DE10104721B4 - Verfahren zur Erhöhung des Gehalts von Schwefelverbindungen in Pflanzen - Google Patents
Verfahren zur Erhöhung des Gehalts von Schwefelverbindungen in Pflanzen Download PDFInfo
- Publication number
- DE10104721B4 DE10104721B4 DE2001104721 DE10104721A DE10104721B4 DE 10104721 B4 DE10104721 B4 DE 10104721B4 DE 2001104721 DE2001104721 DE 2001104721 DE 10104721 A DE10104721 A DE 10104721A DE 10104721 B4 DE10104721 B4 DE 10104721B4
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- plants
- sat
- cysteine
- transgenic
- serine acetyltransferase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 title claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 6
- 150000003464 sulfur compounds Chemical class 0.000 title description 14
- 108091022908 Serine O-acetyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 26
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims abstract description 15
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims abstract description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 42
- 108700027408 O-acetylhomoserine (thiol)-lyase Proteins 0.000 claims description 25
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 24
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 19
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 13
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 11
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 4
- -1 cysteine Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 abstract description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 82
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 15
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 11
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 11
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 10
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 10
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 8
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 8
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 5
- 101000716785 Arabidopsis thaliana Serine carboxypeptidase-like 10 Proteins 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- VZXPDPZARILFQX-BYPYZUCNSA-N O-acetyl-L-serine Chemical compound CC(=O)OC[C@H]([NH3+])C([O-])=O VZXPDPZARILFQX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 101150111114 cysE gene Proteins 0.000 description 5
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 4
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 4
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 101150055530 sat gene Proteins 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 101000889837 Aeropyrum pernix (strain ATCC 700893 / DSM 11879 / JCM 9820 / NBRC 100138 / K1) Protein CysO Proteins 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N cefotaxime Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)/C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 3
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 2
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 101710140501 Sulfate adenylyltransferase subunit 2 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100030100 Sulfate anion transporter 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710144481 Sulfate anion transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 230000004790 biotic stress Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229940088530 claforan Drugs 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 230000008676 import Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- VYXXMAGSIYIYGD-NWAYQTQBSA-N propan-2-yl 2-[[[(2R)-1-(6-aminopurin-9-yl)propan-2-yl]oxymethyl-(pyrimidine-4-carbonylamino)phosphoryl]amino]-2-methylpropanoate Chemical compound CC(C)OC(=O)C(C)(C)NP(=O)(CO[C@H](C)Cn1cnc2c(N)ncnc12)NC(=O)c1ccncn1 VYXXMAGSIYIYGD-NWAYQTQBSA-N 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 150000003354 serine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 101000912181 Arabidopsis thaliana Cysteine synthase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101100309519 Arabidopsis thaliana SAT1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100095035 Arabidopsis thaliana SAT5 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102100034274 Diamine acetyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101100498063 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) cysB gene Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000641077 Homo sapiens Diamine acetyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000713305 Homo sapiens Sodium-coupled neutral amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 241000219745 Lupinus Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 101150015378 SAT5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000014701 Transketolase Human genes 0.000 description 1
- 108010043652 Transketolase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 240000006677 Vicia faba Species 0.000 description 1
- 235000010749 Vicia faba Nutrition 0.000 description 1
- 235000002098 Vicia faba var. major Nutrition 0.000 description 1
- 101100060528 Zea mays CNR8 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 235000019728 animal nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000007806 chemical reaction intermediate Substances 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- FFNMBRCFFADNAO-UHFFFAOYSA-N pirenzepine hydrochloride Chemical compound [H+].[H+].[Cl-].[Cl-].C1CN(C)CCN1CC(=O)N1C2=NC=CC=C2NC(=O)C2=CC=CC=C21 FFNMBRCFFADNAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 108010073086 succinyl-CoA-tetrahydrodipicolinate N-succinyltransferase Proteins 0.000 description 1
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical class OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
- C12N15/8253—Methionine or cysteine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Verfahren
zur Erhöhung
des Gehalts an Schwefel-haltigen Verbindungen wie Cystein in Pflanzen
durch Übertragung
und Expression von DNA-Sequenzen, die für eine Serin-Acetyltransferase
kodieren, in Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass die Serin-Acetyltransferase
enzymatisch inaktiv ist.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Erhöhung des Gehalts von Schwefelverbindungen in Pflanzen und insbesondere die Erhöhung des Gehalts an Cystein. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die Expression eines Serin-Acetyltransferase-Gens, welches für eine enzymatisch inaktive Serin-Acetyltransferase kodiert.
- Die quantitativ und funktional bedeutsamsten reduzierten Schwefelverbindungen in Pflanzen werden durch die schwefelhaltige Aminosäure Cystein und ihre Derivate im weiteren Sinne, insbesondere Cystin, Glutathion und Methionin, repräsentiert. Diese Verbindungen sind an einer Vielzahl essentieller Funktionen in Zellen aller Organismen beteiligt. Dies gilt auch für Taxa, die einige dieser Schwefelverbindungen nicht oder nur unzureichend selbst synthetisieren können, wie z. B. das Methionin bei Säugetieren.
- Die Biosynthese des Cysteins wird durch zwei Enzyme katalysiert: Serin-Acetyltransferase (SAT; EC 2.3.1.30) und O-Acetylserin (Thiol) Lyase (OAS-TL; EC 4.2.99.8), die Serin, Acetyl-CoA und Sulfid als Substrate benötigen. Die Regulation der Cysteinsynthese in Pflanzen unterliegt zumindest zwei Mechanismen. Zum einen der Rückkopplungshemmung des von SAT katalysierten ersten Schrittes durch das Endprodukt Cystein, zum anderen der reversiblen Assoziation des Cystein-Synthasekomplexes, bestehend aus SAT und OAS-TL.
