DE10104721A1 - Verfahren zur Erhöhung des Gehalts von Schwefelverbindungen in Pflanzen - Google Patents
Verfahren zur Erhöhung des Gehalts von Schwefelverbindungen in PflanzenInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Erhöhung des Gehalts von Schwefelverbindungen in Pflanzen und insbesondere die Erhöhung des Gehalts an Cystein. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Expression eines Serin-Acetyltransferase-Gens, welches für eine enzymatisch inaktive Serin-Acetyltransferase kodiert.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Erhöhung des Gehalts von Schwefelverbin
dungen in Pflanzen und insbesondere die Erhöhung des Gehalts an Cystein. Das erfindungs
gemäße Verfahren umfaßt die Expression eines Serin-Acetyltransferase-Gens, welches für
eine enzymatisch inaktive Serin-Acetyltransferase kodiert.
Die quantitativ und funktional bedeutsamsten reduzierten Schwefelverbindungen in Pflanzen
werden durch die schwefelhaltige Aminosäure Cystein und ihre Derivate im weiteren Sinne,
insbesondere Cystin, Glutathion und Methionin, repräsentiert. Diese Verbindungen sind an
einer Vielzahl essentieller Funktionen in Zellen aller Organismen beteiligt. Dies gilt auch für
Taxa, die einige dieser Schwefelverbindungen nicht oder nur unzureichend selbst
synthetisieren können, wie z. B. das Methionin bei Säugetieren.
Die Biosynthese des Cysteins wird durch zwei Enzyme katalysiert: Serin-Acetyltransferase
(SAT; EC 2.3.1.30) und O-Acetylserin (Thiol) Lyase (OAS-TL; EC 4.2.99.8), die Serin,
Acetyl-CoA und Sulfid als Substrate benötigen. Die Regulation der Cysteinsynthese in
Pflanzen unterliegt zumindest zwei Mechanismen. Zum einen der Rückkopplungshemmung
des von SAT katalysierten ersten Schrittes durch das Endprodukt Cystein, zum anderen der
reversiblen Assoziation des Cystein-Synthasekomplexes, bestehend aus SAT und OAS-TL.
Bislang ist aktive SAT nur im Komplex mit OAS-TL gefunden worden, während OAS-TL
durch Bindung von SAT inaktiviert wird. Der Cystein-Synthasekomplex besteht demnach aus
aktiver SAT und inaktiver OAS-TL. Das Reaktionsintermediat O-Acetylserin diffundiert in
der Folge aus dem Komplex heraus und wird durch im Überschuss vorliegende, freie und
aktive OAS-TL-Dimere mit Sulfid zu Cystein umgesetzt. Sulfid stabilisiert den Cystein-
Synthasekomplex, wohingegen das Intermediat O-Acetylserin (OAS) den Komplex
dissozüert. Damit ist vermutlich ein Protein-Interaktionssystem zur metabolischen Kontrolle
der Cystein-Syntheserate verwirklicht, in dem die SAT-Aktivität limitierend wirkt.
Überexpression von SAT in transgenen Pflanzen bewirkt in der Tat eine Erhöhung des
Cystein- und Glutathiongehalts.
Die Cystein-Synthese in Pflanzen findet im Cytosol, in den Plastiden und den Mitochondrien
statt. Glutathion wird im Cytosol und den Plastiden als transienter Speicher von Cystein in der
Zelle gebildet und hat weitreichende Funktionen bei der Stress-Resistenz von Pflanzen. Die
Erhöhung des Gehalts von Schwefelverbindungen in Pflanzen ist von großem
biotechnologischem Interesse. So führt ein höherer Gehalt an Schwefelverbindung zu einer
Verbesserung des Ernährungswertes von Nutzpflanzen für die menschliche und tierische
Ernährung. Aber auch unabhängig von der Verwertung der Nutzpflanzen durch Tiere oder
Menschen ist eine Erhöhung des Gehalts an Schwefelverbindungen für die Pflanze selbst von
Nutzen, da hierdurch eine Verbesserung der Resistenz oder Toleranz von Pflanzen gegen
biotische und ablotische Stressfaktoren bewirkt wird, da viele Schutzmechanismen von der
Verfügbarkeit reduzierter Schwefelverbindungen abhängen. Beispiele hierfür sind die
Entgiftung von Schwermetallen, Xenobiotica einschließlich Herbiziden, radikalischen
Verbindungen einschließlich der des Sauerstoffs, und die Abwehr von Phytopathogenen
insbesondere Pilzen.
Das wirtschaftliche Interesse betrifft somit bio- und agrotechnologische Bereiche wie
Phytoremediation, Pflanzenschutz und Ertrags- sowie Qualitätszüchtung.
