CN107849554B - 新的蛋白质、基因、表达载体、转化体、生产转化体的方法和筛选新的荧光蛋白质的方法 - Google Patents

新的蛋白质、基因、表达载体、转化体、生产转化体的方法和筛选新的荧光蛋白质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种新的荧光蛋白质。本发明的新的蛋白质的特征在于它是下述蛋白质(F1)。(F1)：包含由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列的蛋白质，其中，在所述由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列中，位于第52位的氨基酸残基Xaa52是任意氨基酸残基，位于第133位的氨基酸残基Xaa133是任意氨基酸残基，并且位于第154位的氨基酸残基Xaa154是任意氨基酸残基。

Description

新的蛋白质、基因、表达载体、转化体、生产转化体的方法和筛 选新的荧光蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及新的蛋白质、新的基因、表达载体、转化体、生产转化体的方法和筛选新的荧光蛋白质的方法。
背景技术
绿色荧光蛋白质(GFP)、黄色荧光蛋白质(YFP)等通常被用作荧光蛋白质(非专利文献1)。所述荧光蛋白质用于各种不同目的，例如研究，然而，对于每种目的来说，并不总是存在适合的荧光蛋白质。因此，对新的荧光蛋白质存在着需求。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Chalfie M等，作为基因表达的标志物的绿色荧光蛋白质(Greenfluorescent protein as a marker for gene expression)， Science,February 1994,Vol.263,no.5148,p802-805。
发明内容
本发明待解决的问题
因此，本发明旨在提供新的荧光蛋白质。
解决问题的手段
本发明提供了一种新的蛋白质，其包括下述蛋白质(F1)：
(F1)由SEQ ID NO：1的氨基酸序列构成的蛋白质，其中：
在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中，
第52位氨基酸Xaa52是任意氨基酸，
第133位氨基酸Xaa133是任意氨基酸，并且
第154位氨基酸Xaa154是任意氨基酸。
本发明提供了一种新的基因，其包括下述多核苷酸(f1)：
(f1)由SEQ ID NO：14的碱基序列构成的多核苷酸，其中：
在SEQ ID NO：14的碱基序列中，
第154位碱基N154、第155位碱基N155和第156位碱基N156形成编码任意氨基酸的密码子，
第397位碱基N397、第398位碱基N398和第399位碱基N399形成编码任意氨基酸的密码子，并且
第460位碱基N460、第461位碱基N461和第462位碱基N462形成编码任意氨基酸的密码子。
本发明提供了一种表达载体，其包含本发明的新的基因。
本发明提供了一种转化体，其包含本发明的新的基因。
本发明提供了一种生产转化体的方法，所述方法包括下述步骤：
将本发明的新的基因转染到宿主。
本发明提供了一种筛选新的荧光蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤：
从通过向本发明的新的蛋白质引入突变而获得的候选蛋白质中，选择其中在SEQID NO：1的氨基酸序列中对应于第52位氨基酸Xaa52的氨基酸、对应于第133位氨基酸Xaa133的氨基酸和对应于第154位氨基酸Xaa154的氨基酸各自是任意氨基酸的具有荧光活性的蛋白质。
本发明的效果
根据本发明，可以提供荧光蛋白质。
附图说明
[图1A]图1A示出的图显示了实施例1中在不同激发波长和荧光波长下的荧光强度。
[图1B]图1B示出的图显示了实施例1中在不同激发波长和荧光波长下的荧光强度。
[图2A]图2A示出的图显示了实施例3中在不同激发波长和荧光波长下的荧光强度。
[图2B]图2B示出的图显示了实施例3中在不同激发波长和荧光波长下的荧光强度。
[图2C]图2C示出的图显示了实施例3中在不同激发波长和荧光波长下的荧光强度。
[图3A]图3A示出的图显示了实施例3中在不同激发波长和荧光波长下的荧光强度。
[图3B]图3B示出的图显示了实施例3中在不同激发波长和荧光波长下的荧光强度。
[图3C]图3C示出的图显示了实施例3中在不同激发波长和荧光波长下的荧光强度。
[图3D]图3D示出的图显示了实施例3中在不同激发波长和荧光波长下的荧光强度。
[图4]图4示出的图显示了实施例4中在不同激发波长和荧光波长下的荧光强度。
[图5]图5示出的图各自显示了实施例5中每种蛋白质表达癌细胞的荧光强度。
示例性实施方式的描述
<新的蛋白质>
如上所述，本发明的新的蛋白质是选自下述蛋白质(F1)至(F3) 的至少一者：
(F1)由SEQ ID NO：1的氨基酸序列构成的蛋白质，
在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中，
第52位氨基酸Xaa52是任意氨基酸，
第133位氨基酸Xaa133是任意氨基酸，并且
第154位氨基酸Xaa154是任意氨基酸；
(F2)具有荧光活性并且由通过在蛋白质(F1)的除了第52位氨基酸Xaa52、第133位氨基酸Xaa133和第154位氨基酸Xaa154之外的氨基酸序列中缺失、替换、插入和/或添加一个至几个氨基酸而获得的氨基酸序列构成的蛋白质；以及
(F3)具有荧光活性并且由与蛋白质(F1)的除了第52位氨基酸 Xaa52、第133位氨基酸Xaa133和第154位氨基酸Xaa154之外的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列构成的蛋白质。
本发明的发明人进行了最认真的研究并发现，在包括SEQ ID NO： 1的氨基酸序列的蛋白质中，第52位氨基酸、第133位氨基酸和第154 位氨基酸与所述蛋白质的荧光活性相关。具体来说，估计所述蛋白质中的第52位氨基酸、第133位氨基酸和第154位氨基酸与例如所述蛋白质的发色团相互作用。因此，本发明的第52位氨基酸、第133位氨基酸和第154位氨基酸是任意氨基酸的新的蛋白质可以调节其荧光活性。例如，可以获得即使在使用具有相对低波长的激发光(例如紫外光(在后文中同样适用))时也显示出较强荧光的蛋白质和在使用相同强度的激发光激发下显示出较强荧光的蛋白质。然而，上述估计不以任何方式限制本发明。
在后文中，所述新的蛋白质也可以被称为新的荧光蛋白质。所述新的荧光蛋白质是由本发明的发明人新生产的蛋白质。例如，在本发明中，所述新的荧光蛋白质可以包括一种类型的蛋白质或两种或更多种类型的蛋白质(在后文中同样适用)。
蛋白质(F1)中的SEQ ID NO：1的氨基酸序列如下所述。在下述氨基酸序列中，三个带框氨基酸中的第一个氨基酸(X)是对应于 Xaa52的氨基酸，三个带框氨基酸中的第二个氨基酸(X)是对应于Xaa133的氨基酸，并且三个带框氨基酸中的第三个氨基酸(X)是对应于Xaa154的氨基酸。此外，在下述氨基酸序列中，两个带下划线氨基酸中的第一个氨基酸是对应于Xaa198的氨基酸，并且两个带下划线氨基酸中的第二个氨基酸是对应于Xaa205的氨基酸。
(F1)的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)
Figure BDA0001512135050000054
在蛋白质(F1)中，Xaa52是任意氨基酸。所述任意氨基酸是A、 C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或 Y，优选为C、F、H、K、M或T，更优选为C、M或T，因为它例如即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出较强荧光。在蛋白质 (F1)中，Xaa52更优选为H，因为它例如在使用相同强度的激发光激发下显示出较强荧光。
在蛋白质(F1)中，Xaa133是任意氨基酸。所述任意氨基酸是A、 C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或 Y，优选为L、Q、S或T。在蛋白质(F1)中，Xaa133更优选为T，因为它例如在使用相同强度的激发光激发下显示出较强荧光。
在蛋白质(F1)中，Xaa154是任意氨基酸。所述任意氨基酸是A、 C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或 Y，优选为A、H、I、K、L、Q、V或Y，更优选为A、I、L、V或Y，因为它例如即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出较强荧光。在蛋白质(F1)中，Xaa154更优选为K，因为它例如在使用相同强度的激发光激发下显示出较强荧光。
在蛋白质(F1)中，Xaa52、Xaa133和Xaa154的组合不限于特定组合，并且可以例如如下所述：
Xaa52是例如C、F、H、K、M或T，
Xaa133是例如L、Q、S或T，并且
Xaa154是例如A、H、I、K、L、Q、V或Y。
在蛋白质(F1)中，Xaa52、Xaa133和Xaa154的组合优选如下所述，因为它例如即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出较强荧光：
Xaa52是例如C、M或T，
Xaa133是例如L、Q、S或T，并且
Xaa154是例如A、I、L、V或Y。
在下面的描述中，在蛋白质(F1)以这种组合包括Xaa52、Xaa133和Xaa154的情况下，蛋白质(F1)也被称为蛋白质(B1)，并且当蛋白质(F1)是蛋白质(B1)时，蛋白质(F2)和(F3)也被称为蛋白质(B2)和(B3)。在下面的描述中，例如对于蛋白质(B2)和(B3) 来说，通过分别用(B1)替代(F1)、用(B2)替代(F2)和用(B3) 替代(F3)，也可以参考对于蛋白质(F2)和(F3)的描述。
作为特定实例，在本发明的新的蛋白质中，Xaa52、Xaa133和Xaa154的组合是例如下述组合(aa1)至(aa12)之一。在本发明的新的蛋白质中，Xaa52、Xaa133和Xaa154的组合优选为组合(aa1)、(aa3)、(aa6)、 (aa9)、(aa10)或(aa12)，更优选为组合(aa1)或(aa9)，因为它例如即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出较强荧光。在本发明的新的蛋白质中，Xaa52、Xaa133和Xaa154的组合优选为组合 (aa2)，因为它例如在使用相同强度的激发光激发下显示出较强荧光。本发明的新的蛋白质是除了例如其中Xaa52、Xaa133和Xaa154分别是H、 S和R的蛋白质和其中Xaa52、Xaa133和Xaa154分别是D、S和R的蛋白质之外的蛋白质。
[表1]
Xaa<sub>52</sub> Xaa<sub>133</sub> Xaa<sub>154</sub>
(aa1) T S Y
(aa2) H T K
(aa3) C L L
(aa4) C S H
(aa5) T S H
(aa6) M L V
(aa7) F S Q
(aa8) K T A
(aa9) C Q L
(aa10) T T I
(aa11) K S Q
(aa12) M L A
在本发明的新的蛋白质中，Xaa205优选被I替换，因为它例如即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出较强荧光。在本发明的新的蛋白质中，Xaa198优选被L或H替换，因为它例如即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出较强荧光。在所述新的蛋白质中，估计第198位和第205位氨基酸与例如所述蛋白质的发色团相互作用。因此，估计通过进行上面描述的第198位和第205位氨基酸之一的替换，获得即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出较强荧光的蛋白质。然而，上述估计不以任何方式限制本发明。在本发明的新的蛋白质中，Xaa198和Xaa205更优选地分别为L和I，或者分别为H和I，因为它例如即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出远远更强的荧光。
蛋白质(F1)可以是例如由选自例如SEQ ID NO：2至13、34至 67的至少一个氨基酸序列构成的蛋白质。在蛋白质(F1)是由选自SEQ ID NO：2至13和34至67的至少一个氨基酸序列构成的蛋白质的情况下，蛋白质(F1)也被称为蛋白质(F1-1)至(F1-46)之一，蛋白质(F2)也被称为蛋白质(F2-1)至(F2-46)之一，并且蛋白质(F3) 也被称为蛋白质(F3-1)至(F3-46)之一。
蛋白质(B1)可以是由选自例如SEQ ID NO：2、4、7、10、11、 13和34至67的至少一个氨基酸序列构成的蛋白质。对于由上述氨基酸序列中的至少一者构成的蛋白质(B1)来说，可以参考对于由上述氨基酸序列中的至少一者构成的蛋白质(F1)的描述。
蛋白质(F1)的SEQ ID NO：2至13和34至67的氨基酸序列如下所述。SEQ ID NO：2至13的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO：1 的氨基酸序列中Xaa52、Xaa133和Xaa154的组合(aa1)至(aa12)。SEQ ID NO：34至48的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中Xaa52、Xaa133和Xaa154的组合(aa1)。SEQ ID NO：49至67的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中Xaa52、Xaa133和Xaa154的组合(aa9)。
(F1-1)的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)
Figure BDA0001512135050000081
(F1-2)的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)
Figure BDA0001512135050000082
Figure BDA0001512135050000091
(F1-3)的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)
Figure BDA0001512135050000092
(F1-4)的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)
Figure BDA0001512135050000093
(F1-5)的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)
Figure BDA0001512135050000094
(F1-6)的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)
Figure BDA0001512135050000095
(F1-7)的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)
Figure BDA0001512135050000101
(F1-8)的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)
Figure BDA0001512135050000102
(F1-9)的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)
Figure BDA0001512135050000103
(F1-10)的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)
Figure BDA0001512135050000104
(F1-11)的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)
Figure BDA0001512135050000111
(F1-12)的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)
Figure BDA0001512135050000112
(F1-13)的氨基酸序列(SEQ ID NO：34)
Figure BDA0001512135050000113
(F1-14)的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)
Figure BDA0001512135050000114
(F1-15)的氨基酸序列(SEQ ID NO：36)
Figure BDA0001512135050000115
Figure BDA0001512135050000121
(F1-16)的氨基酸序列(SEQ ID NO：37)
Figure BDA0001512135050000122
(F1-17)的氨基酸序列(SEQ ID NO：38)
Figure BDA0001512135050000123
(F1-18)的氨基酸序列(SEQ ID NO：39)
Figure BDA0001512135050000124
(F1-19)的氨基酸序列(SEQ ID NO：40)
Figure BDA0001512135050000125
Figure BDA0001512135050000131
(F1-20)的氨基酸序列(SEQ ID NO：41)