- Bislang ist aktive SAT nur im Komplex mit OAS-TL gefunden worden, während OAS-TL durch Bindung von SAT inaktiviert wird. Der Cystein-Synthasekomplex besteht demnach aus aktiver SAT und inaktiver OAS-TL. Das Reaktionsintermediat O-Acetylserin diffundiert in der Folge aus dem Komplex heraus und wird durch im Überschuss vorliegende, freie und aktive OAS-TL-Dimere mit Sulfid zu Cystein umgesetzt. Sulfid stabilisiert den Cystein-Synthasekomplex, wohingegen das Intermediat O-Acetylserin (OAS) den Komplex dissoziiert. Damit ist vermutlich ein Protein-Interaktionssystem zur metabolischen Kontrolle der Cystein-Syntheserate verwirklicht, in dem die SAT-Aktivität limitierend wirkt. Überexpression von SAT in transgenen Pflanzen bewirkt in der Tat eine Erhöhung des Cystein- und Glutathiongehalts.
- Die Cystein-Synthese in Pflanzen findet im Cytosol, in den Plastiden und den Mitochondrien statt. Glutathion wird im Cytosol und den Plastiden als transienter Speicher von Cystein in der Zelle gebildet und hat weitreichende Funktionen bei der Stress-Resistenz von Pflanzen. Die Erhöhung des Gehalts von Schwefelverbindungen in Pflanzen ist von großem biotechnologischem Interesse. So führt ein höherer Gehalt an Schwefelverbindung zu einer Verbesserung des Ernährungswertes von Nutzpflanzen für die menschliche und tierische Ernährung. Aber auch unabhängig von der Verwertung der Nutzpflanzen durch Tiere oder Menschen ist eine Erhöhung des Gehalts an Schwefelverbindungen für die Pflanze selbst von Nutzen, da hierdurch eine Verbesserung der Resistenz oder Toleranz von Pflanzen gegen biotische und abiotische Stressfaktoren bewirkt wird, da viele Schutzmechanismen von der Verfügbarkeit reduzierter Schwefelverbindungen abhängen. Beispiele hierfür sind die Entgiftung von Schwermetallen, Xenobiotica einschließlich Herbiziden, radikalischen Verbindungen einschließlich der des Sauerstoffs, und die Abwehr von Phytopathogenen insbesondere Pilzen.
- Das wirtschaftliche Interesse betrifft somit bio- und agrotechnologische Bereiche wie Phytoremediation, Pflanzenschutz und Ertrags- sowie Qualitätszüchtung.
- Es ist jetzt überraschenderweise gelungen, ein neues Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an Schwefelverbindungen in Pflanzen bereitzustellen, bei dem ein durch Mutation enzymatisch inaktiviertes Serin-Acetyltransferase-Enzym in Pflanzen exprimiert wird. Dabei zeigt die Serin-Acetyltransferase zwar selbst keine enzymatische Aktivität, ist aber dennoch in der Lage, mit der O-Acetylserin (Thiol) Lyase (OAS-TL) zu interagieren.
- Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an Schwefelverbindungen, insbesondere an Cystein in Pflanzen, gekennzeichnet durch die Übertragung und Expression eines Serin-Acetyltransferase-Gens, welches für eine enzymatisch inaktive Serin-Acetyltransferase kodiert.
- In einer bevorzugten Ausführungsform ist die enzymatisch inaktive Serin-Acetyltransferase in der Lage, mit OAS-TL zu interagieren.
- Bevorzugt ist die in Pflanzen exprimierte Serin-Acetyltransferase aufgrund mindestens einer Mutation, insbesondere mindestens eines Aminosäureaustausches, innerhalb des in SAT-Enzymen konservierten Aminosäuremotivs
G K X1 X2 G D R H P K I G D
inaktiviert. Bei der Aminosäure X handelt es sich um eine beliebige Aminosäure, bei X1 handelt es sich bevorzugt um Q oder A; bei der Aminosäure X2 handelt es sich bevorzugt um C oder S. Auch die N- bzw. C-terminal neben diesem genannten Motiv liegenden Aminosäuren sind in Serien-Acetyltransferasen stark konserviert. Das Kernmotiv innerhalb des genannten Aminosäuresequenzmotivs ist D R H. Ein Aminosäureaustausch innerhalb dieses Kernmotivs ist besonders bevorzugt. - In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Mutation, die zu der enzymatischen Inaktivierung der SAT führt, um einen Aminosäureaustausch der Aminosäure Histidin innerhalb des genannten Motivs. Dabei ist ein Austausch von Histidin zu Alanin besonders bevorzugt.