Es ist jetzt überraschenderweise gelungen, ein neues Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an
Schwefelverbindungen in Pflanzen bereitzustellen, bei dem ein durch Mutation enzymatisch
inaktiviertes Serin-Acetyltransferase-Enzym in Pflanzen exprimiert wird. Dabei zeigt die
Serin-Acetyltransferase zwar selbst keine enzymatische Aktivität, ist aber dennoch in der
Lage, mit der O-Acetylserin (Thiol) Lyase (OAS-TL) zu interagieren.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an Schwefelverbin
dungen, insbesondere an Cystein in Pflanzen, gekennzeichnet durch die Übertragung und
Expression eines Serin-Acetyltransferase-Gens, welches für eine enzymatisch inaktive Serin-
Acetyltransferase kodiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die enzymatisch inaktive Serin-Acetyltransferase in
der Lage, mit OAS-TL zu interagieren.
Bevorzugt ist die in Pflanzen exprimierte Serin-Acetyltransferase aufgrund mindestens einer
Mutation, insbesondere mindestens eines Aminosäureaustausches, innerhalb des in SAT-
Enzymen konservierten Aminosäuremotivs
G K X1 X2 G D R H P K I G D
G K X1 X2 G D R H P K I G D
inaktiviert. Bei der Aminosäure X handelt es sich um eine beliebige Aminosäure, bei X1
handelt es sich bevorzugt um Q oder A; bei der Aminosäure X2 handelt es sich bevorzugt um
C oder S. Auch die N- bzw. C-terminal neben diesem genannten Motiv liegenden
Aminosäuren sind in Serien-Acetyltransferasen stark konserviert. Das Kernmotiv innerhalb
des genannten Aminosäuresequenzmotivs ist D R H. Ein Aminosäureaustausch innerhalb
dieses Kernmotivs ist besonders bevorzugt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Mutation, die zu der
enzymatischen Inaktivierung der SAT führt, um einen Aminosäureaustausch der Aminosäure
Histidin innerhalb des genannten Motivs. Dabei ist ein Austausch von Histidin zu Alanin
besonders bevorzugt.
In der beigefügten Abb. 1 werden verschiedene SAT-Aminosäuresequenzen im
Vergleich dargestellt. Dabei steht SAT1 für die Arabidopsis thaliana SAT-Isoform A (cDNA
SAT-1, database axcession no. U 22964), SATS steht für die Arabidopsis thaliana SAT-
Isoform B (cDNA SAT-5, database axcession no. Z 34888), SAT52 steht für die Arabidopsis
thaliana SAT-Isoform C (cDNA SAT-52, database axcession no. U 30298), CysE steht für
das SAT-Enzym aus S. typhimurium (CysE, database accession no. A 00198); TDT steht für
Tetrahydrodipicolinat-N-Succinyltransferase aus E. coli (TDT; database accession no.
P 56220); LpxA steht für UDP-N-Acetylglucosaminacyltransferase aus E. coli (LpxA;
database accession no. P 10440). Weitere Sequenzangaben sind zu finden in Murillo et al.
(1995) Cell. Mol. Biol. Res. 41, 425-433; Howarth et al. (1997) Biochim. Biophys. Acta
1350, 123-127; Saito et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 16321-16326, Genbank Accession
no. D 88530 (K. Saito). Dem beiliegenden Alignment kann die Position des für die
Inaktivierung des SAT-Enzyms geeigneten Motivs entnommen werden bzw. die Position des
konservierten Aminosäuremotivs in weiteren, dem Stand der Technik zu entnehmenden SAT-
Enzymen bestimmt werden. Z. B. befindet sich das Kernmotiv D R H in der Arabidopsis
thaliana SAT-Isoform A bei Aminosäure 307-309, wobei sich die Numerierung immer auf
das erste Methionin des längsten offenen Leserahmens bezieht. Die Position des Motivs in
den anderen SAT-Isoformen kann problemlos dem als Abb. 1 beigefügten Aminosäure-
Alignment entnommen werden.
Neben den in oben genannten SAT-Genen stehen dem Fachmann weitere im Stand der
Technik beschriebene und in den Gendatenbanken erhältliche SAT-Sequenzen zur
Verfügung, die sich für die Umsetzung der Erfindung eignen. Darüber hinaus ist der
Fachmann mittels Routineverfahren wie PCR oder das Screening von Bibliotheken mit
geeigneten SAT-Gensonden problemlos in der Lage weitere SAT-Gensequenzen aus einem
beliebigen Organismus zu isolieren.
