CN108777947B - 具有蓝色系花色的植物及其制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明所要解决的技术课题在于提供不需要以往提出的复杂的蓝色表达机制或重现其的技术，而通过更为简便的蓝色表达控制技术来制作具有蓝色系花色的植物的方法。使花青素B环的3’及5’位被糖苷化的花翠素型花青素与成为辅色素的黄酮糖苷或者黄酮醇糖苷在植物的花瓣等花器官的细胞内共存。

Description

具有蓝色系花色的植物及其制作方法
技术领域
本发明为具有蓝色系花色的植物的制作方法，涉及以使花青素B环的3’及5’位被糖苷化的花翠素型花青素与辅色素(黄酮糖苷或者黄酮醇糖苷)在植物细胞内共存为特征的方法以及以使花青素B环的3’及5’位被糖苷化的花翠素型花青素与辅色素(黄酮糖苷或者黄酮醇糖苷)在细胞内共存为特征的具有蓝色系花色的植物或其自殖或者他殖后代或者它们的营养繁殖体、植物体的一部分(特别是切花)或者其加工品(特别是切花加工品)、组织或细胞。
背景技术
菊花、玫瑰、康乃馨、百合等为世界性产业上重要的花卉。然而，在这样的主要花卉中，在可杂交的近缘种中没有蓝色系花色的野生种等，从而在以往的杂交育种、突变育种中制作具有蓝色系花色的品种存在困难。关于这个本发明者近年来通过将风铃草F3’5’H及蝶豆A3’5’GT进行基因导入，成功制作出了比单独导入CamF3’5’H的情况(专利文献1)更蓝的具有在英国皇家园艺协会(RHSCC)中为Violet-Blue95、Violet-Blue97或Blue100等被称作真正的蓝色花色的“蓝色菊花”(专利文献2)。然而，在玫瑰、百合、康乃馨、大丽花、蝴蝶兰等其他主要花卉中，并没有制作出具有与“蓝色菊花”相同程度的蓝色度的品种，而正在摸索蓝色花制作法。
为了花的蓝色化而通过基因重组来进行花色改变时，所导入的基因为基于在自然界中存在的蓝色花的蓝色表达机制的见解来选择的。由于在大多数蓝色花中蓄积的花青素的基本骨架为花翠素型，故而负责其生物合成的类黄酮3’,5’-氧化酶的基因为了蓝色花的制作被导入从而实现花色的改变(专利文献3)。另一方面，即使为花翠素型花青素，表达粉红色、红紫色、紫色、蓝紫色的花在自然界中大量存在。据报道在花的蓝色表达机制中除花翠素型花青素以外，还需要分子内缔合(分子内共色)、分子间缔合(分子间共色)、与金属离子的相互作用、金属配合物形成、液胞内pH的上升等(非专利文献1)。
被2个以上的芳香族有机酸与糖修饰的聚酰化花翠素型花青素在花瓣中蓄积时，通过分子内缔合而表达蓝色。从通过该机理来表达蓝色花色的龙胆(专利文献4、5)、飞燕草(专利文献6、非专利文献2)、蝶豆(专利文献2、7)等中报道了糖基转移酶基因、芳香族酰基转移酶基因等的相关酶基因。作为在分子间缔合(共色)中与花青素共存时对于蓝色表达有效的辅色素，还报道了参与C-糖基黄酮的生物合成的酶基因(非专利文献3)、可在玫瑰中进行黄酮类的合成的基因(专利文献8)。在与金属离子的相互作用中报道了在郁金香中铁离子参与，在绣球花中铝离子参与，在花青素蓄积的液胞中报道了运送金属离子的基因(非专利文献4)。另外，在金属配合物的形成中，认为为了与金属离子形成配合物所必需的用于控制黄酮的糖苷化方式的7-糖苷酶基因在黄芩、拟南芥中报道(非专利文献5)，4’,7-糖苷酶基因在喜林草(专利文献9)等中报道。其他还报道了参与分子内缔合、分子间缔合或金属配合物的形成的将在花青素的3位羟基上键合的糖进一步通过糖修饰的糖基转移酶基因、在键合于花青素的糖上转移有机酸的酰基的酰基转移酶基因。明确了在主要花卉中使导入基因在花瓣的表达中有效的启动子、终止子。因此，认为导入参与这些蓝色表达机制的基因从而发挥功能在理论上是可行的。
通过基因工程的方法来制作具有蓝色系花色的花卉，对于康乃馨与玫瑰而言已有市售，其花色为紫色(RHSCC色相组：Purple)、蓝紫色(Purple-Violet，Violet)，具有紫蓝色(Violet-Blue)、蓝色(Blue)花色的蓝色花卉除“蓝色菊花”(专利文献2)以外并没有被制作。因此为了使各种各样的蓝色表达机制(非专利文献1)在康乃馨、百合或玫瑰等的花卉中重现，尝试了将相关基因单离来导入及将它们组合的基因导入，但并没能制作出蓝色花。这是由于大多数负责蓝色花的发色的聚酰化花青素、金属配合物的结构复杂，在它们的合成中需要大量的基因。从自然界的蓝色花单离负责其蓝色表达的一系列的基因的例子是有限的。聚集了为了进行基因导入并蓝色化所需的基因组群仅有龙胆的聚酰化花青素生物合成基因组。假如即使将对于蓝色表达所需的全部导入基因聚集，由于大量基因的导入与控制变得复杂，故而蓝色花的制作变得困难。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2010/122849号公报
专利文献2：国际公开第2017/002945号公报
专利文献3：国际公开第2010/069004号公报
专利文献4：国际公开第1996/025500号公报
专利文献5：国际公开第2006/046780号公报
专利文献6：国际公开第2011/016260号公报
专利文献7：国际公开第2007/046148号公报
专利文献8：国际公开第2008/156211号公报
专利文献9：国际公开第2012/096307号公报
专利文献10：国际公开第2002/086110号公报
专利文献11：国际公开第2000/044907号公报
专利文献12：国际公开第1994/003606号公报
专利文献13：国际公开第2013/157502号公报
专利文献14：国际公开第2006/105598号公报
非专利文献
非专利文献1：Nat.Prod.Rep.(2009)26：884
非专利文献2：Plant Cell Physiol.(2015)56：28
非专利文献3：J Biol.Chem.(2009)284：17926
非专利文献4：Plos one(2012)7：e43189，Genes to Cells(2013)18：341
非专利文献5：Planta(2000)210：1006，Biosci.Biotechnol.Biochem.(2006)70：1471
非专利文献6：Saito et al.，(1983)A cyanidin glycoside giving scarletcoloration in plants of the Bromeliaceae.，Phytochemistry 22：1735-1740