- In der beigefügten
1 werden verschiedene SAT-Aminosäuresequenzen im Vergleich dargestellt. Dabei steht SAT1 für die Arabidopsis thaliana SAT-Isoform A (cDNA SAT-1, database axcession no. U 22964), SAT5 steht für die Arabidopsis thaliana SAT-Isoform B (cDNA SAT-5, database axcession no. Z 34888), SAT52 steht für die Arabidopsis thaliana SAT-Isoform C (cDNA SAT-52, database axcession no. U 30298), CysE steht für das SAT-Enzym aus S. typhimurium (CysE, database accession no. A 00198); TDT steht für Tetrahydrodipicolinat-N-Succinyltransferase aus E. coli (TDT; database accession no. P 56220); LpxA steht für UDP-N-Acetylglucosaminacyltransferase aus E. coli (LpxA; database accession no. P 10440). Weitere Sequenzangaben sind zu finden in Murillo et al. (1995) Cell. Mol. Biol. Res. 41, 425 – 433; Howarth et al. (1997) Biochim. Biophys. Acta 1350, 123 – 127; Saito et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 16321 – 16326, Genbank Accession no. D 88530 (K. Saito). Dem beiliegenden Alignment kann die Position des für die Inaktivierung des SAT-Enzyms geeigneten Motivs entnommen werden bzw. die Position des konservierten Aminosäuremotivs in weiteren, dem Stand der Technik zu entnehmenden SAT-Enzymen bestimmt werden. Z.B. befindet sich das Kernmotiv D R H in der Arabidopsis thaliana SAT-Isoform A bei Aminosäure 307-309, wobei sich die Numerierung immer auf das erste Methionin des längsten offenen Leserahmens bezieht. Die Position des Motivs in den anderen SAT-Isoformen kann problemlos dem als1 beigefügten Aminosäure-Alignment entnommen werden. - Neben den in oben genannten SAT-Genen stehen dem Fachmann weitere im Stand der Technik beschriebene und in den Gendatenbanken erhältliche SAT-Sequenzen zur Verfügung, die sich für die Umsetzung der Erfindung eignen. Darüber hinaus ist der Fachmann mittels Routineverfahren wie PCR oder das Screening von Bibliotheken mit geeigneten SAT-Gensonden problemlos in der Lage weitere SAT-Gensequenzen aus einem beliebigen Organismus zu isolieren.
- Die Übertragung und Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein enzymatisch inaktives, aber noch zur Interaktion mit OAS-TL befähigtes SAT-Enzym im Cytosol oder in den Plastiden kodiert, resultiert in einer mehrfachen Erhöhung der Gesamtgehalte von Cystein, Glutathion und z. T. von Methionin in Pflanzen. Die Neuartigkeit dieses Verfahrens, das eine Erhöhung des Cysteingehalts in Pflanzen bewirkt und in der Folge zu einer Erhöhung des Gehalts an Glutathion und Methionin führt, besteht in der völlig unerwarteten Erhöhung des Gehalts an Schwefelverbindungen durch Expression eines enzymatisch inaktiven Proteins. Dabei kann ein enzymatisch inaktives SAT-Protein nicht nur mittels Mutagenese erzeugt werden, vielmehr kann die Serin-Acetyltransferase auch durch Inhibition durch geeignete Liganden oder Proteine, einschließlich Antikörper, erreicht werden.
- Ohne an eine Hypothese gebunden sein zu wollen, wird gegenwärtig angenommen, daß die jetzt beobachtete überraschende Erhöhung der Gesamtgehalte an schwefelhaltigen Verbindungen sehr wahrscheinlich auf einer Überkompensationsreaktion der anderen Kompartimente mit Cysteinsynthese in der Pflanzenzelle beruht.
- Die für die Realisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Erhöhung des Gehalts an schwefelhaltigen Verbindungen in Pflanzen erforderlichen Methoden und molekularbiologischen Techniken sind dem Fachmann bestens bekannt, so kann er beispielsweise Mutationen mittels kommerziell erhältlicher Mutagenese-Kits erzeugen. Die relevanten Techniken kann der Fachmann auch aus dem Standardwerk von Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, entnehmen.
- Der Fachmann kann auch durch Einführung von Mutationen in das oben genannte Aminosäuremotiv feststellen, welche Mutation, d. h. an welcher Position und welcher Aminosäureaustausch (also i) welche Aminosäure und ii) zu welcher Aminosäure ausgetauscht werden soll), welche Mutation gleichzeitig zu einer Inaktivierung des SAT-Enzyms und einer Erhöhung des Gehalts an schwefelhaltigen Verbindungen in Pflanzenzellen führt. Hierzu müssen die Mutationskonstrukte entweder auf Pflanzenzellen übertragen und die Auswirkungen der Expression in Pflanzenzellen getestet oder die Enzymaktivität bzw. die Fähigkeit zur Komplexbildung mit OAS-TL mittels der unten beschriebenen Methoden getestet werden. Die Überprüfung, ob eine bestimmte Mutation zu der gewünschten Inaktivierung des SAT-Enzyms führt, kann der Fachmann, wie den nachfolgenden Beispielen zu entnehmen ist, auch auf einfache Weise durch Übertragung und Expression eines Plasmids, enthaltend das mutierte SAT-Gen, in Bakterienstämmen, die eine SAT-Defizienz aufweisen, durchführen.
- Auch die diversen Methoden zur Übertragung von Genkonstrukten und Plasmiden auf Pflanzen sind dem Fachmann bestens bekannt. Gleiches gilt für regulatorische Sequenzen, die für die Expression von Genen in Pflanzen geeignet sind, wie z. B. konstitutive Promotoren, gewebe- und entwicklungsspezifische Promotoren, induzierbare Promotoren, Enhancer-Sequenzen und andere regulatorische Sequenzen, die die Transkription und Translation einer mit einer Promotorregion operativ verknüpften kodierenden DNA-Sequenz in transformierten Pflanzenzellen steuern.
- Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz, im vorliegenden Fall also ein mutiertes SAT-Gen kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird dann für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend geerntet und lysiert, und das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysenmethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden.
- Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierigkeiten ermitteln kann. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmedium, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten die bereits seit mehreren Jahren gut etabliert sind und zum üblichen Repertoire des Fachmanns in der pflanzlichen Molekularbiologie bzw. Pflanzenbiotechnologie gehören.
- Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide, wie z. B. pUC-Derivate, verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens empfehlenswert. Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt, und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen.
- Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- bzw. Ri-Plasmid enthaltenen T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobakterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in allseits bekannten Übersichtsartikeln und Handbüchern zur Pflanzentransformation beschrieben worden. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden.
- Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonylharnstoff, Gentamycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten. Hierzu sind auch alternative Marker geeignet, wie nutritive Marker, Screeningmarker (wie GFP, green fluorescent protein). Selbstverständlich kann auch vollkommen auf Selektionsmarker verzichtet werden, was allerdings mit einem ziemlich hohen Screeningbedarf einhergeht. Falls markerfreie transgene Pflanzen erwünscht sind, stehen dem Fachmann auch Strategien zur Verfügung, die eine nachträgliche Entfernung des Markergens erlauben, z. B. Cotransformation, Sequenz-spezifische Rekombinasen.
- Die Regeneration der transgenen Pflanzen aus transgenen Pflanzenzellen erfolgt nach üblichen Regenerationsmethoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die so erhaltenen Pflanzen können dann mittels üblicher Verfahren, einschließlich molekularbiologischer Methoden, wie PCR, Blot-Analysen, auf Anwesenheit der eingeführten Nukleinsäure, die eine enzymatisch inaktive SAT kodiert, untersucht werden.
- Bei der transgenen Pflanze bzw. den transgenen Pflanzenzellen kann es sich um jede beliebige monokotyle oder dikotyle Pflanze bzw. Pflanzenzelle handeln. Vorzugsweise handelt es sich um Nutzpflanzen bzw. Zellen von Nutzpflanzen. Besonders bevorzugt handelt es sich um Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Mais, Reis, Kartoffel, Sojabohne, Lupine, Erbse, Ackerbohne. Insbesondere sind Angehörige der Leguminosen charakteristischerweise arm an S-haltigen Aminosäuren und daher besonders geeignet für eine Erhöhung des Cysteingehalts. Aufgrund gezielter Futtermischungen von Getreiden, Mais und Leguminosen bei der Tierfütterung ist aber generell eine solche Verbesserung von Nutzen. Prinzipiell ist jede Nutzpflanze für die Umsetzung der Erfindung erstrebenswert, die für Ernährungszwecke geeignet ist. Dies ergibt sich auch den oben genannten Vorteilen erhöhter Gehalte an Schwefel-haltigen Verbindungen in Pflanzen.
- Ergänzend sei angemerkt, daß der verbesserte Nährwert durch erhöhte Thiolgehalte in Pflanzen alle Pflanzenteile und –organe betrifft, die für die Nahrung von Mensch und Tier Verwendung finden, also einschließlich Samen, Blätter, Knollen etc.); siehe z.B. Schnug (1997) In Sulphur Metabolism in higher plants; Seiten 109-130, W.J. Cram et al., eds, Backhuys Publ., Leiden, NL; Herbers and Sonnewald (1999) Curr. Opin. Biotechn. 10, 163-168; Tabe and Higgins (1998) TIBS 7, 282-286).
- Da die Erhöhung des Gehalts an schwefelhaltigen Verbindungen auch der Pflanzengesundheit dient, ist ohnehin jede Nutzpflanze von Interesse. Die Toleranz gegen biotischen und abiotischen Streß wird vielfach durch Glutahion vermittelt, dessen unmittelbarer Vorläufer Cystein ist; siehe z.B. im Zusammenhang mit der Resistenz gegenüber Pathogenen Bohlmann H. (1993) In Sulfur Nutrition and Assimilation in Higher Plants, Seiten 211-219, De Kok et al., eds, SPB Academic Publ., The Hague; im Zusammenhang mit der Resistenz gegenüber Xenobiotika und Herbiziden Lamoureux and Rusness (1993) In Sulfur Nutrition and Assimilation in Higher Plants, Seiten 221-237, De Kok et al., eds, SPB Academic Publ., The Hague; im Zusammenhang mit Schwermetall-Resistenz Rauser (1993) In Sulfur Nutrition and Assimilation in Higher Plants, Seiten 239-251, De Kok et al., eds, SPB Academic Publ., The Hague; im Zusammenhang mit der Toleranz gegenüber gasförmigen Schadstoffen wie H2S, SO2 Ernst (1993) In Sulfur Nutrition and Assimilation in Higher Plants, Seiten 295-314, De Kok et al., eds, SPB Academic Publ., The Hague; und im Zusammenhang mit der Toleranz gegenüber oxidativem Streß: Stulen and De Kok (1993) In Sulfur Nutrition and Assimilation in Higher Plants, Seiten 125-138, De Kok et al., eds, SPB Academic Publ., The Hague; Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial und Ernteprodukte der erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge usw.
- Die Expression der inaktiven SAT in den Pflanzen bzw. Pflanzenzellen kann mit Hilfe herkömmlicher molekularbiologischer und biochemischer Methoden nachgewiesen und verfolgt werden. Dem Fachmann sind diese Techniken bekannt und er ist problemlos in der Lage, eine geeignete Nachweismethode zu wählen, beispielsweise eine Northern-Blot-Analyse zum Nachweis SAT-spezifischer RNA bzw. zur Bestimmung der Höhe der Akkumulation von SAT-spezifischer RNA oder eine Southern-Blot-Analyse zur Identifizierung von für SAT-kodierende DNA-Sequenzen.
- Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen mit einem gegenüber Wildtyp-Pflanzen erhöhten Gehalt an schwefelhaltigen Verbindungen, umfassend die folgenden Schritte:
- a) die Übertragung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls oder Vektors, der eine DNA-Sequenz enthält, die für eine enzymatisch inaktive SAT kodiert, die in der Lage ist mit OAS-TL zu interagieren, auf Pflanzenzellen;
- b) die Regeneration von Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.
