde von Debleare et al., Nucl. Acid Res. 13(1985), 4777) beschrieben.
Beispiel 1
Isolierung von cDNA Klonen kodierend für die 5-Phosphoribosyl-1- Pyrophosphat Synthetase 1 (Prs1 ) aus Nicotiana tabacum und Arabidopsis thaliana
Unter Verwendung einer cDNA Sequenz, kodierend für Prs1 aus Arabidopsis thaliana (Accession Nummer X83764; Krath und Hove- Jensen, 1995) wurden Oligonukleotide folgender Sequenz abgeleitet:
RBPRPP3 5'-aag aat tcg gat cca cca tgg tct tga agt tgt tct ctg gta ctg c-3' RBPRPP4 5'-aag aat tcg gat cct caa agg aaa atg cta ctg ac-3'
Durch Verwendung dieser Oligonukleotide wurde ein cDNA Fragment aus Arabidopsis thaliana (Var. Landsberg erecta) Blatt cDNA amplifiziert (35 Zyklen, 30sec 94DC, 45 sec 45DC, 2 min 72DC) und anschließend über EcoRV blunt in einen pGEM-T Vektor (Promega) kloniert. Durch Sequenzierung konnte die Identität des Arabidopsis Prs1 cDNA Klons bestätigt werden, siehe SEQ-ID No. 3.
Dieser Klon wurde zur Durchmusterung einer source-Blatt cDNA Bank aus Nicotiana tabacum Varietät Samsun NN in DDZAPII eingesetzt. Die cDNA Bank wurde mit einem Titer von 2.5D105 Plaque bildenden Einheiten ausplattiert und mit Hilfe der Plaque-Durchmusterungsmethode analysiert (T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1989). Es wurden 12 Phagenpopulationen isoliert, mit denen eine zweite Durchmusterung durchgeführt wurde, wodurch genetisch einheitlich Phagen Populationen isoliert werden konnten, die zur in vivo Excision verwendet wurden. Durch Restriktionsanalyse konnten keine Unterschiede zwischen den cDNA Klonen festgestellt werden und es wurden vier Klone mit den größten Insertionen zur Sequenzierung ausgewählt. Die Sequenzdaten zeigen, daß es sich um cDNA Klone kodierend für die 5- Phosphoribosyl-1 -Pyrophosphat Synthetase handelt.
Der cDNA Klon NtPrsI - siehe SEQ-ID No. 1 - ist 1251 Bp lang und besitzt an Position 21 ein Startkodon und ein Terminationskodon TAG an der Position 1089. Der offene Leserahmen kodiert für ein 356 Aminosäuren umfassendes Protein mit einer Molekülmasse von 38,3 KDa. Der 152 Bp umfassende 3'-untranslatierte Bereich enthält kein Polyadenylierungssignal. Bei der Analyse der aus dem cDNA Klon NtPrsI abgeleiteten Proteinsequenz - siehe SEQ-ID No. 2 - wurde innerhalb der ersten 36 Aminosäuren ein chloroplastidäres Transitpeptid mittels Computeranalyse identifiziert. Beispiel 2
Erzeugung binärer Vektoren zur Transformation von Tabakpflanzen
Zur Herstellung des Plasmids pBinAR-NtPrsI in Antisense-Orientierung wurde der binäre Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66(1990), 221-230) im Polylinker mit BamHI gespalten. Aus dem Plasmid pBluescriptSK-NtPrsI (Abbildung 1) wurde ein 1226 bp umfassendes NtPrsI cDNA Fragment (SEQ-ID No. 1)über die BamHI Schnittstelle im Polylinker des pBluescript SK Plasmids und einer BamHI Schnittstelle in der NtPrsI cDNA (1208 bp) isoliert. Dieses Fragment wurde in den BamHI gespaltenen Vector pBinAR ligiert. Die Orientierung des ligierten NtPrsI cDNA-Fragmentes wurde durch Restriktion mit Hindlll überprüft. Das resultierende Hindlll Fragment von 300 bp bestätigte die Antisense Orientierung. Das Plasmid pBinAR-NtPrsI -Antisense (Abbildung 2) besteht aus 3 Fragmenten A, B und C. Das Fragment A beinhaltet als Bestandteil des Vektors pBinAR den 35S-Promotor des Cauliflower- Mosaik-Virus (CaMV), der eine konstitutive Expression in transgenen Pflanzen bewirkt. Dieses Fragment umfaßt die Nucleotide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck, Cell 21(1980), 285). Das Fragment B enthält ein 1226 bp umfassendes NtPrsI cDNA Fragment, das als BamHI Fragment aus dem Plasmid pBluescriptSK-Λ/fPrs7 isoliert wurde und in den BamHI Ort des Polylinkers des Vektors pBinAR kloniert wurde. Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 (Octopinsynthase, OCS) der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACHδ (Gielen et al., EMBO J. 3(1984), 835), welches die Nukleotide 11749-11939 umfasst.