Die Übertragung und Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein enzymatisch
inaktives, aber noch zur Interaktion mit OAS-TL befähigtes SAT-Enzym im Cytosol oder in
den Plastiden kodiert, resultiert in einer mehrfachen Erhöhung der Gesamtgehalte von
Cystein, Glutathion und z. T. von Methionin in Pflanzen. Die Neuartigkeit dieses Verfahrens,
das eine Erhöhung des Cysteingehalts in Pflanzen bewirkt und in der Folge zu einer Erhöhung
des Gehalts an Glutathion und Methionin führt, besteht in der völlig unerwarteten Erhöhung
des Gehalts an Schwefelverbindungen durch Expression eines enzymatisch inaktiven
Proteins. Dabei kann ein enzymatisch inaktives SAT-Protein nicht nur mittels Mutagenese
erzeugt werden, vielmehr kann die Serin-Acetyltransferase auch durch Inhibition durch
geeignete Liganden oder Proteine, einschließlich Antikörper, erreicht werden.
Ohne an eine Hypothese gebunden sein zu wollen, wird gegenwärtig angenommen, daß die
jetzt beobachtete überraschende Erhöhung der Gesamtgehalte an schwefelhaltigen
Verbindungen sehr wahrscheinlich auf einer Überkompensationsreaktion der anderen
Kompartimente mit Cysteinsynthese in der Pflanzenzelle beruht.
Die für die Realisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Erhöhung des Gehalts an
schwefelhaltigen Verbindungen in Pflanzen erforderlichen Methoden und
molekularbiologischen Techniken sind dem Fachmann bestens bekannt, so kann er
beispielsweise Mutationen mittels kommerziell erhältlicher Mutagenese-Kits erzeugen. Die
relevanten Techniken kann der Fachmann auch aus dem Standardwerk von Sambrook et al.
(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, entnehmen.
Der Fachmann kann auch durch Einführung von Mutationen in das oben genannte
Aminosäuremotiv feststellen, welche Mutation, d. h. an welcher Position und welcher
Aminosäureaustausch (also i) welche Aminosäure und ii) zu welcher Aminosäure
ausgetauscht werden soll), welche Mutation gleichzeitig zu einer Inaktivierung des SAT-
Enzyms und einer Erhöhung des Gehalts an schwefelhaltigen Verbindungen in Pflanzenzellen
führt. Hierzu müssen die Mutationskonstrukte entweder auf Pflanzenzellen übertragen und die
Auswirkungen der Expression in Pflanzenzellen getestet oder die Enzymaktivität bzw. die
Fähigkeit zur Komplexbildung mit OAS-TL mittels der unten beschriebenen Methoden
getestet werden. Die Überprüfung, ob eine bestimmte Mutation zu der gewünschten
Inaktivierung des SAT-Enzyms führt, kann der Fachmann, wie den nachfolgenden Beispielen
zu entnehmen ist, auch auf einfache Weise durch Übertragung und Expression eines Plasmids,
enthaltend das mutierte SAT-Gen, in Bakterienstämmen, die eine SAT-Defizienz aufweisen,
durchführen.
Auch die diversen Methoden zur Übertragung von Genkonstrukten und Plasmiden auf
Pflanzen sind dem Fachmann bestens bekannt. Gleiches gilt für regulatorische Sequenzen, die
für die Expression von Genen in Pflanzen geeignet sind, wie z. B. konstitutive Promotoren,
gewebe- und entwicklungsspezifische Promotoren, induzierbare Promotoren, Enhancer-
Sequenzen und andere regulatorische Sequenzen, die die Transkription und Translation einer
mit einer Promotorregion operativ verknüpften kodierenden DNA-Sequenz in transformierten
Pflanzenzellen steuern.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen
eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.
coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für
derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewün
schte Sequenz, im vorliegenden Fall also ein mutiertes SAT-Gen kann an einer passenden
Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird dann
für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli-Zellen werden in
einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend geerntet und lysiert, und das Plasmid
wird wiedergewonnen. Als Analysenmethode zur Charakterisierung der gewonnenen
Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere
biochemisch-molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die
Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen
verknüpft werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von
Techniken zur Verfügung, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne
Schwierigkeiten ermitteln kann. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher
Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium
rhizogenes als Transformationsmedium, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die
Elektroporation, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Einbringung
von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten die bereits seit
mehreren Jahren gut etabliert sind und zum üblichen Repertoire des Fachmanns in der
pflanzlichen Molekularbiologie bzw. Pflanzenbiotechnologie gehören.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine
speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den
direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide, wie z. B. pUC-Derivate, verwendet
werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist
die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens empfehlenswert. Dem Fachmann sind die
gängigen Selektionsmarker bekannt, und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten
Marker auszuwählen.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-
Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti-
oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die
rechte und linke Begrenzung der im Ti- bzw. Ri-Plasmid enthaltenen T-DNA als
Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die
Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide
kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die
intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der
T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien
integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-
Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines
Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen
werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien
replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, welche
von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die
Agrobakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein
Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA
in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig
transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die
Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht
und ausreichend in allseits bekannten Übersichtsartikeln und Handbüchern zur
Pflanzentransformation beschrieben worden. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle
können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder
Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B.
Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte
Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide
zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert
werden.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der
Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle
erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten
Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin,
G 418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonylharnstoff,
Gentamycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollte
daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA
fehlt, gestatten. Hierzu sind auch alternative Marker geeignet, wie nutritive Marker,
Screeningmarker (wie GFP, green fluorescent protein). Selbstverständlich kann auch
vollkommen auf Selektionsmarker verzichtet werden, was allerdings mit einem ziemlich
hohen Screeningbedarf einhergeht. Falls markerfreie transgene Pflanzen erwünscht sind,
stehen dem Fachmann auch Strategien zur Verfügung, die eine nachträgliche Entfernung des
Markergens erlauben, z. B. Cotransformation, Sequenz-spezifische Rekombinasen.
Die Regeneration der transgenen Pflanzen aus transgenen Pflanzenzellen erfolgt nach
üblichen Regenerationsmethoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die so
erhaltenen Pflanzen können dann mittels üblicher Verfahren, einschließlich
molekularbiologischer Methoden, wie PCR, Blot-Analysen, auf Anwesenheit der
eingeführten Nukleinsäure, die eine enzymatisch inaktive SAT kodiert, untersucht werden.
Bei der transgenen Pflanze bzw. den transgenen Pflanzenzellen kann es sich um jede
beliebige monokotyle oder dikotyle Pflanze bzw. Pflanzenzelle handeln. Vorzugsweise
handelt es sich um Nutzpflanzen bzw. Zellen von Nutzpflanzen. Besonders bevorzugt handelt
es sich um Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Mais, Reis, Kartoffel, Sojabohne, Lupine, Erbse,
Ackerbohne. Insbesondere sind Angehörige der Leguminosen charakteristischerweise arm an
S-haltigen Aminosäuren und daher besonders geeignet für eine Erhöhung des Cysteingehalts.
Aufgrund gezielter Futtermischungen von Getreiden, Mais und Leguminosen bei der
Tierfütterung ist aber generell eine solche Verbesserung von Nutzen. Prinzipiell ist jede
Nutzpflanze für die Umsetzung der Erfindung erstrebenswert, die für Ernährungszwecke
geeignet ist. Dies ergibt sich auch den oben genannten Vorteilen erhöhter Gehalte an
Schwefel-haltigen Verbindungen in Pflanzen.
Ergänzend sei angemerkt, daß der verbesserte Nährwert durch erhöhte Thiolgehalte in
Pflanzen alle Pflanzenteile und -organe betrifft, die für die Nahrung von Mensch und Tier
Verwendung finden, also einschließlich Samen, Blätter, Knollen etc.); siehe z. B. Schnug
(1997) In Sulphur Metabolism in higher plants; Seiten 109-130, W. J. Cram et al., eds,
Backhuys Publ., Leiden, NL; Herbers and Sonnewald (1999) Curr. Opin. Biotechn. 10,
163-168; Tabe and Higgins (1998) TIBS 7, 282-286).
Da die Erhöhung des Gehalts an schwefelhaltigen Verbindungen auch der Pflanzengesundheit
dient, ist ohnehin jede Nutzpflanze von Interesse. Die Toleranz gegen biotischen und
ablotischen Streß wird vielfach durch Glutahion vermittelt, dessen unmittelbarer Vorläufer
Cystein ist; siehe z. B. im Zusammenhang mit der Resistenz gegenüber Pathogenen Bohlmann
H. (1993) In Sulfur Nutrition and Assimilation in Higher Plants, Seiten 211-219, De Kok et
al., eds, SPB Academic Publ., The Hague; im Zusammenhang mit der Resistenz gegenüber
Xenobiotika und Herbiziden Lamoureux and Rusness (1993) In Sulfur Nutrition and
Assimilation in Higher Plants, Seiten 221-237, De Kok et al., eds, SPB Academic Publ., The
Hague; im Zusammenhang mit Schwermetall-Resistenz Rauser (1993) In Sulfur Nutrition and
Assimilation in Higher Plants, Seiten 239-251, De Kok et al., eds, SPB Academic Publ., The
Hague; im Zusammenhang mit der Toleranz gegenüber gasförmigen Schadstoffen wie H2S,
SO2 Ernst (1993) In Sulfur Nutrition and Assimilation in Higher Plants, Seiten 295-314, De
Kok et al., eds, SPB Academic Publ., The Hague; und im Zusammenhang mit der Toleranz
gegenüber oxidativem Streß: Stulen and De Kok (1993) In Sulfur Nutrition and Assimilation
in Higher Plants, Seiten 125-138, De Kok et al., eds, SPB Academic Publ., The Hague;
Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial und Ernteprodukte der
erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke,
Sämlinge, Stecklinge usw.
