JP4853853B2 - 新規芳香族アシル基転移酵素遺伝子 - Google Patents
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Description
(b)配列番号2、4、6、8、10、若しくは12に記載のアミノ酸配列において一個又は複数個のアミノ酸が付加、欠失及び/又は他のアミノ酸により置換されているアミノ酸配列を有するタンパク質、
(c)配列番号2、4、6、8、10、若しくは12に記載のアミノ酸配列に対して20%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
(d)配列番号2、4、6、8、10、若しくは12に記載のアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(b)配列番号14、16、若しくは18に記載のアミノ酸配列において一個又は複数個のアミノ酸が付加、欠失及び/又は他のアミノ酸により置換されているアミノ酸配列を有するタンパク質、
(c)配列番号14、16、若しくは18に記載のアミノ酸配列に対して20%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
(d)配列番号14、16、若しくは18に記載のアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(1−1)第一の遺伝子
本発明の第一の遺伝子は、1-O-アシル-β-D-グルコースをアシル基供与体とし、芳香族アシル基をフラボノイドの糖残基へ転移させる活性を有するタンパク質をコードするものである。
ここで「配列番号2、4、6、8、10、若しくは12に記載のアミノ酸配列を有する」とは、配列番号2、4、6、8、10、若しくは12に記載のアミノ酸配列のみからなるタンパク質だけでなく、このようなタンパク質のN末端又はC末端側に複数のアミノ酸が付加したタンパク質をも含む趣旨である。付加するアミノ酸の個数は、上記アシル基転移活性を失わせない範囲であれば特に限定されないが、通常は400個以内であり、好ましくは50個以内である。
このような付加、欠失、置換されているアミノ酸配列を有するタンパク質は、天然のものでもよく、また、人工的なものであってもよい。付加、欠失、置換するアミノ酸の個数は上記アシル基転移酵素活性を失わせない範囲であれば特に限定されないが、通常は20個以内であり、好ましくは5個以内である。
ここで「一定以上の相同性」とは、通常は20%以上の相同性、好ましくは50%以上の相同性、より好ましくは60%以上の相同性、最も好ましくは70%以上の相同性を意味する。
ここで「核酸の一部」とは、例えば、コンセンサス配列領域の6個以上のアミノ酸配列をコードする部分などを意味する。「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいい、例えば、温度が50℃、塩濃度が5×SSC(又はこれと同等の塩濃度)といった条件である。なお、適切なハイブリダイゼーション温度は、核酸の塩基配列やその核酸の長さによって異なり、例えば、アミノ酸6個をコードする18塩基からなるDNAフラグメントをプローブとした場合には50℃以下の温度が好ましい。
本発明の第二の遺伝子は、UDP-グルコースをグルコシル基供与体とし、ヒドロキシケイ皮酸の1位水酸基へグルコシル基を転移させる活性を有する、チョウマメ及びロベリア由来のアシル基供与体を合成するタンパク質をコードする遺伝子である。
ここで「配列番号14、16、若しくは18に記載のアミノ酸配列を有する」とは、配列番号14、16、若しくは18に記載のアミノ酸配列のみからなるタンパク質だけでなく、このようなタンパク質のN末端又はC末端側に複数のアミノ酸が付加したタンパク質をも含む趣旨である。付加するアミノ酸の個数は、上記グルコシル基転移活性を失わせない範囲であれば特に限定されないが、通常は400個以内であり、好ましくは50個以内である。
このような付加、欠失、置換されているアミノ酸配列を有するタンパク質は、天然のものでもよく、また、人工的なものであってもよい。付加、欠失、置換するアミノ酸の個数は上記グルコシル基転移活性を失わせない範囲であれば特に限定されないが、通常は20個以内であり、好ましくは5個以内である。
ここで「一定以上の相同性」とは、通常は20%以上の相同性、好ましくは50%以上の相同性、より好ましくは60%以上の相同性、最も好ましくは70%以上の相同性を意味する。
本発明のベクターは、既知の発現ベクターに(1)の遺伝子を挿入することにより作製できる。
本発明における形質転換された宿主細胞とは、(2)のベクターにより形質転換された宿主細胞である。
上記(1)の遺伝子によってコードされるタンパク質も本発明に含まれる。このタンパク質は、例えば、後述する(5)の方法によって製造することができる。
本発明のタンパク質の製造方法は、(3)の宿主細胞を培養し、又は生育させ、その後、該宿主細胞から1-O-アシル-β-D-グルコースをアシル基供与体とし、芳香族アシル基をフラボノイドの糖残基へ転移させる活性を有するタンパク質、又はUDP-グルコースをグルコシル基供与体とし、ヒドロキシケイ皮酸の1位水酸基へグルコシル基を転移させる活性を有する、チョウマメ及びロベリア由来のアシル基供与体を合成するタンパク質を採取すること、もしくはin vitro translation 法などによるタンパク質の製造を特徴とするものである。宿主細胞の培養又は生育は、その宿主細胞の種類に応じた方法に従って行うことができる。タンパク質の採取は常法に従って行うことができ、例えば、培養細胞や培地等から濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等により回収、精製することにより、目的のタンパク質を得ることができる。
本発明の植物は、上記(1)の遺伝子又は(2)のベクターが導入され形質転換されたものである。
上記(6)の植物の子孫も本発明に含まれる。
上記(6)の植物又は(7)の植物の子孫の細胞、組織、器官も本発明に含まれる。
上記(6)の植物又は(7)の植物の子孫の切り花も本発明に含まれる。
上記(1−1)の遺伝子又は(2)のベクター(第一の遺伝子を含むもの)を植物又は植物細胞に導入し、該遺伝子を発現させることによる、1-O-アシル-β-D-グルコースをアシル基供与体とし、芳香族アシル基をフラボノイドの糖残基へ転移させる方法も本発明に含まれる。