Wie in Abbildung 1 dargestellt wurden bei der Erzeugung der cDNA Bank die einzelnen Fragmente mit EcoRI/Notl Linkern versehen und anschließend in die EcoRI Restriktionsstellen des Polylinkers von pBluescript kloniert. Demnach sind die Notl Schnittstellen nicht ursprünglicher Bestandteil des Polylinkers von pBluescript.
A Multiple Klonierungsstelle des Plasmids pBluescript SK
B NtPrsI cDNA 1251 bp
C Multiple Klonierungsstelle des Plasmids pBluescript SK
Abbildung 2 zeigt die Expressionskassette zur Expression der NtPrsI cDNA (1226 bp) in Antisenseorientierung in transgenen Tabakpflanzen
A: 35S Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (CaMV), 529 bp Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV.
B: NtPrsI cDNA (1226 bp) in Antisense-Orientierung, welches als BamHI Fragment aus dem Plasmid pBluescript SK-NtPrs1 isoliert wurde und die Basen 1-1208 der Kodierregion von NtPrsI umfaßt. C: Polyadenylierungssignal des Gens 3 (Octopin Synthase, OCS) der T- DNA des Ti Plasmides pTiACHδ (192 bp).
Beispiel 3
Transformation von Tabakpflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens
Die Transformation von Tabakpflanzen erfolgte nach der Methode von Rosahl, S, Schell, J. und Willmitzer, L, EMBO J. 6(1987), 1155-1159. Das Plasmid pBinAR-NtPrsI Antisense (Abbildung 2) wurde in Agrobacterium tumefaciens C58C1 mit dem Plasmid pGV 3850kan (Debleare et al., Nucl. Acid Res. 13(1985), 4777) transformiert. Zur Transformation von
Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum cv.Samsun NN) wurden 10 ml einer Übernachtkultur einer positiv transformierten Agrobakterienkolonie in YEB- Medium (Vervliet et al., Gen. Virol. 26 (1975), 33) benutzt. Blattscheiben steriler Pflanzen, (zu je ca 1 cm2) wurden in einer Petrischale mit dieser Lösung 5-10 min inkubiert. Es erfolgte eine zweitägige Inkubation in Dunkelheit bei 25°C auf MS-Medium (Murashige-Skoog Medium,
Murashige und Skoog, Plant Physiology, 15(1962), 473) mit 0,8% BiTek ™ Agar (DIFCO Laboratories). Die Kultivierung wurde nach zwei Tagen mit 16 h Licht /8 h Dunkelheit weitergeführt und im wöchendlichen Rhythmus auf MS-Medium mit 500mg/l Claforan (Cefotaxime-Natrium), 100 mg/l Kanamycin, 1mg/l Benzylaminopurin (BAP), 0,2 mg/l Naphtylessigsäure und 1 ,6 g/l Glukose weitergeführt. Wachsende Sprosse wurden auf MS- Medium mit 2% Saccharose, 250 mg/l Claforan und 0,8% BiTek ™ Agar transferiert. Nach Bewurzelung wurden die Sprosse in Erde überführt, nach Kultivierung für zwei Wochen in einer Klimakammer mit 16h Licht und 8h Dunkelheit in größere Pflanztöpfe umgesetzt und ins Gewächshaus gebracht.
Beispiel 4
Analyse der transgenen Pflanzen
Transgene Pflanzen, die mit dem Konstrukt pBinAR-NtPrsI Antisense transformiert werden, sind gekennzeichnet durch große chlorotische Bereiche in den Blättern sowie durch ein starkes Ausbleichen der Blätter im Vergleich zu untransformierten Wildtyp-Pflanzen. Generell sind unter den transgenen pBinAR-NtPrsl-Antisensepflanzen solche, die in ihrem Wachstum stark beeinträchtigt sind.