Die Expression der inaktiven SAT in den Pflanzen bzw. Pflanzenzellen kann mit Hilfe
herkömmlicher molekularbiologischer und biochemischer Methoden nachgewiesen und
verfolgt werden. Dem Fachmann sind diese Techniken bekannt und er ist problemlos in der
Lage, eine geeignete Nachweismethode zu wählen, beispielsweise eine Northern-Blot-
Analyse zum Nachweis SAT-spezifischer RNA bzw. zur Bestimmung der Höhe der
Akkumulation von SAT-spezifischer RNA oder eine Southern-Blot-Analyse zur
Identifizierung von für SAT-kodierende DNA-Sequenzen.
Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen mit einem
gegenüber Wildtyp-Pflanzen erhöhten Gehalt an schwefelhaltigen Verbindungen, umfassend
die folgenden Schritte:
- a) die Übertragung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls oder Vektors, der eine DNA-Sequenz enthält, die für eine enzymatisch inaktive SAT kodiert, die in der Lage ist mit OAS-TL zu interagieren, auf Pflanzenzellen;
- b) die Regeneration von Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.
Die vorliegende Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen, die nur der
Veranschaulichung der Erfindung dienen und in keiner Weise als Einschränkung zu verstehen
sind, erläutert.
Klonierungsverfahren, wie z. B. Restriktionsspaltung, DNA-Isodierung, Agarose,
Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf
Nitrocellulose und Nylon-Membranen, verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation
von E. coli-Zellen, Anzucht von Bakterien, Sequenz-Analyse von rekombinanter DNA,
wurden nach Sambrook et al. (1989) vide supra, durchgeführt. Die Transformation von
Agrobacterium tumefaciens wurde entsprechend der Methode von Höfgen and Willmitzer
(Nucl. Acids Res. (1988) 16, 9877) ausgeführt. Die Anzucht der Agrobakterien erfolgte in
YEB-Medium (Vervliet et al. 1975 J. Gen. Virol. 26, 33).
E. coli (XL 1 Blue) Bakterien wurden von der Firma Stratagene, La Jolla, USA bezogen. Der
zur Pflanzentransformation eingesetzte Agrobakterienstamm (C58C1 mit dem Plasmid pGV
3850kan) wurde von Deblare et al. (1985, Nucl. Acids Res. 13, 4777) beschrieben. Zur
Klonierung wurde der Vektor Bin19 bzw. dessen Derivate pBinAR und pBinAR-TkTp
(Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12, 8711-8720) verwendet.
Zur Transformation von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN) wurden 10 ml
einer unter Selektion gewachsenen Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens
abzentrifugiert, der Überstand verworfen und die Bakterien im gleichen Volumen
Antibiotika-freien Mediums resuspendiert. In einer sterilen Petrischale wurden Blattscheiben
steriler Pflanzen (Durchmesser ca. 1 cm) in dieser Bakterienlösung gebadet. Anschließend
wurden die Blattscheiben in Petrischalen auf MS-Medium (Murashige and Skoog (1962)
Physiol. Plant 15, 473) mit 2% Saccharose und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach zweitägiger
Inkubation im Dunkeln bei 25°C wurden sie auf MS-Medium mit 100 mg/l Kanamycin, 500 mg/l
Claforan (Cefotaxim), 1 mg/l Benzylaminopurin (BAP), 0,2 mg/l Naphthylessigsäure
(NAA), 1,6% Glukose und 0,8% Bacto-Agar übertragen und die Kultivierung (16 Std. Licht /-
8 Std. Dunkelheit) fortgesetzt. Wachsende Sprosse wurden auf hormonfreies MS-Medium mit
2% Saccharose, 250 mg/l Claforan und 0,8% Bacto-Agar überführt.
Herstellung einer enzymatisch inaktiven Serin-Acetyltransferase (SAT) die noch zur
Interaktion mit OAS-TL befähigt ist.
Die im Stand der Technik hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz sowie der zugrundeliegenden
DNA-Sequenz beschriebene SAT-A aus Arabidopsis thaliana wurde durch gerichtete
Mutagenese der Aminosäure Histidin 309 zu Alanin inaktiviert (die Numerierung bezieht sich
auf das erste Methionin des offenen Leserahmens). Die gerichtete Mutagenese der
zugehörigen cDNA im Plasmid pBlueScript (Stratagene) erfolgte durch Basenpaaraustausch
nach einem kommerziell verfügbaren Verfahren der Firma Promega (Heidelberg,
Deutschland).