本発明の花色の調節方法は、上記(1)の遺伝子又は(2)のベクターを植物又は植物細胞に導入し、該遺伝子を発現させることにより、あるいは、上記(1)の遺伝子を持つ植物において、該遺伝子の発現を抑制することにより、植物体の花や果実の色を調節するものである。遺伝子導入の対象とする植物は特に限定されず、例えば、上記(6)で例示した植物を使用できる。また、(1)の遺伝子の抑制対象とする植物は(1)の遺伝子を持つ植物であれば特に限定されない。
(1)植物材料の調製
チョウマメ‘ダブルブルー’(Clitoria ternatea cv. Double blue)(サカタのタネ)を常法により無菌播種して発根させたのちにガラス温室にて育苗、生育させた。エゾリンドウ‘八甲田’(Gentiana triflora cv. Hakkoda)は青森県下にて栽培されていた植物体を切り花として採取し花弁のみを調整した。ロベリア‘リビエラ・ミッドナイト・ブルー’(Lobelia erinus cv. Riviera Midnight Blue)、‘アクア・ホワイト’(L. erinus cv. Aqua White)、‘アクア・ラベンダー’(L. erinus cv. Aqua Lavender)、‘アクア・ブルー’(L. erinus cv. Aqua Blue)(タキイ種苗)はガラス温室にて播種後ポリポットにて開花まで生育させた。開花花弁及び花蕾花弁は採取後、液体窒素にて瞬間的に凍結し、-80℃で保存した。
1-O-ヒドロキシシンナモイル-β-D-グルコース類(Milkowski et al., (2000) FEBS Letters 486: 183-184、Bokern and Strack(1988)Planta 174:101-105、Bokern et al., (1991) Planta 184: 261-270、Bokern et al., (1992) Botanica Acta 105: 146-151)の標品、すなわち、1-O-p-クマロイル-β-D-グルコース, 1-O-カフェオイル-β-D-グルコース, 1-O-フェルロイル-β-D-グルコース、及び1-O-シナポイル-β-D-グルコースはDr. Alfred Baumert及びProf. Dieter Strack (Leibniz IPB, Halle, Germany)より分与された化合物を用いた。1-O-p-クマロイル-β-D-グルコースはチョウマメの花弁より、1-O-カフェオイル-β-D-グルコース, 1-O-フェルロイル-β-D-グルコースはロベリアの花弁より精製し単離した(数馬ら(2005)日本農芸化学会2005年大会講演要旨集:3)。デルフィニジン3-(6-マロニル)グルコシド3',5'-ジグルコシド(テルナチンC5、Terahara et al., (1998) Journal of Natural Products 61: 1361-1367)、デルフィニジン3, 3', 5'-トリグルコシド(プレテルナチンC5、Terahara et al., (1990) Phytochemistry 29: 3686-3687)、及びデルフィニジン3-(6-マロニル)グルコシド-3'-グルコシド(Kazuma et al., (2005) Chemistry & Biodiversity 1: 1762-1770)はチョウマメの花弁より精製し単離した。
100mMリン酸緩衝液(pH 6.5)、0.4mMアントシアニン 4μl、0.5mM 1-O-アシル-β-D-グルコース 4μl及び酵素液8μlを含む反応液20μlを30℃で反応させた。1M塩酸水溶液4μlを加えて反応を停止させ、0.05M TFAを含む5%アセトニトリル24μlを加えた後、Millex-LHフィルター(ミリポア)によるろ過を行い、10μlをHPLCに注入して分析した。
1-O-アシル-β-D-グルコースをアシル基供与体とし、芳香族アシル基をフラボノイドの糖残基へ転移させる酵素活性を検出するために、1-O-アシル-β-D-グルコース及びアントシアニンの種類を検討した。チョウマメ花弁から抽出したタンパク質の35-70%の硫安沈殿画分を酵素溶液に、アシル基受容体にプレテルナチンC5、アシル基供与体に様々な1-O-アシル-β-D-グルコースを用いて酵素活性を測定した。その結果、試験に用いた全ての1-O-アシル-β-D-グルコースでアシル基転移酵素活性が検出でき、1-O-シナポイル-β-D-グルコース、1-O-フェルロイル-β-D-グルコース、1-O-p-クマロイル-β-D-グルコース、1-O-カフェオイル-β-D-グルコースの順で比活性が高いことが明らかになった。また、アシルドナーに1-O-p-クマロイル-β-D-グルコース、アクセプターに様々なアントシアニンを用いて酵素活性を測定した。その結果、試験に用いた全てのアントシアニン(プレテルナチンC5、テルナチンC5、デルフィニジン3-(6-マロニル)グルコシド-3'-グルコシド)においてアシル基転移酵素活性が検出できた。
チョウマメの花弁から、酵素活性測定の基質としてプレテルナチンC5および1-O-p-クマロイル-β-D-グルコースを用いて3'位グルコシル基の6位へp-クマロイル基を転移する活性を有するタンパク質であるアシル基転移酵素(3'AT)の精製を1,2-ジ-O-アシル-β-D-グルコースを生合成するグルコースアシル基転移酵素の精製方法(Li et al., (1999) Plant Physiology 121: 453-460、Li and Steffens (2000) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97: 6902-6907、PCT/WO97/48811)を参考にして行った。タンパク質の精製工程は0-4℃で行い、タンパク質抽出、硫安分画、TSK gel DEAE-TOYOPEARL 650M(東ソー)を用いたイオン交換クロマトグラフィー、コンカナバリンA(ConA)-アガロース(ホーネン)を用いたクロマトグラフィー、Mono P HR 5/20(アマシャムバイオサイエンス)を用いたクロマトグラフィー 及びMono Q HR 5/5(アマシャムバイオサイエンス)を用いたイオン交換クロマトグラフィーを順次行うことによって達成された。TSK gel DEAE-TOYOPEARL 650M、Mono P及びMono QによるカラムクロマトグラフィーにはFPLC(ファルマシア)を用いた。ConAアガロースによるカラムクロマトグラフィーはオープンカラムを用いた。