Diese Daten stellen einen direkten Zusammenhang zwischen verringerter Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 -Expression und verringertem Wachstum bei Tabakpflanzen her und weisen daher Phosphoribosyl- Pyrophosphat Synthetase 1 als geeignetes Zielprotein (Target) für herbizide Wirkstoffe aus. Beispiel 5
Verfizierung der NtPrsI -Antisense Genexpression durch Northern-Analyse
Die RNA Analyse erfolgte durch eine strangspezifische Markierung eines NtPrsI cDNA Fragmentes. Zur strangspezifischen radioaktiven Markierung wurde das Plasmid pBluescript SK-NtPrs1 mit EcoRI gespalten und ein 1251 bp umfassendes Fragment, das die kodierende Region des NtPrsI Genes besitzt, isoliert. Für die Reaktion wurde ein 3' Oligonukleotid mit folgender Sequenz:5' CTT CAA GTT CCA GAC AAC AGT GTC-3' eingesetzt. Für die Reaktion kam ein Kit der Firma
Finnzymes Oy zum Einsatz, dessen Anleitung verwendet wurde. Das Reaktionsgemisch enthielt ca. 10 ng Fragment DNA, 0,1 mM des Oligonukleotids, 5ml 10xPuffer, 1 ,5 mM MgCI2, 5 mM Desoxy-Nukleotide (dGTP, dATP, dTTP), 50 mCi a-32P-dCTP (Amersham) und 1 ml DyNazyme Polymerase. Die Amplifikationsbedingungen wurden wie folgt gewählt:
Denaturierungstemperatur:95°C, 5 sec Anlagerungstemperatur: 45°C, 30 sec Elongationstemperatur: 72°C, 1 min Anzahl der Zyklen: 40
Für die Northern-Analyse wurde Gesamt-RNA aus ca. 0,5-1 ,0 cm großen Sink-Blättem isoliert, 20 Dg RNA wurden in einem formaldehydhaltigen Agarosegel aufgetrennt und durch Kapillarblotting auf eine Nylonmembran übertragen. Diese wurde mit der strangspezifisch markierten NtPrsI Gensonde hybridisiert. Abbildung 3 zeigt die Hybridisierungssignale für Wildtyp (WT) und transgene Pflanzen. Die Hybridisierungssignale wurden anschließend mittels eines Phospho- imagers quantifiziert. Entsprechend dem Phänotyp der Pflanzen ist die Transkriptakkumulation der Λ/fPrs7-Synthetase mRNA in der Linie 45-1 dramatisch reduziert. Die Pflanzen 33.4, 14.5 und 30.4 zeigen lediglich eine verminderte mRNA Akkumulation und analog dazu einen nicht so deutlich ausgeprägten Wachstumsphänotyp.
Beispiel 6
Herstellung einer cDNA Bank aus Physcomitrella patens
Es wurden Planzen der Species Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. aus der öffentlich zugänglichen Sammlung der Genetik der Universität Hamburg für die vorliegenden Arbeiten genutzt. Der verwendete Stamm 16/14 wurde durch H.L.K. Whitehouse in Gransden Wood, Huntingdonshire (England) gesammelt und über Sporen nach Engel subkultiviert ( Am. J. Bot. 55(1968), 438-446). Die Proliferation der Moospflanzen wurde über Sporen und Regeneration von Gametophoren durchgeführt. Das sich aus der haploiden Spore entwickelnde Protonemagewebe besteht aus Chloroplasten-reichem Chloronema und Chloroplasten-armem Caulonema, auf dem sich nach ca. 12 Tagen Knospen bilden. Diese Knospen wachsen zum Gametophoren aus und enthalten Antheridien und Archegonien. Nach Befruchtung resultiert der diploide Sporophyt, kurzes Seta und Sporenkapsel, in der sich die reifenden Sporen entwickeln.
