JP7482563B1 - シイノトモシビタケ由来の発光関連遺伝子 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]配列番号1で表されるアミノ酸配列又は配列番号1で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列;
配列番号2若しくは3で表されるアミノ酸配列又は配列番号2若しくは3で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列;
配列番号4若しくは5で表されるアミノ酸配列又は配列番号4若しくは5で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列;及び
配列番号6で表されるアミノ酸配列又は配列番号6で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列;
から選択される少なくとも1つの塩基配列を含む、核酸。
[2]配列番号1で表されるアミノ酸配列においてp.T6A、p.P22L、p.E82V、p.P84Q、p.V206I及びp.N241Dから選択される少なくとも1つの変異を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を含む、[1]に記載の核酸。
[3]配列番号7~9のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を含む、[2]に記載の核酸。
[4][1]~[3]のいずれかに記載の核酸を組み込んだ、発現用ベクター。
[5]植物発現用ベクターである、[4]に記載の発現用ベクター。
[6][1]~[3]のいずれかに記載の核酸を含む、トランスジェニック生物。
[7]植物細胞である、[6]に記載のトランスジェニック生物。
[8]カルスである、[6]に記載のトランスジェニック生物。
[9]植物体である、[6]に記載のトランスジェニック生物。
[10][5]に記載の発現用ベクターを用いて、植物細胞、カルス又は植物体を形質転換することを含む、トランスジェニック生物の製造方法。
1-1 概要
本発明の第1の実施形態は、配列番号1で表されるアミノ酸配列又は配列番号1で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列;配列番号2若しくは3で表されるアミノ酸配列又は配列番号2若しくは3で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列;配列番号4若しくは5で表されるアミノ酸配列又は配列番号4若しくは5で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列;及び配列番号6で表されるアミノ酸配列又は配列番号6で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列;から選択される少なくとも1つの塩基配列を含む、核酸である。より具体的には、本実施形態は、シイノトモシビタケのルシフェラーゼ(Luz)(配列番号1)又はその変異体、ヒスピジンシンターゼ(HispS)(配列番号2若しくは3)又はその変異体、ヒスピジン-3-ヒドロキシラーゼ(H3H)(配列番号4若しくは5)又はその変異体、及びカフェオイルピルビン酸ヒドロラーゼ(CPH)(配列番号6)又はその変異体から選択されるタンパク質に関する発光関連遺伝子に関する。
「核酸」とは、デオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)を指すが、本明細書においては、特に記載のない限り、DNAを指すものとする。
配列同一性(%)=一致数(ギャップ同士は無視する)/短いほうの配列長(ギャップを含まない長さ)×100・・・式(1)
本実施形態の核酸は、シイノトモシビタケの発光関連遺伝子又はその変異体を含む核酸である。
本実施形態の核酸は、シイノトモシビタケ由来のLuz(以下、本項において、単に「Luz」とも称する)をコードする核酸を選択的に含む。本実施形態において、Luzとは、配列番号1に示すアミノ酸配列又は配列番号1で表される配列と90%以上、好ましくは、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、又は99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ルシフェリンを酸化する機能を有するタンパク質を指す。
本実施形態の核酸は、シイノトモシビタケ由来のHispS(以下、本項において、単に「HispS」とも称する)をコードする核酸を選択的に含む。本実施形態において、HispSは、配列番号2若しくは3に示すアミノ酸配列又は配列番号2若しくは3で表される配列と90%以上、好ましくは、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、又は99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、コーヒー酸とマロニルCoAからヒスピジンが生成される反応を触媒する機能を有するタンパク質を指す。
