JP4118385B2 - 植物プロモーター - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物においてプロモーター機能を有するDNA、いわゆる植物プロモーターに関する。さらに詳しくは、本発明は、ワタ植物においてワタ繊維などの発現を調節する植物プロモーターに関する。本発明の植物プロモーターは、真核生物または原核生物のいずれにおいても、外来遺伝子の発現を調節することが可能である。
【0002】
【従来の技術】
プロモーターとは、DNAを鋳型としてmRNA合成を開始するDNA上のシグナルであり、特徴的な塩基の共通配列を有する。特に、真核生物においては、転写開始点の20塩基前後上流に、「TATAボックス」と呼ばれる共通配列があり、転写開始に必要な部位であると考えられている。そして、目的のタンパクを大量に産生させるためには、より強力なプロモーターを用いることが有利であると考えられている。一般に、植物ではその活性が強いことから、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモーターがよく利用されており、実際、除草剤耐性植物やウイルス抵抗性植物の作出に用いられている。しかし、35Sプロモーターは、組織特異性が低いので、組織特異性が要求される用途には適していない。これまで、組織特異性を有する植物プロモーターとして、シス因子、トランス因子の研究が行われているが、組織特異性を有する植物プロモーターを用いると、所望の植物器官において、導入した遺伝子の発現を調節することが可能な形質転換植物体を作出することができる。
【0003】
現在、ワタ繊維はゴシピウム(Gossypium)属に属するワタ植物を栽培し、得られたさく果(コットンボール)から採取することにより生産されている。ワタ繊維は、様々な物性(以下「繊維特性」という)によって特徴付けられるが、その中でも特に重要なものとして、繊維長、繊度、強度などが挙げられる。従来から、ワタの繊維特性を改善するために多大な努力がなされてきた。今日、遺伝子工学の発展により、ワタ植物を形質転換して、その繊維特性を変化させることが可能となってきている。その際、目的遺伝子を所望の組織および時期に発現させることは非常に重要なことである。しかし、ワタ繊維の形成および伸長機構は充分に解明されておらず、関与する遺伝子やプロモーターについても充分に知られていないのが現状である。目的遺伝子を所望の組織または時期に発現させるには、CaMV35Sプロモーターのように常に発現しているものではなく、より組織特異的または時期特異的なプロモーターを用いることが望ましい。特にワタ繊維の改良には、こうしたプロモーターが必要不可欠である。
【0004】
ワタ繊維は胚珠の表皮細胞が各々伸長したものであり、一本の繊維は一個の細胞から構成されている。ワタ繊維は、成長開始、伸長、二次壁沈着、成熟の段階を経て形成される。これまでにいくつかのワタ由来のプロモーターが発見され、繊維特性を改善するのに有用であると報告され(国際出願公開第WO94/12014号)、例えば、E6プロモーターまたはB8プロモーターが開示されている。特に、E6構造遺伝子について詳しく研究されており、E6mRNAは、開花後15日目以降に繊維で強く発現していることが示されている。また、様々な組織のmRNAにE6cDNA由来のプローブを用いて、ノーザンブロティングをロングエクスポーズすると、花や胚珠、葉において弱いシグナルが得られている[プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ユー・エス・エイ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)89,5769-5773,1992の図1参照]。さらに、FbL2Aプロモーターは、開花後25〜30日目に繊維で強く発現することが示されている[プラント・フィジオロジー(Plant Physiol.)(1996)112:1331-1341]。また、プロモーターの強さや作用する時期などは、各々のプロモーターによって、様々に異なっていることが知られている。しかし、開花後15日目以降はワタの繊維形成において伸長の後半期にあたり、繊維特性の改善には、これらのプロモーターだけでは充分ではなく、開花直後から15日目までに作用するプロモーターも必要である。また、繊維以外の組織でも作用する、いわゆる組織特異性の低いプロモーターであっても、有用なものになると考えられる。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