Die ortgerichtete Mutagenese der SAT-A cDNA wurde mit pBS/ΔSAT1-6 durchgeführt
(Bogdanova et al. (1995) FEBS Lett. 358, 43-47). Das eingesetzte Promega GeneEditor in
vitro Site Directed Mutagenesis System erzielte im Durchschnitt 80% positive Klone. Die
Punktmutationen wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert und die resultierenden
Aminosäureaustausche wurden in Bezug auf das Startkodon des längsten möglichen offenen
Leserahmens einer mitochondrialen SAT-A cDNA numeriert (cDNA SAT-1 (Roberts et al.
(1996) Plant Mol. Biol. 30, 1041-1049)).
Die Inaktivierung der SAT-Mutante durch den Aminosäureaustausch in Position 309 (Histidin
→ Alanin) wurde durch fehlende heterologe Komplementation einer SAT-freien E. coli-
Mutante und durch Enzymbestimmung in vitro (maximal 1% Restaktivität) belegt. Die
Interaktionsfähigkeit mit O-Acetylserin (Thiol) Lyase (OAL-TL) wurde durch heterologe
Expression in dem Hefe "two-hybrid"-System und Coexpression in E. coli mit nachfolgender
biochemischer Reinigung bewiesen.
Die Inaktivierung des cysE-Gens von E. coli zwecks Erzeugung einer SAT-freien E. coli
Mutante wurde nach der von Hamilton et al. beschriebenen Methode durchgeführt (Hamilton
(1989) J. Bacteriol. 171, 4617-4622). Hierdurch sollte ein Bakterienstamm bereitgestellt
werden, der bezüglich seiner SAT-Defizienz stabiler ist als die im Stand der Technik
gegenwärtig erhältlichen. Hierzu wurde das Wildtyp cysE-Gen mittels PCR kloniert und
durch Insertion einer Gentamycin-Resistenz-Kassette in eine ClaI-Restriktionsschnittstelle bei
Position 522, bezogen auf das Startcodon des cysE-Gens, inaktiviert. Nach Klonierung dieser
Cassette in das Plasmid pMAK705, welches einen Temperatursensitiven
Replikationsursprung trägt, wurde das inaktivierte cysE-Gen in das Genom von E. coli C600
via homologe Rekombination integriert, um den Stamm MW 1 zu ergeben (thr, leu, 114 lac, λ-
P1 + F', cysE, Gmr). Komplementationstests unter Einsatz der E. coli-Stämme EC1801 (E.
coli Genetik Stock Center, Yale University, New Haven, CT, USA) oder MW1 wurden auf
M9-Minimalmedium-Agarplatten mit oder ohne Cystein unter Zugabe von Induktionsmittel
und selektiven Antibiotika durchgeführt.
Die Konstrukte für die Expression der mitochondrialen SAT-A aus Arabidopsis thaliana
umfaßten pBS/ΔSAT1-6 (X82888 (Bogdanova et al. (1985) vide supra)), pET/ΔSAT1-6
sowie mutierte Formen der SAT-A. Um das zuletzt genannte Plasmid zu erhalten, wurde die
kodierende Region der SAT-A mittels PCR von Basenpaar 28-939 ohne mitochondriales
Transitpeptid unter Einsatz spezifischer Primer, flankiert von EcoRI- und XhoI-Schnittstellen,
amplifiziert. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pCAP (Roche, Mannheim, Deutschland)
kloniert, die Sequenz mittels Sequenzierung beider Stränge verifiziert und in die
entsprechenden Schnittstellen von pET29a (Novagen, Madison, USA) eingefügt, was in
einem Fusionsprotein mit den 35 Aminosäuren des S-Tag an seinem N-Terminus für
Affinitätsreinigung an S-Agarose resultierte. Mitochondriale OAS-TL aus A. thaliana wurde
in ähnlicher Weise durch Klonierung eines PCR-Produkts, welches das reife Protein ohne das
mitochondriale Transitpeptid von Basenpaar 172-1162 (AJ271727 (Hesse et al. (1999)
Amino Acids 16, 113-131) umfaßte, in die NcoI-BamHI-Schnittstellen von pET3d, was
pET/OAS-C ergab, exprimiert.
Die Expression, Kultivierung und Affinitätsreinigung von SAT und OAS-TL unter Einsatz
des S-tag-Systems (Novagen) wurden im wesentlichen wie von Droux et al. (1998, Eur. J.