チョウマメの凍結花蕾510.5gを液体窒素存在下で乳鉢及び乳棒で磨砕した。さらに、約1000mlの緩衝液A(100mMトリス塩酸(pH7.5)、5mM ジチオスレイトール(DTT)、10μM p-アミジノフェニルフッ化メタンスルフォニル塩酸塩(pAPMSF))、ポリビニルポリピロリドン(PVPP)5g及び適量の海砂を加えて磨砕した。抽出懸濁液を7,000rpmで15分間遠心した後、上清を四重のガーゼで濾過した。上清の濾液に800gのDowex 1×2(100-200mesh、室町化学)を添加して15分間静置した後に、ナイロンメッシュを用いて濾過し、1240mlの粗酵素液を得た。
粗酵素液を35%飽和硫安で30分間塩析を行った後、不溶物を7,000 rpmで20分間遠心することにより除去した。70%飽和硫安で再び一晩塩析を行った後、7,000 rpmで20分間遠心することによりタンパク質の沈殿を得た。沈殿を緩衝液B(20mMトリス塩酸(pH 7.5)、1mM DTT、10μM pAPMSF)に再溶解した後、緩衝液Bで平衡化したSephadex G-25 Fine(70 mm×40 mm i.d.;アマシャムバイオサイエンス)カラムを用いて脱塩した。タンパク質画分(1598.4mg/144mL)を回収して以下のクロマトグラフィーに供した。
TSK gel DEAE-TOYOPEARL 650M 30mlをカラム(XK16/20, 180 mm×16 mm i.d.)に充填し緩衝液Bで平衡化した。カラムへ酵素溶液をアプライして流速 8 ml/分で塩化ナトリウム濃度を45分間に0 mMから200 mMへ変化させる直線勾配によりタンパク質を分画した。各画分のアシル基転移酵素活性を測定した後、活性のある画分840mlを集め、90%飽和硫安で一晩塩析を行った。7,000rpmで20分間遠心することにより得られたタンパク質の沈殿を40mlの緩衝液Bで再溶解した。溶解したタンパク質溶液を5mlずつ分注して以後の精製に用いるまで-80℃にて保存した。
凍結保存していたDEAE活性画分5mlを溶解した後、緩衝液C(50mM HEPES-NaOH(pH7.5)、10%グリセロール、0.2M KCl)で平衡化したゲル濾過カラムPD-10(アマシャムバイオサイエンス)を用いて脱塩した。脱塩したタンパク質溶液7mlを限外遠心濾過により0.5mlまで濃縮した。カラムに充填して緩衝液Cで平衡化したConAアガロース(4ml)にタンパク質濃縮液(0.5ml)をアプライした。タンパク質溶液のアプライ後、4ベット量の緩衝液C(16ml)にて洗浄した後に、Con-Aアガロースに吸着したタンパク質を3ベット量の緩衝液D(50mM HEPES-NaOH(pH 7.5)、10%グリセロール、0.2M KCl、1M α-D-メチルグルコシド)(12ml)で溶出した。溶出液を透析用チューブSnakeSkin Dialysis Tubing MWCO 10,000(PIERCE Biotechnology)に注入した後、緩衝液E(25mM ピペラジン-HCl(pH 5.5))(3,000ml)にて一晩透析した。PD-10を用いてさらに脱塩した後に、Amicon Ultra(分画分子量10,000、ミリポア)を用いた遠心濃縮を行って0.5mlのタンパク質溶液(0.5mg/ml)とした。
ConA活性画分(0.5ml)を緩衝液Eで平衡化したMono Pカラムに流速0.8ml/分でアプライした。タンパク質のアプライ後に緩衝液E(6ml)でカラムを洗浄した。1:10(v/v)に希釈したPolybuffer 74-HCl(pH4.0)(32ml)で溶出した。0.08mlの0.5M HEPES-NaOH(pH 7.5)と0.08mlのグリセロールを予め入れておいた試験管に0.8mlずつ分画した。活性のある画分を集め(8.8ml)遠心濃縮を行って1.5mlのタンパク質溶液とした。
Mono P活性画分(1.5ml)を緩衝液F(10mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM DTT、10μM pAPMSF)で平衡化したMono Q HR5/5カラムに流速1.0ml/分でアプライした。A液として緩衝液F(10mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM DTT、10μM pAPMSF)を、B液として緩衝液G(10mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM DTT、10μM pAPMSF、1M NaCl)を用い、60分でB液0%から25%の直線濃度勾配を行い1mlずつ分画した。活性画分を回収し(6ml)、遠心濃縮を行って0.1mlのタンパク質溶液(0.9μg/ml)とした。
3'ATタンパク質を精製する過程においてプレテルナチンC5のB環3'位及び5'位のグルコシル基を逐次的にアシル化する3'5'AT活性が検出された。硫安分画、DEAE陰イオン交換FPLC、ConAクロマトグラフィー、Mono P FPLC後の3'AT活性画分には3'5'AT活性も検出されたが、Mono Q FPLC後の3'AT画分には3'5'AT活性は検出されなかった。そこで酵素活性測定の基質としてプレテルナチンC5および1-O-フェルロイル-β-D-グルコースを用いて、3'位グルコシル基の6位へフェルロイル基を転移する活性を有するタンパク質であるアシル基転移酵素(3'AT)及び3'位及び5'位グルコシル基の両方の6位へフェルロイル基を転移する活性を有するタンパク質である3'5'ATの3'ATからの分画と部分精製を行った。
〔実施例3〕の(1)粗酵素液の調製および(2)硫安分画に準じた方法によってチョウマメ花弁101.4gから269.15mgの3'AT及び3'5'AT活性を有するタンパク質を含む画分(50ml)を得た。
緩衝液Bで平衡化したTSK gel DEAE-TOYOPEARL 650Mカラムへ酵素溶液をアプライし、流速 1 ml/分で塩化ナトリウム濃度を360分間に0mMから200mMへ変化させる直線勾配によりタンパク質を分画した。回収した3'AT活性画分(54ml)及び3'5'AT活性画分(42ml)を、90%飽和硫安で一晩塩析を行い、7,000 rpmで20分間遠心することにより得られたタンパク質の沈殿を〔実施例3〕(3)に準じた方法で再溶解した後に、〔実施例3〕(4)に準じた脱塩及び濃縮を行った。