本発明のある目的は、ワタの繊維特性を改善するのに有用なプロモーター、該プロモーターを含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体などを提供することにある。さらなる目的は、ワタ以外の植物においても、目的遺伝子を所望の組織または器官で発現させて、形質転換植物体を提供することにある。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、すでに、ワタの繊維特性を改善あるいは生産性を向上させるために鋭意研究して、ワタ繊維よりいくつかのcDNAを単離した(米国特許出願第08/391,696号、第08/580,545号、特願平8-31987号)。これらの単離したcDNAの組織特異的および時期特異的な発現を調べ、さらに、特に遺伝子Gh3の上流配列をクローニングし、解析した結果、ワタの繊維特性を改善あるいは生産性を向上させるのに有用な植物プロモーターを見い出し、本発明を完成するに至った。
【0007】
すなわち、本発明は、以下の(a)、(b)または(c)のDNAを含む植物プロモーターを提供する。
(a)配列番号1の塩基配列からなるDNA
(b)(a)の塩基配列において1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA
(c)(a)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA
【0008】
また、本発明は、上記植物プロモーターをベクターに挿入した植物発現ベクター、該植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入した形質転換植物細胞、該形質転換植物細胞から再生された形質転換植物体、該形質転換植物体から得られた植物種子、上記植物プロモーターを挿入した植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入して形質転換植物細胞を得て、該形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生し、得られた形質転換植物体から植物種子を得て、該種子から植物体を生産することを特徴とする植物体の製造法を提供する。
【0009】
さらに、本発明は、配列番号1の塩基配列からなるDNAを含む植物プロモーターを挿入した植物発現ベクターを宿主ワタ植物細胞に導入して形質転換ワタ植物細胞を得て、該形質転換ワタ植物細胞から形質転換ワタ植物体を再生し、得られた形質転換ワタ植物体からワタ植物種子を得て、該ワタ植物種子からワタ植物体を生産することを特徴とするワタ植物体の製造法を提供する。
【0010】
【発明の実施の形態】
本発明の「植物プロモーター」とは、植物においてプロモーターとして作用する能力(プロモーター機能)を有するDNAのことである。「プロモーター」とは、DNAを鋳型としてmRNA合成(転写)を開始するDNA上の特定塩基配列を意味し、塩基の共通配列を有し、これを認識してmRNAを合成する酵素(RNAポリメラーゼ)がmRNAを合成する。ここで、「プロモーター機能」とは、RNAポリメラーゼがDNA上の特異的な領域に結合し、転写開始する作用をいう。
【0011】
本発明の植物プロモーターは、具体的には、以下の(a)、(b)または(c)のDNAを含む。
(a)配列番号1の塩基配列からなるDNA
(b)(a)の塩基配列において1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA
(c)(a)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA
【0012】
本発明者らは、本発明の植物プロモーターを得るために、アシルキャリアープロテイン遺伝子に対し相同性を有するワタ繊維で発現する遺伝子Gh3の上流領域をクローニングした。様々な組織のmRNAにGh3cDNA由来のプローブを用いてノーザンブロッティングしたところ、Gh3は、開花後2日目から胚珠でシグナル(転写産物)が認められ、開花後6〜8日目にピークとなった。繊維と比べて、子葉、根、茎、葉、繊維を取り除いた胚珠では、ほとんどシグナル(転写産物)が認められなかった。しかし、Gh3遺伝子の上流領域をレポーター遺伝子であるGUS遺伝子と連結したキメラ遺伝子構築物を作成し、それを導入した形質転換ワタでは、繊維でGUS活性が認められたほか、花柱、葯、花弁、葉でもGUS活性が認められた。ノーザンブロッティングとプロモーター:GUS遺伝子構築物を導入した形質転換体での発現パターンとの違いは、Gh3遺伝子の転写後の修飾が考えられる。また、組織特異性を調節する領域が、さらに上流に存在する可能性も考えられる。
【0013】