Biochem. 255, 235-245) beschrieben, durchgeführt, mit den folgenden Modifikationen. Nach
dem letzten Waschschritt wurde der S-tag nicht durch proteolytische Spaltung an der
Affinitätssäule entfernt, da diese Behandlung in Fraktionen mit labiler SAT-Aktivität
resultierte. Statt dessen wurde SAT mit 3 M MgCl2 eluiert, welches anschließend durch
Gelfiltration an PD 10-Säulen (Amerschan, Freiburg, Deutschland) entfernt wurde. In vitro
Interaktion von SAT und OAS-TL an der Säule wurde in einem Standardwasch- und
Elutionsprotokoll mit oder ohne 1 mM OAS (O-Acetylserin) bestimmt, wie beschrieben von
Droux et al. (1998, vide supra).
Die Bestimmung der Proteinkonzentration und die Auftrennung von Proteinen wurden nach
Standardprotokollen (z. B. Sambrook et al. (1989) vide supra) durchgeführt.
Die SAT-Enzymaktivität mit und ohne OAS-TL wurde in einem Standard-Assay auf der
Grundlage der Methode von Kredich and Becker (1971, In Methods in Enzymology (Tabor
and Tabor, eds), Seiten 459-469, Academic Press, New York, USA) bestimmt. Roh- oder
gereinigtes rekombinantes SAT-Protein wurde in einem Volumen von 250 µl (50 mM
Tris/HCl, pH 7,5, 0,2 mM Acetyl-CoA, 2 mM Dithiothreitol, 5 mM Serin) bei 25°C inkubiert
und A232 wurde für bis zu 3 Min. aufgenommen.
Die OAS-TL-Aktivität wurde unter gesättigten Bedingungen wie zuvor beschrieben
untersucht (Nakamura et al. (1987) Plant Cell Physiol. 28, 885-891). Kinetische Analysen
wurden mit der SigmaPlot-Software durchgeführt, welche hyperbolische Anpassungen auf der
Grundlage der Michaelis-Menten-Gleichung erlaubte: ν = Vmaxx[S])/(Km + [S]).
Für die Interaktionsanalysen unter Einsatz des Hefe "two-hybrid"-Systems wurden die
Transformation der Hefestämme HF7c und PCY2, die Selektion auf Minimalmedium und β-
Galaktosidase-Assays durchgeführt wie bereits beschrieben (Bogdanova and Hell (1997)
Plant J. 11, 251-262). PCR mit spezifischen Primerpaaren, flankiert von SalI- bzw. SpeI-
Schnittstellen, wurde für sämtliche Konstrukte eingesetzt, um die kodierenden Regionen in
die entsprechenden Restriktionsschnittstellen von pPC86 (GAL4-Aktivierungsdomäne) und
pPC97 (GAL4-DNA-Bindungsdomäne) einzufügen (Chevray and Nathans (1992) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89, 5789-5793). EST 181H17T7 (GenBank Accession Number AJ2711727)
wurde als Template eingesetzt, um OAS-TL C ohne mitochondriales Transitpeptid von
Basenpaar 172-1162 zu erzeugen. Im Unterschied zu den bisher eingesetzten full length-
Konstukt (Bogdanova et al. (1997) vide supra) wurden die pPC-Vektoren mit mitochondrialer
SAT-A ohne mitochondriales Transitpeptid durch Amplifizierung von Basenpaar 28-939
konstruiert (X82888 (Bogdanova et al. (1995) vide supra).
Die cDNA der SAT-Mutante wurde in den binären Transformationsvektor pBin-AR (Höfgen
und Willmitzer (1990) Plant Sci. 66, 221; pBin19-Ursprung) bzw. in dessen Derivat pBinAR-
TkTp (R. Badur, Dissertation, Universität Göttingen, 1998) kloniert. Als Promotor wurde der
35S RNA-Promotor des Cauliflower Mosaik Virus (CaMV) verwendet. Als Terminations
signal diente das 3'-Ende des Octopin-Synthasegens.
Der Eintransport in Chloroplasten wurde durch Fusion der SAT-Mutante mit dem Plastiden-
Importpeptid der plastidären Transketolase aus Tabak in pBinAr-TkTp erreicht. Die
Lokalisierung in Cytosol erfolgte mit pBinAR unter Weglassung des Abschnitts für das
Importpeptid.
Die Klonierungen erfolgten jeweils in die vorgegebenen BamHI- bzw. SaII-
Restriktionsschnittstellen der genannten Vektoren pBIN-AR und pBINAr-TkTp. Die cDNA
der SAT-Mutante wurde jeweils mit den Oligonukleotid-Primern SAT208 und SAT209 mit 5'
gelegenen zusätzlichen BamHI- bzw. SaII-Restriktionsschnittstellen durch Standard-PCR
amplifiziert.