カラムに充填して緩衝液Cで平衡化したConAアガロース(5ml)に3'AT及び3'5'AT各タンパク質濃縮液をアプライした。〔実施例3〕(4)に準じたクロマトグラフィー、透析及び脱塩を行った。
ConA活性画分を〔実施例3〕(5)に従ってクロマトグラフィー、脱塩及び濃縮を行った。3'AT活性画分の3'AT比活性は45.9pkat/mgであり、硫安分画後の比活性0.46pkat/mgの100倍にまで精製された。3'AT活性画分には3'5'AT活性も検出され、その比活性は3.6pkat/mgであった。一方、3'5'AT活性画分の3'5'AT比活性は9.6pkat/mgであり、硫安分画後の比活性0.13pkat/mgの74倍にまで精製された。3'5'AT活性画分には3'AT活性も検出され、その比活性は4.1pkat/mgであった。
〔実施例4〕により精製した3'ATタンパク質約65ngをSDS-PAGEにて分画後、PAGE Blue83(CBB R-250、第一化学)にて染色した。染色された30.8kDa及び24.1kDaのバンドをそれぞれ切り抜き、各試料名をCTDCPQ-30及びCTDCPQ-24とした。トリプシンを含むトリス緩衝液(pH8.0)を加えて35℃、20時間の処理を行った。その後、溶液の全量を逆相HPLCに供して、断片ペプチドを分離した。対象としてバンドのないゲル部分を切り出し、同様に処理をした。断片ペプチドのHPLC分離条件は以下の通りである。カラムはSymmetry C18 3.5μm(1.0×150mm、ウォーターズ)を用いた。流速は50μl/分で溶媒Aに0.1%TFAを含む2%アセトニトリル、溶媒Bに0.09%TFAを含む90%アセトニトリルを用い、はじめの6分間は溶媒B濃度を0%とし、その後5分で溶媒B濃度を10%に、その後75分で溶媒Bを50%に、その後の5分で溶媒Bを100%に濃度勾配をかけた後、5分間溶媒B100%とした。210nm及び280nmで検出を行い、50μlごとに分取を行った。
CTDCPQ-30-T44+45:(R/K)ISFAHILER(配列番号21及び22)
CTDCPQ-24-T18+19:(R/K)RPLYEXNTM(配列番号23及び24)
〔実施例7〕 SCPL-AT cDNA断片増幅用プライマーの設計
1-O-アシル-β-D-グルコースをアシル基供与体として反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、セリンカルボキシペプチダーゼ(SCPase)をコードする遺伝子の塩基配列と相同性が高く、1-O-アシル-β-D-グルコースをアシル基供与体として反応を触媒するタンパク質はSCPL-ATと呼称される(Milkowski and Strack(2004)Phytochemistry 65: 517-524)。そこでSCPaseおよびSCPL-ATに高度に保存されている領域とその塩基配列に基づき縮重プライマーを合成した。高度に保存されている領域の特定とプライマーの設計にはCLUSTAL Wプログラムを用いたマルチプルアライメント、Block Maker(http://blocks.fhcrc.org/blocks/)及びCODEHOP(http://blocks.fhcrc.org/codehop.html)を用いた。マルチプルアライメントに用いた配列は、NCBI/EMBL/DDBJアクセション番号AF242849、AF275313、AF248647、AY033947、AY383718、X80836(REGION: 12728..14326)及びUniProt/Swiss-Protアクセション番号P07519、P08819、P37890のアミノ酸配列である。合成したCODEHOPプライマー及び縮重プライマーを以下に示す。
cdhp Rv:CCGCAGAAGCAGGAGCAICCIGGICC(配列番号26)
blockA Fd:AMIGGWGGICCTGGITGYWSIWS(配列番号27)
blockB Fd:GAIWSICCIGYIGGIWSIGG(配列番号28)
blockC Fd:RTIGSIGGIGAIWSITAYDSIGG(配列番号29)
blockE Rv:RTCRTGRTCICCISWRWA(配列番号30)
blockF Rv:GGYTTRTAYTCIGGIRCIGTRTGICC(配列番号31)
〔実施例8〕 チョウマメSCPL-AT cDNAのクローン化
(1)RNAの調製
チョウマメ花弁を花蕾の長さ5mmごとにステージ分けをした。すなわち花蕾長5-10mmをステージ1、10-15mmをステージ2、15-20mmをステージ3、20-25mmをステージ4、25-30mmをステージ5、30-35mmをステージ6、35-40mmをステージ7、40-45mmをステージ8、45-50mmをステージ9、開花ステージをステージ10とした。各ステージの花弁数百ミリグラムからTRIzol(インビトロゲン)を用いて全RNAを調製した。この全RNA(50μg)からOligotex-dT30 super(タカラバイオ)を用いて製造者の推奨する方法にてpoly(A)+RNAを各ステージごとに精製して15μlのpoly(A)+RNA溶液とした。
精製したpoly(A)+RNA溶液15μlを鋳型にして1st strand cDNA synthesis kit(アマシャムバイオサイエンス)を用いて製造者の推奨する方法に従って一本鎖cDNAを合成した。合成した全ステージのcDNAを等量ずつ混合してPCR反応の鋳型とした。PCR反応には[実施例7]に示したCODEHOPプライマー、縮重プライマー及びNotI-d(T)18プライマー(アマシャムバイオサイエンス)を用いた。
チョウマメ花弁から全RNAを改変CTAB法(Chang et al.,(1993)Plant Molecular Biology Reporter、向井・山本、植物細胞工学シリーズ7 pp. 57-62)により調製した。この全RNA250μgからOligotex-dT30 superを用い、製造者の推奨する方法にてpoly(A)+RNAを精製した。精製したpoly(A)+RNAのうち約480ngからGene Racer Ready cDNA(GRR cDNA)をGeneRacer kit(インビトロゲン)を用いて製造者の推奨する方法に従って合成した。