本実施形態の核酸は、シイノトモシビタケ由来のH3H(以下、本項において、単に「H3H」とも称する)をコードする核酸を選択的に含む。本実施形態において、H3Hは、配列番号4若しくは5に示すアミノ酸配列又は配列番号4若しくは5で表される配列と90%以上、好ましくは、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、又は99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ヒスピジンの3位の炭素にヒドロキシ基を付加する機能を有するタンパク質を指す。
本実施形態の核酸は、シイノトモシビタケ由来のCPH(以下、本項において、単に「CPH」とも称する)をコードする核酸を選択的に含む。本実施形態において、CPHは、配列番号6に示すアミノ酸配列又は配列番号6で表される配列と90%以上、好ましくは、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、又は99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、オキシルシフェリンからコーヒー酸を生成する機能を有するタンパク質を指す。
本発明の第2の実施形態は、発現用ベクターである。本実施形態の発現用ベクターは、「1.発光関連遺伝子(核酸)」の項に記載の核酸を含む、ことを特徴とする。
Luz遺伝子:配列番号1で表されるアミノ酸配列又は配列番号1で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する;
HispS遺伝子:配列番号2若しくは3で表されるアミノ酸配列又は配列番号2若しくは3で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する;
H3H遺伝子:配列番号4若しくは5で表されるアミノ酸配列又は配列番号4若しくは5で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する;
CPH遺伝子:配列番号6で表されるアミノ酸配列又は配列番号6で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する。
本発明の第3の実施形態は、トランスジェニック生物である。本実施形態のトランスジェニック生物は、「1.発光関連遺伝子(核酸)」の項に記載の核酸を含む、ことを特徴とする。より具体的には、本実施形態のトランスジェニック生物は、シイノトモシビタケ由来の発光関連遺伝子により形質転換された生物を指す。好ましくは、本実施形態のトランスジェニック生物は、「2.発光関連遺伝子発現用ベクター」の項に記載の発現用ベクターの導入により得られる。好ましくは、本実施形態のトランスジェニック生物は、暗所で視認可能な程度に生物発光が見られる。
Luz遺伝子:配列番号1で表されるアミノ酸配列又は配列番号1で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する;
HispS遺伝子:配列番号2若しくは3で表されるアミノ酸配列又は配列番号2若しくは3で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する;
H3H遺伝子:配列番号4若しくは5で表されるアミノ酸配列又は配列番号4若しくは5で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する;
CPH遺伝子:配列番号6で表されるアミノ酸配列又は配列番号6で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する。
本発明の第4の実施形態は、トランスジェニック生物の製造方法である。より具体的には、本実施形態の方法は、「2.発光関連遺伝子発現用ベクター」の項に記載の発現用ベクターのうち、植物発現用ベクターを用いて、植物細胞、カルス又は植物体を形質転換することを含む、ことを特徴とする。
Luz遺伝子:配列番号1で表されるアミノ酸配列又は配列番号1で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する;
HispS遺伝子:配列番号2若しくは3で表されるアミノ酸配列又は配列番号2若しくは3で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する;
H3H遺伝子:配列番号4若しくは5で表されるアミノ酸配列又は配列番号4若しくは5で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する;