非专利文献7：Andersen et al.，The anthocyanins，in Flavonoids，Chemistry，biochemistry and applications，Edited by Andersen，O.M.&Markham，K.R.，Taylor&Francis，pp.472-537(2006)
非专利文献8：Shimizu-Yumoto et al.，(2012)Slantingly cross loadingsample system enables simultaneous performance of separation and mixture todetect molecular interactions on thin-layer chromatography.J.Chromatogr.A，1245：183-189
发明内容
本发明所要解决的技术课题在于提供基于与以往的理论、技术完全不同的蓝色表达控制技术来制作具有以往无法得到的蓝色系花色(RHS色谱标准第5版：Violet-Blue组/Blue组且/或色相角：230°～290°)的植物的制作方法。
本发明者为了解决上述课题进行了深入研究并反复进行了实验，结果得到了如下令人吃惊的见解：即使没有芳香族有机酸进行的修饰，通过使花青素B环的3’及5’位被糖苷化的花翠素型花青素与辅色素(黄酮糖苷或者黄酮醇糖苷)在植物细胞内共存也可制作具有蓝色系花色的植物，从而完成了本发明。
即，本发明如下所示。
[1]一种方法，为具有蓝色系花色的植物的制作方法，其特征在于，使花青素B环的3’及5’位被糖苷化的花翠素型花青素与辅色素(黄酮糖苷或者黄酮醇糖苷)在植物的细胞内共存。
[2]根据1所述的方法，其特征在于，所述黄酮糖苷选自木犀草素糖苷、五羟黄酮糖苷、芹菜素糖苷、金合欢素糖苷及它们的组合。
[3]根据2所述的方法，其特征在于，所述木犀草素糖苷为木犀草素7-丙二酰基葡萄糖苷、木犀草素7-葡萄糖苷、木犀草素7,3’-二葡萄糖苷、木犀草素8-C-葡萄糖苷、木犀草素6-C-葡萄糖苷或它们的衍生物。
[4]根据2所述的方法，其特征在于，所述五羟黄酮糖苷为五羟黄酮7-丙二酰基葡萄糖苷或其衍生物。
[5]根据2所述的方法，其特征在于，所述芹菜素糖苷为芹菜素7-葡萄糖苷、芹菜素7-芸香糖苷、芹菜素8-C-葡萄糖苷、芹菜素6-C-葡萄糖苷或它们的衍生物。
[6]根据2所述的方法，其特征在于，所述金合欢素糖苷为金合欢素7-芸香糖苷或其衍生物。
[7]根据1所述的方法，其特征在于，所述黄酮醇糖苷选自山奈酚糖苷、槲皮素糖苷及它们的组合。
[8]根据7所述的方法，其特征在于，所述山奈酚糖苷为山奈酚3-葡萄糖苷或其衍生物。
[9]根据7所述的方法，其特征在于，所述槲皮素糖苷为槲皮素3-葡萄糖苷、槲皮素3-(6”-丙二酰基)葡萄糖苷、槲皮素3-芸香糖苷或它们的衍生物。
[10]根据1～9中任一项所述的方法，其特征在于，所述花青素B环的3’及5’位被糖苷化的花翠素型花青素选自花翠素3-(6”-丙二酰基)葡萄糖苷-3’,5’-二葡萄糖苷即ternatin C5、花翠素3,3’,5’-三葡萄糖苷即preternatin C5及它们的组合。
[11]根据1～10中任一项所述的方法，其特征在于，所述花青素B环的3’及5’位被糖苷化的花翠素型花青素与所述黄酮糖苷以1：1～1：10的量比共存。
[12]根据1～11中任一项所述的方法，其特征在于，所述植物的液胞内的pH为5.2～6.4。
[13]根据1～12中任一项所述的方法，其特征在于，所述植物为玫瑰、百合、康乃馨、大丽花、蝴蝶兰或菊花。
[14]一种植物或其自殖或者他殖后代，其特征在于，为具有蓝色系花色的植物，在植物的细胞内花青素B环的3’及5’位被糖苷化的花翠素型花青素与黄酮糖苷或者黄酮醇糖苷共存。
[15]根据14所述的植物或其自殖或者他殖后代，其特征在于，所述黄酮糖苷选自木犀草素糖苷、五羟黄酮糖苷、芹菜素糖苷、金合欢素糖苷及它们的组合。
[16]根据15所述的植物或其自殖或者他殖后代，其特征在于，所述木犀草素糖苷为木犀草素7-丙二酰基葡萄糖苷、木犀草素7-葡萄糖苷、木犀草素7,3’-二葡萄糖苷、木犀草素8-C-葡萄糖苷、木犀草素6-C-葡萄糖苷或它们的衍生物。
[17]根据15所述的植物或其自殖或者他殖后代，其特征在于，所述五羟黄酮糖苷为五羟黄酮7-丙二酰基葡萄糖苷或其衍生物。
[18]根据15所述的植物或其自殖或者他殖后代，其特征在于，所述芹菜素糖苷为芹菜素7-葡萄糖苷、芹菜素7-芸香糖苷、芹菜素8-C-葡萄糖苷、芹菜素6-C-葡萄糖苷或它们的衍生物。
[19]根据15所述的植物或其自殖或者他殖后代，其特征在于，所述金合欢素糖苷为金合欢素7-芸香糖苷或其衍生物。
[20]根据14所述的方法，其特征在于，所述黄酮醇糖苷选自山奈酚糖苷、槲皮素糖苷及它们的组合。
[21]根据20所述的方法，其特征在于，所述山奈酚糖苷为山奈酚3-葡萄糖苷或其衍生物。
[22]根据20所述的方法，其特征在于，所述槲皮素糖苷为槲皮素3-葡萄糖苷、槲皮素3-(6”-丙二酰基)葡萄糖苷、槲皮素3-芸香糖苷或它们的衍生物。
[23]根据14～22中任一项所述的植物或其自殖或者他殖后代，其特征在于，所述花青素B环的3’及5’位被糖苷化的花翠素型花青素选自花翠素3-(6”-丙二酰基)葡萄糖苷-3’,5’-二葡萄糖苷即ternatin C5、花翠素3,3’,5’-三葡萄糖苷即preternatin C5及它们的组合。
[24]根据14～23中任一项所述的植物或其自殖或者他殖后代，其特征在于，所述花青素B环的3’及5’位被糖苷化的花翠素型花青素与所述黄酮糖苷或者黄酮醇糖苷以1：1～1：10的量比共存。
[25]根据14～24中任一项所述的植物或其自殖或者他殖后代，其特征在于，所述植物的液胞内的pH为5.2～6.4。
[26]根据14～25中任一项所述的植物或其自殖或者他殖后代，其特征在于，所述植物为玫瑰、百合、康乃馨、大丽花、蝴蝶兰或菊花。
[27]一种营养繁殖体、植物体的一部分、组织或细胞，其特征在于，来自根据14～26中任一项所述的植物或其自殖或者他殖后代。
[28]一种切花或由该切花制作的加工品，其特征在于，来自14～27中任一项所述的植物或其自殖或者他殖后代。
根据本发明，不仅是菊花，在玫瑰、百合、康乃馨、大丽花、蝴蝶兰等其他主要花卉中也可制作以往无法得到的具有蓝色系花色(RHS色谱标准第5版：Violet-Blue组/Blue组且/或色相角：230°～290°)的品种。尤其是，在包含作为适当的辅色素的黄酮糖苷或者黄酮醇糖苷花中，可仅通过将花青素B环的3’及5’位糖苷化这样简便的方法来制作“蓝色花”。
附图说明