RACEにより得られた5'及び3'末端の塩基配列から予想されるタンパク質の開始コドンを含むpE-CtSCPL1-F(5'-GACGACGACAAGATGACCATAGTAGAGTTCCTTCCTG-3':配列番号44)をフォワードプライマーとして、終始コドンを含むpE-CtSCPL1-R(5'-GAGGAGAAGCCCGGTTATTATAGAATGGATGCCAAGTTGG-3':配列番号45)をリバースプライマとして合成した。一本鎖cDNAを鋳型にpE-CtSCPL1-FとpE-CtSCPL1-Rそれぞれ20pmoleをプライマーとし、LA Taqポリメラーゼを用いて製造者の推奨する方法により計50μlでPCR反応を行った。PCR反応は、95℃で3分反応させた後、95℃・30秒、55℃・45秒、72℃・80秒の反応を30サイクル行い、最後に72℃で7分間処理した。PCR産物をアガロース電気泳動にて分画した後に増幅産物のバンドを切り出し、精製したPCR産物をpET30 Ek/LICベクター(ノバゲン)にサブクローニングした。得られた幾つかのpET-CtSCPL1クローンを解析して、CtSCPL1のタンパク質コード全領域の塩基配列を決定した。その結果、〔実施例6〕で得られたアントシアニン3'ATタンパク質の内部アミノ酸配列の全てを含むことが確認された。また、CTDCPQ-24-T18+19:(R/K)RPLYEXNTM(配列番号23及び24)で検出されなかった6サイクル目のアミノ酸XはcDNAの推定アミノ酸配列ではNであり、糖鎖修飾をうけていると考えられた。CtSCPL1のORFは1464bpであり、487アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードし、3カ所の糖鎖修飾サイトとN末端には分泌シグナルが存在していた。CtSCPL1の塩基配列を配列番号:1に示し、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号:2に示す。
チョウマメ花弁cDNAライブラリの約10万個のクローンをCtSCPL1、2、3及び4のcDNA断片クローン、シロイヌナズナSNG1及びSNG2遺伝子cDNAをプローブに用いて最終洗浄条件(55℃、0.1×SSC、0.1%SDS)で各プローブごとにスクリーニングし最終的に14個の陽性クローンを得た。13個はCtSCPL1であり、残りの1クローンはCtSCPL3であった。CtSCPL1の陽性クローンの中で最長のクローンであるCtSCPLA1-8は1740bpで、5'-RACEにより得られたクローンと比較すると開始メチオニンより上流(配列番号46:ATTAAAAAAAAAATATG)を欠いていた。CtSCPLA1-8を始めとする13個の陽性クローンのオープンリーディングフレームにおける塩基配列はRACEにより得られたクローンおよびpET-CtSCPL1クローンと同一であった。
(1)CtSCPL1組換えバキュロウイルスの作製
バキュロウイルス-昆虫細胞における組換えタンパク質の発現にはBaculoDirect Baculovirus Expression Systems(BaculoDirect C-Term Expression Kit、インビトロゲン)を用いた。〔実施例8〕によって得られたクローンの塩基配列から予想されるタンパク質コード領域をフォワードプライマー(CtSCPL1-DTOPO-Fd:5'-CACCATGGCAGCCTTCAGTTCAACTCATA-3':配列番号47)及びリバースプライマー(CtSCPL1-Rv-C-Tag:5'-TAGAATGGATGCCAAGTTGGTGTATG-3':配列番号48)を用いたPCRにより増幅した。一本鎖cDNA 1μlを鋳型とし、フォワードプライマー及びリバースプライマーを各20pmole、Pyrobest Taqポリメラーゼ(タカラバイオ)2ユニットを用いて製造者の推奨する方法により計50μlでPCR反応を行った。94℃で3分反応させた後、94℃・30秒、65℃・45秒、72℃・80秒の反応を30サイクル行い、最後に72℃で7分間処理した。得られたPCR産物をpENTR-D-TOPOベクター(インビトロゲン)へ製造者の推奨する方法に従ってサブクローニングした。得られた幾つかのpENTR-CtSCPL1クローンを解析して塩基配列を確認した。LRクロナーゼ(インビトロゲン)を用いてpETNR-CtSCPL1からBaculoDirect C-Term Linear DNAへCtSCPL1を組換えた。LR反応産物をSpodoptera frugiperda卵巣細胞由来の Sf9細胞にCellfectinを用いてトランスフェクションした。Ganciclovirを用いた非組換えウイルスの除去、組換えウイルスの増殖、ウイルスの力価測定を製造者の推奨する方法により行い、2-3×107pfu/mlの組換えCtSCPL1ウイルスを作製した。
直径35mmの6穴プレートで完全グレース培地またはSf900II-SFM無血清培地(ギブコ)を用いて単層培養した3×106cellsのSf9細胞に対して、多重感染度(MOI、multiplicity of infection)5-10で組換えウイルスを感染させた。28℃で5日間培養した後に培養液及びSf9細胞を回収した。培養液は遠心濃縮を行い、Sf9細胞は緩衝液に懸濁した後に超音波破砕し、遠心上清を培養液同様に遠心濃縮した。濃縮したタンパク質溶液を用いて酵素反応を行い、反応産物をHPLC及びLC-MSにて分析した。
〔実施例8〕によって得られたクローンの塩基配列から予想されるタンパク質コード領域(オープンリーディングフレーム)をフォワードプライマー(CtSCPL4-DTOPO-Fd:5'-CACCATGGCGAGGTTTAGTTCAAGTCTTG-3':配列番号49)及びリバースプライマー(CtSCPL4-Rv-Stop:5'-TTACAAAGGCCTTTTAGATATCCATCTCC-3'配列番号50)を用いたPCRにより増幅した。PCR反応は〔実施例9〕に従って行い、得られたPCR産物をpENTR-D-TOPOベクターへ製造者の推奨する方法に従ってサブクローニングした。得られた幾つかのpENTR-CtSCPL4クローンを解析してCtSCPL4の全塩基配列を確認した。CtSCPL4のORFにおける塩基配列を配列番号:3に示し、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号:4に示す。CtSCPL4のORFは1410bpであり、469アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードし、3カ所の糖鎖修飾サイトとN末端には分泌シグナルが存在していた。CtSCPL4はCtSCPL1とアミノ酸レベルで79.1%の相同性を有しており、また分子系統解析においてSCPL-ATクレードの中でも最も近くに位置していることから、CtSCPL1と同様に1-O-アシル-β-D-グルコースをアシル基供与体として、特にアントシアニンのB環グルコシル基にアシル基を転移する酵素活性をもつタンパク質をコードしているといえる。pENTR-CtSCPL4からBaculoDirect Baculovirus Expression Systemsを用いて、BaculoDirect Secreted Linear DNAへCtSCPL4を組換え、製造者の推奨する方法に従って組換えCtSCPL4ウイルスを作製した。