CPH遺伝子:配列番号6で表されるアミノ酸配列又は配列番号6で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する。
本発明の第5の実施形態は、植物を発光させる方法である。本実施形態の方法は、具体的には「4.生物発光能を有するトランスジェニック生物の製造方法」の項に記載の方法で製造されたトランスジェニック生物(植物)を発光させる方法である。前記トランスジェニック生物は、ルシフェリン前駆体であるコーヒー酸を含み、かつ、コーヒー酸からルシフェリンを生合成する機能、ルシフェリンを酸化する機能、さらにオキシルシフェリンからコーヒー酸を再生する機能を有することから、通常の栽培により、自発発光させることが可能である。
シイノトモシビタケ発光子実体0.05gからIsogen(ニッポンジーン)を用いてRNAを抽出し、50μLの水に溶解して、RNA液を調製した。
RNA液1μLと下記リンカーオリゴdTプライマー(配列番号18)、逆転写酵素SuperScriptIII(ThermoFisher)を用いて逆転写反応を行い、逆転写産物を得た。
リンカーオリゴdTプライマー ACTCGAATTCACGCGGCCGCATTTTTTTTTTTTTTT (配列番号18)
フォワードプライマー CGCCTTCCCGAGAAACGCAGGTGG (配列番号19)
リバースプライマー AGTCATGGTAGTCGTGCATATG (配列番号20)
PCR産物について、常法に従って、アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルグリーン(Biotium社)染色を行うことで、DNA断片を確認した(図2)。
フォワードプライマー CAACACGTCGAACCGGAATT (配列番号21)
リバースプライマー GAATATGGCCTCCGCATGAA (配列番号22)
RNA液1μLと該リバースプライマーを用いて逆転写反応を行い、生成したcDNAを精製し、ターミナルトランスフェラーゼ(タカラバイオ)を用いて3’末端にオリゴdAを付加した。
リバースプライマー CGACGTGTTGGTTCAACTGT (配列番号23)
オリゴdAを付加したcDNAについて、該プライマーと前記リンカーオリゴdTプライマーとを用いて、PCRを行った。常法に従って、PCR産物のDNA断片を確認した(図4)。最終的に、全長コーディング領域(luz(配列番号10))のcDNA配列が得られた。
Hispの保存領域として既知の配列に基づいて、以下の通りにプライマーを設計した。
フォワードプライマー TTCGCTCTCATGCTGGCCGTCTGG (配列番号24)
リバースプライマー AGGGTCGCTGTGCCGATATCCTGCAT (配列番号25)
実施例2で調製した逆転写反応物を鋳型として、上記プライマーセットを用いてPCR反応を行った。常法に従って、PCR産物のDNA断片を確認した(図5)。
フォワードプライマー GGCTGTAGGCGAAAACCATCCTTA (配列番号26)
フォワードプライマー GAYRTNGGNCCNCARVYNGTNGC (配列番号27)
前記PCR産物を鋳型として、下記プライマーと前記リンカーオリゴdTプライマーとを用いてネステッドPCRを行った。常法に従って、PCR産物のDNA断片を確認した(図7)。
逆転写用リバースプライマー AGGGGAACTGCCTTCAGATT (配列番号28)
リバースプライマー GCTGATGAGGTGAAGAGGTA (配列番号29)
リンカーオリゴdTプライマーと逆転写用リバースプライマー(配列番号28)を用いて、RNA液からの逆転写反応を行い、得られた逆転写産物を鋳型として、リンカーオリゴdTプライマーとPCR用のリバースプライマー(配列番号29)を用いて、PCRを行った。常法に従って、PCR産物のDNA断片を確認した(図8)。
フォワードプライマー TTCAAGCCCAACCATAACTGCAGCACAGGT (配列番号30)
リバースプライマー CACAAAACGTGAAATGAAAATTGTACAAAACAATCAAGCAGAAGA (配列番号31)
前記逆転写反応物をテンプレートとして、上記プライマーセットを用いてPCRを行った。常法に従って、PCR産物のDNA断片を確認した(図9)。その結果、全長コーディング領域のcDNA配列が得られた。この中には、2種類の配列(hisps1、hisps2(配列番号11、12))が含まれていた。
H3Hの保存領域として既知の配列から、下記フォワードプライマー(配列番号32)を設計した。
フォワードプライマー TTYVRVGAYTAYCAYCCRCGNTT (配列番号32)
実施例2と同様に調製した逆転写反応物を鋳型として、上記フォワードプライマーと前記リンカーオリゴdTプライマーを用いて3’RACEを行った。常法に従って、PCR産物のDNA断片を確認した(図10)。これにより、3’側コーディング領域末端を含むcDNA断片を得た。