图1为在宿主的菊花及蓝色系花色的基因重组菊花的花瓣中所包含的花青素：a)矢车菊素型花青素(A1-A4)；b)花翠素型花青素(A5-A10)。
图2的a)表示通过Cross TLC法将蓝色菊花花瓣提取液展开的结果(荧光灯下)。b)表示通过Cross TLC将蓝色菊花花瓣提取液展开的结果(UV光(365nm)下)。谱带A包含B环被糖苷化的花青素(ternatin C5与preternatin C5)。在谱带A中发色为蓝色的部分也用灰色的箭头表示。在灰色的箭头部分中在UV光下显示黄色荧光的谱带C1交叉。谱带A中发色为紫色的部分中在UV光下暗的谱带C2(虚线)也交叉。C1及C2中分别包含A成为蓝色、紫色的辅色素物质。c)及d)表示鉴定的C1及C2的结构。箭头表示HMBC。
图3a)表示蓝色的可见光域的吸光谱。在Ternatin C5(TC5；A8)中混合Lt7MG(C1)的结果为随着使与TC5的量比从1：1增加至1：5、1：10，在蓝色花瓣中特征性的在600-620nm范围的吸光度上升，同时最大吸收波长也向长波长侧位移，且变为与蓝色花瓣相同的吸光谱。b)表示紫色/蓝紫色的可见光域的吸光谱。通过在A5中添加C1在570nm附近的吸光度上升，显示出与紫色花瓣的吸光谱相同的图谱图案。c)表示除C1及C2以外添加A8等量的Mg2+离子或A8的1/10等量的Fe3+离子时的可见光域的吸光谱。
图4表示在各种pH条件(pH4.0，4.6，5.0，5.6，5.8，6.0，6.6，7.0)下的B环糖苷化花青素(TC5)与黄酮糖苷(Lt7MG)混合液的颜色与吸光谱。
图5表示B环糖苷化花青素(TC5)与各种各样的黄酮糖苷(Lt7MG，Lt7G，Lt3’7G，Tr7MG，Ap7G，Ap7RG，Aca7RG)的混合液的吸光谱。
图6表示具有各种各样的B环修饰图案的花青素(Pg3MG，Cy3MG，Dp3MG3’G，TC5)与黄酮糖苷(Lt7MG)的混合液的吸光谱(左图)。表示在各种条件下的花青素与黄酮糖苷的混合液(Lt7MG+TC5(pH5.6)，Lt7MG+pTC5(pH5.6)，Tr7MG+pTC5(pH5.6)，Lt7MG+pTC5(pH5.8))的吸光谱(右图)。
图7表示B环糖苷化花青素(TC5)与各种黄酮糖苷(Lt7OMG＝Lt7MG(C1)，Lt8CG，Lt6CG，Ap8CG，Ap6CG)的混合液的吸光谱。
图8表示B环糖苷化花青素(TC5)与黄酮糖苷(Lt7MG)或各种黄酮醇糖苷(Km3G，Qu3G，Qu3MG，Qu3RG)的混合液的吸光谱。
具体实施方式
本发明为具有蓝色系花色的植物的制作方法，涉及以使花青素B环的3’及5’位被糖苷化的花翠素型花青素与辅色素(黄酮糖苷或者黄酮醇糖苷)在植物细胞内共存为特征的方法。
花青素为在植物中广泛存在的色素组，已知呈现红色、紫色、蓝色的花色。根据作为糖苷配基的花色素部位的B环的羟基数，分类为天竺葵色素、矢车菊素及花翠素的3个系统。发色团为糖苷配基部分，天竺葵色素呈现橙红色，矢车菊素呈现红色，花翠素呈现紫红色。已知作为蓝色菊花花瓣的主要色素的B环3’位、5’位被糖苷化的花青素与没有被糖苷化的花青素相比，在酸性条件下的吸光谱的最大吸收波长向短波长侧位移(非专利文献6)，进一步报道了B环被糖苷化的花青素在花瓣中蓄积时表达带红色度的花色(非专利文献7)。
本发明者此次发现通过使风铃草F3’5’H基因与蝶豆A3’5’GT基因同时在菊花花瓣中表达所制作的蓝色菊花(专利文献2)作为主要色素包含花翠素3-(6”-丙二酰基)葡萄糖苷-3’,5’-二葡萄糖苷(ternatin C5,TC5)，作为微量色素包含作为ternatin C5的脱丙二酰基体的花翠素3,3’,5’-三葡萄糖苷(preternatin C5,pTC5)、花翠素3-(3”,6”-二丙二酰基)葡萄糖苷-3’,5’-二葡萄糖苷、花翠素3-(6”-丙二酰基)葡萄糖苷-3’-葡萄糖苷(Dp3MG3’G)以及矢车菊素3-(6”-丙二酰基)葡萄糖苷-3’-葡萄糖苷(Cy3MG3’G)。作为蓝色菊花的主要花青素的ternatin C5在酸性条件下的HPLC分析中最大可见吸收波长为511nm，与作为原本的红色、粉红色的主要花青素的矢车菊素3-(6”-丙二酰基)葡萄糖苷(Cy3MG)的最大吸收波长518nm相比，进一步向短波长侧位移。这意味着尽管ternatin C5比原本的矢车菊素型花青素色素更红，但在菊花的花瓣中发色为蓝色。Ternatin C5这样的花青素B环的3’位及5’位羟基均被糖苷化的红色花青素在花的花瓣器官等中进行蓝色表达的例子迄今没有报道。
通过使花青素色素与黄酮、黄酮醇、有机酸酯类、单宁类等的物质共存，与它们进行分子间相互作用从而有时表达带蓝色度的颜色。该现象被称作共色(辅色素作用、分子间共色、分子间缔合)，引起该现象的物质被称作辅色素(copigment)。在共色中不仅有引起蓝色表达的深色效果，还有浓色效果、提高颜色稳定性的效果。因此，本发明者推测在蓝色菊花中，ternatin C5、preternatin C5、花翠素3-(3”,6”-二丙二酰基)葡萄糖苷-3’,5’-二葡萄糖苷等的花青素B环的3’及5’位被糖苷化的花翠素型花青素通过与植物内源性的辅色素物质相互作用等从而使花瓣表达蓝色。
本申请说明书中，“花青素B环的3’及5’位被糖苷化的花翠素型花青素”只要与黄酮糖苷或者黄酮醇糖苷共存而呈现蓝色，就没有特别限制，例如可列举ternatin C5、preternatin C5等。另外，认为在蓝色基因重组菊花花瓣中发现蓄积的花翠素3-(3”,6”-二丙二酰基)葡萄糖苷-3’,5’-二葡萄糖苷也与黄酮糖苷或者黄酮醇糖苷共存而呈现蓝色。
黄酮是有机化合物的一种，为黄烷衍生物的环状酮，在植物内主要作为糖苷存在。黄酮狭义上是指化学式C15H10O2、分子量222.24的化合物、2,3-二脱氢黄烷-4-酮，广义的黄酮(黄酮类)是类黄酮的分类之一，在类黄酮中以黄酮结构为基本骨架，而进一步在3位没有羟基的类黄酮被分类为“黄酮”。在本申请说明书中，“黄酮糖苷”为广义的黄酮，即意味着属于黄酮类的衍生物的糖苷。作为黄酮糖苷，可列举木犀草素糖苷、五羟黄酮糖苷、芹菜素糖苷、金合欢素糖苷，而并不限定于此。木犀草素糖苷、五羟黄酮糖苷、芹菜素糖苷、金合欢素糖苷另外还包含木犀草素、五羟黄酮、芹菜素、金合欢素的衍生物的糖苷。作为木犀草素糖苷，例如可列举木犀草素7-(6”-丙二酰基)葡萄糖苷(Lt7MG)、木犀草素7-葡萄糖苷(木犀草苷)、木犀草素7,3’-二葡萄糖苷、木犀草素8-C-葡萄糖苷(荭草素)、木犀草素6-C-葡萄糖苷(异荭草素)或它们的衍生物，作为五羟黄酮糖苷，例如可列举五羟黄酮7-(6”-丙二酰基)葡萄糖苷(Tr7MG)或其衍生物，作为芹菜素糖苷，例如可列举芹菜素7-葡萄糖苷(大波斯菊苷)、芹菜素7-芸香糖苷(异野漆树苷)、芹菜素8-C-葡萄糖苷(牡荆素)、芹菜素6-C-葡萄糖苷(异牡荆素)或它们的衍生物，另外作为金合欢素糖苷，例如可列举金合欢素7-芸香糖苷(蒙花苷)或其衍生物。