Zur Herstellung einer cDNA Bank wurde ausgehend von PolyA+-RNA isoliert aus 9 Tage altem Protonema die Erststrangsynthese mittels Murine Leukemia Virus Reverser Transcriptase (Röche, Mannheim, Germany) and oligo-d(T)-primers durchgeführt. Die Zweitstrangsynthese erfolgte durch Inkubation mit DNA Polymerase I, Klenow Enzym, RNAse H Verdau bei 12D C (2h), 16D C (1 h) and 22D C (1 h). Die Reaktion wurde gestoppt durch Inkubation bei 65DC (10 Min) und auf Eis überführt. Doppelsträngige DNA wurde mittels T4-DNA-Polymerase (Röche, Mannheim) bei 37DC (30 min) aufgefüllt und Nukleotide über Phenol/Chloroform Extraktion und Sephadex G50 Chromatographie abgetrennt. EcoRI Adaptoren (Pharmacia, Freiburg, Germany) wurden mittels T4-DNA-Ligase (Röche, 12D C, 16h) an die cDNA Enden ligiert und mittels Polynukleotidkinase (Röche, 37DC, 30 min) phosphoryliert. Die DNA wurde mittels Gelelektrophorese getrennt und solche von größer 300 Basenpaaren mittels Phenolextraktion isoliert und mittels Elutip-D- Säulen aufkonzentriert (Schleicher and Schuell, Dassel, Germany). Die erhaltene doppelsträngige DNA wurde in lambda ZAPII ligiert und mittels des Gigapack Gold Kit (Stratagene, Amsterdam, Netherlands) nach Anweisungen des Herstellers vorgegangen. Mittels in-vivo Excision wurde Plasmid DNA erhalten, die für die Transformation von E. coli XLI blue Bakterien genutzt wurde. Aus Einzelkolonien wurden Klone in Flüssigkultur angezogen, Plasmid DNA isoliert und diese für Sequenzreaktionen eingesetzt. Durch Homologievergleich konnte ein EST kodierend für 5-Phosphoribosyl-1 -Pyrophosphat Synthese identifiziert werden, siehe SEQ-ID No. 5.
Beispiel 7
5-Phosphoribosyl-1 -Pyrophosphat Synthetase 1 - Testsystem
Um aktive 5-Phosphoribosyl-1 -Pyrophosphat Synthetase 1 aus
Arabidopsis thaliana für Hochdurchsatz Screeningmethoden zu erhalten, wird aus dem Vektor pGEM-T AtPrsI (Abbildung 2) mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI (Schnittstellen über Primer RBPRPP3 und RBPRPP4 eingefügt) das Fragment der Prs1 aus Arabidopsis thaliana gewonnen und in den identisch geschnittenen Transfervektor pFastBacHTb (GibcoBRL) kloniert. Das erhaltene Konstrukt pFASTBAC Tb-AtPrs1 wird nach Herstellerangaben (GibcoBRL) zur Erzeugung von rekombinantem Baculovirus verwendet. Dieses Virus wird nach Herstellerangaben (GibcoBRL) zur Infektion von Sf21 Insektenzellen eingesetzt, um aktives 5-Phosphoribosyl-1- pyrophosphat Synthetase 1 Enzym zu erzeugen. Die spezifische enzymatische Phosphoribosyl-Pyrophosphat-Synthese 1 Aktivität wird nach Ultraschall-Aufschluß der Zellen photometrisch gemessen. Pro 90DI Ansatz werden folgende Komponenten eingesetzt:
16,4 mM NaH2P-Puffer pH 7,8; 0,3 mM Phosphoenolpyruvat (Sigma P- 71279); 0,3 mM MgCI2; 0.15 mM ATP (Sigma A-3377); 0,06 mM NADH (Sigma N-8129); 0,3 U Pyruvat-Kinase (Sigma P-9136); 0,2 U Myokinase (Sigma M-5520); 0,3 units L-Lactat-Dehydrogenase (Böhringer/Roche 127230); für Inhibitor-Assay 0,5-5 mM Cordycepin 5'-Triphosphat (Sigma C-9137); 64 mM Ribose-5-phosphat (SIGMA R-7750).
Nach dem Zellaufschluß in Lysispuffer (50 mM NaH2P0 , 300 mM NaCI, pH 7,8) durch Ultraschall wird 18 Dg Gesamtprotein eingesetzt. Eine weitere Aufreinigung kann nach Herstellerangaben (Qiagen) über eine Affinitätschromatographie des durch den Vektor eingebrachten His-Tags erfolgen. Zur Umpufferung des Proteins werden PD-10 Säulen (Pharmacia) sowie Konzentrierungs-Standardverfahren wie z.B. Ammoniumsulfatfällung eingesetzt. Gemessen wird die Abnahme von NADH bei 340nm. Es konnte gezeigt werden, daß Cordycepin-5'- Triphosphat - ein Inhibitor der 5-Phosphoribosyl-1 -Pyrophosphat Synthetase anderer höherer Eukaryoten - auch die pflanzliche 5- Phosphoribosyl-1 -Pyrophosphat Synthetase 1 in ihrer enzymatischen Aktivität hemmt.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung einer DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 , SEQ-ID No. 3 oder SEQ-ID No. 5, enthaltend die Kodierregion einer pflanzlichen Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 , zur Herstellung eines Testsystems zur Identifizierung von Inhibitoren pflanzlicher
Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1.
2. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 , die mit der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 , SEQ-ID No. 3 oder SEQ-ID No. 5 oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder
Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, hybridisiert und für ein Protein kodiert, das die biologische Aktiviät einer pflanzlichen Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 besitzt.
3. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2 zur
Einführung in pro- oder eukaryontische Zellen, wobei diese Sequenz gegebenenfalls mit Steuerelementen, die die Transkription und Translation in den Zellen gewährleisten, verknüpft ist und zur Expression einer translatierbaren mRNA, die die Synthese einer pflanzlichen Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 bewirkt, führt.
4. Verwendung eines Proteins mit Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Aktivität zur Herstellung eines Testsystems zur Identifizierung von Substanzen, die die pflanzliche Phosphoribosyl-
Pyrophosphat Synthetase 1 inhibieren.
5. Verwendung eines Proteins mit Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Aktivität gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein die in SEQ-ID No. 2, SEQ-ID No. 4 oder SEQ-ID No. 6 dargestellte Aminosäursequenz enthält.
6. Verwendung eines Proteins mit Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Aktivität, enthaltend eine Aminosäureteilsequenz, von mindestens 100 Aminosäuren aus SEQ-ID No. 2 oder SEQ-ID No. 4 gemäß Anspruch 5.
7. Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Aktivität der pflanzlichen Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 inhibieren, dadurch gekennzeichnet, daß in einem ersten Schritt unter Verwendung einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 ,2 oder 3
Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 hergestellt wird und in einem zweiten Schritt die Aktivität der pflanzlichen Phosphoribosyl- Pyrophosphat Synthetase 1 in Anwesenheit einer Testsubstanz gemessen wird.
8. Verfahren, nach Anspruch 7 dadurch gekennzeichnet, daß die Messung der pflanzlichen Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 in einem High-Throughput-Screening (HTS) ausgeführt wird.
9. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung, die die Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Aktivität in Pflanzen hemmen, bestehend aus
a) der Herstellung von transgenen Pflanzen, Pflanzengeweben, oder Pflanzenzellen, die eine zusätzliche DNA-Sequenz codierend für ein Enzym mit Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Aktivität enthalten und in der Lage sind eine enzymatisch aktive Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 überzuexprimieren; b) das Aufbringen einer Substanz auf transgene Pflanzen,
Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile sowie auf nicht-transformierten Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile;
c) das Bestimmen des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit der transgenen und der nicht-transformierten Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile nach der Aufbringung der chemischen Substanz; und
d) dem Vergleich des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit der transgenen und der nicht-transformierten Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile nach der Aufbringung der chemischen Substanz;
wobei die Unterdrückung des Wachstums oder der
Überlebensfähigkeit der nicht-transformierten Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile ohne jedoch das Wachstum oder die Überlebensfähigkeit der transgenen Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile stark zu unterdrücken, belegt, daß die Substanz aus b) herbizide Aktivität zeigt und die Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 Enzymaktivität in Pflanzen inhibiert.
10. Testsystem basierend auf der Expression einer DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 , SEQ-ID No. 3 oder SEQ-ID No. 5 oder Teilen davon oder Derivaten nach Anspruch 1 , 2 oder 3 zur Identifizierung von Inhibitoren pflanzlicher Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1.
1 1. Testsystem gemäß Anspruch 10 zur Identifizierung von Inhibitoren pflanzlicher Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym mit einem zu untersuchenden
Testsubstrat inkubiert und nach einer geeigneten Reaktionszeit die enzymatische Aktivität des Enzyms im Vergleich zur Aktivität des nicht gehemmten Enzyms ermittelt wird.
12. Inhibitoren pflanzlicher Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1.
13. Inhibitoren pflanzlicher Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase 1 , identifiziert unter Verwendung eines Testsystems nach Anspruch 10 oder 11.
14. Inhibitoren, identifiziert nach einem der Ansprüche 12 oder 13 zur Verwendung als Herbizid.
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