(1)縮重RT-PCRを用いたcDNA断片の増幅とクローン化
リンドウ花弁を花蕾の長さ2.5mm以下及び2.5-3.5mmのステージ分けをした。各ステージの花弁1.5グラムからTRIzol(インビトロゲン)を用いて全RNAを調製した。この全RNAのうちの5μgを鋳型として1st strand cDNA synthesis kit(アマシャムバイオサイエンス)を用いて製造者の推奨する方法に従って一本鎖cDNAを合成した。合成した全ステージのcDNAを等量ずつ混合してPCR反応の鋳型とした。PCR反応には〔実施例6〕に示したCODEHOPプライマー、縮重プライマー及びNotI-d(T)18プライマーを用いた。一本鎖cDNA 2μlを鋳型とし、フォワード及びリバースプライマーを各2μl、LATaqポリメラーゼ 1ユニットを用いて計50μlでPCR反応を行った。PCR反応は、95℃で3分反応させた後、95℃・30秒、48℃・45秒、72℃・80秒の反応を35サイクル行い、最後に72℃で7分間処理した。1stPCR産物を鋳型に行ったネステッドPCRの結果得られた反応産物をアガロースゲル電気泳動し、各プライマーの組み合わせにより増幅すると予想されるサイズのゲル断片を回収した。精製したPCR産物をpGEM-T Easyベクターにサブクローニングして塩基配列を決定した。
〔実施例11〕(1)で調整したステージ別の全RNA(合計550μg)からそれぞれOligotex-dT30 superを用い、製造者の推奨する方法にてpoly(A)+RNAを精製した。精製したpoly(A)+RNAのうち約210ngからGRR cDNAをGeneRacer kitを用いて製造者の推奨する方法に従って合成した。合成したGRR cDNAを1:3に希釈したcDNA溶液を鋳型にGeneRacer 5'プライマーとGentrSCPL1 cDNA断片の内部配列に特異的なリバースプライマー(GentrSCPL1-R1プライマー:5'-GCATAAACCGTTGCTTTGATCCGCC-3':配列番号51、GentrSCPL1-R2プライマー:5'-CATCAATGAAGCCATCAGCCACAGG-3':配列番号52)を用いPCRを行った。また、GeneRacer 5'プライマー とCtSCPL2 cDNA断片の内部配列に特異的なリバースプライマー(GentrSCPL2-R1プライマー:5'-TTAAGCACGTCAGGAATCCGGAGG-3':配列番号53、GentrSCPL2-R2プライマー:5'-TGAACGTCGAATGCCGTGAAACACC-3':配列番号54)を用いPCRを行った。GRR cDNAを鋳型にし、GeneRacer 5'プライマー(30pmole)、リバースプライマー(20pmole)、LA Taqポリメラーゼを用いて製造者の推奨する方法により計50μlでPCR反応を行った。94℃で3分反応させた後、94℃・30秒、65℃・45秒、72℃・80秒の反応を30サイクル行い、最後に72℃で7分間処理した。さらに、1st PCR産物を鋳型にGeneRacer 5'ネステッドプライマーとリバースプライマーを組み合わせてネステッドPCRを行った。1st PCRとネステッドPCR産物をアガロース電気泳動にて分画し、増幅産物のバンドを切り出してPCR産物を回収した。ゲルから精製したPCR産物をTAクローニングし、得られた幾つかのクローンを解析して、GentrSCPL1及びGentrSCPL2 cDNAの5'末端の塩基配列を決定した。
RACEにより得られた5'及び3'末端の塩基配列から、予想されるタンパク質の開始コドンを含むフォワードプライマー(Gentr1-DTOPO-F:5'-CACCATGGCGGTGCCGGCGGTGCC-3':配列番号59、Gentr2-DTOPO-F:5'-CACCATGGCGGATACAAACGGCACAGCC-3':配列番号60)、及び終始コドンを含むリバースプライマー(Gentr1-Rv-CTag:5'-CAATGGAGAATCCGAGAAAAACCG-3':配列番号61、Gentr1-Rv-Stop:5'-TTACAATGGAGAATCCGAGAAAAACCG-3':配列番号62、Gentr2-Rv-CTag:5'-CAACGGTTTATGAGTTATCCACC-3':配列番号63、Gentr2-Rv-Stop:5'-CTACAACGGTTTATGAGTTATCCAC-3':配列番号64)を合成した。一本鎖cDNA 1μlを鋳型とし、フォワードプライマー及びリバースプライマーを各20pmole、Pyrobest Taqポリメラーゼ 2ユニットを用いて製造者の推奨する方法により計50μlでPCR反応を行った。94℃で3分反応させた後、94℃・30秒、65℃・45秒、72℃・80秒の反応を30サイクル行い、最後に72℃で7分間処理した。得られたPCR産物をpENTR-D-TOPOベクターへ製造者の推奨する方法に従ってサブクローニングした。得られた幾つかのpENTR-GentrSCPL1及びpENTR-GentrSCPL2クローンを解析して塩基配列を確認した。GentrSCPL2には二種類のORFが確認され、それぞれをGentrSCPL2-1及びGentrSCPL2-2とした。GentrSCPL1、GentrSCPL2-1及びGentrSCPL2-2のORFにおける塩基配列を配列番号:5、7、9に示し、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号:6、8、10に示す。GentrSCPL1、GentrSCPL2-1及びGentrSCPL2-2のORFはそれぞれ1446bp、1485bp及び1455bpであり、481、494及び484アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードしていた。GentrSCPL1、GentrSCPL2-1、GentrSCPL2-2のN末端には分泌シグナル配列が存在し、活性型タンパク質のコード領域にはそれぞれ2、3、3、カ所の糖鎖修飾サイトが存在していた。GentrSCPL2-2はGentrSCPL2-1の226から235番目のアミノ酸領域が欠損しているクローンであった。GentrSCPL2-1及びGentrSCPL2-2はCtSCPL1とアミノ酸レベルで41%の相同性を有しており、また分子系統解析においてもSCPL-ATクレードにおいてCtSCPL4の次に近くに位置していることから、CtSCPL1と同様に1-O-アシル-β-D-グルコースをアシル基供与体として、特にアントシアニンのB環グルコシル基にアシル基を転移する酵素活性をもつタンパク質をコードしているといえる。また、GentrSCPL1もSCPL-ATクレードに位置しており、GentrSCPL2とアミノ酸レベルで32%の相同性を有しており、1-O-アシル-β-D-グルコースをアシル基供与体とするアシル基転移酵素をコードしているといえる。pENTR-GentrSCPL1及びpENTR-GentrSCPL2-1からBaculoDirect Baculovirus Expression Systemsを用いて、BaculoDirect C-Tag Linear DNA及びBaculoDirect Secreted Linear DNAへGentrSCPL1及びGentrSCPL2-1を組換えた後に製造者の推奨する方法に従い、組換えGentrSCPL1ウイルス及び組換えGentrSCPL2-1ウイルスを作製した。
(1)縮重RT-PCRを用いたcDNA断片の増幅とクローン化
ロベリア(Lobelia erinus cv. Riviera Midnight Blue)の花弁からQuickPrep Micro mRNA Purification Kit(アマシャムバイオサイエンス)を用いて製造者の推奨する方法に従ってpoly(A)+RNAを調製した。このpoly(A)+RNAを鋳型として1st strand cDNA synthesis kitを用いて製造者の推奨する方法に従って一本鎖cDNAを合成した。PCR反応には〔実施例6〕に示したCODEHOPプライマー、縮重プライマー及びNotI-d(T)18プライマーを用いた。一本鎖cDNA 2μlを鋳型とし、フォワード及びリバースプライマーを各2μl、ExTaqポリメラーゼ 1ユニットを用いて計50μlでPCR反応を行った。PCR反応は、95℃で3分反応させた後、95℃・30秒、50℃・45秒、72℃・90秒の反応を30サイクル行い、最後に72℃で7分間処理した。1stPCR産物を鋳型に行ったネステッドPCRの結果得られた反応産物をアガロースゲル電気泳動し、各プライマーの組み合わせにより増幅すると予想されるサイズのゲル断片を回収した。精製したPCR産物をpGEM-T Easyベクターにサブクローニングして塩基配列を決定した。
ロベリア花弁5g(開花花弁2g及び花蕾花弁3g)から全RNAを改変CTAB法により調製した。この全RNAからOligotex-dT30 superを用い、製造者の推奨する方法にてpoly(A)+RNAを精製した。精製したpoly(A)+RNAのうち約480ngからGRR cDNAをGeneRacer kitを用いて製造者の推奨する方法に従って合成した。
RACEにより得られた5'及び3'末端の塩基配列から予想されるタンパク質の開始コドンを含むフォワードプライマー(LeSCPL-DTOPO-F:5'-CACCATGGCGTTTGGTATGCCATTTTCG-3':配列番号69)及び終始コドンを含むリバースプライマー(LeSCPL-Rv-CTag:5'-CAATAAACTACGAGTAAGCCACCTTC-3':配列番号70、LeSCPL-Rv-Stop:5'-TCACAATAAACTACGAGTAAGCCAC-3':配列番号71)を合成した。一本鎖cDNA 1μlを鋳型とし、フォワードプライマー及びリバースプライマーを各20pmole、Pyrobest Taqポリメラーゼ(タカラバイオ)2ユニットを用いて製造者の推奨する方法により計50μlでPCR反応を行った。得られたPCR産物をpENTR-D-TOPOベクターへ製造者の推奨する方法に従ってサブクローニングした。得られた幾つかのpENTR-LeSCPL1クローンを解析して塩基配列を確認した。LeSCPL1のORFにおける塩基配列を配列番号:11に示し、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号:12に示す。LeSCPL1のORFは1446bpであり、481アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードし、3カ所の糖鎖修飾サイトが存在していた。LeSCPL1はCtSCPL1とアミノ酸レベルで26%の相同性を有しており、また分子系統解析においてもSCPL-ATクレードに位置しており1-O-アシル-β-D-グルコースをアシル基供与体とするアシル基転移酵素をコードしているといえる。pENTR-LeSCPL1からBaculoDirect Baculovirus Expression Systemsを用いて、BaculoDirect C-Tag Linear DNA及びBaculoDirect Secreted Linear DNAへLeSCPL1を組換えた後に製造者の推奨する方法に従い、組換えLeSCPL1ウイルスを作製した。
(1)チョウマメ1-O-アシル-β-D-グルコース合成酵素cDNAの単離