黄酮醇类为类黄酮的分类之一，具有3-羟基黄酮(3-羟基-2-苯基色烯-4-酮)骨架。在植物内主要作为糖苷存在。在本申请说明书中，“黄酮醇糖苷”意味属于黄酮醇类的衍生物的糖苷。作为黄酮醇糖苷，可列举山奈酚糖苷、槲皮素糖苷、杨梅素糖苷，而并不限定于此。山奈酚糖苷、槲皮素糖苷、杨梅素糖苷另外还包含山奈酚、槲皮素、杨梅素的衍生物的糖苷。作为山奈酚糖苷，例如可列举山奈酚3-葡萄糖苷、山奈酚3-芸香糖苷或它们的衍生物，另外作为槲皮素糖苷，例如可列举槲皮素3-葡萄糖苷、槲皮素3-(6”-丙二酰基)葡萄糖苷、槲皮素3-芸香糖苷或它们的衍生物。
黄酮在菊花、康乃馨、非洲菊等很多植物的花瓣中合成，作为糖苷而蓄积，但在玫瑰、百合或洋桔梗等中未从花瓣检测到黄酮，或者也存在仅蓄积极微量的植物。为了在这样的植物的花瓣中使黄酮合成并使该糖苷蓄积，可使用黄酮合成酶基因。例如，可从各种植物种来克隆编码作为酮戊二酸依赖性双加氧酶的黄酮合成酶I(FNSI)的基因(专利文献10)与编码作为NADPH依赖型细胞色素P450的黄酮合成酶II(FNSII)的基因(专利文献11)。因此，通过将这些基因进行基因导入，在玫瑰等未从花瓣中检测到黄酮糖苷的植物中也可合成黄酮，该糖苷可在花瓣中蓄积(专利文献8)。另外，黄酮醇在玫瑰、百合或洋桔梗等很多植物的花瓣中合成并作为糖苷而蓄积，但也存在菊花、康乃馨、非洲菊等从花瓣中未检测到黄酮醇或仅蓄积极微量的植物。为了在这样的植物的花瓣中合成黄酮醇并使其糖苷蓄积，可使用黄酮醇合成酶基因(FLS)。可从各种植物种来克隆编码作为酮戊二酸依赖性双加氧酶的黄酮醇合成酶的基因(专利文献12)。因此，通过将该基因进行基因导入，即使在菊花等未从花瓣检测到黄酮醇糖苷的植物中也可合成黄酮醇，可使其糖苷在花瓣中蓄积。关于本发明中可使用的植物没有特别限制，例如可列举玫瑰、百合、康乃馨、大丽花、蝴蝶兰或菊花等，可使用报道有导入基因的方法的洋桔梗、仙客来、勿忘我、兰花、非洲菊、石斛兰、郁金香、天竺葵色素、矮牵牛、卡特兰等各种植物。
在这样的黄酮糖苷蓄积的植物中，通过将该细胞内的花青素B环的3’及5’位糖苷化，可使花青素B环的3’及5’位被糖苷化的花翠素型花青素与黄酮糖苷共存。花青素B环的3’及5’位的糖苷化可通过将来自蝶豆的花青素3’,5’-O-葡萄糖基转移酶基因(CtA3’5’GT)导入到植物中来实现(专利文献2)。另外，还可通过由包含3’,5’位被糖苷化的花青素的植物器官、组织将花青素3’,5’位糖基转移酶基因克隆化来实现。另外，还可使CtA3’5’GT与来自风铃草的类黄酮3’,5’-氧化酶基因(CamF3’5’H)(专利文献13)共表达(专利文献2)。
在目前的技术水平下，为了将基因导入植物并使该基因构成性或组织特异性表达，可通过本领域技术人员公知的方法例如农杆菌法、双元载体法、电穿孔法、PEG法、粒子枪法等来进行。
通过使花青素B环的3’及5’位被糖苷化的花翠素型花青素与黄酮糖苷典型而言以1：1～1：10、优选1：5～1：10、最优选约1：10的量比共存，可呈现蓝色。
花青素色素及花青素色素与辅色素的分子间共色因pH而其发色被左右。负担发色的色素蓄积的液胞等细胞内细胞器内的pH可直接插入电极来测定，通过测定花瓣等组织榨汁液的pH也能测定出大概的值。在欲使花瓣等组织进行蓝色表达的植物的花中，即使在花青素与辅色素蓄积而共存的液胞的pH并不适合通过共色进行的蓝色表达时，通过使调节pH的基因发挥功能也可使液胞pH最佳化。液胞的pH通过存在于液胞膜的液胞型H+-ATP酶(V-ATPase)与液胞型H+-pyrophosphatases(V-PPase)的液胞型质子泵的功能而成为酸性，通过促进或抑制这些基因的功能可调节pH(专利文献14)。另外，开花时pH从6.6上升到7.7，花色从紫色变化为蓝色的天蓝色牵牛花中，报道了编码通过伴随着将钾离子向液胞内的运送而排出质子离子从而使pH上升的钠离子-氢离子逆向转运蛋白(NHX)的基因(非专利文献1)，可调节成为更易使蓝色发色的液胞内pH。呈现蓝色的液胞内的pH典型而言为5.2～6.4左右，优选5.4～6.2左右，最优选5.6～6.0左右，只要可呈现蓝色则并不限定于该范围。
进而，本发明还涉及通过上述方法可得到的具有蓝色系花色的植物或其自殖或者他殖后代的切花或者由该切花制成的加工品(尤其是切花加工品)。在此作为切花加工品，包括使用该切花的压花、保鲜花、干花、树脂密封品等，但并不限定于此。
实施例
[实施例1：在蓝色菊花的花瓣中蓄积的在B环3’位与5’位的羟基上键合了糖的花翠素糖苷的鉴定]
将使用导入了使来自风铃草的F3’5’H(CamF3’5’H；专利文献13；GenBankaccession number：FW570877)与编码来自蝶豆的花青素3’,5’-糖苷酶的CtA3’5’GT(专利文献2；GenBank accession number：AB115560)共表达的双元载体pB423的农杆菌进行转化所得到的显示蓝色的“大平”转化体的主要花青素用LC-MS进行分析。使用的菊花舌状花瓣的花色使用英国皇家园艺协会(RHSCC)第5版在荧光灯下进行对比测色时，具有相当于Violet-Blue 97、Blue100的蓝色花色。算出将CIEL*a*b*表色系中的L*值(明度)、a*值(红/绿)、b*值(黄/蓝色)使用CD100测色计(横河Meters&Instruments)测定3次以上的值的平均值，以该值为基础算出色相角(Hue angle)时，显示出表示230-290°的蓝色的色相角的值。LC-MS分析使用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm，2.1i.d.x 100mm；Waters)于35℃通过ACQUITY UPLC进行分级分离，通过ACQUITY UPLC光电二极管阵列(PDA)检测器与ACQITY串联四极杆质谱仪(TQD)(Waters)检测。在UPLC的流动相中使用1％甲酸水溶液(溶剂A)与含1％甲酸的乙腈(溶剂B)。流动相的流速为0.1ml/分钟，进行0-5％B(0-5分钟)、5-35％B(5-20分钟)、35％B(20-25分钟)的梯度洗脱。通过PDA检测200-800nm，在360nm处得到类黄酮与酰基奎宁酸类的色谱，在530nm处得到花青素的色谱。质谱仪的分析条件如下所示：ESI正离子模式；毛细管电压，3.5kV；锥孔电压，45V；离子源温度，150℃；脱溶剂温度，350℃；脱溶剂气体流速flow rate，500L/h；锥孔气体流速，50L/h；碰撞能量，6V、20V；测定质量范围，180-1080m/z。解析检测波长530nm的色谱的结果为主要花青素色素为A7与A8。另外，作为微量色素检测了以A3为代表的8个花青素成分(A1-6、A9-10，图1)。