- Die vorliegende Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen, die nur der Veranschaulichung der Erfindung dienen und in keiner Weise als Einschränkung zu verstehen sind, erläutert.
- Allgemeine Klonierungsverfahren
- Klonierungsverfahren, wie z. B. Restriktionsspaltung, DNA-Isodierung, Agarose, Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrocellulose und Nylon-Membranen, verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli-Zellen, Anzucht von Bakterien, Sequenz-Analyse von rekombinanter DNA, wurden nach Sambrook et al. (1989) vide supra, durchgeführt. Die Transformation von Agrobacterium tumefaciens wurde entsprechend der Methode von Höfgen and Willmitzer (Nucl. Acids Res. (1988) 16, 9877) ausgeführt. Die Anzucht der Agrobakterien erfolgte in YEB-Medium (Vervliet et al. 1975 J. Gen. Virol. 26, 33).
- Bakterienstämme und Plasmide
- E. coli (XL 1 Blue) Bakterien wurden von der Firma Stratagene, La Jolla, USA bezogen. Der zur Pflanzentransformation eingesetzte Agrobakterienstamm (C58C1 mit dem Plasmid pGV 3850kan) wurde von Deblare et al. (1985, Nucl. Acids Res. 13, 4777) beschrieben. Zur Klonierung wurde der Vektor Bin19 bzw. dessen Derivate pBinAR und pBinAR-TkTp (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12, 8711-8720) verwendet.
- Pflanzentransformation
- Zur Transformation von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN) wurden 10 ml einer unter Selektion gewachsenen Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens abzentrifugiert, der Überstand verworfen und die Bakterien im gleichen Volumen Antibiotika-freien Mediums resuspendiert. In einer sterilen Petrischale wurden Blattscheiben steriler Pflanzen (Durchmesser ca. 1 cm) in dieser Bakterienlösung gebadet. Anschließend wurden die Blattscheiben in Petrischalen auf MS-Medium (Murashige and Skoog (1962) Physiol. Plant 15, 473) mit 2% Saccharose und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach zweitägiger Inkubation im Dunkeln bei 25°C wurden sie auf MS-Medium mit 100 mg/l Kanamycin, 500 mg/l Claforan (Cefotaxim), 1 mg/l Benzylaminopurin (BAP), 0,2 mg/l Naphthylessigsäure (NAA), 1,6% Glukose und 0,8% Bacto-Agar übertragen und die Kultivierung (16 Std. Licht/8 Std. Dunkelheit) fortgesetzt. Wachsende Sprosse wurden auf hormonfreies MS-Medium mit 2% Saccharose, 250 mg/l Claforan und 0,8% Bacto-Agar überführt.
- Herstellung einer enzymatisch inaktiven Serin-Acetyltransferase (SAT) die noch zur Interaktion mit OAS-TL befähigt ist.
- Die im Stand der Technik hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz sowie der zugrundeliegenden DNA-Sequenz beschriebene SAT-A aus Arabidopsis thaliana wurde durch gerichtete Mutagenese der Aminosäure Histidin 309 zu Alanin inaktiviert (die Numerierung bezieht sich auf das erste Methionin des offenen Leserahmens). Die gerichtete Mutagenese der zugehörigen cDNA im Plasmid pBlueScript (Stratagene) erfolgte durch Basenpaaraustausch nach einem kommerziell verfügbaren Verfahren der Firma Promega (Heidelberg, Deutschland).
- Die ortgerichtete Mutagenese der SAT-A cDNA wurde mit pBS/ΔSAT1-6 durchgeführt (Bogdanova et al. (1995) FEBS Lett. 358, 43-47). Das eingesetzte Promega GeneEditor in vitro Site Directed Mutagenesis System erzielte im Durchschnitt 80% positive Klone. Die Punktmutationen wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert und die resultierenden Aminosäureaustausche wurden in Bezug auf das Startkodon des längsten möglichen offenen Leserahmens einer mitochondrialen SAT-A cDNA numeriert (cDNA SAT-1 (Roberts et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30, 1041-1049)).
- Die Inaktivierung der SAT-Mutante durch den Aminosäureaustausch in Position 309 (Histidin → Alanin) wurde durch fehlende heterologe Komplementation einer SAT-freien E. coli-Mutante und durch Enzymbestimmung in vitro (maximal 1 % Restaktivität) belegt. Die Interaktionsfähigkeit mit O-Acetylserin (Thiol) Lyase (OAL-TL) wurde durch heterologe Expression in dem Hefe "two-hybrid"-System und Coexpression in E. coli mit nachfolgender biochemischer Reinigung bewiesen.
- Die Inaktivierung des cysE-Gens von E. coli zwecks Erzeugung einer SAT-freien E. coli Mutante wurde nach der von Hamilton et al. beschriebenen Methode durchgeführt (Hamilton (1989) J. Bacteriol. 171, 4617 – 4622). Hierdurch sollte ein Bakterienstamm bereitgestellt werden, der bezüglich seiner SAT-Defizienz stabiler ist als die im Stand der Technik gegenwärtig erhältlichen. Hierzu wurde das Wildtyp cysE-Gen mittels PCR kloniert und durch Insertion einer Gentamycin-Resistenz-Kassette in eine ClaI-Restriktionsschnittstelle bei Position 522, bezogen auf das Startcodon des cysE-Gens, inaktiviert. Nach Klonierung dieser Cassette in das Plasmid pMAK705, welches einen Temperatur-sensitiven Replikationsursprung trägt, wurde das inaktivierte cysE-Gen in das Genom von E. coli C600 via homologe Rekombination integriert, um den Stamm MW1 zu ergeben (thr, leu, thi, lac, λ-P1 + F', cysE, Gmr). Komplementationstests unter Einsatz der E. coli-Stämme EC1801 (E. coli Genetik Stock Center, Yale University, New Haven, CT, USA) oder MW1 wurden auf M9-Minimalmedium-Agarplatten mit oder ohne Cystein unter Zugabe von Induktionsmittel und selektiven Antibiotika durchgeführt.