Figure BDA0001512135050000132
(F1-21)的氨基酸序列(SEQ ID NO：42)
Figure BDA0001512135050000133
(F1-22)的氨基酸序列(SEQ ID NO：43)
Figure BDA0001512135050000134
(F1-23)的氨基酸序列(SEQ ID NO：44)
Figure BDA0001512135050000135
(F1-24)的氨基酸序列(SEQ ID NO：45)
Figure BDA0001512135050000141
(F1-25)的氨基酸序列(SEQ ID NO：46)
Figure BDA0001512135050000142
(F1-26)的氨基酸序列(SEQ ID NO：47)
Figure BDA0001512135050000143
(F1-27)的氨基酸序列(SEQ ID NO：48)
Figure BDA0001512135050000144
(F1-28)的氨基酸序列(SEQ ID NO：49)
Figure BDA0001512135050000145
Figure BDA0001512135050000151
(F1-29)的氨基酸序列(SEQ ID NO：50)
Figure BDA0001512135050000152
(F1-30)的氨基酸序列(SEQ ID NO：51)
Figure BDA0001512135050000153
(F1-31)的氨基酸序列(SEQ ID NO：52)
Figure BDA0001512135050000154
(F1-32)的氨基酸序列(SEQ ID NO：53)
Figure BDA0001512135050000155
Figure BDA0001512135050000161
(F1-33)的氨基酸序列(SEQ ID NO：54)
Figure BDA0001512135050000162
(F1-34)的氨基酸序列(SEQ ID NO：55)
Figure BDA0001512135050000163
(F1-35)的氨基酸序列(SEQ ID NO：56)
Figure BDA0001512135050000164
(F1-36)的氨基酸序列(SEQ ID NO：57)
Figure BDA0001512135050000165
(F1-37)的氨基酸序列(SEQ ID NO：58)
Figure BDA0001512135050000171
(F1-38)的氨基酸序列(SEQ ID NO：59)
Figure BDA0001512135050000172
(F1-39)的氨基酸序列(SEQ ID NO：60)
Figure BDA0001512135050000173
(F1-40)的氨基酸序列(SEQ ID NO：61)
Figure BDA0001512135050000174
(F1-41)的氨基酸序列(SEQ ID NO：62)
Figure BDA0001512135050000181
(F1-42)的氨基酸序列(SEQ ID NO：63)
Figure BDA0001512135050000182
(F1-43)的氨基酸序列(SEQ ID NO：64)
Figure BDA0001512135050000183
(F1-44)的氨基酸序列(SEQ ID NO：65)
Figure BDA0001512135050000184
(F1-45)的氨基酸序列(SEQ ID NO：66)
Figure BDA0001512135050000185
Figure BDA0001512135050000191
(F1-46)的氨基酸序列(SEQ ID NO：67)
Figure BDA0001512135050000192
可以说，蛋白质(F2)是例如具有荧光活性并且由通过在蛋白质(F1)的氨基酸序列中缺失、替换、插入和/或添加一个至几个氨基酸而获得的氨基酸序列构成的蛋白质，其中Xaa52、Xaa133和Xaa154得以保留。在蛋白质(F2)中，“一个至几个”可以是例如蛋白质(F2) 在其中具有荧光活性的范围。在蛋白质(F2)的氨基酸序列中，“一个至几个”是例如1至43、1至33、1至22、1至11、1至9、1至7、 1至5、1至3、1或2个。在本发明中，例如，关于碱基数目的数值范围公开了落于该范围内的所有正整数。也就是说，例如，描述“1至5 个碱基”公开了“1、2、3、4和5个碱基”的所有情况(在后文中同样适用)。当蛋白质(F1)中的Xaa205被I替换时，蛋白质(F2)优选为其中蛋白质(F1)的Xaa205得以保留的蛋白质。在这种情况下，蛋白质(F2)可以是例如具有荧光活性并且由通过在蛋白质(F1)的氨基酸序列中缺失、替换、插入和/或添加一个至几个氨基酸而获得的氨基酸序列构成的蛋白质，其中Xaa52、Xaa133、Xaa154和Xaa205得以保留。当蛋白质(F1)中的Xaa198被L或H替换时，蛋白质(F2)优选为其中蛋白质(F1)的Xaa198得以保留的蛋白质。在这种情况下，蛋白质(F2)可以是例如具有荧光活性并且由通过在蛋白质(F1)的氨基酸序列中缺失、替换、插入和/或添加一个至几个氨基酸而获得的氨基酸序列构成的蛋白质，其中Xaa52、Xaa133、Xaa154和Xaa198得以保留。当蛋白质(F1)中的Xaa198和Xaa205分别被L和I或H和I替换时，蛋白质(F2)优选为其中蛋白质(F1)的Xaa198和Xaa205得以保留的蛋白质。在这种情况下，蛋白质(F2)可以是例如具有荧光活性并且由通过在蛋白质(F1)的氨基酸序列中缺失、替换、插入和/或添加一个至几个氨基酸而获得的氨基酸序列构成的蛋白质，其中Xaa52、 Xaa133、Xaa154、Xaa198和Xaa205得以保留。对于“一个至几个”来说，可以参考上面的描述。
可以说，蛋白质(F3)可以是具有荧光活性并且由与蛋白质(F1) 具有至少80％同一性的氨基酸序列构成的蛋白质，其中Xaa52、Xaa133和Xaa154得以保留。在蛋白质(F3)中，“同一性”可以是例如蛋白质(F3)在其中具有荧光活性的范围。在蛋白质(F3)的氨基酸序列中，“同一性”是例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。所述“同一性”可以使用分析软件例如BLAST或FASTA，使用例如缺省参数来计算(在后文中同样适用)。当蛋白质(F1)中的Xaa205被I替换时，蛋白质(F3) 优选为其中蛋白质(F1)的Xaa205得以保留的蛋白质。在这种情况下，蛋白质(F3)可以是例如具有荧光活性并且由与蛋白质(F1)的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列构成的蛋白质，其中Xaa52、 Xaa133、Xaa154和Xaa205得以保留。当蛋白质(F1)中的Xaa198被L或 H替换时，蛋白质(F3)优选为其中蛋白质(F1)的Xaa198得以保留的蛋白质。在这种情况下，蛋白质(F3)可以是例如具有荧光活性并且由与蛋白质(F1)的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列构成的蛋白质，其中Xaa52、Xaa133、Xaa154和Xaa198得以保留。当蛋白质(F1)中的Xaa198和Xaa205分别被L和I或H和I替换时，蛋白质(F3)优选为其中蛋白质(F1)的Xaa198和Xaa205得以保留的蛋白质。在这种情况下，蛋白质(F3)可以是例如具有荧光活性并且由与蛋白质(F1)的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列构成的蛋白质，其中Xaa52、Xaa133、Xaa154、Xaa198和Xaa205得以保留。对于“同一性”来说，可以参考上面的描述。
本发明的新的荧光蛋白质具有例如下面描述的化学性质。下面描述的激发波长、最大激发波长、荧光波长和最大荧光波长是例如在350 至650nm的波长范围内的化学性质。
激发波长：350至650nm
最大激发波长：386至514nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：506至524nm
当本发明的新的荧光蛋白质是蛋白质(F1-1)至(F1-46)之一时，蛋白质(F1-1)至(F1-46)具有例如下述化学性质。当在蛋白质(F1-1) 至(F1-46)中在激发波长或荧光波长中荧光强度存在两个或更多个最大值时，描述最大激发波长和最大荧光波长的两个或更多个数值范围。 (F1-1)
激发波长：350至560nm
最大激发波长：396至404nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-2)
激发波长：350至600nm
最大激发波长：501至509nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-3)
激发波长：350至620nm
最大激发波长：396至404nm，506至514nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：516至524nm
(F1-4)
激发波长：350至625nm
最大激发波长：496至504nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-5)
激发波长：350至615nm
最大激发波长：501至509nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-6)
激发波长：350至625nm
最大激发波长：391至399nm，506至514nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：516至524nm
(F1-7)
激发波长：350至625nm
最大激发波长：476至484nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：506至514nm
(F1-8)
激发波长：350至605nm
最大激发波长：496至504nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-9)
激发波长：350至615nm
最大激发波长：401至409nm，496至504nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-10)
激发波长：350至590nm
最大激发波长：391至399nm，506至514nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：516至524nm
(F1-11)
激发波长：350至575nm
最大激发波长：476至484nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：506至514nm
(F1-12)
激发波长：350至595nm
最大激发波长：386至394nm，506至514nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：516至524nm
(F1-13)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：396至404nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-14)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：401至409nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-15)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：396至404nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-16)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：391至399nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-17)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：396至404nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-18)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：396至404nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-19)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：396至404nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-20)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：391至399nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-21)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：391至399nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-22)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：396至404nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-23)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：391至399nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-24)
激发波长：350至645nm
最大激发波长：396至404nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-25)
激发波长：350至580nm
最大激发波长：396至404nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-26)
激发波长：350至560nm
最大激发波长：396至404nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-27)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：391至399nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-28)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：401至409nm，496至504nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-29)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：401至409nm，496至504nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-30)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：401至409nm，496至504nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-31)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：401至409nm，496至504nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-32)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：401至409nm，496至504nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-33)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：401至409nm，496至504nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-34)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：401至409nm，496至504nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-35)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：406至414nm，496至504nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-36)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：401至409nm，501至509nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-37)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：401至409nm，496至504nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-38)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：401至409nm，496至504nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-39)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：416至424nm，496至504nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-40)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：401至409nm，496至504nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-41)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：401至409nm，496至504nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-42)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：416至424nm，496至504nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-43)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：421至429nm，501至509nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-44)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：401至409nm，496至504nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-45)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：401至409nm，496至504nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