将A8进行LC-MS/MS分析的结果为作为前体离子得到了m/z＝875[M]+，作为产物离子得到了m/z＝713(-葡萄糖)、627(-葡萄糖-丙二酰基)、465(-2×Glc-丙二酰基)、303(-3×Glc-丙二酰基；花翠素)。另外，从花瓣进行单离纯化并测定1H-NMR，NOESY图谱(表1)及高分解能ESI-TOF-MS图谱(表2)，从而鉴定为ternatin C5(图1)。将A7进行LC-MS/MS分析的结果为作为前体离子得到了m/z＝789[M]+，作为产物离子得到了627(-Glc)、465(-2×葡萄糖)、303(-3×葡萄糖))，由于发现与A8的酸水解产物的HPLC的保持时间及图谱一致，故而认为是preternatin C5(图1)。将在蓝色花瓣中作为微量花青素所检测到的A3进行LC-MS分析的结果为作为前体离子得到了m/z＝773[M]+。从花瓣单离纯化并进行NMR解析(1H-NMR、NOESY)及精密质量分析，鉴定为Cy3MG3’G(图1、表1、表2)。
表1
单离的花青素的1H(600MHz)NMR图谱数据
Figure BDA0001804242060000131
A3：在DMSO-d6+TFA中，A8：在CD3OD+TFA中
表2
Figure BDA0001804242060000141
[实施例2：在花瓣中所包含的B环3’位与5’位的羟基上键合了糖的花翠素糖苷的比例与蓝色发色的关系]
通过在作为马先蒿(Decora)花型的粉红色品种“SEI ARABELLA”中导入CamF3’5’H及CtA3’5’GT，解析所得到的转化体系统的花色与花青素的组成、导入基因的表达。矢车菊素型花青素为主要花青素的花与3’位的糖苷无关，虽然带紫色但显示出接近宿主的花色的粉红色。花翠素型花青素为主要花青素的花与宿主相比，蓝色的色调变强而呈现紫色或者蓝色，3’位及5’位被糖苷化的花青素的比例越高，蓝色的色调越强。发现花翠素型花青素的比例与CamF3’5’H的表达量相关及3’位及5’位被糖苷化的花青素的比例与CtA3’5’GT的表达量相关。由以上结果可知，作为3’,5’位被葡萄糖基化的花翠素型花青素的A7与A8负担蓝色的发色。
[实施例3：在B环3’位与5’位的羟基上键合糖的花翠素糖苷的溶液中及菊花花瓣中的吸光谱的不同]
将菊花舌状花瓣的吸光谱使用安装了积分球附属装置ISR-2200的分光光度计UV-2450(岛津制作所)进行测定。宿主品种“SEI ARABELLA”的粉红色花瓣的可见光区域的最大吸收(λvismax)为556nm，紫色重组体的λvismax为更倾向于长波长域的561nm。蓝色重组体的λvismax为进一步倾向于长波长域的573nm，615nm附近具有特征性的肩峰区域。在HPLC酸性条件下的测定中，粉色花色的宿主的主要色素A1，A2的λvismax为518nm，相对于此紫色重组体的主要色素A5的λvismax为527nm。另一方面，作为蓝色重组体的主要花青素A8的λvismax与A1、A2相比为更倾向于短波长域的511nm。将各自的主要花青素溶解于作为花瓣榨汁液pH的pH5.6的醋酸缓冲液时，A1的λvismax为533nm。A5的λvismax为535nm，在570nm附近发现肩峰区域。A8的λvismax为561nm，在590nm附近观察到肩峰区域。A8具有如下特征：尽管在酸性条件下与其他花青素相比在短波长处具有λmax，在弱酸性条件下λvismax向长波长侧有大的位移从而发色为蓝紫色。由于任一花瓣的λvismax与各个主要花青素的λvismax相比均进一步位于长波长域，故而推定在菊花的花色、尤其是蓝色的发色中显示深色效果的辅色素物质参与。
[实施例4：与在B环3’位与5’位的羟基上键合了糖的花翠素糖苷共存从而发色为蓝色的辅色素物质的探索]
使用Cross TLC法(非专利文献8)对与具有蓝色花瓣的菊花“大平”的转化体的主要花青素相互作用的辅色素物质进行探索。将基因重组菊花的蓝色花瓣约200mg在冷冻状态下粉碎，添加10％醋酸水溶液500μl从而提取花瓣中所包含的成分。使用纤维素TLC玻璃板(100×100mm，Merck公司)，将提取液按照已有报道(非专利文献8)进行倾斜交叉并展着。将展着的TLC板使用展开溶剂BAW(正丁醇：醋酸：水＝4：1：2(v/v/v))在室温下展开。将展开的板风干，在荧光灯下(Light Box NEW5000INVERTER，Fuji color)与UV光下(254/360nm，CSN-15AC，Cosmo Bio)观察，同时用数码相机拍摄。花青素类的Rf值为ternatin C5(A8)：0.15；preternatin C5(A7)：0.11；Cy3MG3’G(A3)：0.30。
花青素的展开线存在认为与辅色素分离的呈现红色的部分，同时存在认为与辅色素共存的呈现紫色及蓝色的部分(图2a)。在UV光下观察时，在蓝色的部分发出黄色荧光的谱带交叉，在紫色部分暗的谱带交叉(图2b)。由于作为在各个谱带中所包含的辅色素的C1及C2与花青素共存，从而认为有助于蓝色的表达。将C1与C2从TLC板提取并通过UPLC-MS/MS分析的结果为分别可得到[M+H]+＝535与[M+H]+＝551。
由蓝色菊花花瓣提取物将具有分子量535及551的C1及C2的峰纯化。另外将花青素A7、A8及A3也纯化、单离。
[实施例5：辅色素与在B环3’位/3’位与5’位的羟基上键合糖的花青素糖苷的纯化与结构确定]