このように、ゴシピウム(Gossypium)属に属するワタ植物由来の遺伝子Gh3の上流領域は、繊維形成・伸長時のワタ繊維組織だけでなく、花柱や葯などの初期成長(ヤングディヴェロッピング)組織でもプロモーター機能を示す植物プロモーターであり、その塩基配列を決定したところ、配列番号1の塩基配列を有することが判明した。以下、この植物プロモーターを、特に「Gh10」と呼ぶことがある。
【0014】
本発明の植物プロモーターは、配列番号1の塩基配列からなるDNAだけでなく、配列番号1の塩基配列において1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA、また、配列番号1の塩基配列において、その3'末端に翻訳効率を上げる塩基配列などを付加したものや、プロモーター活性を失うことなく、その5'末端を欠失したものを含む。
【0015】
さらに、本発明の植物プロモーターは、配列番号1の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNAを含む。ここで、ストリンジェントな条件とは、2xSSC(300mM NaCl、30mMクエン酸)、42℃である。
【0016】
本発明の「植物発現ベクター」とは、上記植物プロモーターをベクターに挿入したものである。ベクターとしては、大腸菌由来のベクター、例えば、pGEM−Tベクター、β−グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子を含むプラスミド、pBI101−Hm2、シャトルベクター、ヘルパープラスミド、pRK2013などが挙げられる。また、植物ウイルス、例えば、カリフラワーモザイクウイルスを利用することもできる。ベクターは、各々の宿主細胞に応じて選択する。なお、植物プロモーターをベクターに挿入する方法は、通常の遺伝子をベクターに挿入する方法に従う。
【0017】
本発明の「形質転換植物細胞」とは、上記植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入した形質転換植物細胞である。宿主植物細胞としては、シロイヌナズナ、トマト、タバコ、ペチュニア、コムギ、イネ、トウモロコシ、カボチャ、キュウリ、ワタなどが挙げられる。植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入する形質転換法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト融合法、マイクロインジェクション法、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法などが挙げられる。
【0018】
本発明の「形質転換植物体」とは、上記形質転換植物細胞から再生された形質転換植物体である。再生方法としては、カルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変えた培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体を得る方法がある。使用する培地としては、ワタでは、MSIC培地(MS塩、0.75%MgCl2、1.9g/l KNO3、30g/lグルコース、2.0g/lジェランガム、pH5.8)、ニンジンでは、カマダ・アンド・ハラダ(Kamada & Harada)培地などが例示される。
【0019】
本発明の「植物体を製造する方法」は、上記植物プロモーターを挿入した植物発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換植物細胞を得て、該形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生し、得られた形質転換植物体から植物種子を得て、該植物種子から植物体を生産する工程を含む。
【0020】
形質転換植物体から植物種子を得る工程とは、例えば、形質転換植物体を発根培地から採取し、水を含んだ土を入れたポットに移植し、一定温度下で生育させて、花を形成させ、最終的に種子を形成させる工程という。また、種子から植物体を生産する工程とは、例えば、形質転換植物体上で形成された種子が成熟したところで、単離して、水を含んだ土に播種し、一定温度、照度下で生育させることにより、植物体を生産する工程をいう。
【0021】
本発明の植物プロモーターは、例えば、以下のようにして製造し、利用することができる。
【0022】
(1)ワタ繊維形成および伸長に関与する遺伝子のプロモーター領域の単離
ワタ繊維から得られた組織特異的遺伝子Gh3の塩基配列から合成オリゴヌクレオチドを調製し、インバースPCR法を行う。ワタ繊維からゲノムDNAを抽出した後、制限酵素EcoRIで切断し、自己連結させた後、PCRの鋳型として用いる。第一プライマー群を用いてPCRを行った後、反応産物をさらに第二プライマー群を用いてPCRを行い、上流領域をクローニングする。
【0023】
アガロースゲル電気泳動で目的の長さのクローンを得た後、TAクローニングベクターにサブクローニングして、配列決定を行う。得られたPCR断片の塩基配列の一部がGh3の塩基配列と完全に一致することから、Gh3の上流の存在する植物プロモーターと判断する。
【0024】
(2)ワタ繊維形成および伸長に関する遺伝子のプロモーター領域の利用
上記方法で得た植物プロモーターを、ワタ植物またはその他の植物において、キメラ遺伝子構築物を作成し、繊維形成および伸長に関与するタンパクの発現制御に利用することができる。さらに、シグナルペプチドをコードするDNA配列と組み合わせると、細胞壁での各種タンパクの発現による細胞壁成分の改変が可能となり、耐病性などを付与した新規植物の育種にも応用できる。
【0025】
例えば、繊維形成および伸長に関与する遺伝子を本発明の植物プロモーターに接続して、ワタ植物またはその他の植物に導入すると、目的タンパクの含量を増大させることができる。これに対し、マイナス鎖(コード配列に相補的な配列)の少なくとも一部を逆向きに植物プロモーターに接続したものを植物に導入し、いわゆるアンチセンスRNAを発現させると、目的タンパクの含量を低下させることができる。
【0026】
(3)植物プロモーターのベクターへの導入と宿主植物細胞の形質転換
植物細胞の形質転換方法としては、プロトプラストに電気パルス処理してプラスミドを植物細胞へ導入するエレクトロポレーション法や、小細胞、細胞、リソソームなどとプロトプラストとの融合法、マイクロインジェクション法、ポリエチレングリコール法、あるいは、パーティクルガン法などの方法が挙げられる。
【0027】
また、植物ウイルスをベクターとして利用することによって、目的遺伝子を植物体に導入することができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。すなわち、まず、ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中に、これらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって該組換え体から切り出し、植物体に接種することによって、これらの目的遺伝子を植物体に導入することができる[ホーン(Hohn)ら、モレキュラー・バイオロジー・オブ・プラント・チューモアーズ(Molecular Biology of Plant Tumors)、アカデミック・プレス、ニューヨーク、549-560(1982)、米国特許第4,407,956号]。
【0028】
さらに、アグロバクテリウムのTiプラスミドを利用する方法がある。アグロバクテリウム(Agrobacterium)属に属する細菌が植物に感染すると、それが有するプラスミドDNAの一部を植物ゲノム中に移行させるという性質を利用して、目的遺伝子を植物体に導入することができる。アグロバクテリウム属に属する細菌のうちアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)は植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を形成し、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacteriumu rhizogenes)は植物に感染して毛状根を発生させる。これらは、感染の際にTiプラスミドまたはRiプラスミドと呼ばれる各々の細菌中に存在するプラスミド上のT−DNA領域(Transferred DNA)と呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因する。さらに、TiまたはRiプラスミド上には、vir領域と呼ばれる領域があり、T−DNA領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれるのに必須である。vir領域自体は、植物中に移行することはなく、また、T−DNA領域が存在するプラスミドとは別のプラスミド上にあっても機能しうる[ネイチャー(Nature)303,179(1983)]。
【0029】
TiまたはRiプラスミド上のT−DNA領域中に、植物ゲノム中に組み込みたいDNAを挿入しておけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物体に感染する際に目的とするDNAを植物ゲノム中に組込むことができる。ここで、TiまたはRiプラスミドのT−DNA中のクラウンゴールまたは毛状根を発生させる部分を、目的とする移行機能を損なうことなく取り除き、得られたものをベクターとして使用することもできる。
【0030】
このように、本発明においては、様々なベクターを用いることができる。例えば、バイナリーベクターと呼ばれるpBI101(クロンテック社)などのベクターに、本発明の植物プロモーターに繊維形成および伸長に関与する遺伝子をセンスまたはアンチセンス方向で接続したものを挿入して、これらを植物細胞に導入することができる。なお、これらのベクターは、上記のvir領域を有していないので、該ベクターを導入して用いるアグロバクテリウム属の細菌は、vir領域を含む他のプラスミドを有する必要がある。
【0031】
また、これらのベクターは、アグロバクテリウム属の細菌だけではなく、大腸菌においても増幅することができるシャトルベクターである。従って、Tiプラスミドの組換え操作は、大腸菌を用いて行うことができる。また、これらのベクターは、抗生物質耐性遺伝子を含んでおり、大腸菌、アグロバクテリウム属の細菌または植物細胞などを形質転換する際に、形質転換体を容易に選別することができる。さらに、これらのベクターには、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモーターが存在しており、これらのベクターに目的遺伝子を挿入して植物ゲノム中に組み込んだ後、非調節的に発現させることが可能となる。
【0032】
(4)形質転換植物細胞から植物体の再生
まず、ワタ植物以外の植物、例えば、シロイヌナズナについて、アグロバクテリウムによる目的遺伝子の導入および形質転換植物細胞の植物体への再生法を以下に詳述する。
【0033】
シロイヌナズナの種子を常法に従って播種し、無菌的に栽培する。発根した胚軸の切片を用いてカルス培養を行う。本発明の植物プロモーターに目的遺伝子を接続し、抗生物質耐性遺伝子を有するプラスミドにより形質転換したアグロバクテリウムを培養し、カルス化した胚軸の切片と共存培養する。アグロバクテリウムが肉眼で観察できるまで充分に増殖したら、除菌操作を行う。形質転換した切片は増殖を続け、カルスが現れてくる。抗生物質で選択しているので、非形質転換切片は褐変する。形質転換体が5cm程度の大きさになり、シュートを形成するまで培養する。完全なシュートの形状を示すようになったら、発根プレートに移植し、発根後、ロックウール上に定植する。
【0034】
発根した植物体を無機塩類培地に浸した土に移植して種子を得る。この種子を滅菌処理し、発芽させることにより形質転換体を得る。この形質転換体から常法に従ってDNAを抽出し、このDNAを適当な制限酵素で切断し、繊維形成および伸長に関与する遺伝子をプローブに用いてサザーンハイブリダイゼーションを行い、形質転換の有無を確認する。
【0035】
次に、ワタ植物について、アグロバクテリウムによる目的遺伝子の導入および形質転換植物細胞の植物体への再生法を以下に詳述する。
【0036】
形質転換は、エヌ・トロリンダー(N. Trolinder)らの方法[セオレティカル・アンド・アプライド・ジェネティクス(Theor. Appl. Genet.)(1992)83:645-649]で行うことができる。具体的には、まず、ワタ種子を殺菌した後、発芽させる。その胚軸をアグロバクテリウムに感染させ、培養を続ければ、数カ月でカルスが得られる。さらに生育させて直径1cm程度になれば、懸濁培養を行う。胚を約1cmに成熟させた後、培養チューブで発育させる。ある程度まで生育させた後、土壌に移植すれば、最終的に複数個の形質転換ワタ植物体が得られる。得られた形質転換体について、ゲノムDNAをPCR法で確認することで、目的遺伝子が導入されているかどうかを調べることができる。
【0037】
また、常法に従って形質転換体や非形質転換体からRNAを抽出し、繊維形成および伸長に関与する遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列を有するプローブを作成し、これらのプローブを用いてノーザンハイブリザイゼーションを行ない、目的遺伝子の発現の状態を調べることができる。
【0038】
(5)レポーター遺伝子を用いたプロモーターの強さの評価
本発明の植物プロモーターは、例えば、その3'末端にレポーター遺伝子、例えば、植物で広く用いられているGUS遺伝子を連結して用いれば、GUS活性を調べることでプロモーターの強さを簡単に評価することができる。なお、レポーター遺伝子としては、GUS遺伝子以外にも、ルシフェラーゼ、グリーンフルオレセイントプロテインなども用いることができる。
【0039】
【発明の効果】
繊維形成および伸長に関与する遺伝子は、ワタ繊維細胞において、ワタ繊維形成過程で発現し繊維伸長に関与するので、その塩基配列の上流領域などを用いることで、ワタ繊維の伸長に関与する転写因子などが同定される可能性がある。従って、本発明の植物プロモーターは、ワタ繊維形成および伸長に関与するプロモーターであり、繊維形成および伸長を誘導する技術の確立、繊維伸長に関与するシス因子やトランス因子の単離、繊維形成および伸長のメカニズムの解明またはそれを調節する遺伝子の単離に利用することができ、細胞形成および伸長に関する技術分野において極めて有用である。また、初期成長組織で発現を示すことより、初期成長組織で目的遺伝子をセンス方向やアンチセンス方向で発現させることにより、期待する変化を得ることができる。
【0040】
さらに、本発明の植物プロモーターは、繊維形成および伸長に関与するタンパクをコードする塩基配列と連結したキメラ遺伝子を作成し、特定の組織の植物細胞壁の構造を変化させることができ、産業分野で用いられる植物原料の加工に有用である。また、一般にCaMV35Sプロモーターを用いることによって、植物の器官全体に生活環の全過程を通して形態変化をもたらすことができる。光、熱、傷害などに対する調節性プロモーターを用いれば、生育環境に応じて、その形態が変化しうる植物体を作製することができる。また、器官または組織に特異的なプロモーターを用いれば、特定の器官または組織だけに形態変化を生じさせることができる。つまり、本発明のプロモーターを用いることによって、繊維の形成を制御し繊維特性の変化をもたらすことができる。また、初期成長組織においても適用できる。
【0041】
本発明の植物プロモーターを用いることにより、特定の植物組織で特異的に目的遺伝子を発現させることができる。特に植物の初期成長組織やワタ繊維で目的遺伝子を発現させることができる。例えば、本発明の植物プロモーターを用い、特定の遺伝子をワタ繊維で発現させることにより、ワタ繊維の繊維長、繊度、強度などの繊維特性の改善および生産性の向上を行うことが可能となる。換言すれば、本発明の植物プロモーターを利用することにより、より優れた繊維特性を有し、かつ生産性の高い新規なワタ品種を作出することができる。
【0042】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【0043】
実施例1
(1)ワタ繊維組織由来の遺伝子Gh3の上流領域(Gh10)のクローニング
ゴシピウム属(Gossypium)に属するワタ植物(コーカー312)を播種した後、100日目の植物体の葉から、マーレイ(Murray)およびトンプソン(Thompson)の改良法でゲノムDNAを抽出し、インバースPCR法でゲノムDNAのクローニングを行った。
【0044】
まず、1μgのゲノムDNAを制限酵素EcoRIで切断した後、T4ライゲースで自己連結させた。連結したDNA500μgを鋳型にしてTaqDNAポリメラーゼを用いて、Gh3遺伝子の上流領域(以下「Gh10」という)を増幅した。この反応は、配列番号2および3の塩基配列を有する第一プライマー群を用い、98℃、30秒間および68℃、6分間を35サイクル実施した。次に、このPCR産物を用いて、配列番号4および5の塩基配列を有する第二プライマー群を用いて、同様の条件でPCRを行った。このPCR産物を電気泳動に付して量および長さを確認し、得られたDNA断片をベクターpGEM−T(プロメガ社)に導入し、大腸菌(Escherichia coli)JM109を形質転換してクローニングした。こうして得られたプラスミドクローンをpGh10と命名した。その後、シーケネースシークエンスキット(アマシャム社)を用いて、pGh10の塩基配列を決定した。この塩基配列はプライマーの配列よりcDNAと全て一致し、cDNAに対応するゲノム領域であることが確認できた。この塩基配列を配列番号1に示す。
【0045】
(2)β−グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子との融合
NcoI制限酵素部位を有する3'末端のプライマー(5'-GCAATAGAAGCCATGGGAGAGAG-3')を合成した。このプライマーとT7プライマーを用いて、1069bpの断片をPCRで増幅した。この断片を制限酵素部位を用いてpGEM−Tベクターにサブクローニングした。サブクローニングされたものから制限酵素PstIおよびNcoIで切断して断片を取り出し、GUSレポーター遺伝子および35Sターミネーターに連結した。正しく連結されたプラスミドをpGh10:GUSと命名した。
【0046】
さらに、このプラスミドpGh10:GUSを制限酵素PstIで切断し、電気泳動後、断片をバイナリーベクターpCGN1578のPstI制限酵素部位に挿入して、新規なプラスミドpCGN−Gh10:GUSを得た。その概略を図1に示す。次に、このプラスミドpCGN−Gh10:GUSで大腸菌JM109を形質転換して、大腸菌JM109/pCGN−Gh10:GUSを得た。
【0047】
(3)プラスミドのアグロバクテリウムへの導入
(2)で得られた大腸菌JM109/pCGN−GGh10:GUSと、ヘルパープラスミドpRK2013を有する大腸菌とを、各々、50mg/lのカナマイシンを含むLB培地で、37℃で一晩培養した。別途、アグロバクテリウムEHA101株を50mg/lのカナマイシンを含むLB培地で37℃で二晩培養した。
【0048】
各培養液1.5mlをエッペンドルフチューブに取り、集菌した後、LB培地で洗浄した。これらの菌体を1mlのLB培地に懸濁後、三種の菌を100μlずつ混合し、LB寒天培地にプレートし、28℃で培養して両方のプラスミドをアグロバクテリウムに接合伝達させた。1〜2日後に一部を白金耳で掻き取り、50mg/lカナマイシン、20mg/lハイグロマイシンおよび25mg/lクロラムフェニコールを含むLB寒天培地上に塗布した。28℃で2日間培養後、単一コロニーを選択した。得られた形質転換体をEHA101/pCGN−GGh10:GUSと命名した。
【0049】
(4)形質転換ワタ植物体の作出
アグロバクテリウムEHA101/pCGN:GGh10:GUSを用いて、ワタ植物(コーカー312)を形質転換した。形質転換法としては、エヌ・トロリンダー(N. Trolinder)らの方法[セオレティカル・アンド・アプライド・ジェネティクス(Theor. Appl. Genet.(1992)83:645-649)]を用いた。コーカー312の種子を3%次亜塩素酸ナトリウム水溶液で20分殺菌した後、セファトキシム入りの滅菌水で3回洗浄した。次にスチュワート(Stewart)培地で6日間発芽させた。その胚軸を5mmほどに切断し、一晩培養したアグロバクテリウムを約10μl感染させ、0.8%アガロース培地上に置き、常温で暗所に3日間放置した。次に、この胚軸をB5ビタミン、30g/lグルコース、0.1mg/ml 2,4D、0.5mg/lカイネチン、1.6mg/mlゲルライト(ケルコ社製)、750μg/ml塩化マグネシウムを含むMS培地で、30℃、3日間前培養した。抗生物質は50μg/lカナマイシン、500μg/lセファタキシムを用いた。この後、植え継ぎは4週間毎に行った。
【0050】
細胞懸濁培養の開始および維持は、以下のように行った。得られたコーカー312のカルスが直径約1cm程度になった後で懸濁培養液に移した。培地はカルスイニシエーション培地と同じ組成であるが、ホルモンとゲル化剤を含まないものを使った。10mlの懸濁培養液には約100mgのカルスを用いた。培養は120rpm、30℃、照明下で行った。植え継ぎは約1カ月毎に行った。細胞懸濁培養液のプレーティングを行い、胚の発達は半固体の培地の上で行った。
【0051】
胚の発芽および植物体の再生には1cm以上になった成熟した胚を用いて、25×150mmの培養チューブ内で培養した。培養チューブには、0.1mg/lのIAA入りスチュワート・アンド・シュー(Stewart and Hsu)培地を含浸したバーミキュライトを満たした。胚は、90μEm-2g-1の光照射下、28℃で培養した。発芽およびシュート形成時には、新鮮な培地をバーミキュライトに補給した。最終的に複数個の形質転換ワタ植物体が得られた。このうち形質転換ワタ植物体#3−5、#4−1、#4−3、#4−9、#4−8について、遺伝子が導入されているかどうか、ゲノムDNAをPCR法で確認したところ、図2に示すように、明らかに導入されていることを示すDNA断片が得られた。
【0052】
(5)GUS活性の測定
得られた形質転換ワタ植物体を栽培し、組織をメスで切り取り、切片を数mlの固定液(0.03%ホルマリン、10mM MES(pH5.6)、0.3Mマンニトール)に室温で45分間浸した。次に50mMリン酸バッファー(pH7.0)で数回洗浄した。切片をGUS染色液(50mMリン酸バッファー、0.5Mフェリシアン化カリウム、0.5Mフェロシアン化カリウム、1mM X−Gluc)に浸し、真空装置で吸引して溶液を試料内部までよく染み込ませ、37℃で一晩インキュベートした。クロロフィルを除くため、5%ホルマリンに10分間浸した後、5%酢酸に10分間、50%エタノールに10分間、100%エタノールに10時間浸した。青く染まった組織を顕微鏡で観察したところ、形質転換ワタ植物体においてプロモーター活性が認められた。図3に示すように、開花後2日目の繊維(左)は染色されたが、野生型ワタ(右)は染色されなかった。図4に示すように、開花後12日目の繊維(右)も染色されたが、野生型ワタ(左)は染色されなかった。また、図5に示すように、花柱(右)も染色されたが、野生型ワタ(左)は染色されなかった。さらに、図6に示すように、葯(左)も染色されたが、野生型ワタ(右)は染色されなかった。
【0053】
また、GUS活性を測定したところ、図7に示すように、形質転換ワタ植物体#4−8および#4−9において発育中の胚珠で強いGUS活性が認められた。次に、様々な組織においてGUS活性を測定したところ、図8に示すように、花柱や葯に加えて、葉や花弁でも活性が認められた。
【0054】
これらの結果から、Gh10プロモーターは、ワタ植物の繊維、花弁、葯、花柱および葉においてプロモータ機能を有することが明らかである。
【0055】
【配列表】
【0056】
配列番号:2
配列の長さ:31
配列の形:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA
配列:
GTTTGGCAGC ACAGCAGATC TGCAAGCGAG C 31
【0057】
配列番号:3
配列の長さ:30
配列の形:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA
配列:
GCAGAACTTC TTGAGAAGCT GTGCAGTGAG 30
【0058】
【0059】
【図面の簡単な説明】
【図1】 β−グルクロニダーゼ(GUS)レポーター遺伝子がGh10プロモーターに連結されたpGh10:GUSキメラ遺伝子構築物の概念図である。この遺伝子構築物は、アグロバクテリウム感染による遺伝子組換えワタ植物の作出に用いられた。
【図2】 目的遺伝子の導入を確認するために形質転換ワタ植物体のゲノムDNAを用いたPCR法による分析の結果を示すバンド図である。
【図3】 開花後2日目のワタ胚珠のGUS染色を示す図(生物の形態を表す図面代用写真)である。
【図4】 開花後12日目のワタ胚珠のGUS染色を示す図(生物の形態を表す図面代用写真)である。
【図5】 ワタ花柱のGUS染色を示す図(生物の形態を表す図面代用写真)である。
【図6】 ワタ葯のGUS染色を示す図(生物の形態を表す図面代用写真)である。
【図7】 ワタ胚珠におけるGh10/GUS発現の蛍光定量分析の結果を示す棒グラフ図である。ここで、「DPA」という用語は開花後の日数(days post-anthesis)の略であり、例えば、「4DPA」は開花後4日目を表す。
【図8】 様々なワタ組織におけるGh10/GUS発現の蛍光定量分析の結果を示す棒グラフ図である。
Claims (2)
- 植物プロモーターを挿入した植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入して形質転換植物細胞を得て、該形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生し、得られた形質転換植物体から植物種子を得て、該植物種子から植物体を生産することを特徴とする植物体の製造法であって、
植物プロモーターが以下の ( a ) 、 ( b ) または ( c ) のDNAを含む繊維形成・伸長時の繊維組織および初期成長組織において機能を示す植物プロモーターであり
( a ) 配列番号1の塩基配列からなるDNA
( b )( a ) の塩基配列において1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ繊維形成・伸長時の繊維組織および初期成長組織において機能を示す植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA
( c )( a ) の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ繊維形成・伸長時の繊維組織および初期成長組織において機能を示す植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA、
植物プロモーターがそれに接続された目的遺伝子を、繊維形成・伸長時の繊維組織、ならびに花柱、葯、花弁および葉からなる群より選択される初期成長組織において発現させる、植物体の製造法。 - 配列番号1の塩基配列からなるDNAを含む植物プロモーターを挿入した植物発現ベクターを宿主ワタ植物細胞に導入して形質転換ワタ植物細胞を得て、該形質転換ワタ植物細胞から形質転換ワタ植物体を再生し、得られた形質転換ワタ植物体からワタ植物種子を得て、該ワタ植物種子からワタ植物体を生産することを特徴とするワタ植物体の製造法であって、
植物プロモーターが繊維形成・伸長時の繊維組織および初期成長組織において機能を示す植物プロモーターであり、
植物プロモーターがそれに接続された目的遺伝子を、繊維形成・伸長時の繊維組織、ならびに花柱、葯、花弁および葉からなる群より選択される初期成長組織において発現させる、ワタ植物体の製造法。
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