(F1-46)
激发波长：350至650nm
最大激发波长：401至409nm，496至504nm
荧光波长：350至650nm
最大荧光波长：511至519nm
测量激发波长、最大激发波长、荧光波长和最大荧光波长的方法不限于特定方法，并且每种波长可以例如按照JIS K0120测量。例如，激发波长、最大激发波长、荧光波长和最大荧光波长可以按照实施例1 中描述的方法来测量。
所述新的荧光蛋白质只需要荧光活性。例如，除了荧光活性之外，所述新的荧光蛋白质也可以具有其他活性。
<新的基因>
本发明的新的基因具有选自如下所述的(f1)至(f7)的至少一个多核苷酸：
(f1)由SEQ ID NO：14的碱基序列构成的多核苷酸，其中
在SEQ ID NO：14的碱基序列中，
第154位碱基N154、第155位碱基N155和第156位碱基N156形成编码任意氨基酸的密码子(在后文中，也被称为“N154N155N156密码子”)，
第397位碱基N397、第398位碱基N398和第399位碱基N399形成编码任意氨基酸的密码子(在后文中，也被称为“N397N398N399密码子”)，并且
第460位碱基N460、第461位碱基N461和第462位碱基N462形成编码任意氨基酸的密码子(在后文中，也被称为“N460N461N462密码子”)；
(f2)编码具有荧光活性的蛋白质并且由通过在除了第154位碱基N154、第155位碱基N155、第156位碱基N156、第397位碱基N397、第398位碱基N398、第399位碱基N399、第460位碱基N460、第461 位碱基N461和第462位碱基N462之外的多核苷酸(f1)的碱基序列中缺失、替换、插入和/或添加一个至几个碱基而获得的碱基序列构成的多核苷酸；
(f3)编码具有荧光活性的蛋白质并且由与除了第154位碱基 N154、第155位碱基N155、第156位碱基N156、第397位碱基N397、第 398位碱基N398、第399位碱基N399、第460位碱基N460、第461位碱基N461和第462位碱基N462之外的多核苷酸(f1)的碱基序列具有至少80％同一性的碱基序列构成的多核苷酸；
(f4)编码具有荧光活性的蛋白质并且由与在严紧条件下与由多核苷酸(f1)的碱基序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸，其中在所述互补序列中，对应于多核苷酸(f1)的第154位碱基N154、第155位碱基N155、第156位碱基N156、第397位碱基N397、第398位碱基N398、第399位碱基N399、第460位碱基 N460、第461位碱基N461和第462位碱基N462的碱基得以保留；
(f5)编码由SEQ ID NO：1的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸，其中
在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中，
第52位氨基酸Xaa52是任意氨基酸，
第133位氨基酸Xaa133是任意氨基酸，并且
第154位氨基酸Xaa154是任意氨基酸；
(f6)编码具有荧光活性并且由通过在除了第52位氨基酸Xaa52、第133位氨基酸Xaa133和第154位氨基酸Xaa154之外的多核苷酸(f5) 的氨基酸序列中缺失、替换、插入和/或添加一个至几个氨基酸而获得的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸；以及
(f7)编码具有荧光活性并且由与除了第52位氨基酸Xaa52、第 133位氨基酸Xaa133和第154位氨基酸Xaa154之外的多核苷酸(f5)的碱基序列具有至少80％同一性的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸。
由于所述新的基因是编码本发明的新的荧光蛋白质的基因，因此在后文中，它也被称为新的荧光蛋白质基因。所述新的荧光蛋白质基因可能含有例如一种类型的多核苷酸或两种或更多种类型的多核苷酸 (在后文中同样适用)。
下面描述了多核苷酸(f1)的SEQ ID NO：14的碱基序列。在下面描述的碱基序列中，三个带框碱基序列中的第一个碱基序列(NNN) 是对应于N154N155N156密码子的碱基序列，三个带框碱基序列中的第二个碱基序列是对应于N397N398N399密码子的碱基序列，并且三个带框碱基序列中的第三个碱基序列是对应于N460N461N462密码子的碱基序列。在下面描述的碱基序列中，两个带下划线的密码子中的第一个密码子是对应于第592位碱基N592、第593位碱基N593和第594位碱基N594的密码子，并且两个带下划线的密码子中的第二个密码子是对应于第 613位碱基N613、第614位碱基N614和第615位碱基N615的密码子。
多核苷酸(f1)(SEQ ID NO：14)
Figure BDA0001512135050000321
Figure BDA0001512135050000331
在多核苷酸(f1)中，N154N155N156密码子是编码任意氨基酸的密码子。所述编码任意氨基酸的密码子是编码A、C、D、E、F、G、H、 I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y的密码子，优选为编码C、F、H、K、M或T的密码子，更优选为编码C、M或T的密码子，因为它例如即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出较强荧光。在多核苷酸(f1)中，N154N155N156密码子更优选为编码H的密码子，因为它例如在使用相同强度的激发光激发下显示出较强荧光。
在多核苷酸(f1)中，N397N398N399密码子是编码任意氨基酸的密码子。所述编码任意氨基酸的密码子是编码A、C、D、E、F、G、H、 I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y的密码子，并且优选为编码L、Q、S或T的密码子。在多核苷酸(f1)中，N397N398N399密码子更优选为编码T的密码子，因为它例如在使用相同强度的激发光激发下显示出较强荧光。
在多核苷酸(f1)中，N460N461N462密码子是编码任意氨基酸的密码子。所述编码任意氨基酸的密码子是编码A、C、D、E、F、G、H、 I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y的密码子，优选为编码A、H、I、K、L、Q、V或Y的密码子，更优选为编码A、I、L、V 或Y的密码子，因为它例如即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出较强荧光。在多核苷酸(f1)中，N460N461N462密码子更优选为编码K的密码子，因为它例如在使用相同强度的激发光激发下显示出较强荧光。
在多核苷酸(f1)中，N154N155N156密码子、N397N398N399密码子和 N460N461N462密码子的组合不限于特定组合，并且例如如下所述：
N154N155N156密码子是编码C、F、H、K、M或T的密码子；
N397N398N399密码子是编码L、Q、S或T的密码子；并且
N460N461N462密码子是编码A、H、I、K、L、Q、V或Y的密码子。
在多核苷酸(f1)中，N154N155N156密码子、N397N398N399密码子和 N460N461N462密码子的组合优选地例如如下所述，因为由所述新的荧光蛋白质基因编码的新的荧光蛋白质即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出较强荧光：
N154N155N156密码子是编码C、M或T的密码子；
N397N398N399密码子是编码L、Q、S或T的密码子；并且
N460N461N462密码子是编码A、I、L、V或Y的密码子。
在下面的描述中，在多核苷酸(f1)以这种组合包括Xaa52、Xaa133和Xaa154的情况下，核苷酸(f1)也被称为多核苷酸(b1)，并且当多核苷酸(f1)是多核苷酸(b1)时，多核苷酸(f2)至(f4)也被称为多核苷酸(b2)至(b4)。在下面的描述中，例如对于多核苷酸(b2) 至(b4)来说，通过分别用(b1)替代(f1)、用(b2)替代(f2)、用(b3)替代(f3)并且用(b4)替代(f4)，也可以参考对于多核苷酸(f2)至(f4)的描述。
作为特定实例，在本发明的新的荧光蛋白质基因中，N154N155N156密码子、N397N398N399密码子和N460N461N462密码子的组合是例如编码下述氨基酸组合(aa1')至(aa12')之一的密码子的组合。在本发明的新的荧光蛋白质基因中，N154N155N156密码子、N397N398N399密码子和N460N461N462密码子的组合优选为编码下述氨基酸组合(aa1')、(aa3')、 (aa6')、(aa9')、(aa10')或(aa12')的密码子的组合，更优选为编码下述氨基酸组合(aa1')或(aa9')的密码子的组合，因为例如由所述新的荧光蛋白质基因编码的新的荧光蛋白质即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出较强荧光。此外，在本发明的新的荧光蛋白质基因中，N154N155N156密码子、N397N398N399密码子和N460N461N462密码子的组合优选为编码下述氨基酸组合(aa2')的密码子的组合，因为例如由所述新的荧光蛋白质基因编码的新的荧光蛋白质在使用相同强度的激发光激发下显示出较强荧光。本发明的新的基因不包括例如其中N154N155N156密码子、N397N398N399密码子和N460N461N462密码子的组合是编码H、S和R的密码子的组合和编码D、S和R的密码子的组合的基因。
[表2]
N<sub>154</sub>N<sub>155</sub>N<sub>156</sub> N<sub>397</sub>N<sub>398</sub>N<sub>399</sub> N<sub>460</sub>N<sub>461</sub>N<sub>462</sub>
(aa1’) T S Y
(aa2’) H T K
(aa3’) C L L
(aa4’) C S H
(aa5’) T S H
(aa6’) M L V
(aa7’) F S Q
(aa8’) K T A
(aa9’) C Q L
(aa10’) T T I
(aa11’) K S Q
(aa12’) M L A
在本发明的新的荧光蛋白质基因中，N154N155N156密码子、 N397N398N399密码子和N460N461N462密码子的氨基酸的组合是例如下述组合(n1)至(n18)之一。在本发明的新的荧光蛋白质基因中，例如， N154N155N156密码子、N397N398N399密码子和N460N461N462密码子的氨基酸的组合优选为下述组合(n1)、(n2)、(n3)、(n6)、(n10)、 (n11)、(n14)、(n15)、(n16)和(n18)之一，因为由所述新的荧光蛋白质基因编码的新的荧光蛋白质即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出较强荧光，并且更优选为下述组合(n1)、(n2)、 (n3)、(n14)和(n15)之一，因为由所述新的荧光蛋白质基因编码的新的荧光蛋白质即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出远远更强的荧光。在本发明的新的荧光蛋白质基因中，N154N155N156密码子、N397N398N399密码子和N460N461N462密码子的氨基酸的组合优选为下述组合(n4)或(n5)，因为例如由所述新的荧光蛋白质基因编码的新的荧光蛋白质在使用相同强度的激发光激发下显示出较强荧光。
[表3]
N<sub>154</sub>N<sub>155</sub>N<sub>156</sub> N<sub>397</sub>N<sub>398</sub>N<sub>399</sub> N<sub>460</sub>N<sub>461</sub>N<sub>462</sub>
(n1) ACA TCT TAC
(n2) ACC AGC TAT
(n3) ACT AGT TAC
(n4) CAC ACT AAG
(n5) CAC ACA AAG
(n6) TGC TTA CTT
(n7) TGC AGC CAT
(n8) TGT AGC CAC
(n9) ACG AGC CAC
(n10) ATG CTG GTA
(n11) ATG CTC GTG
(n12) AAA AGC CAA
(n13) AAA ACT GCT
(n14) TGT CAA CTT
(n15) TGC CAA TTG
(n16) ACT ACA ATT
(n17) AAA AGC CAA
(n18) ATG CTC GCC
在本发明的新的荧光蛋白质基因中，N613N614N615密码子优选被编码I的密码子替换，因为例如由所述新的荧光蛋白质基因编码的新的荧光蛋白质即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出较强荧光。在这种情况下，编码I的密码子优选为ATA。此外，在本发明的新的荧光蛋白质基因中，N592N593N594密码子优选被编码L或H的密码子替换，因为例如由所述新的荧光蛋白质基因编码的新的荧光蛋白质即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出较强荧光。在这种情况下，编码L的密码子优选为CTC，编码H的密码子优选为CAC。在本发明的新的荧光蛋白质基因中，N592N593N594密码子和N613N614N615密码子优选被编码L和I的密码子的组合或编码H和I的密码子的组合替换，因为例如由所述新的荧光蛋白质基因编码的新的荧光蛋白质即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出远远更强的荧光。在这种情况下，编码L和I的密码子优选分别为CTC和ATA，并且编码H和I的密码子优选分别为CAC和ATA。
多核苷酸(f1)可以是例如由选自SEQ ID NO：15至32、68至 100和101的至少一个碱基序列构成的多核苷酸。在多核苷酸(f1)是由选自SEQ ID NO：15至32和68至101的至少一个碱基序列构成的多核苷酸的情况下，多核苷酸(f1)也被称为多核苷酸(f1-1)至(f1-52) 之一，多核苷酸(f2)也被称为多核苷酸(f2-1)至(f2-52)之一，多核苷酸(f3)也被称为多核苷酸(f3-1)至(f3-52)之一，多核苷酸(f4) 也被称为多核苷酸(f4-1)至(f4-52)之一，多核苷酸(f5)也被称为多核苷酸(f5-1)至(f5-52)之一，多核苷酸(f6)也被称为多核苷酸(f6-1)至(f6-52)之一，并且多核苷酸(f7)也被称为多核苷酸(f7-1) 至(f7-52)之一。
多核苷酸(b1)可以是由选自例如SEQ ID NO：15至17、20、24、 25、28至30、32和68至101的至少一个碱基序列构成的多核苷酸。对于由上述碱基序列中的至少一者构成的多核苷酸(b1)来说，可以参考对于由上述碱基序列中的至少一者构成的多核苷酸(f1)的描述。