采集蓝色菊花舌状花瓣于-80℃保存。将约2.5kg的冷冻花瓣在液氮中粉碎，在约5.9L的10％甲酸水溶液中浸渍从而进行成分的提取。相对于提取后的花瓣，再次使用6L的10％甲酸水溶液进行提取。将提取液使用滤网(100目)过滤后，以3,000rpm离心10分钟从而得到上清。将上清注入到填充有Diaion HP-20树脂(三菱化成)3L的色谱柱中。将色谱柱用9L的0.1％甲酸水溶液清洗后，使用含0.1％甲酸的甲醇将吸附于树脂的辅色素与花青素进行再洗脱。将洗脱液浓缩后，将冷冻干燥所得到的14.2g的残渣溶解于含0.1％甲酸的20％乙腈水溶液。将溶解的试样通过YMC-Pack ODS A(S-15μm，50mm i.d.×250mm)色谱柱以流速30ml/分钟且使用含0.1％甲酸的20％乙腈水溶液作为溶剂，于360nm处进行检测从而进一步进行分级分离。将包含花青素A7(preternatin C5)、A8(ternatin C5)及A3(Cy3MG3’G)的组分1、包含辅色素2(C2；Tr7MG)的组分2、包含辅色素1(C1；Lt7MG)的组分3分别浓缩、冷冻干燥后，再溶解于含0.1％甲酸的10％乙腈水溶液。组分1为通过对分别包含A3与A7及A8的组分用使用含0.1％甲酸的35％甲醇作为溶剂的制备HPLC(流速30ml/分钟、检测波长530nm)进行分级分离。A3、A7与A8通过使用含0.5％甲酸的20％甲醇作为溶剂的制备HPLC(流速28ml/分钟、检测波长530nm)进一步分级分离来单离。
C1与C2通过使用含0.1％甲酸的35％甲醇作为溶剂的制备HPLC(流速30ml/分钟、检测波长280nm)进行分级分离来单离。将单离的辅色素与花青素浓缩、冷冻干燥从而得到黄色的粉末(C1,Lt7MG：201.5mg；C2,Tr7MG：52mg)与深红色的粉末(A8,ternatin C5：52mg；A7，preternatin C5：7mg；A3,Cy3MG3’G：9.8mg)。
将辅色素C1与C2溶解于DMSO-d6。将花青素A8与A3分别溶解于10％(v/v)三氟乙酸(TFA)-重甲醇混合液与TFA-二甲基亚砜-d6(DMSO-d6)混合液。辅色素的1H-NMR、13C-NMR、HMBC、HMQC、COSY各图谱、花青素的1H-NMR及NOESY图谱通过核磁共振仪JNM-ECZ600R/S1(JEOL Ltd.，Japan)进行测定。1H与13C的共振频率分别为600.17MHz与150.91MHz。
纯化的辅色素与花青素的高分解能质量分析(HR-MS)通过在Agilent1200LC上连接ESI-TOF-MS(JMS-T100LP，Jeol)来进行。将样品以0.01mg/ml的浓度溶解于甲醇并注入10-20μl。分析条件如下所示：溶剂，甲醇；针电压，2.2kV；孔1电压，85V；孔2电压，10V；环透镜电压，25V；峰管电压，2kV；干燥气体流量，1L/分钟，喷雾气体流量，0.5L/分钟；脱溶剂温度，250℃；孔1温度，80℃。
辅色素1(C1)的高分辨质谱可检测到m/z值535.10457(M+H)+、557.10887(M+Na)+，与从Lt7MG的分子式C24H23O14(535.10878)、C24H22O14Na(557.09725)算出的质量一致。辅色素2(C2)的高分辨质谱可检测到m/z值551.10341(M+H)+、573.09189(M+Na)+，与从Tr7MG的分子式(C24H23O15(551.10369)、C24H22O15Na(573.08564))算出的质量一致。
通过HR-MS图谱、1H-NMR与13C-NMR的一维NMR图谱及HMBC、HMQC的二维NMR图谱解析，确定C1的结构为Lt7MG，C2的结构为Tr7MG(图2c及d，表2及3)。
表3
黄酮糖苷的1H(600MHz)及13C(150MHz)NMR图谱数据
Figure BDA0001804242060000181
辅色素(C1及C2)在DMSO-d6中
[实施例6：通过将在B环3’位与5’位的羟基上键合糖的花翠素糖苷与辅色素在试管内混合所进行的蓝色花瓣吸光谱的再构建]
首先，将蓝色菊花花瓣中所包含的花青素与黄酮通过HPLC进行分析、定量。在花青素中从以检测波长530nm、在黄酮中从以检测波长360nm所得到的色谱的HPLC峰面积的值使用花翠素3-葡萄糖苷(花青素)及木犀草素(黄酮)的标准曲线算出单位花瓣的化合物量(nmol/mg)。其结果，蓝色花瓣的3’-及5’-位均被葡萄糖基化的花青素A7-A9的合计与辅色素C1(Lt7MG)及C2(Tr7MG)的摩尔比率平均为1.0：1.7：0.4。另外，花青素总量与黄酮总量的摩尔比率平均为1：5。以上述比率为基础，使相对于花青素的黄酮的比率为1：1～1：10来制作混合液。
接着，将约5g的舌状花瓣在液氮中粉碎后，在蒸馏水15ml中提取从而得到榨汁液。将榨汁液加入到15ml管中，以8,000rpm于10℃离心10分钟，将上清的pH用安装了9611-10DpH电极的pH计D-71(堀场制作所)进行测定。花色的再构建实验使用作为该“大平”转化体的花瓣榨汁液的平均pH的pH5.6的醋酸缓冲液进行。将纯化的辅色素(黄酮)的Lt7MG及Tr7MG溶解于二甲基亚砜(DMSO)。将作为花青素的ternatin C5(A8)、Cy3MG3’G(A3)、花翠素3-(6”-丙二酰基)葡萄糖苷(Dp3MG)(A5)、Cy3MG(A1)溶解于蒸馏水。从蝶豆的浅紫色花瓣纯化Dp3MG。将矢车菊素3-葡萄糖苷(Funakoshi)与丙二酰基-CoA(Sigma·Aldrich)使用从蝶豆花瓣提取的粗酶来合成、纯化Cy3MG。
在1.5ml微型管中加入100mM醋酸缓冲液(pH5.6)(96-78μl)，添加10mM的黄酮DMSO溶液(2-20μl)并使其均匀地溶解。接着，添加10mM的花青素水溶液(2μl)，将均匀溶解的反应液100μl注入超微量黑壁比色皿(光路长10mm，岛津制作所)，使用UV-2450分光光度计(岛津制作所)测定吸光谱。使相对于A8的C1的比率从1：1成为1：10来进行添加，随着C1比率的上升，最大吸收波长及肩峰向长波长侧位移，且最大吸收波长的吸光度上升(图3a)。相对于A8添加5当量以上的C1时，最大吸收波长在570nm附近，肩峰区域成为600-620nm，显示出与蓝色花瓣相同的图谱，同时蓝色的色调增强(图3a)。另外，发现在C2中也存在与C1相同的蓝色表达效果。表明若存在A8的5当量分的C1或C2，则可实现菊花花瓣的蓝色表达。另外，通过在A5中添加C1，570nm附近的吸光度上升，显示出与紫色花瓣的吸光谱相同的图谱图案(图3b)。该结果提示在紫色/蓝紫色的发色中也有相同的辅色素参与。
为了调查金属离子对蓝色表达的影响，进行了镁离子与铁离子的添加实验。将作为二价镁盐的醋酸镁(Mg(OAc)2)以10mM的浓度溶解于蒸馏水。另外，将作为三价铁盐的硫酸铁铵(III)(NH4Fe(SO4)2)以1mM的浓度溶解于蒸馏水。将各个金属离子水溶液2μl添加在包含黄酮的醋酸缓冲液溶液后添加花青素，测定最终量100μl的反应液的吸光谱。其结果，除C1及C2以外，将Mg2+离子以A8等量或将Fe3+离子以A8的1/10等量添加，结果为吸光谱图案没有变化(图3c)。因此，表明金属离子未参与，B环糖苷化花青素与黄酮糖苷的共色成为菊花的蓝色表达的主要原因。