- Die Konstrukte für die Expression der mitochondrialen SAT-A aus Arabidopsis thaliana umfaßten pBS/ΔSAT1-6 (X82888 (Bogdanova et al. (1985) vide supra)), pET/ΔSAT1-6 sowie mutierte Formen der SAT-A. Um das zuletzt genannte Plasmid zu erhalten, wurde die kodierende Region der SAT-A mittels PCR von Basenpaar 28 – 939 ohne mitochondriales Transitpeptid unter Einsatz spezifischer Primer, flankiert von EcoRI- und XhoI-Schnittstellen, amplifiziert. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pCAP (Roche, Mannheim, Deutschland) kloniert, die Sequenz mittels Sequenzierung beider Stränge verifiziert und in die entsprechenden Schnittstellen von pET29a (Novagen, Madison, USA) eingefügt, was in einem Fusionsprotein mit den 35 Aminosäuren des S-Tag an seinem N-Terminus für Affinitätsreinigung an S-Agarose resultierte. Mitochondriale OAS-TL aus A. thaliana wurde in ähnlicher Weise durch Klonierung eines PCR-Produkts, welches das reife Protein ohne das mitochondriale Transitpeptid von Basenpaar 172 – 1162 (AJ271727 (Hesse et al. (1999) Amino Acids 16, 113-131) umfaßte, in die NcoI-BamHI-Schnittstellen von pET3d, was pET/OAS-C ergab, exprimiert.
- Die Expression, Kultivierung und Affinitätsreinigung von SAT und OAS-TL unter Einsatz des S-tag-Systems (Novagen) wurden im wesentlichen wie von Droux et al. (1998, Eur. J. Biochem. 255,235-245) beschrieben, durchgeführt, mit den folgenden Modifikationen. Nach dem letzten Waschschritt wurde der S-tag nicht durch proteolytische Spaltung an der Affinitätssäule entfernt, da diese Behandlung in Fraktionen mit labiler SAT-Aktivität resultierte. Statt dessen wurde SAT mit 3 M MgCl2 eluiert, welches anschließend durch Gelfiltration an PD10-Säulen (Amerschan, Freiburg, Deutschland) entfernt wurde. In vitro Interaktion von SAT und OAS-TL an der Säule wurde in einem Standardwasch- und Elutionsprotokoll mit oder ohne 1 mM OAS (O-Acetylserin) bestimmt, wie beschrieben von Droux et al. (1998, vide supra).
- Die Bestimmung der Proteinkonzentration und die Auftrennung von Proteinen wurden nach Standardprotokollen (z.B. Sambrook et al. (1989) vide supra) durchgeführt.
- Die SAT-Enzymaktivität mit und ohne OAS-TL wurde in einem Standard-Assay auf der Grundlage der Methode von Kredich and Becker (1971, In Methods in Enzymology (Tabor and Tabor, eds), Seiten 459-469, Academic Press, New York, USA) bestimmt. Roh- oder gereinigtes rekombinantes SAT-Protein wurde in einem Volumen von 250 μl (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 0,2 mM Acetyl-CoA, 2mM Dithiothreitol, 5mM Serin) bei 25°C inkubiert und A232 wurde für bis zu 3 Min. aufgenommen.
- Die OAS-TL-Aktivität wurde unter gesättigten Bedingungen wie zuvor beschrieben untersucht (Nakamura et al. (1987) Plant Cell Physiol.28, 885-891). Kinetische Analysen wurden mit der SigmaPlot-Software durchgeführt, welche hyperbolische Anpassungen auf der Grundlage der Michaelis-Menten-Gleichung erlaubte: ν = Vmax × [S])/(Km + [S]).
- Für die Interaktionsanalysen unter Einsatz des Hefe "two-hybrid"-Systems wurden die Transformation der Hefestämme HF7c und PCY2, die Selektion auf Minimalmedium und β-Galaktosidase-Assays durchgeführt wie bereits beschrieben (Bogdanova and Hell (1997) Plant J. 11, 251-262). PCR mit spezifischen Primerpaaren, flankiert von SalI- bzw. SpeI-Schnittstellen, wurde für sämtliche Konstrukte eingesetzt, um die kodierenden Regionen in die entsprechenden Restriktionsschnittstellen von pPC86 (GAL4-Aktivierungsdomäne) und pPC97 (GAL4-DNA-Bindungsdomäne) einzufügen (Chevray and Nathans (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793). EST 181H17T7 (GenBank Accession Number AJ2711727) wurde als Template eingesetzt, um OAS-TL C ohne mitochondriales Transitpeptid von Basenpaar 172 – 1162 zu erzeugen. Im Unterschied zu den bisher eingesetzten full length-Konstukt (Bogdanova et al. (1997) vide supra) wurden die pPC-Vektoren mit mitochondrialer SAT-A ohne mitochondriales Transitpeptid durch Amplifizierung von Basenpaar 28 – 939 konstruiert (X82888 (Bogdanova et al. (1995) vide supra).