植物二次代謝産物配糖化酵素群に高度に保存されている領域PSPG-box(Huges and Huges (1994) DNA Seq., 5: 41-49)のアミノ酸配列を基に以下の縮重プライマーGT-SPF(5'-WCICAYTGYGGITGGAAYTC-3':配列番号72)を合成した。一本鎖cDNAを鋳型にし、GtSPFプライマー100pmole及びNotI-d(T)18プライマー14pmole、ExTaqポリメラーゼ 1ユニットを用いて製造者の推奨する方法により計50μlでPCR反応を行った。PCR反応は94℃で5分反応させた後、94℃・30秒、42℃・30秒、72℃・60秒の反応を38サイクル行い、最後に72℃で10分間処理した。得られたPCR産物をpGEM-T easyベクターへ製造者の推奨する方法に従ってサブクローニングした。得られた幾つかのクローンを解析して塩基配列を確認し、セイヨウアブラナやシロイヌナズナから報告のあるUDP-グルコース:ヒドロキシケイ皮酸1-O-グルコシル基転移酵素(NCBI/EMBL/DDBJアクセッション番号AF287143、PIRアクセション番号D71419、E71419、F71419)と高い相同性を示すcDNA断片クローンGTC600-11を得た。このcDNA断片をプローブに用いてチョウマメ花弁cDNAライブラリの25万個のクローンを洗浄条件(2×SSC、1% SDS、60℃)でスクリーニングし、最終的にpBluescript SK-にサブクローニングされたインサートのサイズが1.5kbp以上のクローンを7個得た。それらのORFがコードする推定アミノ酸配列は同一であり、開始コドンを含む最長のクローンをCtGT11-4と名付けた。なおライブラリのスクリーニングは公知の方法(例えば特開2005-95005号公報)によった。CtGT11-4遺伝子は1788bpで473アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードしていた。塩基配列を配列番号13に示し、これらの塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号14に示す。
CGT11-4遺伝子の発現にはpET30Ek/LIC Systemを用いて行った。まず、CtGT11-4のORF cDNAを増幅するためのプライマーである、pEGTC11-4F(5'-GACGACGACAAGATGGGGTCTGAAGCTTCGTTTC-3'(配列番号73)及びpEtGTC11-4R(5'-GAGGAGAAGCCCGGTCTAAGGGTTACCACGGTTTC-3'(配列番号74)を用いてPCR反応を行った。〔実施例12〕(1)で得たプラスミドを鋳型とし、pEGTC11-4F及びpEtGTC11-4Rそれぞれ40pmole、ExTaqポリメラーゼ 1ユニットを用いて製造者の推奨する方法により計50μlでPCR反応を行った。得られたPCR産物をpET30Ek/LICベクターへ製造者の推奨する方法に従ってサブクローニングした。得られた幾つかのクローンを解析して塩基配列を確認した後に、大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP(ストラタジーン)に形質転換した。
〔実施例12〕(1)の方法に従って、ロベリア花弁由来一本鎖cDNAを鋳型にディジェネレートRT-PCRを行い、既知の遺伝子と相同性の高いcDNA断片をクローン化した。ロベリア(Lobelia erinus cv. Riviera Midnight Blue)花弁由来のcDNAライブラリを作製し、得られたcDNA断片クローンLeGT13をプローブに用いて約50万クローンをスクリーニングし、最終的に陽性クローンを28個得た。それらのORFがコードする推定アミノ酸配列は2つに分類することができ、それぞれの最長クローンをLeGT13-20およびLeGT13-30とした。LeGT13-20及びLeGT13-30は、それぞれ1574bpおよび1700bpで、どちらも開始コドンを有しておりORFは1461bpで486アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードしていた。アミノ酸レベルで95%の相同性を示したことから、同一の酵素をコードする対立遺伝子であると考えられた。LeGT13-20及びLeGT13-30の塩基配列を配列番号15および17に示し、これらの塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号16および18に示す。
LeGT13-20およびLeGT13-30遺伝子の発現にはpET30Ek/LIC System(Novagen)を用いて行った。LeGT13-20のORF cDNAを増幅するためのプライマーである、pELeGT13A-F(5'-GACGACGACAAGATGGGCTCACTGCAGGGTACTACTACCGTC-3'(配列番号75)及びpELeGT13A-R(5'-GAGGAGAAGCCCGGTTAGTGCCCAACAACATCTTTTC-3'(配列番号76)を用いてPCR反応を行った。また、LeGT13-30のORF cDNAを増幅するためのプライマーである、pELeGT13B-F(5'-GACGACGACAAGATGGGCTCACTGCAGGGTACTACTACCGTT-3'(配列番号77)及びpELeGT13B-R(5'-GAGGAGAAGCCCGGTTAGTGCCCAATAACACCTTTTT-3'(配列番号78)を用いてPCR反応を行った。〔実施例12〕(3)で得たプラスミドを鋳型とし、フォワードプライマーにpELeGT13A-FまたはpELeGT13B-Fを20pmole、リバースプライマーにpELeGT13A-RまたはpELeGT13B-Rを20pmole、ExTaqポリメラーゼ 1ユニットを用いて製造者の推奨する方法により計50μlでPCR反応を行った。得られたPCR産物をpET30Ek/LICベクターへ製造者の推奨する方法に従ってサブクローニングした。得られた幾つかのクローンを解析して塩基配列を確認した後に、大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RPに形質転換した。形質転換した大腸菌における導入遺伝子の発現、組換えタンパク質の部分精製、酵素反応と反応産物の分析を〔実施例12〕(2)に従って行ったところ、用いた4種類全てのヒドロキシケイ皮酸に対するグルコシル基転移酵素活性が確認された。このことからLeGT13-20遺伝子及びLeGT13-30遺伝子は、UDP-グルコース:ヒドロキシケイ皮酸1-O-グルコシル基転移活性を有する酵素をコードしていることが確認され、1-O-アシル-β-D-グルコース合成酵素遺伝子であることが明らかになった。
Claims (11)
(a)配列番号2、4、6、8、10、若しくは12に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(b)配列番号2、4、6、8、10、若しくは12に記載のアミノ酸配列において、20個以内のアミノ酸が付加、欠失及び/又は他のアミノ酸により置換されているアミノ酸配列を有するタンパク質。
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