[实施例7：在B环3’位与5’位的羟基上键合了糖的花翠素糖苷与黄酮糖苷的共色中各种pH条件对发色带来的影响]
将各种菊花的育成系统或品种及转化体的花瓣榨汁液的pH进行测定，结果其值为5.6～6.1左右的幅度。因此，首先使用将0.2M磷酸氢二钠水溶液与0.1M柠檬酸水溶液混合成为pH5.6、5.8、6.0的McIlvaine缓冲液，调查pH对B环糖苷化花青素与黄酮糖苷的共色反应引起的蓝色表达的影响。B环糖苷化花青素使用A8(ternatin C5)，黄酮糖苷使用C1(Lt7MG)。在1.5ml微型管中加入调整成各pH的McIlvaine缓冲液(88μl)，添加10mM C1的DMSO溶液(10μl)并均匀地溶解。接着，将添加了10mM的A8水溶液(2μl)均匀溶解的反应液100μl注入到超微量黑壁比色皿(光路长10mm，岛津制作所)中，使用UV-2450分光光度计(岛津)测定吸光谱。其结果，与pH5.6相比pH5.8的最大吸收波长向长波长侧(约600nm)位移，进而为pH6.0时600nm附近的吸光度上升(图4)。由此提示在花瓣的液胞内pH成为5.6、更高的5.8或6.0等的品种·系统·植物种中，而且在液胞内pH成为5.8或6.0的栽培·保管·运送条件下，通过使B环糖苷化花青素与黄酮糖苷共存能够实现更加鲜艳的蓝色表达。
在植物的花中花青素蓄积的液胞内pH从绣球花等的4左右到牵牛花等的7左右等有各种各样。因此，接下来调查各种pH条件对共色引起的发色带来的影响。在3’,5’-糖苷化花青素中使用ternatin C5、在辅色素的黄酮糖苷中使用C1(Lt7MG)，以1：5的量比进行混合。在缓冲液中使用pH4.0、pH4.6、pH5.0、pH5.6、pH5.8、pH6.0、pH6.6、pH7.0的McIlvaine缓冲液(磷酸·柠檬酸缓冲液)。在缓冲液88μL中添加10μL的10mM黄酮DMSO溶液并混合后，添加2μL的10mM花青素水溶液并混合。将反应液加入到超微量黑壁比色皿(岛津制作所)中，通过UV2450(岛津制作所)测定400-700nm的吸收谱。其结果，为pH5.6时最大吸收波长在577nm附近，肩峰成为590-596nm，而且显示出与发现了600-620nm的肩峰区域的吸收的蓝色菊花的鲜花瓣为相同的吸收谱图案，成为些许偏紫的蓝色。为pH5.8～6.0时最大吸收波长成为593nm～596nm，发色为蓝色。为pH6.6～7.0时最大吸收波长进一步向长波长侧位移(597-598nm)，400-500nm的吸光度变高，发色为绿蓝色～蓝绿色。随着从pH5.6变为pH4.0而酸性度变高，最大吸收波长向577nm～568nm的短波长侧位移，同时吸光度显著降低。另外，反应液的颜色从蓝色变化为红紫色。由以上结果可知，适合B环糖苷化花翠素型花青素与黄酮糖苷的共色引起的蓝色发色的pH条件为5.6～6.0左右，与在蓝色菊花的花瓣榨汁液中所测定的pH范围为相同程度。
[实施例8：引起与B环糖苷化花翠素型花青素共色的黄酮糖苷结构的不同对发色带来的影响]
使用通过Cross TLC法而明确的在蓝色菊花的花瓣中通过与3’,5’-糖苷化花翠素型花青素共存而表达蓝色的辅色素且具有与Lt7MG及Tr7MG不同结构的黄酮糖苷，调查它们对B环糖苷化花翠素型花青素的发色带来的影响。对于花青素使用溶解到蒸馏水中的ternatin C5。对于黄酮糖苷，将仅B环4’位被羟化的芹菜素的7-葡萄糖苷与7-芸香糖苷、B环4’位被羟化、3’位被甲氧基化的金合欢素7-芸香糖苷、B环3’位及4’位被羟化的木犀草素的7-葡萄糖苷、7-(6”-丙二酰基)葡萄糖苷(Lt7MG)及3’,7-二葡萄糖苷、B环3’位、4’位、5’位被羟化的Tr7MG溶解于DMSO来使用。在pH5.6的醋酸缓冲液88μL中添加10μL的10mM黄酮DMSO溶液并混合后，添加10mM花青素水溶液2μL，将花青素与黄酮以1：5的量比混合。将反应液加入超微量黑壁比色皿(岛津制作所)，通过UV2450(岛津制作所)测定400-700nm的吸收谱。其结果，仅溶解ternatin C5时的最大吸收波长为559nm，而显示出试验了与ternatinC5共色的全部黄酮糖苷的最大吸收波长为572-574nm、肩峰为595-597nm的图谱图案，从而表达蓝色(图5)。由该结果可知黄酮B环3’位及5’位的羟基与甲氧基引起的修饰图案的不同、7位羟基中的糖残基的不同、7位葡萄糖基的丙二酰基引起的修饰的有无并不会对共色引起的蓝色表达带来大的差别。因此，认为在蓝色菊花的花瓣中全部的3’,5’-糖苷化花翠素型花青素类与全部的黄酮糖苷共色从而表达蓝色。另外，显示出即使在使与菊花的黄酮糖苷不同结构的黄酮糖苷在花中合成的其他植物种中，通过使3’,5’-糖苷化花翠素型花青素蓄积也可表达蓝色。
[实施例9：花青素B环的修饰图案的不同对共色引起的发色带来的影响]
调查Lt7MG共存时通过共色来表达蓝色的花青素的结构特征。在花青素中使用天竺葵色素3-(6”-丙二酰基)葡萄糖苷(Pg3MG)、Cy3MG、Dp3MG3’G、ternatin C5(TC5)。如图6左所示，在花青素的B环3’位及5’位未被修饰的Pg3MG、3’位被羟化的Cy3MG中，无法得到发色为蓝色的图谱。在不存在表达蓝色的TC5的5’位葡萄糖基的Dp3MG3’G中最大吸收值大体相同，但从600nm的肩峰到620nm左右为止的吸光度低，相反显示出在短波长侧的530nm附近可观察到肩峰区域的图谱，从而不会引起蓝色的发色。由此显示出作为将黄酮糖苷作为辅色素的花青素的结构，3’位及5’位的羟基均被糖苷化尤为重要。
[实施例10：3’,5’-糖苷化花翠素型花青素的3位葡萄糖的丙二酰基的有无对共色引起的发色带来的影响]
调查与黄酮糖苷交联时，3’,5’-糖苷化花翠素型花青素的3位葡萄糖的丙二酰基的有无是否影响蓝色发色。在花青素中使用ternatin C5(TC5)及preternatin C5(pTC5)，在辅色素的黄酮糖苷中使用Lt7MG、Tr7MG。Preternatin C5从菊花的蓝色花瓣纯化并通过LC-MS/MS确认结构后使用。将花青素与黄酮以1：5的量比混合。在pH5.6的醋酸缓冲液88μL中添加10mM黄酮DMSO溶液10μL进行混合后，添加10mM花青素水溶液2μL并混合。将反应液加入到超微量黑壁比色皿(岛津制作所)中，通过UV2450(岛津制作所)测定400-700nm的吸收谱。其结果如图6右所示，即使在花青素的3位葡萄糖上没有丙二酰基时(Lt7MG+pTC5)，与某些情况(Lt7MG+TC5)同样地显示出最大吸收波长572nm、肩峰595nm附近的图谱图案，并发色为蓝色。另外，pH从5.6成为5.8时，最大吸收波长从572nm位移到594nm，从而发色为蓝色。另一方面，与具有丙二酰基的TC5相比，在pTC5的混合溶液中退色显著快，为了实现更稳定的蓝色发色，认为需要由花青素3位葡萄糖中的丙二酰基进行修饰。
[实施例11：3’,5’-糖苷化花翠素型花青素与C-葡萄糖基化黄酮的共色引起的发色]
将辅色素的黄酮糖苷中糖的键合方式对蓝色表达带来的影响使用C-糖基化黄酮(Funakoshi)进行调查。在3’,5’-糖苷化花青素中使用ternatin C5，在辅色素中使用通过O-键而糖键合于黄酮的糖苷配基的Lt7MG、通过C-键而糖键合于黄酮的糖苷配基的木犀草素8-C-葡萄糖苷(荭草素,Lt8CG)、木犀草素6-C-葡萄糖苷(均荭草素、异荭草素、Lt6CG)、芹菜素8-C-葡萄糖苷(牡荆素、Ap8CG)、芹菜素6-C-葡萄糖苷(异牡荆素、Ap6CG)的5种。将花青素与黄酮以1：5的量比混合。在pH5.6的醋酸缓冲液88μL中添加10mM黄酮DMSO溶液10μL并混合后，添加10mM花青素水溶液2μL并混合。将反应液加入到超微量黑壁比色皿(岛津制作所)中，通过UV2450(岛津制作所)测定400-700nm的吸收谱。其结果如图7所示，在8位糖进行了C-键合的Lt8CG及Ap8CG中，与Lt7OMG相比最大吸收与肩峰均向短波长侧位移数nm，从而成为紫蓝色。另一方面，在6位糖进行了C-键合的Lt6CG及Ap6CG中，与Lt7OMG相比最大吸收向长波长侧位移3nm左右，进而595nm附近的肩峰的吸光度也上升。尤其是，在Ap6CG(异牡荆素)中于595nm处出现峰，与Lt7OMG或其他的C-糖基黄酮相比表达稳定且漂亮的蓝色。其结果，使在6位葡萄糖进行了C键合的黄酮糖苷共存显示出对于3’,5’-糖苷化花翠素型花青素的蓝色表达有效。
[实施例12：3’,5’-糖苷化花翠素型花青素与黄酮醇糖苷的共色引起的发色]
将有大量报道与黄酮糖苷同样在花瓣中与花青素同时蓄积的黄酮醇糖苷用作辅色素来调查对共色引起的蓝色表达带来的影响。在3’,5’-糖苷化花青素中使用ternatinC5，在辅色素中使用作为黄酮醇糖苷的山奈酚3-葡萄糖苷(Km3G)、槲皮素3-葡萄糖苷(Qu3G)、槲皮素3-丙二酰基葡萄糖苷(Qu3MG)及槲皮素3-芸香糖苷(芦丁、Qu3RG)及黄酮的Lt7MG。将花青素与黄酮醇或黄酮以1：5的量比混合。在pH5.6的醋酸缓冲液88μL中添加10mM黄酮醇DMSO溶液或黄酮DMSO溶液10μL并混合后，添加10mM花青素水溶液2μL并混合。将反应液加入到超微量黑壁比色皿(岛津制作所)中，通过UV2450(岛津制作所)测定400-700nm的吸收谱。其结果如图8所示，在黄酮的Lt7MG中显示出最大吸收波长为572nm，在-595nm附近具有肩峰的吸收谱图案并表达蓝色。另一方面，在黄酮醇的Km3G、Qu3MG、Qu3RG中最大吸收向568-569nm的短波长侧位移，肩峰也在592mm附近，与Lt7MG相比成为偏紫的蓝色。Qu3G在调查的4种黄酮醇中成为最接近将黄酮的Lt7MG作为辅色素的吸收谱，最大吸收波长与肩峰的位置大体相同。由以上结果提示，不仅是黄酮类，黄酮醇类通过与3’,5’-糖苷化花翠素型花青素共色也可发色为蓝色、紫蓝色。

Claims (11)

1.一种方法，为具有蓝色系花色的选自玫瑰、百合、康乃馨、大丽花、蝴蝶兰及菊花的植物或其自殖或者他殖后代、或者它们的营养繁殖体、植物体的一部分、组织或细胞的制作方法，其特征在于，对植物进行转化，使花青素B环的3'及5'位被糖苷化的花翠素型花青素与黄酮糖苷或者黄酮醇糖苷在植物的细胞内共存，
其中，
所述转化通过如下步骤来进行：
将来自蝶豆的花青素3',5'-O-葡萄糖基转移酶基因导入植物；
在所述植物的细胞内，花翠素型花青素没有蓄积时，将来自风铃草的类黄酮3',5'-氧化酶基因进一步导入植物中；以及，
在所述植物的细胞内，黄酮糖苷或者黄酮醇糖苷没有蓄积时，将黄酮合成酶基因和/或黄酮醇合成酶基因进一步导入植物中，
所述花青素B环的3'及5'位被糖苷化的花翠素型花青素与所述黄酮糖苷或者黄酮醇糖苷以1:5～1:10的量比共存，并且，
所述植物的液胞内的pH为5.2～6.4。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黄酮糖苷选自木犀草素糖苷、五羟黄酮糖苷、芹菜素糖苷、金合欢素糖苷及它们的组合。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述木犀草素糖苷为木犀草素7-丙二酰基葡萄糖苷、木犀草素7-葡萄糖苷、木犀草素7,3'-二葡萄糖苷、木犀草素8-C-葡萄糖苷、木犀草素6-C-葡萄糖苷或它们的衍生物。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述五羟黄酮糖苷为五羟黄酮7-丙二酰基葡萄糖苷或其衍生物。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述芹菜素糖苷为芹菜素7-葡萄糖苷、芹菜素7-芸香糖苷、芹菜素8-C-葡萄糖苷、芹菜素6-C-葡萄糖苷或它们的衍生物。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述金合欢素糖苷为金合欢素7-芸香糖苷或其衍生物。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黄酮醇糖苷选自山奈酚糖苷、槲皮素糖苷及它们的组合。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述山奈酚糖苷为山奈酚3-葡萄糖苷或其衍生物。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述槲皮素糖苷为槲皮素3-葡萄糖苷、槲皮素3-(6”-丙二酰基)葡萄糖苷、槲皮素3-芸香糖苷或它们的衍生物。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述花青素B环的3'及5'位被糖苷化的花翠素型花青素选自花翠素3-(6”-丙二酰基)葡萄糖苷-3',5'-二葡萄糖苷即ternatin C5、花翠素3,3',5'-三葡萄糖苷即preternatin C5及它们的组合。
11.一种选自压花、保鲜花、干花或者树脂密封品的加工品，其以使用权利要求1～10中任一项所述的方法所制作的切花为原料而得到。
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