多核苷酸(f1)的SEQ ID NO：15至32和68至101的碱基序列如下所述。SEQ ID NO：15至32的碱基序列对应于其中在SEQ ID NO： 14的碱基序列中N154N155N156密码子、N397N398N399密码子和 N460N461N462密码子的氨基酸的组合分别是组合(n1)至(n18)的情况。每个多核苷酸(f1-1)至(f1-3)是编码蛋白质(F1-1)的氨基酸序列的多核苷酸，每个多核苷酸(f1-4)和(f1-5)是编码蛋白质(F1-2) 的氨基酸序列的多核苷酸，多核苷酸(f1-6)是编码蛋白质(F1-3)的氨基酸序列的多核苷酸，每个多核苷酸(f1-7)和(f1-8)是编码蛋白质(F1-4)的氨基酸序列的多核苷酸，多核苷酸(f1-9)是编码蛋白质 (F1-5)的氨基酸序列的多核苷酸，每个多核苷酸(f1-10)和(f1-11) 是编码蛋白质(F1-6)的氨基酸序列的多核苷酸，多核苷酸(f1-12) 是编码蛋白质(F1-7)的氨基酸序列的多核苷酸，多核苷酸(f1-13) 是编码蛋白质(F1-8)的氨基酸序列的多核苷酸，每个多核苷酸(f1-14) 和(f1-15)是编码蛋白质(F1-9)的氨基酸序列的多核苷酸，多核苷酸(f1-16)是编码蛋白质(F1-10)的氨基酸序列的多核苷酸，多核苷酸(f1-17)是编码蛋白质(F1-11)的氨基酸序列的多核苷酸，并且多核苷酸(f1-18)是编码蛋白质(F1-12)的氨基酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO：68至82的碱基序列对应于其中在SEQ ID NO：14的碱基序列中N154N155N156密码子、N397N398N399密码子和N460N461N462密码子的氨基酸的组合对应于组合(n3)的情况。多核苷酸(f1-19)至(f1-33) 分别是编码蛋白质(F1-13)至(F1-27)的氨基酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO：83至101的碱基序列对应于其中在SEQ ID NO：14的碱基序列中N154N155N156密码子、N397N398N399密码子和N460N461N462密码子的氨基酸的组合对应于组合(n15)的情况。多核苷酸(f1-34)至(f1-52)分别是编码蛋白质(F1-28)至(F1-46)的氨基酸序列的多核苷酸。
多核苷酸(f1-1)(SEQ ID NO：15)
Figure BDA0001512135050000391
Figure BDA0001512135050000401
多核苷酸(f1-2)(SEQ ID NO：16)
Figure BDA0001512135050000402
多核苷酸(f1-3)(SEQ ID NO：17)
Figure BDA0001512135050000403
Figure BDA0001512135050000411
多核苷酸(f1-4)(SEQ ID NO：18)
Figure BDA0001512135050000412
多核苷酸(f1-5)(SEQ ID NO：19)
Figure BDA0001512135050000413
Figure BDA0001512135050000421
多核苷酸(f1-6)(SEQ ID NO：20)
Figure BDA0001512135050000422
多核苷酸(f1-7)(SEQ ID NO：21)
Figure BDA0001512135050000431
多核苷酸(f1-8)(SEQ ID NO：22)
Figure BDA0001512135050000432
Figure BDA0001512135050000441
多核苷酸(f1-9)(SEQ ID NO：23)
Figure BDA0001512135050000442
多核苷酸(f1-10)(SEQ ID NO：24)
Figure BDA0001512135050000443
Figure BDA0001512135050000451
多核苷酸(f1-11)(SEQ ID NO：25)
Figure BDA0001512135050000452
多核苷酸(f1-12)(SEQ ID NO：26)
Figure BDA0001512135050000453
Figure BDA0001512135050000461
多核苷酸(f1-13)(SEQ ID NO：27)
Figure BDA0001512135050000462
多核苷酸(f1-14)(SEQ ID NO：28)
Figure BDA0001512135050000471
多核苷酸(f1-15)(SEQ ID NO：29)
Figure BDA0001512135050000472
Figure BDA0001512135050000481
多核苷酸(f1-16)(SEQ ID NO：30)
Figure BDA0001512135050000482
多核苷酸(f1-17)(SEQ ID NO：31)
Figure BDA0001512135050000483
Figure BDA0001512135050000491
多核苷酸(f1-18)(SEQ ID NO：32)
Figure BDA0001512135050000492
多核苷酸(f1-19)(SEQ ID NO：68)
Figure BDA0001512135050000493
Figure BDA0001512135050000501
多核苷酸(f1-20)(SEQ ID NO：69)
Figure BDA0001512135050000502
多核苷酸(f1-21)(SEQ ID NO：70)
Figure BDA0001512135050000503
Figure BDA0001512135050000511
多核苷酸(f1-22)(SEQ ID NO：71)
Figure BDA0001512135050000512
Figure BDA0001512135050000521
多核苷酸(f1-23)(SEQ ID NO：72)
Figure BDA0001512135050000522
多核苷酸(f1-24)(SEQ ID NO：73)
Figure BDA0001512135050000523
Figure BDA0001512135050000531
多核苷酸(f1-25)(SEQ ID NO：74)
Figure BDA0001512135050000532
多核苷酸(f1-26)(SEQ ID NO：75)
Figure BDA0001512135050000533
Figure BDA0001512135050000541
多核苷酸(f1-27)(SEQ ID NO：76)
Figure BDA0001512135050000542
多核苷酸(f1-28)(SEQ ID NO：77)
Figure BDA0001512135050000543
Figure BDA0001512135050000551
多核苷酸(f1-29)(SEQ ID NO：78)
Figure BDA0001512135050000552
多核苷酸(f1-30)(SEQ ID NO：79)
Figure BDA0001512135050000561
多核苷酸(f1-31)(SEQ ID NO：80)
Figure BDA0001512135050000562
Figure BDA0001512135050000571
多核苷酸(f1-32)(SEQ ID NO：81)
Figure BDA0001512135050000572
多核苷酸(f1-33)(SEQ ID NO：82)
Figure BDA0001512135050000573
Figure BDA0001512135050000581
多核苷酸(f1-34)(SEQ ID NO：83)
Figure BDA0001512135050000582
多核苷酸(f1-35)(SEQ ID NO：84)
Figure BDA0001512135050000583
Figure BDA0001512135050000591
多核苷酸(f1-36)(SEQ ID NO：85)
Figure BDA0001512135050000592
多核苷酸(f1-37)(SEQ ID NO：86)
Figure BDA0001512135050000601
多核苷酸(f1-38)(SEQ ID NO：87)
Figure BDA0001512135050000602
Figure BDA0001512135050000611
多核苷酸(f1-39)(SEQ ID NO：88)
Figure BDA0001512135050000612
多核苷酸(f1-40)(SEQ ID NO：89)
Figure BDA0001512135050000613
Figure BDA0001512135050000621
多核苷酸(f1-41)(SEQ ID NO：90)
Figure BDA0001512135050000622
多核苷酸(f1-42)(SEQ ID NO：91)
Figure BDA0001512135050000623
Figure BDA0001512135050000631
多核苷酸(f1-43)(SEQ ID NO：92)
Figure BDA0001512135050000632
多核苷酸(f1-44)(SEQ ID NO：93)
Figure BDA0001512135050000641
多核苷酸(f1-45)(SEQ ID NO：94)
Figure BDA0001512135050000642
Figure BDA0001512135050000651
多核苷酸(f1-46)(SEQ ID NO：95)
Figure BDA0001512135050000652
多核苷酸(f1-47)(SEQ ID NO：96)
Figure BDA0001512135050000653
Figure BDA0001512135050000661
多核苷酸(f1-48)(SEQ ID NO：97)
Figure BDA0001512135050000662
多核苷酸(f1-49)(SEQ ID NO：98)
Figure BDA0001512135050000663
Figure BDA0001512135050000671
多核苷酸(f1-50)(SEQ ID NO：99)
Figure BDA0001512135050000672
多核苷酸(f1-51)(SEQ ID NO：100)
Figure BDA0001512135050000673
Figure BDA0001512135050000681
多核苷酸(f1-52)(SEQ ID NO：101)
Figure BDA0001512135050000682
Figure BDA0001512135050000691
可以说，多核苷酸(f2)是例如编码具有荧光活性的蛋白质并且由通过在多核苷酸(f1)中缺失、替换、插入和/或添加一个至几个碱基而获得的碱基序列构成的多核苷酸，其中N154、N155、N156、N397、 N398、N399、N460、N461和N462得以保留。在多核苷酸(f2)中，“一个至几个”可以是例如由多核苷酸(f2)编码的蛋白质在其中具有荧光活性的范围。在多核苷酸(f2)中，“一个至几个”可以是例如1至 132、1至99、1至66、1至33、1至26、1至20、1至13、1至7、1、2、3或4个。当多核苷酸(f1)中N613N614N615密码子被编码I的密码子替换时，多核苷酸(f2)优选为其中多核苷酸(f1)的N613、N614和 N615得以保留的多核苷酸。在这种情况下，多核苷酸(f2)是例如编码具有荧光活性的蛋白质并且由通过在多核苷酸(f1)的碱基序列中缺失、替换、插入和/或添加一个至几个碱基而获得的碱基序列构成的多核苷酸，其中N154、N155、N156、N397、N398、N399、N460、N461、N462、N613、 N614和N615得以保留。当多核苷酸(f1)中N592N593N594密码子被编码 L或H的密码子替换时，多核苷酸(f2)优选为其中多核苷酸(f1)的 N592、N593和N594得以保留的多核苷酸。在这种情况下，多核苷酸(f2) 可以是例如编码具有荧光活性的蛋白质并且由通过在多核苷酸(f1)的碱基序列中缺失、替换、插入和/或添加一个至几个碱基而获得的碱基序列构成的多核苷酸，其中N154、N155、N156、N397、N398、N399、N460、 N461、N462、N592、N593和N594得以保留。当多核苷酸(f1)中N592N593N594密码子和N613N614N615密码子的组合分别被编码L和I的密码子的组合或编码H和I的密码子的组合替换时，多核苷酸(f2)优选为其中多核苷酸(f1)的N154、N155、N156、N397、N398、N399、N460、N461、N462、 N592、N593、N594、N613、N614和N615得以保留的多核苷酸。在这种情况下，多核苷酸(f2)是例如编码具有荧光活性的蛋白质并且由通过在多核苷酸(f1)的碱基序列中缺失、替换、插入和/或添加一个至几个碱基而获得的碱基序列构成的多核苷酸，其中N154、N155、N156、N397、 N398、N399、N460、N461、N462、N592、N593、N594、N613、N614和N615得以保留。关于“一个至几个”，可以参考上面的描述。
可以说，多核苷酸(f3)是例如编码具有荧光活性的蛋白质并且由与多核苷酸(f1)的碱基序列具有至少80％同一性的碱基序列构成的多核苷酸，其中N154、N155、N156、N397、N398、N399、N460、N461和N462得以保留。在多核苷酸(f3)中，“同一性”可以是例如由多核苷酸(f3) 编码的蛋白质在其中具有荧光活性的范围。在多核苷酸(f3)中，“同一性”是例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。当多核苷酸(f1)中N613N614N615密码子被编码I的密码子替换时，多核苷酸(f3)优选为其中多核苷酸(f1) 的N613、N614和N615得以保留的多核苷酸。在这种情况下，多核苷酸 (f3)可以是例如编码具有荧光活性的蛋白质并且由与多核苷酸(f1) 的碱基序列具有至少80％同一性的碱基序列构成的多核苷酸，其中 N154、N155、N156、N397、N398、N399、N460、N461、N462、N613、N614和 N615得以保留。当多核苷酸(f1)中N592N593N594密码子被编码L或H 的密码子替换时，多核苷酸(f3)优选为其中多核苷酸(f1)的N592、 N593和N594得以保留的多核苷酸。在这种情况下，多核苷酸(f3)是例如编码具有荧光活性的蛋白质并且由与多核苷酸(f1)的碱基序列具有至少80％同一性的碱基序列构成的多核苷酸，其中N154、N155、N156、 N397、N398、N399、N460、N461、N462、N592、N593和N594得以保留。当多核苷酸(f1)中N592N593N594密码子和N613N614N615密码子的组合分别被编码L和I的密码子的组合或编码H和I的密码子的组合替换时，多核苷酸(f3)优选为其中多核苷酸(f1)的N154、N155、N156、N397、 N398、N399、N460、N461、N462、N592、N593、N594、N613、N614和N615得以保留的多核苷酸。在这种情况下，多核苷酸(f3)是例如编码具有荧光活性的蛋白质并且由与多核苷酸(f1)的碱基序列具有至少80％同一性的碱基序列构成的多核苷酸，其中N154、N155、N156、N397、N398、 N399、N460、N461、N462、N592、N593、N594、N613、N614和N615得以保留。关于“同一性”，可以参考上面的描述。
在多核苷酸(f4)中，“与多核苷酸杂交的多核苷酸”是例如与多核苷酸(f1)完全或部分互补的多核苷酸。所述杂交可以例如通过各种不同的杂交测定法来检测。所述杂交测定法不限于特定测定法，并且可以是例如在Sambrook等《分子克隆实验指南》(MolecularCloning: A Laboratory Manual)第二版[Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]中描述的方法。
在多核苷酸(f4)中，“严紧条件”可以是例如低严紧条件、中严紧条件和高严紧条件中的任一者。“低严紧条件”是指例如在32℃下使用5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS和50％甲酰胺的条件。“中严紧条件”是指例如在42℃下使用5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS和50％甲酰胺的条件。“高严紧条件”是指例如在50℃下使用5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS和50％甲酰胺的条件。本领域技术人员可以例如通过适当选择各种条件例如温度、盐浓度、探针的浓度和长度、离子强度、时间等，来调整严紧程度。“严紧条件”可以是例如在Sambrook等《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)第二版[Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]中描述的条件。
多核苷酸(f5)的碱基序列可以是任何碱基序列，只要例如由多核苷酸(f5)编码的蛋白质具有荧光活性即可。多核苷酸(f5)的碱基序列可以例如在SEQ ID NO：1的氨基酸序列和氨基酸Xaa52、Xaa133和Xaa154的基础上，通过将密码子替换为相应密码子来设计。可以说，由多核苷酸(f5)编码的蛋白质是例如在关于本发明的新的蛋白质的描述中所描述的蛋白质(F1)，并且可以参考所述描述。