- Expression der inaktiven SAT-Mutante (H309A) in Pflanzen
- Die cDNA der SAT-Mutante wurde in den binären Transformationsvektor pBin-AR (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Sci. 66, 221; pBin19-Ursprung) bzw. in dessen Derivat pBinAR-TkTp (R. Badur, Dissertation, Universität Göttingen, 1998) kloniert. Als Promotor wurde der 35S RNA-Promotor des Cauliflower Mosaik Virus (CaMV) verwendet. Als Terminationssignal diente das 3'-Ende des Octopin-Synthasegens.
- Der Eintransport in Chloroplasten wurde durch Fusion der SAT-Mutante mit dem Plastiden-Importpeptid der plastidären Transketolase aus Tabak in pBinAr-TkTp erreicht. Die Lokalisierung in Cytosol erfolgte mit pBinAR unter Weglassung des Abschnitts für das Importpeptid.
- Die Klonierungen erfolgten jeweils in die vorgegebenen BamHI- bzw. SalI-Restriktionsschnittstellen der genannten Vektoren pBIN-AR und pBINAr-TkTp. Die cDNA der SAT-Mutante wurde jeweils mit den Oligonukleotid-Primern SAT208 und SAT209 mit 5' gelegenen zusätzlichen BamHI- bzw. SalI-Restriktionsschnittstellen durch Standard-PCR amplifiziert.
- Beispiel für Standard PCR: Reaktionsvolumen 50 μl mit 20 pmol jedes Primers, 1-10 ng Plasmid, Puffer des Herstellers, 1 U Taq-Polymerase (Promega). Abfolge: 5 Min. bei 94°C, dann 30 Zyklen zu 30 Sek. bei 94°C, 60 Sek. bei 55°C, 30 Sek. bei 72°C, gefolgt von 10 Min. bei 72°C.
SAT208: 5'-GGA TCC CAT GAA CTA CTT CCG TTA TC-3'
SAT209: 5'-GTC GAC TCA AAT TAC ATA ATC CGA C-3' - Bestimmung der Thiol- und Aminosäuregehalte transgener Pflanzen
- Cystein-, Glutathion- und Methioningehalte wurden in Blättern von mindestens drei unabhängigen transgenen Tabakpflanzen der ersten und zweiten Generation nach Transformation bestimmt. Im Vergleich zu nicht transformierten Kontrollpflanzen wurden bei cytosolischer dominant-negativer Überexpression bis zu 8× mehr Cystein und 2× mehr Glutathion gefunden. Bei entsprechender plastidärer Überexpression der SAT-Mutante wurden bis zu 25× mehr Cystein und 8× mehr Glutathion gemessen. Bei plastidärer Überexpression erhöht sich der Methioningehalt bis zu 2×.
- Die Extraktion, Trennung und Quantifizierung von Cystein und Glutathion erfolgte wie beschrieben (Hell und Bergmann (1990) Planta 180, 603-612). Die Bestimmung von Methionin erfolgte nach einem kommerziellen Verfahren (Firma Waters, Eschborn) wie beschrieben (Giordano et al. (2000) Plant Physiol. 124, 857-864).
- Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigten eindeutig, daß die Arabidopsis thaliana SAT-Mutante mit einem Aminosäureaustausch in Position 309 keine enzymatische SAT-Aktivität mehr aufweist, dennoch aber zur Komplexbildung, also zur Interaktion mit OAS-TL in der Lage ist. Die Expression dieser Mutante führte zu einer überraschenden Erhöhung des Gehalts an Schwefelverbindungen, insbesondere an Cystein, Glutathion und Methionin, in transgenen Pflanzen.
- Abbildungen
-
1 zeigt ein Aminosäure-Alignment verschiedener Serinacetyltransferasen. -
2 zeigt den Einfluß der Überexpression der SAT A-Mutante H309A auf die Cystein-Bildung.
Claims (8)
- Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an Schwefel-haltigen Verbindungen wie Cystein in Pflanzen durch Übertragung und Expression von DNA-Sequenzen, die für eine Serin-Acetyltransferase kodieren, in Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass die Serin-Acetyltransferase enzymatisch inaktiv ist.
- Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Serin-Acetyltransferase zur Interaktion mit O-Acetylserin (Thiol) Lyase fähig ist.
- Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Serin-Acetyltransferase aufgrund einer Mutation innerhalb des Aminosäuresequenzmotivs G K X X G D R H P K I G D (X steht für eine beliebige Aminosäure) enzymatisch inaktiv ist.
- Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Mutation das Kernmotiv D R H betrifft.
- Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Mutation das Histidin innerhalb des Motivs betrifft.
- Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen mit einem gegenüber Wildtyppflanzen erhöhten Gehalt an Schwefel-haltigen Verbindungen wie Cystein, umfassend die folgenden Schritte: – die Übertragung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls oder Vektors, der eine DNA-Sequenz enthält, die für eine enzymatisch inaktive Serin-Acetyltransferase kodiert, die in der Lage ist mit O-Acetylserin (Thiol) Lyase zu interagieren, auf Pflanzenzellen; – die Regeneration von Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.
- Transgene Pflanzen, hergestellt in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, sowie Teile dieser Pflanzen, transgene Ernteprodukte und transgenes Vermehrungsmaterial dieser Pflanzen wie Pflanzenzellen, Protoplasten, Kalli, Samen, Knollen, Stecklinge sowie die transgenen Nachkommen dieser Pflanzen.
- Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Erhöhung der Stressresistenz in den transgenen Pflanzen.