逆転写用リバースプライマー TCTTCTAGCCCCATTCCGAA (配列番号33)
PCR用リバースプライマー AAGTGTGGGAAGCGATGCAT (配列番号34)
リンカーオリゴdTプライマーと逆転写用リバースプライマー(配列番号33)を用いて、RNA液からの逆転写反応を行い、得られた逆転写産物を鋳型として、リンカーオリゴdTプライマーとPCR用のリバースプライマー(配列番号34)を用いて、PCRを行った。常法に従って、PCR産物のDNA断片を確認した(図11)。
フォワードプライマー ACCCTCTCATATGTCTCCCATCCGCACACA (配列番号35)
リバースプライマー GAGAGCTCAGGGCTAGTGCAAGTCAT (配列番号36)
上記プライマーセットを用いて、RNA液からのRT-PCRを行い、DNA断片を得た(図12)。この中には、2種類の配列(h3h1、h3h2(配列番号13、14))が含まれていた。
H3Hの保存領域として既知の配列から、下記のフォワードプライマー(配列番号37)を設計した。
フォワードプライマー TCNCARTGGTGTTTYTCNAARRGNTT (配列番号37)
前記逆転写反応物を鋳型として、前記フォワードプライマーとリンカーオリゴdTプライマーを用いて3’RACEを行い、3’側コーディング領域末端を含むcDNA断片を得た(図13)。
逆転写用リバースプライマー AGAGGCGGTTTCTTCACGAA (配列番号38)
PCT用リバースプライマー GAATATCTGGTCGGAGGTGT (配列番号39)
最終的に、全長コーディング領域(cph(配列番号15))のcDNA配列が得られた。
(1)HispS発現カセット
HispS1のコーディング領域(配列番号11)をクローニングしたプラスミド(pCR-Blunt II-TOPO、ThermoFisher)を鋳型として、HispSのコーディング領域を増幅するプライマーセット(配列番号40、41)を用いてPCRを行い、得られたDNA断片をIn-fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ)を用いて、植物形質転換用プラスミドpRI201-AN(タカラバイオ)のNdeI、SacIサイトに挿入した(プラスミド1)。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGCCTTTACCTTCCGAATTCACCTCCCTC (配列番号40)
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGCGGAGGTGAGTAATCACTTCTCCATGTATTGTT (配列番号41)
コウジカビPPTaseのアミノ酸配列をもとに、植物コドンに最適化したコーディング配列を合成した(配列番号16)。PPTaseのコーディング領域を増幅するプライマーセット(配列番号42、43)を設計し、これを用いて前記コーディング配列を鋳型としてPCRを行い、DNA断片を得た。
フォワードプライマー AAATCAAGATTAACTATGCAACCACCTCAAGACGA (配列番号42)
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGAGCTCTTATTTTAAGCATTGAC (配列番号43)
さらに、カリフラワーモザイクウイルス35SプロモーターとシロイヌナズナCOR47の5’非翻訳領域(Yamasaki et al., J. Biosci. Bioeng, 125, 124-130, 2018)を含む断片を有するプラスミド(pBluescript-35S-COR47-FLuc-HSP)を鋳型として、この断片を増幅するプライマーセット(配列番号44、45)を用いてPCRを行い、DNA断片を得た。
フォワードプライマー GGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGT (配列番号44)
リバースプライマー AGTTAATCTTGATTTGATTAAAAGT (配列番号45)
フォワードプライマー TGCGGCCGCTGGATCGTCGACTCTAGATTAGCCTTTTC (配列番号46)
リバースプライマー CGAATTCCCGGGATCCAGCGGCCGCAGGTA (配列番号47)
前記逆転写反応物を鋳型として、CPHのコーディング領域(配列番号15)を増幅するプライマーセット(配列番号48、49)を用いてPCRを行い、得られたDNA断片をIn-fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ)を用いて、植物形質転換用プラスミドpRI201-AN(タカラバイオ)のNdeI、SacIサイトに挿入した。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGTCTCCCATCCGCACACA (配列番号48)