当由多核苷酸(f5)编码的蛋白质即蛋白质(F1)的氨基酸Xaa52、 Xaa133和Xaa154的组合是蛋白质(B1)的氨基酸Xaa52、Xaa133和Xaa154的组合时，多核苷酸(f5)也被称为多核苷酸(b5)，并且当多核苷酸 (f5)是多核苷酸(b5)时，多核苷酸(f6)和(f7)也被称为多核苷酸(b6)和(b7)。在下面的描述中，例如对于多核苷酸(b6)和(b7) 而言，通过分别用(b6)替代(f6)、用(b7)替代(f7)、用(B2) 替代(F2)并且用(B3)替代(F3)，也可以参考对于多核苷酸(f6) 和(f7)的描述。
在多核苷酸(f6)中，“一个至几个”可以是例如由多核苷酸(f6) 编码的蛋白质在其中具有荧光活性的范围。在多核苷酸(f6)中，“一个至几个”可以是例如1至43、1至33、1至22、1至11、1至9、1 至7、1至5、1至3、1或2个。由多核苷酸(f6)编码的蛋白质可以是例如在关于本发明的新的蛋白质的描述中所描述的蛋白质(F2)，并且可以参考所述描述。
在多核苷酸(f7)中，“同一性”可以是例如由多核苷酸(f7)编码的蛋白质在其中具有荧光活性的范围。在多核苷酸(f7)中，“同一性”是例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。由多核苷酸(f7)编码的蛋白质可以是例如在关于本发明的新的蛋白质的描述中所描述的蛋白质(F3)，并且可以参考所述描述。
在本发明中，上述多核苷酸可以例如通过公知的遗传工程方法或合成方法来生产。
<新的蛋白质的表达载体>
本发明的表达载体包含如上所述的本发明的新的基因。根据本发明的表达载体，通过例如将所述表达载体转染到宿主，可以容易地生产本发明的新的蛋白质。关于本发明的表达载体，可以参考例如对于本发明的新的基因的描述。
所述表达载体可以是任何载体，只要例如它在功能上包含所述多核苷酸，使得由作为本发明的新的基因的多核苷酸编码的新的蛋白质可以被表达即可，其他配置并不受限。
所述表达载体可以通过例如将所述多核苷酸插入到用作骨架的载体(在后文中也被称为“基础载体”)中来产生。所述载体的类型不限于特定类型，并且可以例如按照宿主的类型适合地确定。所述载体可以是病毒载体或非病毒载体。所述载体优选为例如二元载体。对于植物的转化来说，所述载体优选为T-DNA二元载体。对于通过使用土壤杆菌(Agrobacterium)的方法转化植物来说，所述载体可以是例如pBI121载体、pPZP202载体、pBINPLUS载体、pBIN19载体、pBIG2113N 载体、pBIG2113SF载体、pRI101DNA载体(TAKARABIO INC.的产品)、pRI201DNA载体(TAKARA BIO INC.的产品)、pRI909DNA 载体(TAKARABIO INC.的产品)和pRI910DNA载体(TAKARA BIO INC.的产品)。对于微生物例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)的转化来说，所述载体可以是例如pETDuet-1载体(Novagen的产品)、 pQE-80L载体(QIAGEN的产品)、pBluescript II SK载体、 pET101/D-TOPO载体(Invitrogen Corporation的产品)、pGEX-6P-1 载体(Amersham Biosciences的产品)、pcDNA3.2/V5-GW/D-TOPO载体(Invitrogen Corporation的产品)、pEGFP载体和pcDNA3.1-hygro(-) 载体(Invitrogen Corporation的产品)。
所述表达载体优选地包括用于调控例如所述多核苷酸的表达和由所述多核苷酸编码的本发明的新的蛋白质的表达的调控序列。所述调控序列可以是例如启动子、终止子、增强子、多腺苷化信号序列和复制原点序列(ori)。在所述表达载体中，对所述调控序列的位置没有特别限制。所述调控序列可以位于所述表达载体中的任何位置处，只要它在功能上调控所述多核苷酸的表达和由所述多核苷酸编码的新的蛋白质的表达即可。所述调控序列可以例如按照公知的方法来放置。例如，初始包含在所述基础载体中的序列可用作调控序列，调控序列可以插入到所述基础载体中，或者可以将包含在所述基础载体中的调控序列用另一个调控序列替换。
所述表达载体还可以包括例如选择标志物的编码序列。所述选择标志物可以是例如药物组合物抗性标志物、荧光蛋白质标志物、酶标志物和细胞表面受体标志物。
<新的蛋白质的生产方法>
本发明的新的蛋白质的生产方法不限于特定方法，并且可以是例如公知的遗传工程方法、合成方法等。在前一种情况下，本发明的生产方法包括表达本发明的新的基因的步骤。由此，本发明的新的蛋白质的生产方法可以容易地生产本发明的新的荧光蛋白质。
作为本发明的新的基因的多核苷酸的表达可以例如使用本发明的表达载体来进行。
表达所述多核苷酸的方法不限于特定方法，并且可以是公知的方法。例如，无细胞蛋白质合成系统、宿主等可用于所述表达。
在前一种情况下，优选地，所述多核苷酸在无细胞蛋白质合成系统中表达。在这种情况下，表达载体可用于所述多核苷酸的表达。所述无细胞蛋白质合成系统可以例如通过公知的方法，使用细胞提取物、包括各种不同组分的缓冲液和已转染有目标多核苷酸的表达载体来进行。例如，可以使用可商购的试剂盒。
在后一种情况下，优选地，使用已转染有所述多核苷酸的宿主，并且例如通过培养所述宿主而在所述宿主中表达所述多核苷酸。例如，通过将所述多核苷酸转染到所述宿主，可以产生合成本发明的新的蛋白质的转化体，并且通过培养所述转化体，可以合成本发明的新的蛋白质。
所述宿主的实例包括非人类宿主例如微生物、植物、动物、昆虫及其培养的细胞，分离的人类细胞及其培养的细胞。其中，植物是优选的。当所述宿主是植物时，所述植物可以是例如植株或植株的一部分。所述植株的一部分的实例包括器官、组织、细胞和繁殖体。器官的实例包括花瓣、花冠、花、叶、种子、果实、茎和根。组织可以是例如所述器官的一部分。细胞可以是例如植株或从所述植株的组织收集的细胞、从所述植株的组织收集的细胞的培养细胞、原生质体和愈伤组织。所述植物的起源不限于特定起源，并且可以是例如十字花科 (Brassicaceae)、茄科(Solanaceae)、禾本科(Poaceae)、豆科(Fabaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、菊科(Asteraceae)、龙胆科(Gentianaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、马鞭草科 (Verbenaceae)、报春花科(Primulaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、兰科(Orchidaceae)等。十字花科可以是例如拟南芥属(Arabidopsis) 例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)等。茄科可以是例如烟草属 (Nicotiana)例如烟草(Nicotiana tabacum)等；矮牵牛属(Petunia) 例如矮牵牛(Petunia×hybrid)等；赛亚麻属(Nierembergia)例如赛亚麻(Nierembergia hippoamanica)等；小花矮牵牛属(Calibrachoa) 例如小花矮牵牛栽培种(Calibrachoa hybrid Cultivar)等；等等。禾本科可以是例如玉蜀黍属(Zea)例如玉米(Zea mays)等；稻属(Oryza) 例如水稻(Oryzasativa)等；等等。豆科可以是例如大豆属(Glycine) 例如大豆(Glycine max)等。蔷薇科可以是例如蔷薇属(Rosa)例如蔷薇(Rosa)等。石竹科可以是例如石竹属(Dianthus)例如康乃馨 (Dianthus caryophyllus)等。菊科可以是例如菊属(Chrysanthemum) 例如杭菊(Chrysantemum morifolium)等；大丁草属(Gerbera)例如非洲菊栽培种(Gerbera cvs.)等；等等。龙胆科可以是例如洋桔梗属 (Eustoma)例如洋桔梗(Eustoma grandiflorum)等。玄参科可以是例如蝴蝶草属(Torenia)例如夏堇(Torenia fournieri)等。马鞭草科可以是例如马鞭草属(Verbena)例如铺地马鞭草(Garden verbena)等。报春花科可以是例如仙客来属(Cyclamen)例如仙客来(Cyclamen persicum)等。仙人掌科的实例包括圆筒仙人掌属(Austrocylindropuntia)、星球属(Astrophytum)、金琥属(Echinocactus)、鹿角柱属(Echinocereus)、仙人球属(Echinopsis)、昙花属(Epiphyllum)、仙人掌属(Opuntia)、Schlumbergera russeliana、白檀属(Chamaecereus)、圆柱掌属(Cylindropuntia)、裸萼球属(Gymnocalycium)、蟹爪兰 (Schlumbergera truncata)、蛇鞭柱属(Selenicereus)、纸刺属 (Tephrocactus)、大凤龙属(Neobuxbaumia)、大织冠属(Neoraimondia)、胭脂掌属(Nopalea)、强刺球属(Ferocactus)、银毛球属(Mammillaria)、花座球属(Melocactus)、丝苇属(Rhipsalis)、岩牡丹属(Roseocactus) 和乌羽玉属(Lophophora)。兰科的实例包括蝴蝶兰属(Phalaenopsis) 例如蝴蝶兰栽培种(Phalaenopsis cvs.)等；兰属(Cymbidium)例如兰花栽培种(Cymbidium cvs.)等；石斛兰属(Dendrobium)例如石斛杂交种(Dendrobiumnobile hybrids)、蝴蝶石斛杂交种(D.phalaenopsis hybrids)等；文心兰属(Oncidium)例如文心兰栽培种(Oncidium cvs.) 等；卡特兰属(Cattleya)例如卡特兰栽培种(Cattleyacvs.)等。微生物的实例包括真核生物和原核生物。原核生物可以是例如细菌，包括埃希氏杆菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli) 等，假单胞菌属(Pseudomonas)例如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) 等。真核生物可以是例如酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。动物细胞的实例包括COS细胞和CHO细胞。昆虫细胞的实例包括Sf9和Sf21。
用于将多核苷酸转染到宿主的方法，即宿主的转化方法，不限于特定方法，并且可以是例如使用表达载体的方法或不使用表达载体的公知方法。在后一种情况下，转染方法可以例如根据宿主的类型适当地确定。转染方法的实例包括热冲击法、乙酸锂法、使用基因枪例如粒子枪的方法、磷酸钙法、聚乙二醇法、使用脂质体的脂转染法、电穿孔法、超声核酸转染法、DEAE-葡聚糖法、使用微型玻璃管的直接转染法、水动力学方法、阳离子脂质体法、使用转染辅助剂的方法和通过土壤杆菌的方法。脂质体可以是例如Lipofectamine和阳离子脂质体，并且转染辅助剂可以是例如去端肽胶原、纳米粒子和聚合物。当所述宿主是植物时，转染方法优选为通过土壤杆菌的方法。作为本发明的新的基因的多核苷酸可以例如通过本发明的表达载体转染到宿主。
用于培养宿主的方法不限于特定方法，并且可以根据宿主的类型适当地确定。用于培养宿主的培养基不限于特定培养基，并且可以根据宿主的类型适当地确定。
用于培养宿主的培养基的形式不限于特定形式，并且可以是例如公知的培养基例如固体培养基、液体培养基、琼脂培养基等。所述培养基中含有的组分不限于特定组分。例如，培养基可以含有可商购的培养基。当所述宿主是植物时，可商购的植物培养基不限于特定培养基，并且可以是例如Murashige-Skoog(MS)培养基等。当所述宿主是植物细胞时，可商购的植物细胞培养基不限于特定培养基，并且可以是例如hyponex培养基、MS培养基、Gamborg B5(B5)培养基、White 培养基等。当所述宿主是微生物时，可商购的微生物培养基不限于特定培养基，并且可以是例如LB培养基、Super Broth培养基、M9培养基等。可以单独使用所述培养基之一，或者可以例如组合使用它们中的两者或更多者。培养基的pH没有特别限制，并且例如在pH 6至pH 8或pH 6.5至pH 7.5的范围内。
用于培养宿主的方法不限于特定方法，并且可以例如根据宿主的类型适当地确定。当所述宿主是植物时，培养方法可以是例如植物的土壤栽培、植物的水栽培等。当所述植物是植物细胞时，培养方法可以是例如愈伤组织培养、根培养、胚珠培养、胚培养等。
宿主的培养温度没有特别限制，并且可以例如根据宿主的类型适当地确定。当所述宿主是植物时，培养温度可以是例如植物的存活温度、植物的最佳生长温度等。具体来说，培养温度在例如15℃至40℃的范围内或在30℃至37℃的范围内。当所述宿主是植物细胞时，培养温度可以是例如植物细胞的存活温度、植物细胞的最佳生长温度等。具体来说，培养温度在例如15℃至40℃的范围内或在30℃至37℃的范围内。
所述宿主可以在例如好氧条件或厌氧条件下培养。好氧条件和厌氧条件不限于特定条件，并且可以使用常规已知的方法来确定。
<转化体>
本发明的转化体包含如上所述的本发明的新的基因。本发明的转化体的特征在于它包含本发明的新的基因，并且其他配置和条件并不受限。包含本发明的新的基因的本发明的转化体例如由于所述新的基因而具有荧光活性。关于本发明的转化体，可以参考例如对于本发明的新的蛋白质等的描述。
在本发明中，转化体没有特别限制，并且可以是动物、植物等。其中，植物是优选的。当转化体是动物时，所述转化体可以是例如癌细胞例如人类结肠癌细胞。当转化体是植物时，所述植物和植物的起源没有特别限制，并且可以例如参考上文的描述。具体来说，所述植物可以是例如植株或植株的一部分。所述植株的一部分的实例包括器官、组织、细胞和繁殖体。器官的实例包括花瓣、花冠、花、叶、种子、果实、茎和根。组织可以是例如所述器官的一部分。细胞可以是例如植株或从所述植株的组织收集的细胞、从所述植株的组织收集的细胞的培养细胞、原生质体和愈伤组织。
在本发明中，当转化体是植物时，本发明的转化体可以例如进一步繁殖。在这种情况下，本发明的转化体可以用作繁殖材料。繁殖材料没有特别限制，并且可以是例如所述转化体的全部或一部分。当所述转化体是植株或植株的一部分时，所述繁殖材料可以是例如种子、果实、苗、茎例如块茎、根例如块根、株系、原生质体、愈伤组织等。
用于繁殖本发明的转化体的方法不限于特定方法，并且可以是公知的方法。所述繁殖方法可以是例如有性生殖或无性生殖，并且无性生殖是优选的。所述无性生殖可以是例如营养繁殖，其也被称为营养生殖。所述营养繁殖不限于特定方法。当所述转化体是植株或植株的一部分时，所述营养繁殖可以是例如通过芽或枝条扦插的繁殖、从器官分割成个体植株、通过愈伤组织生长等。作为器官，可以使用例如上文描述的叶、茎和根。
通过所述转化体的营养繁殖获得的繁殖体在后文中被称为本发明的繁殖体。本发明的繁殖体优选地具有与本发明的转化体相同的性质。与转化体中相同，本发明的繁殖体没有特别限制，并且可以是例如植株或植株的一部分。
当所述转化体被有性生殖时，可以获得例如种子、从所述种子生长的后代例如生长材料。本发明的后代优选地具有与本发明的转化体相同的性质。与转化体中相同，本发明的后代可以是例如植株或植株的一部分。
本发明的转化体可以例如进一步加工。待加工的转化体的类型不限于特定类型，并且可以是例如花、叶、枝等。所述转化体的加工产品不限于特定产品，并且可以是例如通过将花、叶、枝等干燥而制成的百花香、压花、干花、保鲜花、树脂密封产品等。本发明的加工产品可以是例如所述转化体的繁殖体、器官、组织或细胞的加工产品。
<转化体的生产方法>
本发明的转化体的生产方法包括如上所述将本发明的新的基因转染到宿主的步骤。本发明的转化体的生产方法的特征在于它包括将本发明的新的基因转染到宿主的步骤，并且其他步骤和条件并不受限。例如，按照本发明的转化体的生产方法，可以容易地生产本发明的转化体。
本发明的转化体的生产方法还可以包括在所述宿主中表达所述新的基因的步骤。
在所述转染步骤中，用于将本发明的新的基因转染到宿主的方法不限于特定方法，并且可以例如参考在本发明的新的蛋白质的生产方法中对于将多核苷酸转染到宿主的方法的描述。在本发明的转化体的生产方法中，宿主优选为植物。
所述表达步骤是例如在宿主中从本发明的新的基因表达本发明的新的蛋白质的步骤。在所述表达步骤中，例如，宿主优选为已转染有本发明的新的基因或表达载体的转化体，并且优选地通过培养所述转化体在所述宿主中表达本发明的新的蛋白质。
当所述宿主是植物时，本发明的转化体的生产方法还可以包括繁殖在所述转染步骤中获得的转化体的步骤。关于所述繁殖步骤中的繁殖方法，可以例如参考上文的描述。本发明的转化体的生产方法还可以包括从繁殖的转化体生产种子的步骤，以及从在所述种子生产步骤中获得的种子进行生长材料生长的步骤。
<新的荧光蛋白质的筛选方法>
用于筛选本发明的新的荧光蛋白质的方法(在后文中也被称为“本发明的筛选方法”)的特征在于，它包括从通过向如上所述本发明的新的蛋白质引入突变而获得的候选蛋白质中选择其中在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中对应于第52位氨基酸Xaa52的氨基酸、对应于第133位氨基酸Xaa133的氨基酸和对应于第154位氨基酸Xaa154的氨基酸各自是任意氨基酸的具有荧光活性的蛋白质的步骤，而其他步骤和条件并不受限。按照本发明的筛选方法，例如，可以容易地筛选具有荧光活性的蛋白质。关于本发明的筛选方法，可以例如参考对于本发明的新的蛋白质、新的基因、表达载体、生产方法等的描述。
所述候选蛋白质是通过向本发明的新的蛋白质引入突变而获得的蛋白质。被引入到所述新的蛋白质的突变的类型不限于特定类型，并且可以是例如氨基酸的缺失、替换、插入和/或添加。作为特定实例，所述候选蛋白质可以是例如由通过在所述新的蛋白质的氨基酸序列中缺失、替换、插入和/或添加一个至几个氨基酸而获得的氨基酸序列构成的蛋白质，或者是由与所述新的蛋白质的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列构成的蛋白质。
在所述候选蛋白质的氨基酸序列中，“一个至几个”是例如1至 43、1至33、1至22、1至11、1至9、1至7、1至5、1至3、1或2 个。
在所述候选蛋白质的氨基酸序列中，“同一性”是例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
所述候选蛋白质可以在所述候选蛋白质的氨基酸序列的基础上，通过公知的蛋白质合成方法或遗传工程方法来产生。在后一种情况下，本发明的筛选方法包括例如向编码新的蛋白质的碱基序列即本发明的新的基因引入突变以产生突变多核苷酸的步骤，以及从所述突变多核苷酸表达所述候选蛋白质的步骤。
在所述突变步骤中，被引入到所述新的基因的突变不限于特定突变，并且可以是例如碱基的缺失、替换、插入和/或添加。用于向所述新的基因引入突变的方法不限于特定方法，并且可以是例如用于向多核苷酸引入突变的公知方法。作为特定实例，用于引入突变的方法可以是通过本发明的新的基因的多核苷酸的随机片段化并使用PCR进行重组来重新构建基因(所谓的DNA穿梭)的方法。
在所述表达步骤中，用于表达所述突变多核苷酸的方法不限于特定方法。关于表达所述突变多核苷酸的方法，可以例如参考对于本发明的新的蛋白质的生产方法的描述，并且可以使用无细胞蛋白质合成系统或宿主。作为宿主，优选地使用例如原核生物，特别是大肠埃希氏杆菌。
本发明的筛选方法可以包括例如纯化在所述表达步骤中获得的候选蛋白质的步骤。所述纯化方法不限于特定方法，并且其实例包括盐析和各种不同种类的柱层析。在所述纯化步骤中使用的溶剂不限于特定溶剂，并且可以是例如缓冲溶液。在本发明的筛选方法中，例如，在所述表达步骤中获得的候选蛋白质可以直接用于下面描述的选择步骤中，或者可以使用部分纯化的候选蛋白质或单一纯化的候选蛋白质。
选择步骤是从所述候选蛋白质中选择其中在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中对应于第52位氨基酸Xaa52的氨基酸、对应于第133位氨基酸Xaa133的氨基酸和对应于第154位氨基酸Xaa154的氨基酸各自是任意氨基酸的具有荧光活性的蛋白质的步骤。
在所述选择步骤中选择的候选蛋白质的对应于Xaa52的氨基酸是任意氨基酸。所述任意氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、 M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为C、F、H、K、M或T，并且更优选为C、M或T，因为它例如即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出较强荧光。在所选择的候选蛋白质中，Xaa52更优选为 H，因为它例如在使用相同强度的激发光激发下显示出较强荧光。
所选择的候选蛋白质的Xaa133是任意氨基酸。所述任意氨基酸是 A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W 或Y，优选为L、Q、S或T。在所选择的候选蛋白质中，Xaa133更优选为T，因为它例如在使用相同强度的激发光激发下显示出较强荧光。
在所选择的候选蛋白质中，Xaa154是任意氨基酸。所述任意氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、 V、W或Y，优选为A、H、I、K、L、Q、V或Y，并且更优选为A、 I、L、V或Y，因为它例如即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出较强荧光。在所选择的候选蛋白质中，Xaa154更优选为K，因为它例如在使用相同强度的激发光激发下显示出较强荧光。
在所述选择步骤中选择的候选蛋白质是具有荧光活性的蛋白质，其中在SEQ IDNO：1的氨基酸序列中，对应于Xaa52的氨基酸是C、 F、H、K、M或T，对应于Xaa133的氨基酸是L、Q、S或T，并且对应于Xaa154的氨基酸是A、H、I、K、L、Q、V或Y。
在所述选择步骤中选择的候选蛋白质是具有荧光活性的蛋白质，其中在SEQ IDNO：1的氨基酸序列中对应于Xaa52、Xaa133和Xaa154的氨基酸的组合是下述组合(aa1)至(aa12)之一。在所述选择步骤中选择的候选蛋白质是其中对应于Xaa52、Xaa133和Xaa154的氨基酸的组合是下述组合(aa1)、(aa3)、(aa6)、(aa9)、(aa10)或(aa12) 的具有荧光活性的蛋白质，或者是其中对应于Xaa52、Xaa133和Xaa154的氨基酸的组合是下述组合(aa1)或(aa9)的具有荧光活性的蛋白质，因为它例如即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出较强荧光。在所述选择步骤中选择的候选蛋白质是具有荧光活性的蛋白质，其中对应于Xaa52、Xaa133和Xaa154的氨基酸的组合是下述组合(aa2)，因为它例如在使用相同强度的激发光激发下显示出较强荧光。
[表4]
Figure BDA0001512135050000831
Figure BDA0001512135050000841
在所述选择步骤中选择的候选蛋白质优选为具有荧光活性的蛋白质，其中Xaa205被I替换，因为它例如即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出较强荧光。在所述选择步骤中选择的候选蛋白质优选为具有荧光活性的蛋白质，其中Xaa198被L或H替换，因为它例如即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出较强荧光。在所述选择步骤中选择的候选蛋白质优选为具有荧光活性的蛋白质，其中Xaa198和Xaa205被L和I或H和I的组合替换，因为它例如即使在使用具有相对低波长的激发光时也显示出远远更强的荧光。
在所述选择步骤中，用于鉴定所述候选蛋白质的氨基酸序列的方法不限于特定方法，并且可以是例如公知的氨基酸鉴定方法。当从突变多核苷酸表达所述候选蛋白质时，所述候选蛋白质的氨基酸序列可以例如通过将所述突变多核苷酸的碱基序列的密码子用相应的氨基酸序列替换来鉴定。
在所述选择步骤中，用于检查所述候选蛋白质的荧光活性的方法不限于特定方法，并且可以是公知的荧光活性检查方法。例如，所述候选蛋白质的荧光活性可以使用公知的光学测量仪器，通过测量在每个激发波长处由激发光产生的荧光的光谱来检查。当所述候选蛋白质在大肠埃希氏杆菌中表达时，用于检查荧光活性的方法不限于特定方法。例如，荧光活性可以使用发光二极管紫外(LEDUV)光源和UV 透射滤光片来检查。
在本发明的筛选方法中的选择步骤中，优选地选择具有荧光活性并且由与SEQ IDNO：1的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列构成的蛋白质。所述“同一性”可以是例如所选择的候选蛋白质在其中具有荧光活性的范围。所述“同一性”是例如至少80％、至少 85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少 99％。
[实施例]
下面描述本发明的实施例。然而，本发明不受下述实施例限制。
[实施例1]
检查本发明的新的蛋白质的荧光活性。
(1)表达载体的构建
通过化学合成获得12种载体插入序列(SEQ ID NO：33)，其各自包括分别编码新的荧光蛋白质(SEQ ID NO：2至13)的新的基因 (SEQ ID NO：17、18、20、21、23、25至27和29至32)之一。在所述载体插入序列中，括号内的带下划线碱基序列是对应于编码所述新的荧光蛋白质的新的基因的碱基序列。带框的N154N155N156密码子、 N397N398N399密码子和N460N461N462密码子与所述新的荧光蛋白质和所述载体插入序列中的新的基因之间的关系被示出在下面的表5中。每个其中N154N155N156密码子、N397N398N399密码子和N460N461N462密码子的组合是(f1-3)、(f1-4)、(f1-6)、(f1-7)、(f1-9)、(f1-11) 至(f1-13)和(f1-15)至(f1-18)之一的载体插入序列分别被称为载体插入序列(f1-3)、(f1-4)、(f1-6)、(f1-7)、(f1-9)、(f1-11)至(f1-13)和(f1-15)至(f1-18)。
载体插入序列(SEQ ID NO：33)
Figure BDA0001512135050000851
Figure BDA0001512135050000861
[表5]
N<sub>154</sub>N<sub>155</sub>N<sub>156</sub> N<sub>397</sub>N<sub>398</sub>N<sub>399</sub> N<sub>460</sub>N<sub>461</sub>N<sub>462</sub> 蛋白质 基因
(f1-3) ACT AGT TAC SEQ ID NO：2 SEQ ID NO：17
(f1-4) CAC ACT AAG SEQ ID NO：3 SEQ ID NO：18
(f1-6) TGC TTA CTT SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：20
(f1-7) TGC AGC CAT SEQ ID NO：5 SEQ ID NO：21
(f1-9) ACG AGC CAC SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：23
(f1-11) ATG CTC GTG SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：25
(f1-12) AAA AGC CAA SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：26
(f1-13) AAA ACT GCT SEQ ID NO：9 SEQ ID NO：27
(f1-15) TGC CAA TTG SEQ ID NO：10 SEQ ID NO：29
(f1-16) ACT ACA ATT SEQ ID NO：11 SEQ ID NO：30
(f1-17) AAA AGC CAA SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：31
(f1-18) ATG CTC GCC SEQ ID NO：13 SEQ ID NO：32
将载体插入序列(f1-3)、(f1-4)、(f1-6)、(f1-7)、(f1-9)、(f1-11)至(f1-13)和(f1-15)至(f1-18)各自用限制性酶HindIII 和EcoRI切开，并将每个得到的产物连接到用所述限制性酶切开的 pEGFP载体(CLONTEC的产品)。其中插入有载体插入序列(f1-3)、(f1-4)、(f1-6)、(f1-7)、(f1-9)、(f1-11)至(f1-13)和(f1-15) 至(f1-18)的载体分别被称为表达载体(f1-3)、(f1-4)、(f1-6)、 (f1-7)、(f1-9)、(f1-11)至(f1-13)和(f1-15)至(f1-18)。所述表达载体通过Gene Script来构建。
(2)转染到大肠埃希氏杆菌
通过热冲击法将每个表达载体(f1-3)、(f1-4)、(f1-6)、(f1-7)、 (f1-9)、(f1-11)至(f1-13)和(f1-15)至(f1-18)单独地转染到大肠埃希氏杆菌DH5α菌株。使用含有100μg/mL抗生素(氨苄青霉素) 的LB培养基，将每种获得的转化体在37℃下培养10小时。然后收集每种培养的细菌细胞，并将获得的细胞团块用40mL含有1片蛋白酶抑制剂(cOmplete，RocheLtd的无EDTA的产品)的PBS溶液洗涤两次。将每种洗涤过的细胞团块悬浮在800μL含有所述蛋白酶抑制剂的 PBS溶液中。随后，使用超声均质机(QSONICA,WAKENBTECH CO., LTD)，以Amp 25％将每种获得的悬液超声处理两次，持续1分钟。然后，将每种处理过的悬液在4℃下以1300rpm离心10分钟，并回收得到的上清液。在后文中，从转染有表达载体(f1-3)、(f1-4)、(f1-6)、 (f1-7)、(f1-9)、(f1-11)至(f1-13)和(f1-15)至(f1-18)的转化体获得的上清液分别被称为蛋白质(F1-1)至(F1-12)蛋白质。每种上清液中蛋白质的浓度通过向所述上清液添加Protein Assay(Bio Rad的产品)，并使用微孔板读板器(
Figure BDA0001512135050000871
M1000Pro，TECAN的产品)在595nm处测量吸光度来确定。
(3)荧光活性的测量
在转染(2)中获得的每种上清液中的蛋白质浓度的基础上，将在转染(2)中获得的每种上清液稀释，使得所述上清液中的蛋白质浓度为0.2mg/mL。使用微孔板读板器，在下文描述的测量条件下测量50μL 稀释后的每种上清液的荧光强度(FI)。作为阴性对照，以与上述相同的方式测量荧光强度(FI)，区别在于用pUC载体代替所述表达载体进行转染。
(测量条件)
激发波长：350至650nm(带宽：5nm)
荧光(检测)波长：350至650nm(带宽：5nm)
激光强度(增益)：105
在激发波长(Ex)为375nm并且荧光波长(Em)为515nm的情况下获得的结果被示出在下面的表6A中，在激发波长为405nm并且荧光波长为515nm的情况下获得的结果被示出在下面的表6B中，在激发波长为500nm并且荧光波长为525nm的情况下获得的结果被示出在下面的表6C中，在激发波长为510nm并且荧光波长为535nm的情况下获得的结果被示出在下面的表6D中。如下面的表6A至6D中所示，蛋白质(F1-1)至(F1-12)各自在每种波长下显示出荧光活性。相反，阴性对照(pUC)不显示出荧光活性。如表6A中所示，在激发波长为375nm并且荧光波长为515nm的情况下，蛋白质(F1-1)至 (F1-6)、(F1-9)、(F1-10)和(F1-12)各自显示出强的荧光活性，并且蛋白质(F1-9)显示出显著强的荧光活性。如表6B中所示，在激发波长为405nm并且荧光波长为515nm的情况下，蛋白质(F1-1)、 (F1-2)、(F1-4)和(F1-9)各自显示出强的荧光活性，并且蛋白质 (F1-9)显示出显著强的荧光活性。如表6C中所示，在激发波长为500 nm并且荧光波长为525nm的情况下，蛋白质(F1-2)显示出强的荧光活性。如表6D中所示，在激发波长为510nm并且荧光波长为535nm 的情况下，蛋白质(F1-2)显示出强的荧光活性。尽管在表中没有示出，但在使用各包括各自编码(F1-1)的氨基酸序列的多核苷酸(f1-1)和 (f1-2)、编码(F1-2)的氨基酸序列的多核苷酸(f1-5)、编码(F1-4) 的氨基酸序列的多核苷酸(f1-8)、编码(F1-6)的氨基酸序列的多核苷酸(f1-10)和编码氨基酸序列(F1-9)的多核苷酸(f1-14)之一的表达载体来代替表达载体的情况下，蛋白质也各自显示出荧光活性。这些结果显示，本发明的新的荧光蛋白质具有荧光活性。
[表6A]
Figure BDA0001512135050000901
[表6B]
Figure BDA0001512135050000902
[表6C]
Figure BDA0001512135050000911
[表6D]
Figure BDA0001512135050000912
激发波长的整个范围和荧光波长的整个范围的测量结果被示出在图1A和1B中。图1A和1B各自显示的图示出了实施例1中在不同激发波长和荧光波长下的荧光强度。在图1A中，(A)至(G)分别示出了蛋白质(F1-1)至(F1-7)的结果。在图1B中，(H)至(L)分别示出了蛋白质(F1-8)至(F1-12)的结果，(M)示出了阴性对照 (pUC)的结果，(N)示出了每张图中的轴的详细情况。如图1B的(N)中所示，在图1A的(A)至(G)和图1B的(H)至(N)中， X-轴方向示出了激发波长，Y-轴方向示出了荧光波长，并且Z-轴方向示出了荧光强度。如图1A和1B的(A)至(L)中所示，蛋白质(F1-1) 至(F1-12)各自显示出荧光活性。相反，如图1B的(M)中所示，阴性对照不显示出荧光活性。如图1A的(B)中所示，在使用相同强度的激发光激发下，蛋白质(F1-2)显示出比其他蛋白质更强的荧光活性。
如图1A的箭头(A)、(C)和(F)以及图1B的箭头(I)、(J) 和(L)所示，蛋白质(F1-1)、(F1-3)、(F1-6)、(F1-9)、(F1-10) 和(F1-12)各自在相对低的激发波长(350至435nm)下显示出比其他蛋白质更强的荧光活性。具体来说，甚至在使用具有下面表7中描述的激发波长的激发光激发下，蛋白质(F1-1)、(F1-3)、(F1-6)、 (F1-9)、(F1-10)和(F1-12)也各自在520nm左右显示出荧光。表7中示出的最大激发波长是在350至435nm的激发波长内显示出最大荧光强度的激发波长。
[表7]
激发波长 最大激发波长
F1-1 350～435nm 396～404nm
F1-3 350～435nm 396～404nm
F1-6 350～435nm 391～399nm
F1-9 350～435nm 401～409nm
F1-10 350～435nm 391～399nm
F1-12 350～435nm 386～394nm
这些结果显示，本发明的新的荧光蛋白质具有荧光活性。
[实施例2]
检查了可以通过本发明的筛选方法筛选新的荧光蛋白质。
(1)表达载体的构建
通过DNA穿梭法产生突变多核苷酸，并将所述突变多核苷酸连接到载体，由此构建突变多核苷酸的表达载体。具体来说，所述表达载体如下构建。首先，使用下述引物组，通过第一聚合酶链反应(PCR) 扩增多核苷酸(f1-3)(SEQ ID NO：17)和多核苷酸(f1-15)(SEQID NO：29)，由此获得第一PCR产物。所述PCR反应溶液使用试剂盒TaKaRa EX
Figure BDA0001512135050000932
(TAKARABIO INC.的产品)，按照说明书来制备。
引物组
引物序列1(SEQ ID NO：102)
5'-ATGCTTCCGGCTCGTATGTTG-3'
引物序列2(SEQ ID NO：103)
5'-GTACGGCCGACTAGTAGGCC-3'
将1.9μg第一PCR产物悬浮在含有脱氧核糖核酸酶(DNase)并具有下述组成的缓冲溶液中，使其在25℃反应20分钟，然后使其在 90℃反应10分钟，由此将DNA片段化
[缓冲溶液的组成]
Figure BDA0001512135050000931
Figure BDA0001512135050000941
通过琼脂糖凝胶电泳和凝胶提取来纯化每种片段化的DNA。然后将获得的纯化产物添加到PCR反应溶液，使得所述溶液的浓度在10 至30μg/μL的范围内，并将得到的产物通过第二PCR进行扩增，由此获得多种第二PCR产物。在所述第二PCR中，不使用上文描述的引物组。然后，将五十分之一的每种第二PCR产物添加到PCR反应溶液并使用所述引物组通过第三PCR进行扩增，由此获得突变多核苷酸。将突变多核苷酸用限制性酶切开，并将每种得到的产物连接到用所述限制性酶切开的pEGFP载体。其中插入有突变多核苷酸的载体被用作突变多核苷酸表达载体。通过这种方式，获得多个突变多核苷酸表达载体。
(2)转染到大肠埃希氏杆菌
通过热冲击法将每种突变多核苷酸表达载体单独地转染到大肠埃希氏杆菌JM109菌株。使用含有100μg/mL抗生素(氨苄青霉素)的 LB培养基将获得的转化体在37℃下培养过夜(18小时)，直至形成约1000个菌落。
(3)荧光活性的检查
然后，收集每种培养的细菌细胞，并使用LEDUV光源(NS375LIM， NitrideSemiconductors Co.,Ltd.的产品)作为光源和UL360(OMG CO.,LTD.)作为滤光片来检查所述细菌细胞的荧光活性。对于观察到荧光活性的细菌细胞来说，对质粒进行纯化，将实施例2的程序(1) 和(2)重复三次，然后以与上述相同的方式检查所述细菌细胞的荧光活性。
(4)大肠埃希氏杆菌的序列
回收在检查(3)中观察到荧光活性的细菌细胞的菌落，对质粒进行纯化，并在下述条件下对得到的质粒进行直接测序。结果显示，观察到荧光活性的细菌细胞包含本发明的新的基因(SEQ ID NO：68至 101)之一。这些结果显示，可以通过本发明的筛选方法筛选本发明的新的荧光蛋白质。
[直接测序的条件]
测序仪ABI 3130xl(Applied Biosystems的产品)
测序试剂BigDye Terminator V1-1循环测序试剂盒(Applied Biosystem的产品)
测序引物
引物序列1(SEQ ID NO：102)
5'-ATGCTTCCGGCTCGTATGTTG-3'
引物序列2(SEQ ID NO：103)
5'-GTACGGCCGACTAGTAGGCC-3'
[实施例3]
检查本发明的新的蛋白质的荧光活性。除非另有注明，否则实验条件、实验方法等与实施例1中所描述的相同。
(1)表达载体的构建
通过向每个编码新的荧光蛋白质(SEQ ID NO：34至48)的新的基因(SEQ ID NO：68至82，(f1-19)至(f1-33))的碱基序列的5’末端添加5'末端序列(5'-AAGCTTG-3')并向其3’末端添加3'末端序列 (5'-AATTC-3')，通过化学合成获得14种载体插入序列。另外，通过向每个编码新的荧光蛋白质(SEQ ID NO：49至67)的新的基因(SEQ ID NO：83至101，(f1-34)至(f1-52))的碱基序列的5’末端添加 5'末端序列(5'-AAGCTTG-3')并向其3’末端添加3'末端序列 (5'-AATTC-3')，通过化学合成获得19种载体插入序列。包含新的基因(f1-19)至(f1-52)的载体插入序列分别被称为载体插入序列(f1-19) 至(f1-52)。
将载体插入序列(f1-19)至(f1-52)各自用限制性酶切开，并将每个得到的产物连接到用所述限制性酶切开的pEGFP载体。其中插入有载体插入序列(f1-19)至(f1-52)的载体分别被称为表达载体(f1-19) 至(f1-52)。
(2)转染到大肠埃希氏杆菌
将每种表达载体(f1-19)至(f1-52)转染到大肠埃希氏杆菌DH5α菌株，从每种转染有表达载体(f1-19)至(f1-52)的转化体获得的上清液被称为蛋白质(F1-13)至(F1-46)，并通过以除了下述实验条件之外与实施例1的转染(2)中相同的方式测量吸光度，来确定每种上清液中的蛋白质浓度。对于实验条件而言，转化体的培养时间为16至 18小时，并且用于在洗涤后悬浮细胞团块的PBS溶液为1.5mL。使用超声均质机，以Amp 35％和10秒/30秒的循环将每种获得的悬液超声处理4次，持续2分钟。将每种超声处理的悬液在4℃下以3000rpm离心10分钟。通过用微孔板读板器测量562nm处的吸光度，来确定每种上清液中的蛋白质浓度。
(3)荧光活性的测量
在转染(2)中测量的每种上清液中的蛋白质浓度的基础上将在转染(2)中获得的每种上清液稀释，使得所述上清液中的蛋白质浓度在 1.5至2.0mg/mL的范围内。对于50至70μL的稀释后的每种上清液，在与实施例1的测量(3)中相同的测量条件下，使用微孔板读板器测量荧光强度(FI)。作为对照，以与上述相同的方式测量荧光强度(FI)，区别在于用表达载体(f1-3)和(f1-15)代替所述表达载体进行转染，并获得蛋白质(F1-1)和(F1-9)。
蛋白质(F1-13)至(F1-27)、(F1-1)和(F1-9)的结果显示在下面的表8A中，蛋白质(F1-28)至(F1-46)、(F1-1)和(F1-9) 的结果显示在下面的表8B中，蛋白质(F1-28)至(F1-46)和(F1-9) 的结果显示在下面的表8C中。表8A至8C示出了每种蛋白质的激发波长(Ex)、荧光波长和荧光强度(FI)的值。如表8A中所示，蛋白质(F1-13)至(F1-27)各自显示出比蛋白质(F1-1)和(F1-9)更强的荧光活性。特别是，蛋白质(F1-14)至(F1-27)各自显示出显著强的荧光活性。如表8B中所示，蛋白质(F1-28)至(F1-46)各自显示出比蛋白质(F1-1)和(F1-9)更强的荧光活性。如表8C中所示，蛋白质(F1-28)至(F1-46)各自显示出比蛋白质(F1-9)更强的荧光活性。这些结果显示，本发明的新的荧光蛋白质具有荧光活性。
[表8A]
Figure BDA0001512135050000971
[表8B]
Figure BDA0001512135050000981
[表8C]
Figure BDA0001512135050000991
激发波长的整个范围和荧光波长的整个范围的测量结果被示出在图2A至3D中。图2A至3D各自显示的图示出了实施例3中在不同激发波长和荧光波长下的荧光强度。在图2A中，(A)至(F)分别示出了蛋白质(F1-13)至(F1-18)的结果。在图2B中，(G)至(L) 分别示出了蛋白质(F1-19)至(F1-24)的结果。在图2C中，(M) 至(Q)分别示出了蛋白质(F1-25)至(F1-27)、(F1-1)和(F1-9) 的结果。在图3A中，(A)至(F)分别示出了蛋白质(F1-28)至(F1-33) 的结果。在图3B中，(G)至(L)分别示出了蛋白质(F1-34)至(F1-39) 的结果。在图3C中，(M)至(R)分别示出了蛋白质(F1-40)至(F1-45) 的结果。在图3D中，(S)至(U)分别示出了蛋白质(F1-46)、(F1-1) 和(F1-9)的结果。如图1B的(N)中所示，在图2A至2C的(A) 至(Q)和图3A至3D的(A)至(U)中，X-轴方向示出了激发波长， Y-轴方向示出了荧光波长，并且Z-轴方向示出了荧光强度。如图2A 至2C的(A)至(O)和图3A至D的(A)至(S)中所示，蛋白质 (F1-13)至(F1-27)和(F1-28)至(F1-46)各自显示出比蛋白质(F1-1) 和(F1-9)更强的荧光活性。具体来说，如图2A至2C的(B)至(O) 中所示，蛋白质(F1-14)至(F1-27)显示出显著强的荧光活性。这些结果显示，本发明的新的荧光蛋白质具有荧光活性。
[实施例4]
检查了本发明的新的蛋白质的荧光活性。除非另有指明，否则实验条件、实验方法等与实施例1中描述的相同。
以与实施例1中相同的方式获得蛋白质(F1-1)、(F1-2)、(F1-9)、 (F1-27)和(F1-42)的上清液，区别在于向每种蛋白质的N末端添加由6个组氨酸残基构成的标签(6×His标签)。按照TALON Superflow Metal Affinity Rsesin(TAKARA BIO INC.的产品)的说明手册对所述上清液进行蛋白质纯化，并获得分别含有蛋白质(F1-1)、(F1-2)、 (F1-9)、(F1-27)和(F1-42)的洗脱液。将每种洗脱液稀释以使蛋白质浓度为0.2mg/mL。对于50μL洗脱后的每种上清液，使用微孔板读板器在下述测量条件下测量荧光强度(FI)。
(测量条件)
激发波长：505to 520nm(带宽：1nm)
荧光(检测)波长：350至525nm(带宽：1nm)
激光强度(增益)：105
在激发波长(Ex)为400nm左右并且荧光波长(Em)为515nm 左右的情况下蛋白质(F1-1)、(F1-9)、(F1-27)和(F1-42)的结果被示出在下面的表9A中，在激发波长(Ex)为507nm并且荧光波长(Em)为515nm左右的情况下蛋白质(F1-2)、(F1-9)和(F1-42) 的结果被示出在下面的表9B中。如表9A中所示，蛋白质(F1-27)和 (F1-42)各自显示出比蛋白质(F1-1)和(F1-9)更强的荧光活性。特别是，蛋白质(F1-27)显示出显著强的荧光活性。如表9B中所示，蛋白质(F1-2)和(F1-42)各自显示出比蛋白质(F1-9)更强的荧光活性。这些结果显示，本发明的新的荧光蛋白质具有荧光活性。
[表9A]
激发波长(nm) 荧光波长(nm) 荧光强度(FI)
F1-1 400 512 4294
F1-9 409 513 4209
F1-27 400 512 37747
F1-42 403 513 16025
[表9B]
激发波长(nm) 荧光波长(nm) 荧光强度(FI)
F1-2 507 516 287170
F1-9 507 513 34757
F1-42 507 513 107742
激发波长的整个范围和荧光波长的整个范围的测量结果被示出在图4中。图4显示的图示出了实施例4中在不同激发波长和荧光波长下的荧光强度。在图4中，(A)至(E)示出了蛋白质(F1-1)、(F1-2)、(F1-9)、(F1-27)和(F1-42)的结果。如图1B的(N)中所示，在图4的(A)至(E)中，X-轴方向显示了激发波长，Y-轴方向显示了荧光波长，并且Z-轴方向显示了荧光强度。如图4中所示，蛋白质 (F1-1)、(F1-2)、(F1-9)、(F1-27)和(F1-42)各自显示出荧光活性。蛋白质(F1-1)、(F1-27)和(F1-42)即使在相对低的激发波长(400nm左右)下也显示出较强荧光活性。特别是蛋白质(F1-27) 显示出显著强的荧光活性。这些结果显示，本发明的新的荧光蛋白质具有荧光活性。
[实施例5]
检查了本发明的新的蛋白质的荧光活性。除非另有指明，否则实验条件、实验方法等与实施例1中描述的相同。
(1)表达载体的构建
通过化学合成获得载体插入序列(SEQ ID NO：104、105和106)，其各自其中具有向每个分别编码新的荧光蛋白质(SEQ ID NO：3、48 和63)的新的基因(SEQ ID NO：18、82和97)的N末端添加了His 标签序列的序列。在所述载体插入序列中，括号内的带下划线碱基序列是对应于编码所述新的荧光蛋白质的新的基因的碱基序列，并且括号外的带下划线碱基序列对应于His标签序列。带框的N592N593N594密码子和N613N614N615密码子与新的荧光蛋白质和载体插入序列中的新的基因之间的关系被示出在下面的表10中。每个其中N592N593N594密码子和N613N614N615密码子是(f1-4)、(f1-33)和(f1-48)之一的载体插入序列分别被称为载体插入序列(f1-4)、(f1-33)和(f1-48)。
载体插入序列(SEQ ID NO：104)
Figure BDA0001512135050001021
Figure BDA0001512135050001031
载体插入序列(SEQ ID NO：105)
Figure BDA0001512135050001032
Figure BDA0001512135050001041
载体插入序列(SEQ ID NO：106)
Figure BDA0001512135050001042
[表10]
N<sub>592</sub>N<sub>593</sub>N<sub>594</sub> N<sub>613</sub>N<sub>614</sub>N<sub>615</sub> 蛋白质 基因
(f1-4) CAC ATG SEQ ID NO：3 SEQ ID NO：18
(f1-33) CTC ATA SEQ ID NO：48 SEQ ID NO：82
(f1-48) CAC ATA SEQ ID NO：63 SEQ ID NO：97
将载体插入序列(f1-4)、(f1-33)和(f1-48)各自用限制性酶 HindIII和XbaI切开，并将每种得到的产物连接到用所述限制性酶切开的pcDNA3.1-hygro(-)载体(Invitrogen Corporation的产品)。其中插入有载体插入序列(f1-4)、(f1-33)和(f1-48)的载体分别被称为表达载体(f1-4)、(f1-33)和(f1-48)。
(2)质粒DNA的扩增和纯化
以与实施例1的转染(2)中相同的方式将每种表达载体(f1-4)、 (f1-33)和(f1-48)转染到大肠埃希氏杆菌DH5α菌株，并将所述大肠埃希氏杆菌在37℃和5％CO2下培养10小时，由此扩增含有基因 (f1-4)、(f1-33)和(f1-48)的质粒DNA。然后使用Midi Prep试剂盒(QIAGEN的产品)，按照产品随附的流程纯化含有基因(f1-4)、 (f1-33)和(f1-48)的质粒DNA。
(3)质粒DNA向结肠癌细胞的转染
首先，将人类结肠癌来源的HCT116细胞(DS Pharma Biomedical Co.,Ltd.)接种到6孔板，以便获得约70％汇合。将McCoy's 5A改良培养基(Invitrogen Corporation的产品)用作培养基，并将细胞在37 ℃和5％CO2下培养。将每个孔中的细胞培养24小时，然后使用转染试剂Lipofectamine2000(产品名称，Invitrogen Corporation的产品)，按照产品随附的流程转染含有基因(f1-4)、(f1-33)和(f1-48)的纯化的质粒DNA。每个孔中的组成被设置如下。所述含有包含基因 (f1-4)、(f1-33)和(f1-48)的质粒DNA的癌细胞分别被称为蛋白质表达癌细胞(F1-2)、(F1-27)和(F1-42)。
(每个孔的组成)
Figure BDA0001512135050001051
(4)通过FACS分析测量荧光活性
在转染后，将孔中的细胞在37℃和5％CO2下培养24小时。然后向板添加潮霉素B溶液(Wako的产品)使得每个孔中的浓度为 500μg/mL，并将得到的细胞继续培养14天。在培养后，使用FACSaria III(BD Biosciences的产品)从每个孔中的细胞分拣出约2×105至 1×106个荧光信号阳性细胞，并将分拣的细胞在37℃和5％CO2下继续培养5天。然后，在下述条件下对培养的细胞进行荧光活化细胞分拣(FACS)分析。作为对照，以与上述相同的方式进行分析，区别在于不转染所述表达载体。
(FACS分析条件)
测量装置 FACSaria III(BD Biosciences的产品)
滤光片设置
488nm蓝色激光；502nm LP反射镜和530/30nm带通滤光片
405nm紫色激光：502nm LP反射镜和530/30nm带通滤光片
结果被示出在图5中。图5显示的图示出了使用每种滤光片获得的每种蛋白质表达癌细胞的荧光活性。在图5中，竖直轴显示了细胞数目，水平轴显示了荧光强度，由实线指示的柱状图显示了每种蛋白质表达癌细胞的结果，由灰线指示的柱状图显示了对照的结果。如图5 中所示，对照未显示出指示荧光活性的峰，而使用V500滤光片分析的蛋白质表达癌细胞(F1-27)和(F1-42)和使用FITC滤光片分析的蛋白质表达癌细胞(F1-2)和(F1-42)各自显示出指示荧光活性的峰。这些结果显示，本发明的新的荧光蛋白质具有荧光活性.。
通过计算使用V500滤光片分析的蛋白质表达癌细胞(F1-27)和 (F1-42)和使用FITC滤光片分析的蛋白质表达癌细胞(F1-2)和 (F1-42)的荧光强度的平均荧光强度(MFI)获得的结果被示出在下面的表11中。如表11中所示，使用V500滤光片分析的蛋白质表达癌细胞(F1-27)和(F1-42)和使用FITC滤光片分析的蛋白质表达癌细胞(F1-2)和(F1-42)各自显示出高的MFI。这些结果显示，本发明的新的荧光蛋白质具有优良的荧光活性。
[表11]
MFI(V500) MFI(FITC)
(F1-2) - 21400
(F1-27) 1538 -
(F1-42) 1004 10700
上面参考实施方式和实施例对本申请的发明进行了描述。然而，本申请的发明不限于上述实施方式和实施例。在本申请的发明范围内，可以在本申请的发明的配置和细节中做出本领域技术人员可以理解的各种不同改变。
本申请要求2015年6月19日提交的日本专利申请号2015-124229 和2016年4月28日提交的日本专利申请号2016-092095的优先权。该日本专利申请的全部公开内容通过参考并入本文。
工业实用性
根据本发明，可以提供新的荧光蛋白质。因此，本发明是在生命科学领域、医学领域、农业领域等中可能显著有用的技术。
序列表
<110> 日本电气方案创新株式会社
<120> 新的蛋白质、新的基因、表达载体、转化体、生产转化体的方法和筛选新的荧光蛋白质的方法
<130> 1010100052
<150> JP2015-124229
<151> 2015-06-19
<150> JP2016-092095
<151> 2016-04-28
<160> 106
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 荧光蛋白质
<220>
<221> misc_feature
<222> (52)..(52)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (133)..(133)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
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cttccgttac acttacgagt tcaacaagat catcggtgac gtcgagtgca ttggacatgg 360
attcccaagt cagagtccga tcttcaagga cacgatcgtg aagnnntgtc ccacggtgga 420
cctgatgttg ccgatgtccg ggaacatcat cgccagctcc tacgctnnng ccttccaact 480
gaaggacggc tctttctaca cggcagaagt caagaacaac atagacttca agaatccaat 540
ccacgagtcc ttctcgaagt cggggcccat gttcacccac agacgtgtcg aggagactca 600
caccaaggag aaccttgcca tggtggagta ccagcaggtt ttcaacagcg ccccaagaga 660
catgtagaat tc 672
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Pro Lys Gly Thr Glu Asn Ile Tyr Leu His Ala Ala Thr Asn Gly Gly
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Tyr Thr Asn Thr Arg Lys Glu Ile Tyr Glu Asp Gly Gly Ile Leu Glu
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Val Asn Phe Arg Tyr Thr Tyr Glu Phe Asn Lys Ile Ile Gly Asp Val
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Gly Asn Ile Ile Ala Ser Ser Tyr Ala Leu Ala Phe Gln Leu Glu Asp
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Gly Ser Phe Tyr Thr Ala Glu Val Lys Asn Asn Ile Asp Phe Lys Asn
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Pro Ile His Glu Ser Phe Ser Lys Ser Gly Pro Met Phe Thr His Arg
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<213> 人工序列
<220>
<223> 荧光蛋白质
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Glu Ile Glu Met Lys Thr Lys Asp Lys Pro Leu Ala Phe Ser Pro Phe
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Leu Leu Ser Cys Cys Met Gly Tyr Gly Phe Tyr His Phe Ala Ser Phe
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Pro Lys Gly Thr Glu Asn Ile Tyr Leu His Ala Ala Thr Asn Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Thr Asn Thr Arg Lys Glu Ile Tyr Glu Asp Gly Gly Ile Leu Glu
85 90 95
Val Asn Phe Arg Tyr Thr Tyr Glu Phe Asn Lys Ile Ile Gly Asp Val
100 105 110
Glu Cys Ile Gly His Gly Phe Pro Ser Gln Ser Pro Ile Phe Lys Asp
115 120 125
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Gly Ser Phe Tyr Thr Ala Glu Val Lys Asn Asn Ile Asp Phe Lys Asn
165 170 175
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<223> 寡核苷酸
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<210> 102
<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 103
gtacggccga ctagtaggcc 20
<210> 104
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 104
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ccagctccta cgctaaggcc ttccaactga aggacggctc tttctacacg gcagaagtca 540
agaacaacat agacttcaag aatccaatcc acgagtcctt ctcgaagtcg gggcccatgt 600
tcacccacag acgtgtcgag gagactcaca ccaaggagaa ccttgccatg gtggagtacc 660
agcaggtttt caacagcgcc ccaagagaca tgtagaattc tgcagatatc cagcacagtg 720
gcgaagctt 729
<210> 105
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 105
tctagatgca tcatcatcat catcatggcg gcagcatgac aaccttcaaa atcgagtccc 60
ggatccacgg caacctcaac ggggagaagt tcgagttggt tggaggtgga gtaggtgagg 120
agggtcgcct cgagattgag atgaagacta aagataaacc actggcattc tctcccttcc 180
tgctgaccac ttgcatgggt tacgggttct accacttcgc cagcttccca aaggggatta 240
agaacatcta tcttcatgct gcaacgaacg gaggttacac caacaccagg aaggagatct 300
atgaagacgg cggcatcttg gaggtcaact tccgttacac ttacgagttc aacaagatca 360
tcggtgacgt cgagtgcatt ggacatggat tcccaagtca gagtccgatc ttcaaggaca 420
cgatcgtgaa gagttgtccc acggtggacc tgatgttgcc aatgtccggg aacatcatcg 480
ccagctccta cgcttacgcc ttccaactga aggacggctc tttctacacg gcagaagtca 540
agaacaacat agacttcaag aatccaatcc acgagtcctt ctcgaagtca gggcccatgt 600
tcacccacag acgtgtcgag gagactctca ccaaggagaa ccttgccata gtggagtacc 660
agcaggtttt caacagcgcc ccaagagaca tgtagaattc tgcagatatc cagcacagtg 720
gcgaagctt 729
<210> 106
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 106
tctagatgca tcatcatcat catcatggcg gcagcatgac aaccttcaaa atcgagtccc 60
ggatccacgg caacctcaac ggggagaagt tcgagttggt tggaggtgga gtaggtgagg 120
agggtcgcct cgagattgag atgaagacta aagataaacc actggcattc tctcccttcc 180
tgctgtcctg ctgcatgggt tacgggttct accacttcgc cagcttccca aaggggactg 240
agaacatcta tcttcatgct gcaacaaacg gaggttacac caacaccagg aaggagatct 300
atgaagacgg cggcatcttg gaggtcaact tccgttacac ttacgagttc aacaagatca 360
tcggtgacgt cgagtgcatt ggacatggat tcccaagtca gagtccgatc ttcaaggaca 420
cgatcgtgaa gcaatggccc acggtggacc tgatgttgcc gatgtccggg aacatcatcg 480
ccagttccta cgctttggcc ttccaactga aggacggctc tttctacacg gcagaggtca 540
agaacaacat agacttcaag aatccaatcc acgagtcctt ctcgaagtcg gggcccatgt 600
tcacccacag acgtgtcgag gagactcaca ccaaggagaa ccttgccata gtggagtacc 660
agcaggtttt caacagcgcc ccaagagaca tgtagaattc tgcagatatc cagcacagtg 720
gcgaagctt 729

Claims (11)

1.一种新的蛋白质，其包括下述蛋白质(F1)或(F3)：
(F1)由SEQ ID NO：1的氨基酸序列构成的蛋白质，其中：
在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中，
Xaa52是C、F、H、K、M或T，
Xaa133是L、Q、S或T，并且
Xaa154是A、H、I、K、L、Q、V或Y，以及
(F3)由与蛋白质(F1)具有至少90％同一性的氨基酸序列构成并且具有荧光活性的蛋白质，其中Xaa52、Xaa133和Xaa154得以保留。
2.权利要求1的新的蛋白质，其中
所述Xaa52、Xaa133和Xaa154的组合是下述组合(aa1)至(aa12)之一：
在(aa1)中，所述Xaa52是T，所述Xaa133是S，并且所述Xaa154是Y，
在(aa2)中，所述Xaa52是H，所述Xaa133是T，并且所述Xaa154是K，
在(aa3)中，所述Xaa52是C，所述Xaa133是L，并且所述Xaa154是L，
在(aa4)中，所述Xaa52是C，所述Xaa133是S，并且所述Xaa154是H，
在(aa5)中，所述Xaa52是T，所述Xaa133是S，并且所述Xaa154是H，
在(aa6)中，所述Xaa52是M，所述Xaa133是L，并且所述Xaa154是V，
在(aa7)中，所述Xaa52是F，所述Xaa133是S，并且所述Xaa154是Q，
在(aa8)中，所述Xaa52是K，所述Xaa133是T，并且所述Xaa154是A，
在(aa9)中，所述Xaa52是C，所述Xaa133是Q，并且所述Xaa154是L，
在(aa10)中，所述Xaa52是T，所述Xaa133是T，并且所述Xaa154是I，
在(aa11)中，所述Xaa52是K，所述Xaa133是S，并且所述Xaa154是Q，以及
在(aa12)中，所述Xaa52是M，所述Xaa133是L，并且所述Xaa154是A。
3.权利要求1或2的新的蛋白质，其中
第205位氨基酸Xaa205被I替换。
4.权利要求1或2的新的蛋白质，其中
第198位氨基酸Xaa198被L替换。
5.一种新的基因，其包括下述多核苷酸(f1)或(f3)：
(f1)由SEQ ID NO：14的碱基序列构成的多核苷酸，其中：
在SEQ ID NO：14的碱基序列中，
N154、N155和N156形成编码C、F、H、K、M或T的密码子，
N397、N398和N399形成编码L、Q、S或T的密码子，并且
N460、N461和N462形成编码A、H、I、K、L、Q、V或Y的密码子；以及
(f3)由与除了第154位碱基N154、第155位碱基N155、第156位碱基N156、第397位碱基N397、第398位碱基N398、第399位碱基N399、第460位碱基N460、第461位碱基N461和第462位碱基N462之外的多核苷酸(f1)的碱基序列具有至少90％同一性的碱基序列构成并且编码具有荧光活性的蛋白质的多核苷酸。
6.一种表达载体，其包含：
权利要求5的新的基因。
7.一种转化体，其包含：
权利要求5的新的基因。
8.一种生产转化体的方法，所述方法包括下述步骤：
将权利要求5的新的基因转染到宿主。
9.一种筛选新的荧光蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤：
从通过向权利要求1或2的新的蛋白质引入突变而获得的候选蛋白质中，选择其中在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中对应于第52位氨基酸Xaa52的氨基酸是C、F、H、K、M或T、对应于第133位氨基酸Xaa133的氨基酸是L、Q、S或T和对应于第154位氨基酸Xaa154的氨基酸是A、H、I、K、L、Q、V或Y的具有荧光活性的蛋白质。
10.权利要求1的新的蛋白质，其中
所述Xaa52、Xaa133和Xaa154的组合是下述组合(aa1)至(aa6)、(aa9)、(aa10)和(aa12)之一：
在(aa1)中，所述Xaa52是T，所述Xaa133是S，并且所述Xaa154是Y，
在(aa2)中，所述Xaa52是H，所述Xaa133是T，并且所述Xaa154是K，
在(aa3)中，所述Xaa52是C，所述Xaa133是L，并且所述Xaa154是L，
在(aa4)中，所述Xaa52是C，所述Xaa133是S，并且所述Xaa154是H，
在(aa5)中，所述Xaa52是T，所述Xaa133是S，并且所述Xaa154是H，
在(aa6)中，所述Xaa52是M，所述Xaa133是L，并且所述Xaa154是V，
在(aa9)中，所述Xaa52是C，所述Xaa133是Q，并且所述Xaa154是L，
在(aa10)中，所述Xaa52是T，所述Xaa133是T，并且所述Xaa154是I，以及
在(aa12)中，所述Xaa52是M，所述Xaa133是L，并且所述Xaa154是A。
11.权利要求5的新的基因，其中
由N154、N155和N156构成的密码子、由N397、N398和N399构成的密码子、以及由N460、N461和N462构成的密码子的组合是下述组合(aa1')至(aa6')、(aa9')、(aa10')和(aa12')之一：
所述Xaa52、Xaa133和Xaa154的组合是下述组合(aa1)至(aa6)、(aa10)和(aa12)之一：
在(aa1')中，N154N155N156是T，N397N398N399是S，并且N460N461N462是Y，
在(aa2')中，N154N155N156是H，N397N398N399是T，并且N460N461N462是K，
在(aa3')中，N154N155N156是C，N397N398N399是L，并且N460N461N462是L，
在(aa4')中，N154N155N156是C，N397N398N399是S，并且N460N461N462是H，
在(aa5')中，N154N155N156是T，N397N398N399是S，并且N460N461N462是H，
在(aa6')中，N154N155N156是M，N397N398N399是L，并且N460N461N462是V，
在(aa9')中，N154N155N156是C，N397N398N399是Q，并且N460N461N462是L，
在(aa10')中，N154N155N156是T，N397N398N399是T，并且N460N461N462是I，以及
在(aa12')中，N154N155N156是M，N397N398N399是L，并且N460N461N462是A。
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