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2001104721 DE10104721B4 (de) | 2001-02-02 | 2001-02-02 | Verfahren zur Erhöhung des Gehalts von Schwefelverbindungen in Pflanzen |
PCT/EP2002/001131 WO2002060939A2 (de) | 2001-02-02 | 2002-02-04 | Verfahren zur erhöhung des gehalts von schwefelverbindungen in pflanzen |
AU2002235893A AU2002235893A1 (en) | 2001-02-02 | 2002-02-04 | Method for increasing the sulphur-compound content in plants |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2001104721 DE10104721B4 (de) | 2001-02-02 | 2001-02-02 | Verfahren zur Erhöhung des Gehalts von Schwefelverbindungen in Pflanzen |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE10104721A1 DE10104721A1 (de) | 2002-08-14 |
DE10104721B4 true DE10104721B4 (de) | 2006-02-09 |
Family
ID=7672631
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2001104721 Expired - Fee Related DE10104721B4 (de) | 2001-02-02 | 2001-02-02 | Verfahren zur Erhöhung des Gehalts von Schwefelverbindungen in Pflanzen |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
AU (1) | AU2002235893A1 (de) |
DE (1) | DE10104721B4 (de) |
WO (1) | WO2002060939A2 (de) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10260871A1 (de) * | 2002-12-23 | 2004-07-08 | Sungene Gmbh & Co. Kgaa | Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt durch Veränderung des Serin-Acetyltransferase-Gehalts |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19539952A1 (de) * | 1995-10-26 | 1997-04-30 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur Herstellung von O-Acetylserin, L-Cystein und L-Cystein-verwandten Produkten |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2787466B1 (fr) * | 1998-12-17 | 2001-02-16 | Rhone Poulenc Agrochimie | Procede pour augmenter la teneur en cysteine, methionine et glutathion chez les plantes et plantes obtenues |
-
2001
- 2001-02-02 DE DE2001104721 patent/DE10104721B4/de not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-02-04 WO PCT/EP2002/001131 patent/WO2002060939A2/de not_active Application Discontinuation
- 2002-02-04 AU AU2002235893A patent/AU2002235893A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19539952A1 (de) * | 1995-10-26 | 1997-04-30 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur Herstellung von O-Acetylserin, L-Cystein und L-Cystein-verwandten Produkten |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Wirtz, M. (u.a.): The cysteine synthase complex from plants, In: Eur. J. Biochem., 2001, Vol. 268, S. 686-693 |
Wirtz, M. (u.a.): The cysteine synthase complex from plants, In: Eur. J. Biochem., 2001, Vol. 268,S. 686-693 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2002060939A3 (de) | 2003-01-03 |
DE10104721A1 (de) | 2002-08-14 |
WO2002060939A8 (de) | 2003-05-01 |
WO2002060939A2 (de) | 2002-08-08 |
AU2002235893A1 (en) | 2002-08-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0973921B1 (de) | 2-desoxyglucose-6-phosphat (2-dog-6-p) phosphatase dna-sequenzen als selektionsmarker in pflanzen | |
DD273855A5 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Rekombinanten DNA Moleküls | |
EP0309862A1 (de) | Stilbensynthase-Gen | |
CA2276612A1 (en) | Polynucleotides encoding choline monooxygenase and plants transformed therewith | |
CA2100674C (en) | Chilling resistant plants and their production | |
DE19502053A1 (de) | Verfahren und DNA-Moleküle zur Steigerung der Photosyntheserate in Pflanzen, sowie Pflanzenzellen und Pflanzen mit gesteigerter Photosyntheserate | |
HU221515B (en) | Transgenic plants with improved biomass production | |
DE3719053A1 (de) | Verbesserte nutzung von pflanzenverwertbarem stickstoff durch kulturpflanzen mit ueberexpression der glutaminsynthetase | |
DE19752647C1 (de) | Reduktiion des Chlorophyllgehaltes in Ölpflanzensamen | |
DE10104721B4 (de) | Verfahren zur Erhöhung des Gehalts von Schwefelverbindungen in Pflanzen | |
EP0977878B1 (de) | Dna-sequenzen kodierend für die untereinheit chld pflanzlicher magnesium-chelatasen sowie verfahren zur aktivitätsbestimmung pflanzlicher magnesium-chelatasen | |
EP1272645B1 (de) | Produktion nicht-kariogener zucker in transgenen pflanzen | |
DE19501840A1 (de) | Desoxyribonukleinsäure und ihre Verwendung | |
WO1999066785A1 (en) | Water stress or salt stress tolerant transgenic cereal plants | |
WO1998010074A2 (de) | Adenylosuccinat synthetase | |
DE10313795A1 (de) | Veränderte PPase-Expression in Zuckerrübe | |
EP1070120A1 (de) | Amp-deaminase | |
WO2000060101A1 (de) | Metabolische selektionsmarker für pflanzen | |
DE10045182A1 (de) | Verwendung von Palatinase- und Trehalulase-Sequenzen als nutritive Marker in transformierten Zellen | |
WO2022198093A1 (en) | Producing albumin using plant cell matrices | |
EP1576164A2 (de) | VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON TRANSGENEN PFLANZEN MIT ERHöHT EM VITAMIN E-GEHALT DURCH VER äNDERUNG DES SERIN-ACETYLTRANSF ERASE-GEHALTS | |
DE60028751T2 (de) | Herbizidresistente pflanzen | |
WO2024077110A2 (en) | Uorf::reporter gene fusions to select sequence changes to gene edit into uorfs to regulate ascorbate genes | |
WO2001059131A2 (de) | Verwendung von palatinase- und trehalulase-sequenzen als nutritive marker in transformierten zellen | |
WO2001064861A2 (de) | Phosphoribosyl-pyrophosphat synthetase 1 als herbizides target |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |