WO2011016260A1 - 新規糖転移酵素、新規糖転移酵素遺伝子および新規糖供与体化合物 - Google Patents

新規糖転移酵素、新規糖転移酵素遺伝子および新規糖供与体化合物 Download PDF

Info

Publication number
WO2011016260A1
WO2011016260A1 PCT/JP2010/050674 JP2010050674W WO2011016260A1 WO 2011016260 A1 WO2011016260 A1 WO 2011016260A1 JP 2010050674 W JP2010050674 W JP 2010050674W WO 2011016260 A1 WO2011016260 A1 WO 2011016260A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
glycosyltransferase
glucose
acid
sugar
gene
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/050674
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
小関良宏
佐々木伸大
長澤和夫
寺正行
松葉由紀
中村晴香
阿部裕
Original Assignee
国立大学法人東京農工大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人東京農工大学 filed Critical 国立大学法人東京農工大学
Priority to CN2010800436082A priority Critical patent/CN102549155A/zh
Priority to US13/389,233 priority patent/US8722868B2/en
Priority to EP10806260.5A priority patent/EP2463366B1/en
Priority to JP2011525808A priority patent/JP5761718B2/ja
Publication of WO2011016260A1 publication Critical patent/WO2011016260A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C07H13/08—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals directly attached to carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/18—Acyclic radicals, substituted by carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/06—Benzopyran radicals
    • C07H17/065—Benzo[b]pyrans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin

Definitions

  • the present invention relates to a novel glycosyltransferase, a glycosyltransferase gene comprising a DNA encoding the glycosyltransferase, use thereof, and a novel sugar donor compound used for a glycosyltransferase reaction.
  • glycosylated compound obtained by glycosylation of a certain compound often has higher stability and solubility than a compound before glycosylation. Therefore, research on glycosyltransferase reaction for glycosylating various compounds has been actively conducted. In addition, the glycosyltransferase reaction can be applied to the synthesis of sugar chains and is one of the research themes attracting attention.
  • Patent Document 1 discloses a flower having a color different from that of a natural plant by incorporating a gene derived from morning glory into another plant so that glucose can be transferred to a flavonoid sugar having a sugar at the 3-position. The method of effect is described.
  • Non-Patent Document 1 discloses a reaction in which UDP-glucose: anthocyanidin 5-glycosyltransferase derived from perilla, verbena and the like transfers sugar to the hydroxy group at the 5-position of anthocyanidin using UDP-glucose as a sugar donor. Is described as a catalyst.
  • Non-Patent Document 2 discloses that UDP-glucose: flavonoid 3-glycosylase derived from perilla, corn, gentian, grape and the like has a sugar at the 3-position hydroxy group of flavonoid or anthocyanidin using UDP-glucose as a sugar donor. Catalyzing the reaction of transferring Patent Document 2 describes that an enzyme derived from snapdragon catalyzes a reaction of transferring sugar to a 4′-position hydroxy group of chalcones using UDP-glucose as a sugar donor. Also in Patent Document 1, the glycosyltransferase encoded by the incorporated gene catalyzes the reaction of transferring glucose using UDP-glucose as a sugar donor (see Example 4 of Patent Document 1). .
  • sugar transfer reactions using sugar nucleotides as sugar donors are known.
  • few transglycosylation reactions using compounds other than sugar nucleotides as sugar donors are known.
  • sugar nucleotides that are sugar donors are required.
  • sugar nucleotides are chemically unstable and difficult to isolate, they are relatively expensive as reagents and may be difficult to obtain. Therefore, there is a need for compounds other than sugar nucleotides that function as sugar donors.
  • Carnation petals contain various pigments, and the main ones are anthocyanins in which the 3rd and 5th positions of anthocyanidins (especially pelargonidin and cyanidin) are glycosylated.
  • anthocyanins especially pelargonidin and cyanidin
  • the present inventors have noted that even in the same carnation, some anthocyanidins do not have anthocyanins glycosylated at the 5-position of anthocyanidins.
  • the present inventors predicted that there is a glycosyltransferase that transfers sugar to the 5-position of anthocyanidins in carnations, and that carnations that do not have anthocyanins glycosylated at the 5-position of anthocyanidins have their glycosyltransferases. It was thought that the sugar donors used by were accumulated. Therefore, the present inventors studied a carnation petal extract that does not have anthocyanin glycosylated at the 5-position, and found a compound functioning as a sugar donor from the extract.
  • the present inventors have discovered a novel glycosyltransferase that catalyzes a glycosyltransferase utilizing the novel sugar donor from carnation petal extract and delphinium petal extract, and the glycosyltransferase A glycosyltransferase gene consisting of DNA encoding was identified.
  • the present invention provides a novel glycosyltransferase, a glycosyltransferase gene comprising a DNA encoding the glycosyltransferase and use thereof, a sugar donor reagent containing a novel sugar donor compound, and the sugar donor reagent
  • a novel polyphenol glycosylation method and polyphenol glycosylation kit used are provided.
  • the gist of the present invention is as described below.
  • Glycosyltransferase gene comprising any of the following DNAs (c) to (e): (c) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 4, (d) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 4, and encodes a protein having glycosyltransferase activity; (e) DNA comprising a degenerate isomer of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 4.
  • R 1 and R 2 are each independently hydrogen, or C 1-6 alkyl, C 2-6 alkenyl or C 2-6 alkynyl (these groups are unsubstituted or OH, F N may be 0, 1, 2, 3, 4 or 5 optionally substituted by one or more groups selected from Cl, Br, I, CN, NO 2 or SO 2 , M is 0 or 1, and X is a monosaccharide ⁇ -bonded at the anomeric carbon].
  • each R 1 is independently hydrogen or C 1-6 alkyl (where C 1-6 alkyl is unsubstituted or is one or more groups selected from OH, F, Cl, Br or I)
  • the sugar donating reagent according to (8) which is selected from (which may be substituted).
  • Compounds represented by formula (I) or formula (II) are vanillic acid 1-O- ⁇ glucose, isovanillic acid 1-O- ⁇ glucose, p-hydroxybenzoic acid 1-O- ⁇ glucose, p- The sugar donating reagent according to (10), which is coumaric acid 1-O- ⁇ glucose, caffeic acid 1-O- ⁇ glucose, ferulic acid 1-O- ⁇ glucose or sinapinic acid 1-O- ⁇ glucose.
  • a method for glycosylation of polyphenol comprising reacting the sugar donating reagent according to any one of (8) to (11) and a glycosyltransferase with polyphenol.
  • a polyphenol glycosylation kit comprising the sugar donating reagent according to any one of (8) to (11) and the glycosyltransferase according to (1).
  • a sugar donation reaction can be performed without using a sugar nucleotide such as UDP-glucose.
  • a sugar nucleotide such as UDP-glucose.
  • an enzyme that catalyzes a glycosyltransferase reaction using a sugar donor other than a sugar nucleotide can be provided.
  • cyanidin 3,5-O- ⁇ diglucoside was produced from cyanidin 3-O- ⁇ glucoside as a result of a glycosyltransferase reaction using a crude enzyme solution obtained from Escherichia coli transformed with a carnation-derived glycosyltransferase gene. It is a figure showing the result of the HPLC analysis shown. It is a figure showing the base sequence (sequence number 4) estimated with the cDNA sequence of glycosyltransferase derived from delphinium, and the deduced amino acid sequence (sequence number 3) encoded by the base sequence.
  • the crude enzyme solution obtained from the petals of carnation causes a transglycosylation reaction using 1-O- ⁇ -glucose of p-hydroxybenzoate as a sugar donor, and cyanidin 3-O- ⁇ -glucoside is converted to cyanidin 3,5-O- It is a figure showing the result of the HPLC analysis which shows that (beta) diglucoside produced
  • the crude enzyme solution obtained from the petal of delphinium causes a transglycosylation reaction using 1-O- ⁇ -glucose of p-hydroxybenzoate as a sugar donor, and the cyanidin 3,5-O- It is a figure showing the result of the HPLC analysis which shows that (beta) diglucoside produced
  • each R 1 is independently hydrogen or C 1-6 alkyl (for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, t-butyl, pentyl, hexyl, etc .: The same for C 1-6 alkyl), C 2-6 alkenyl (eg vinyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 1-methyl-2-propenyl, 1-pentenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 4-pentenyl, 1-methyl-2-butenyl, 2-methyl-3-butenyl, 1-hexenyl, 2-hexenyl, 3-hexenyl, 4-hexenyl, 5-hexenyl, 1, 1-dimethyl-2-butenyl, 2-methyl-3-pentenyl, etc .: hereinafter the same for C 2-6 alkenyl (eg vinyl
  • C 1-6 alkyl, C 2-6 alkenyl or C 2-6 alkynyl are each unsubstituted or OH, F, Cl, Br, I, CN, NO 2 , SO 2 , C 1 It may be substituted by one or more groups selected from -6 alkyl, C 2-6 alkenyl or C 2-6 alkynyl.
  • each R 1 is independently hydrogen, or C 1-6 alkyl (C 1-6 alkyl is unsubstituted or one or more groups selected from OH, F, Cl, Br or I) Optionally substituted by).
  • R 1 is hydrogen, methyl, ethyl, n-propyl or isopropyl (these groups are each unsubstituted or substituted by one or more groups selected from OH, F, Cl, Br or I) May be selected). Particularly preferably R 1 is selected from hydrogen or methyl.
  • n is 0, 1, 2, 3, 4 or 5, preferably n is 0, 1, 2, 3 or 4, particularly preferably n is 1, 2 or 3.
  • m is 0 or 1.
  • the novel sugar donor compound of the present invention is preferably the following formula (I): Or formula (II): Having the structure shown in.
  • R 1 and R 2 are each independently selected from hydrogen or C 1-6 alkyl, C 2-6 alkenyl or C 2-6 alkynyl. Where C 1-6 alkyl, C 2-6 alkenyl or C 2-6 alkynyl are each unsubstituted or OH, F, Cl, Br, I, CN, NO 2 , SO 2 , C 1 It may be substituted by one or more groups selected from -6 alkyl, C 2-6 alkenyl or C 2-6 alkynyl.
  • R 1 and R 2 are each independently hydrogen, or C 1-6 alkyl (C 1-6 alkyl is unsubstituted or one selected from OH, F, Cl, Br or I) It may be substituted with the above groups). More preferably R 1 and R 2 are hydrogen, methyl, ethyl, n-propyl or isopropyl, each of which is unsubstituted or selected from one or more selected from OH, F, Cl, Br or I Optionally substituted by a group). Particularly preferably R 1 and R 2 are selected from hydrogen or methyl. Most preferably in formula (I), R 1 is methyl and R 2 is hydrogen, or R 1 is hydrogen and R 2 is methyl. Most preferably in formula (II) R 1 is hydrogen.
  • the novel sugar donor compound of the present invention is preferably the following formula (III): Or formula (IV): Or the formula (V): Having the structure shown in.
  • R 1 , R 2 and R 3 are each independently hydrogen, or C 1-6 alkyl, C 2-6 alkenyl or C 2-6 alkynyl. Selected. Where C 1-6 alkyl, C 2-6 alkenyl or C 2-6 alkynyl are each unsubstituted or OH, F, Cl, Br, I, CN, NO 2 , SO 2 , C 1 It may be substituted by one or more groups selected from -6 alkyl, C 2-6 alkenyl or C 2-6 alkynyl.
  • R 1 and R 2 are each independently hydrogen, or C 1-6 alkyl (C 1-6 alkyl is unsubstituted or one selected from OH, F, Cl, Br or I) It may be substituted with the above groups). More preferably R 1 , R 2 and R 3 are hydrogen, methyl, ethyl, n-propyl or isopropyl (these groups are each unsubstituted or selected from OH, F, Cl, Br or I 1 Optionally substituted by more than one group). Particularly preferably R 1 , R 2 and R 3 are selected from hydrogen or methyl. Most preferably in formula (III) R 1 is hydrogen. Most preferably in formula (IV), R 1 is hydrogen and R 2 is hydrogen or methyl. Most preferably in formula (V), R 1 is hydrogen and R 2 and R 3 are methyl.
  • X represents a monosaccharide that is ⁇ -bonded at the anomeric carbon.
  • a sugar is “ ⁇ -bonded at the anomeric carbon” as an ether bond so that a moiety other than sugar X (aglycone) occupies the ⁇ -position relative to the sugar on the hydroxy group on the anomeric carbon It means doing.
  • monosaccharides include hexose such as allose, altrose, glucose, mannose, gulose, idose, galactose, and talose, pentose such as ribose, arabinose, xylose, and lyxose, tetrose such as erythrose and threose, and triose such as glyceraldehyde.
  • sugar includes derivatives thereof.
  • sugar derivatives include reduced derivatives such as sugar alcohol, deoxy sugar and glycal, oxidized derivatives such as aldonic acid, uronic acid and aldaric acid, dehydrated derivatives such as glycosene and anhydro sugar, and phosphoric acid ester and acetic acid ester.
  • the monosaccharide is selected from glucose, glucuronic acid, galactose, xylose, apiose, allose, rhamnose, arabinofuranose or mannose.
  • the monosaccharide is selected from glucose, glucuronic acid, galactose, xylose, apiose or allose. Most preferably, the monosaccharide is glucose.
  • the monosaccharide may be D-form or L-form, but D-form is more preferable.
  • Vanillic acid 1-O- ⁇ glucose represented by the following formula:
  • Vanillic acid 1-O- ⁇ -glucose is derived from, for example, carnation petals (especially red, especially petals with a color close to 0406 light red in the Japanese garden plant standard color chart), alcohols such as methanol, ethanol or propanol, or acetonitrile. It can be prepared by extraction using an organic solvent or an aqueous solution thereof, or a solution obtained by adding an organic acid such as formic acid or trifluoroacetic acid to the organic solvent, and purifying by HPLC using a reverse phase column such as an ODS column. .
  • isovanillic acid 1-O- ⁇ glucose which is an isomer of the above vanillic acid 1-O- ⁇ glucose: Is also a particularly preferred compound of formula (I).
  • the compound represented by the formula (I) containing vanillic acid 1-O- ⁇ glucose and isovanillic acid 1-O- ⁇ glucose is not only extracted from natural products but also synthesized according to known methods using commercially available reagents. It is also possible to do. It can also be synthesized by transferring sugar to the corresponding aromatic carboxylic acid using a known glycosyltransferase.
  • One particularly preferred compound of formula (II) is p-hydroxybenzoic acid 1-O- ⁇ glucose represented by the following formula:
  • the compound represented by the formula (II) containing 1-O- ⁇ glucose of p-hydroxybenzoic acid is not only extracted from natural products, but can be synthesized according to known methods using commercially available reagents. . It can also be synthesized by transferring sugar to the corresponding aromatic carboxylic acid using a known glycosyltransferase.
  • One particularly preferred compound of formula (III) is p-coumaric acid 1-O- ⁇ glucose represented by the following formula:
  • One particularly preferred compound of formula (IV) is caffeic acid 1-O- ⁇ glucose represented by the following formula:
  • One particularly preferred compound of formula (IV) is ferulic acid 1-O- ⁇ glucose represented by the following formula:
  • One particularly preferred compound of formula (V) is sinapinic acid 1-O- ⁇ glucose represented by the following formula: p-coumaric acid 1-O- ⁇ glucose, caffeic acid 1-O- ⁇ glucose, ferulic acid 1-O- ⁇ glucose or sinapinic acid 1-O- ⁇ glucose containing formula (III) to formula (V)
  • the compound obtained can be extracted not only from a natural product but also synthesized according to a known method using a commercially available reagent. It can also be synthesized by an enzymatic method as described, for example, in Matsuba Y et al., Plant Biotechnology vol. 25, No. 4 (2008) pp. 369-375.
  • sugar Donor Reagent relates to a sugar donor reagent containing a compound represented by the formula (A).
  • the sugar donating reagent means a reagent capable of glycosylating any compound when used in combination with a glycosyltransferase.
  • any compound can be used for glycosylation using the sugar donor reagent of the present invention, but the sugar donor reagent of the present invention is particularly suitable for glycosylation of polyphenols.
  • polyphenols include flavonoid polyphenols, chlorogenic acid polyphenols such as chlorogenic acid, phenylcarboxylic acid polyphenols such as tannin, ellagic acid polyphenols such as ellagic acid, lignan polyphenols such as sesamin, and curcumin. Curcumin polyphenols, and coumarin polyphenols such as coumarins.
  • the sugar donor reagent of the present invention is particularly suitable for glycosylating flavonoids among polyphenols.
  • Flavonoids are a general term for a group of compounds having 1,3-diphenylpropane as a basic skeleton, and are known to be main pigment compounds that give various colors to plants. Examples of flavonoids include chalcone, flavone, flavonol, flavan, flavanone, flavanol, flavonol, isoflavone, and anthocyanidin.
  • the sugar donating reagent of the present invention is particularly suitable for glycosylating anthocyanidins or anthocyanidin derivatives among flavonoids.
  • Anthocyanidins are compounds that form anthocyanins, which are pigments widely present in the plant kingdom by glycosylation, and there are various types depending on the arrangement of substituents such as -OH and -OMe.
  • Anthocyanidins that can be glycosylated with the sugar donating reagent of the present invention are not particularly limited, and anthocyanidins selected from pelargonidin, cyanidin, delphinidin, aurantidine, luteolinidine, peonidin, malvidin, petunidin, europeinidine or rosinidine, or derivatives thereof. preferable. Particularly preferred anthocyanidins are cyanidin, pelargonidin or derivatives thereof. Cyanidin and pelargonidin are compounds having a structure represented by the following formula.
  • the glycosylated position may be any position as long as the sugar can be bound.
  • the sugar donating reagent of the present invention is excellent in glycosylation (preferably with glucose) at the 3-position, 5-position or 7-position of anthocyanidin or a derivative thereof, particularly at the 5-position or 7-position of cyanidin or pelargonidin or a derivative thereof. Yes.