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGTCAGGGCTAGTGCAAGTCAT (配列番号49)
フォワードプライマー TGCGGCCGCTGGATCAAGCTTGCATGCCTGCAGGT (配列番号50)
リバースプライマー CGAATTCCCGGGATCCAGCGGCCGCAGGTA (配列番号51)
H3H1のコーディング領域(配列番号13)をクローニングしたプラスミド(pCR-Blunt II-TOPO)を鋳型として、H3Hのコーディング領域を増幅するプライマーセット(配列番号52、53)を用いてPCRを行い、得られたDNA断片をIn-fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ)を用いて、植物形質転換用プラスミドpRI201-AN(タカラバイオ)のNdeI、SacIサイトに挿入した。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGTCAACCGACGCAGA (配列番号52)
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGCGTCGAATCTGATTGGAGA (配列番号53)
フォワードプライマー TGCGGCCGCTGGATCAAGCTTGCATGCCTGCAGGT (配列番号54)
リバースプライマー CGAATTCCCGGGATCCAGCGGCCGCAGGTA (配列番号55)
Luzのコーディング領域(配列番号10)をクローニングしたプラスミド(pRSETB)を鋳型として、Luzのコーディング領域を増幅するプライマーセット(配列番号56、57)を用いてPCRを行い、得られたDNA断片をIn-fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ)を用いて、植物形質転換用プラスミドpRI201-AN(タカラバイオ)のNdeI、SacIサイトに挿入した。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGGAAATCAGCTGGACGAC (配列番号56)
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGCTAGATGCTCCCATCAATGG (配列番号57)
フォワードプライマー TGCGGCCGCTGGATCAAGCTTGCATGCCTGCAGGT (配列番号58)
リバースプライマー CGAATTCCCGGGATCCAGCGGCCGCAGGTA (配列番号59)
プラスミド5は、配列番号17に示す塩基配列を有する。具体的には、シイノトモシビタケ由来のHispS、コウジカビ由来のPPTase、シイノトモシビタケ由来のCPH、シイノトモシビタケ由来のH3H及びシイノトモシビタケ由来のLuzの発現カセットがタンデムに配置された構造を有する。
比較対象用に、ヤコウタケの発光関連遺伝子のクローニングを行った。シイノトモシビタケ由来のLuz、HispS、H3H及びCPHのコーディング領域に代えて、ヤコウタケのLuz、HispS、H3H及びナラタケのCPH(それぞれ配列番号60、61、62及び63のアミノ酸配列を有する)のコーディング領域(それぞれ配列番号64、65、66及び67)の発現カセットを使用した以外は、(1)~(5)と同様に植物形質転換用プラスミドpRI201-AN(タカラバイオ)に各発現カセットを挿入し、プラスミド5’を調製した。
実施例6で調製したプラスミド5を、アグロバクテリウムGV3101系統に導入し、50μg/mLカナマイシン、12.5μg/mLゲンタマイシンを含むLB液体培地で培養した。集菌後、50mM塩酸マグネシウム、5mMモルフォリノエタンスルホン酸、200μMアセトシリンゴン(pH5.7)に、OD500が0.2となるよう懸濁した。18℃、4時間静置後、菌懸濁液をシリンジにとり、シリンジの先端をベンサミアナタバコの葉裏に押し当て、ピストンを押して、気孔を通して菌懸濁液を葉肉細胞の間隙に導入した。3日以上経過後、発光の観察を行った。比較対象として、プラスミド5に代えて、実施例6(6)で調製したヤコウタケの発光関連遺伝子を発現するプラスミド5’を用いた。その結果、シイノトモシビタケ由来の発光関連遺伝子が、ヤコウタケ由来の発光関連遺伝子よりも強い発光能を植物に付与することが確認できた(図15)。
(1)シイノトモシビタケLuz発現プラスミドの調製
Luzのコーディング領域(配列番号10)をクローニングしたプラスミド(pRSETB)を鋳型として、Luzのコーディング領域を増幅するプライマーセット(配列番号56、57)を用いてPCRを行い、シイノトモシビタケLuz遺伝子を増幅した。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGGAAATCAGCTGGACGAC (配列番号56)
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGCTAGATGCTCCCATCAATGG (配列番号57)
得られた増幅産物をNdeI、SacIで処理して、植物形質転換用プラスミドpRI201-AN(タカラバイオ)のNdeI、SacIサイトに挿入した。
ヤコウタケ発光子実体よりRNAを抽出し、リンカーオリゴdTプライマーを用いて逆転写後、下記プライマーセット(配列番号68、69)を用いてPCRを行い、ヤコウタケLuz遺伝子を増幅した。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGGTCCAACTCACCCGAAC (配列番号68)
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGATCCTTCGCCCACACTTCCA (配列番号69)
得られた増幅産物をNdeI、SacIで処理して、植物形質転換用プラスミドpRI201-AN(タカラバイオ)のNdeI、SacIサイトに挿入した。
プラスミドp305-FBP_4(配列番号70、AddGeneより入手)をテンプレートとして、下記のプライマーセット(配列番号71、72)を用いてPCRを行い、シロヒカリタケLuz遺伝子を増幅した。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGCGTATAAATATCTCTCTGTC (配列番号71)
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGTCATTTGGCATTCTCGACGAT (配列番号72)
得られた増幅産物をNdeI、SacIで処理して、植物形質転換用プラスミドpRI201-AN(タカラバイオ)のNdeI、SacIサイトに挿入した。
シイノトモシビタケ由来のHispS、H3H、CPHをコードする遺伝子の発現カセットに代えて、ヤコウタケのHispS(配列番号61)、ヤコウタケのH3H(配列番号62)、及びナラタケのCPH(配列番号63)をコードする各遺伝子(配列番号65、66及び67)の発現カセットを組み込んだ以外は、実施例6の(1)~(4)と同様にして、HispS、PPTase、H3H、CPH発現プラスミド(プラスミド4’)を調製した。
(1)~(4)で調製した発現プラスミドを、それぞれアグロバクテリウムに導入した。各種Luz発現プラスミドを導入したアグロバクテリウムを、それぞれプラスミド4’を導入したアグロバクテリウムと組み合わせて、ベンサミアナタバコ葉に共感染させた。感染7日後に、ベンサミアナタバコ葉の発光像をイメージアナライザーLAS-1000(富士フイルム社、露光10秒)で撮影し、Fusion FX7 Edgeソフトウェア(Vivilber社)で発光を定量化した。図16は、ベンサミアナタバコ葉上の、シイノトモシビタケLuz、ヤコウタケLuz及びシロヒカリタケLuzの遺伝子を導入したアグロバクテリウムの感染箇所を、明視野及び暗視野で観察した写真である。図17は、各感染箇所の発光量を定量化したグラフである。シイノトモシビタケLuz遺伝子を導入したアグロバクテリウムを感染させた箇所の発光量は、他のLuz遺伝子を導入した例と比較して非常に高くなった。
pRI201-ANプラスミドに、実施例2で得られたシイノトモシビタケLuz遺伝子を挿入したものをテンプレートに、下記のプライマーセット(配列番号73、74)を用いてPCRを行い、シイノトモシビタケLuz遺伝子を増幅した。
フォワードプライマー AGAGGTAATACCATATGGAAATCAGCTGGACGAC (配列番号73)
リバースプライマー ATGGATCCTAGATGCTCCCATCAATGG (配列番号74)
増幅DNA断片をNdeIとBamHI制限酵素で処理後、ポリヒスチジン配列を付加したpColdIVプラスミド(タカラバイオ社)のNdeIとBamHIサイトにライゲーションした。これを野生型シイノトモシビタケLuz発現プラスミドとした。
フォワードプライマー CCGAAAGGCACACTTAATTATTAAGAGGTAATACCATATG (配列番号75)
リバースプライマー CTAGATCAATGGTGATGGTGATGATGGGATCC (配列番号76)
増幅DNA断片をNdeIとBamHI制限酵素で処理後、ポリヒスチジン配列を付加したpColdIVプラスミドのNdeIとBamHIサイトにライゲーションした。このライゲーションしたプラスミドを大腸菌に導入して、LBプレートに蒔き、コロニーが形成された後にナイロン膜に移し取った。ナイロン膜を0.2mMIPTGを含むLBプレート上に置き、15℃で一晩置いた。このプレートに10μM 3-ヒドロキシヒスピジンを含む6mL PBS(タカラバイオ社)を注ぎ、イメージアナライザーLAS-3000(富士フイルム社)で、感度:スーパー、5分露光の条件で発光映像を取得した。得られた像から、強い発光を示す大腸菌を選抜した(1次スクリーニング)。
Claims (11)
- 配列番号7で表されるアミノ酸配列、若しくは、配列番号7で表されるアミノ酸配列の22番目及び241番目に相当するアミノ酸がそれぞれロイシン(L)、アスパラギン酸(D)であり、全体として配列番号7で表されるアミノ酸配列と91%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列;配列番号8で表されるアミノ酸配列、若しくは、配列番号8で表されるアミノ酸配列の6番目及び82番目に相当するアミノ酸がそれぞれアラニン(A)、バリン(V)であり、全体として配列番号8で表されるアミノ酸配列と91%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列;又は、配列番号9で表されるアミノ酸配列、若しくは、配列番号9で表されるアミノ酸配列の84番目及び206番目に相当するアミノ酸がそれぞれグルタミン(Q)、イソロイシン(I)であり、全体として配列番号9で表されるアミノ酸配列と91%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列;を含む、ルシフェリンを酸化し発光させる機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含み、
前記タンパク質のルシフェリンを酸化し発光させる機能は、配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質よりも高い、
核酸。 - 請求項1に記載の核酸を組み込んだ、発現用ベクター。
- 植物発現用ベクターである、請求項2に記載の発現用ベクター。
- 請求項1に記載の核酸を含む、非ヒトトランスジェニック生物。
- 植物細胞である、請求項4に記載の非ヒトトランスジェニック生物。
- カルスである、請求項4に記載の非ヒトトランスジェニック生物。
- 植物体である、請求項4に記載の非ヒトトランスジェニック生物。
- 請求項3に記載の発現用ベクターを用いて、植物細胞、カルス又は植物体を形質転換することを含む、非ヒトトランスジェニック生物の製造方法。
- 請求項1に記載の核酸を含む、発現カセット。
- 請求項9に記載の発現カセットが、
配列番号2若しくは3で表されるアミノ酸配列又は配列番号2若しくは3で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、コーヒー酸とマロニルCoAからヒスピジンが生成される反応を触媒する機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を含む、発現カセット;
配列番号4若しくは5で表されるアミノ酸配列又は配列番号4若しくは5で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ヒスピジンの3位の炭素にヒドロキシ基を付加する機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を含む、発現カセット;及び
配列番号6で表されるアミノ酸配列又は配列番号6で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、カフェオイルピルビン酸からコーヒー酸を生成する機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を含む、発現カセット;
から選択される少なくとも1つと、プラスミド内でタンデムに配置される発現カセット。 - 請求項9に記載の発現カセットと、
配列番号2若しくは3で表されるアミノ酸配列又は配列番号2若しくは3で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、コーヒー酸とマロニルCoAからヒスピジンが生成される反応を触媒する機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を含む、発現カセット;
配列番号4若しくは5で表されるアミノ酸配列又は配列番号4若しくは5で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ヒスピジンの3位の炭素にヒドロキシ基を付加する機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を含む、発現カセット;及び
配列番号6で表されるアミノ酸配列又は配列番号6で表される配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、カフェオイルピルビン酸からコーヒー酸を生成する機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を含む、発現カセット;
から選択される少なくとも1つの発現カセットとの組み合わせ物。
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