Beispiel für Standard PCR: Reaktionsvolumen 50 µl mit 20 µmol jedes Primers, 1-10 ng
Plasmid, Puffer des Herstellers, 1 U Taq-Polymerase (Promega). Abfolge: 5 Min. bei 94°C,
dann 30 Zyklen zu 30 Sek. bei 94°C, 60 Sek. bei 55°C, 30 Sek. bei 72°C, gefolgt von 10 Min.
bei 72°C.
SAT208: 5'-GGA TCC CAT GAA CTA CTT CCG TTA TC-3'
SAT209: 5'-GTC GAC TCA AAT TAC ATA ATC CGA C-3'
Cystein-, Glutathion- und Methioningehalte wurden in Blättern von mindestens drei
unabhängigen transgenen Tabakpflanzen der ersten und zweiten Generation nach
Transformation bestimmt. Im Vergleich zu nicht transformierten Kontrollpflanzen wurden bei
cytosolischer dominant-negativer Überexpression bis zu 8× mehr Cystein und 2× mehr
Glutathion gefunden. Bei entsprechender plastidärer Überexpression der SAT-Mutante
wurden bis zu 25× mehr Cystein und 8× mehr Glutathion gemessen. Bei plastidärer
Überexpression erhöht sich der Methioningehalt bis zu 2×.
Die Extraktion, Trennung und Quantifizierung von Cystein und Glutathion erfolgte wie
beschrieben (Hell und Bergmann (1990) Planta 180, 603-612). Die Bestimmung von
Methionin erfolgte nach einem kommerziellen Verfahren (Firma Waters, Eschborn) wie
beschrieben (Giordano et al. (2000) Plant Physiol. 124, 857-864).
Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigten eindeutig, daß die Arabidopsis thaliana SAT-
Mutante mit einem Aminosäureaustausch in Position 309 keine enzymatische SAT-Aktivität
mehr aufweist, dennoch aber zur Komplexbildung, also zur Interaktion mit OAS-TL in der
Lage ist. Die Expression dieser Mutante führte zu einer überraschenden Erhöhung des Gehalts
an Schwefelverbindungen, insbesondere an Cystein, Glutathion und Methionin, in transgenen
Pflanzen.
Abb. 1 zeigt ein Aminosäure-Alignment verschiedener Serinacetyltransferasen.
Abb. 2 zeigt den Einfluß der Überexpression der SAT A-Mutante H309A auf die
Cystein-Bildung.
Claims (11)
1. Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an Schwefel-haltigen Verbindungen wie
Cystein in Pflanzen durch Übertragung und Expression von DNA-Sequenzen, die für eine
Serin-Acetyltransferase kodieren, in Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Serin-
Acetyltransferase enzymatisch inaktiv ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Serin-Acetyltransferase zur Interaktion mit
O-Acetylserin (Thiol) Lyase fähig ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Serin-Acetyltransferase aufgrund
einer Mutation innerhalb des Aminosäuresequenzmotivs G K X X G D R H P K I G D
(X steht für eine beliebige Aminosäure) enzymatisch inaktiv ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Mutation das Kernmotiv D R H betriff.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Mutation das Histidin innerhalb des
Motivs betrifft.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Serin-Acetyltransferase aufgrund der
Bindung und Inhibition durch einen Liganden oder ein Protein oder einen Antikörper
enzymatisch inaktiv ist.
7. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend einen in Pflanzenzellen aktiven
Promotor in operativer Verknüpfung mit einer DNA-Sequenz, die für eine enzymatisch
inaktive Serin-Acetyltransferase kodiert, wobei die enzymatische Inaktivität durch eine
Mutation in dem Aminosäuresequenzmotiv G K X X G D R H P K I G D (X steht für
eine beliebige Aminosäure) bedingt ist.
8. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 7, wobei die Mutation in dem
Kernmotiv D R H liegt.
9. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Mutation
das Histidin betrifft.
10. Verfahren zur Erzeugung von Pfanzen mit einem gegenüber Wildtyppflanzen
erhöhten Gehalt an Schwefel-haltigen Verbindungen wie Cystein, umfassend die folgenden
Schritte:
- - die Übertragung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls oder Vektors, der eine DNA-Sequenz enthält, die für eine enzymatisch inaktive Serin-Acetyltransferase kodiert, die in der Lage ist mit O-Acetylserin (Thiol) Lyase zu interagieren, auf Pflanzenzellen;
- - die Regeneration von Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.
11. Transgene Pflanzen, hergestellt in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1
bis 6 oder 10 oder enthaltend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach einem der
Ansprüche 7 bis 9, sowie Teile dieser Pflanzen, transgene Ernteprodukte und transgenes
Vermehrungsmaterial dieser Pflanzen wie Pflanzenzellen, Protoplasten, Kalli, Samen,
Knollen, Stecklinge sowie die transgenen Nachkommen dieser Pflanzen.
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Patent Citations (1)
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