  • the derivative of anthocyanidin means that at least one hydroxy group of anthocyanidin is ether-linked with a monosaccharide, oligosaccharide or polysaccharide, or at least one of the hydrogen atom or hydroxy group of anthocyanidin is halo, hydroxy , Alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, aryl, cycloalkyl, carbonyl, ester, ether, amide, amino, cyano, nitro, sulfonyl, sulfinyl, and the like.
  • the present invention relates to a method for glycosylation of polyphenol comprising reacting a sugar donating reagent containing a compound represented by formula (A) with a polyphenol and a glycosyltransferase.
  • polyphenols include flavonoid polyphenols, chlorogenic acid polyphenols such as chlorogenic acid, phenylcarboxylic acid polyphenols such as tannin, ellagic acid polyphenols such as ellagic acid, lignan polyphenols such as sesamin, and curcumin. Curcumin polyphenols, and coumarin polyphenols such as coumarins.
  • the glycosylation method of the present invention is particularly suitable for glycosylating flavonoids among polyphenols.
  • flavonoids include chalcone, flavone, flavonol, flavan, flavanone, flavanol, flavonol, isoflavone, and anthocyanidin.
  • the glycosylation method of the present invention is particularly suitable for glycosylating anthocyanidins or anthocyanidin derivatives among flavonoids.
  • Anthocyanidins that can be glycosylated by the glycosylation method of the present invention are not particularly limited, and anthocyanidins selected from pelargonidin, cyanidin, delphinidin, aurantidin, luteolinidine, peonidin, malvidin, petunidin, europeinidine or rosinidine, or derivatives thereof. preferable.
  • Particularly preferred anthocyanidins are cyanidin, pelargonidin or derivatives thereof.
  • the glycosylated position may be any position as long as the sugar can be bound thereto.
  • the glycosylation method of the present invention is excellent for glycosylation (preferably with glucose) at the 3-position, 5-position or 7-position of anthocyanidin or a derivative thereof, particularly the 5-position or 7-position of cyanidin or pelargonidin or a derivative thereof. Yes.
  • the glycosyltransferase used in the glycosylation method of the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme that catalyzes a glycosyltransferase reaction using the compound of formula (A) as a sugar donor, but an enzyme derived from carnation is preferably used.
  • Carnation (scientific name: Dianthus caryophyllus) is a plant belonging to the genus Nadesicoaceae, and is widely sold for ornamental purposes.
  • those extracted from carnation petals are particularly preferred.
  • the glycosyltransferase can be extracted by, for example, a method in which petals ground in liquid nitrogen until dissolved in powder form are dissolved in potassium phosphate buffer, and an ammonium sulfate solution is further added to precipitate proteins.
  • the extracted glycosyltransferase may be used after being purified by dialysis or HPLC, if necessary.
  • purification e.g., adsorbed on an anion exchanger (Resouce Q (GE Healthcare), DEAE sepharose (GE Healthcare), etc.) around pH 5.6 to 7.2 and eluted by a linear concentration gradient elution method using NaCl aqueous solution. This can be done.
  • Benzamidine-sepharose carrier BenzamidineGEsepharose, GE Healthcare
  • affinity chromatography carrier a kind of affinity chromatography carrier, using a phosphate buffer at pH 7.2, and by a linear concentration gradient elution method using 4-aminobenzamidine. This can be done by elution.
  • the glycosyltransferase used in the glycosylation method of the present invention is other than red (especially the red color close to 0406 light red in the Japanese garden plant standard color chart).
  • Carnations of colors such as white, yellow, pink, purple, etc., especially pink (especially the color close to 0107 in the Japanese garden plant standard color chart) or purple (especially the color close to 9207 in the Japanese garden plant standard color chart)
  • the petal color is as described above, the carnation variety itself is not limited.
  • the color of the carnation petal is determined based on the Japanese garden plant standard color chart (published by the Japan Color Research Institute).
  • glycosyltransferase used in the glycosylation method of the present invention those extracted from carnation petals of pink color (especially the color close to 0107 bright red of the Japanese garden plant standard color chart) are particularly preferable. Examples of carnations having such pink petals include varieties “Beam Cherry”, “Cinderella”, “Bellmouth”, and the like.
  • the glycosyltransferases extracted from the pink carnation petals as described above the glycosyltransferase used in the glycosylation method of the present invention has a molecular weight of about 55 kDa in SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) analysis. Most preferred is a glycosyltransferase having a pH of 5.0 to 5.5.
  • an enzyme derived from delphinium can also be suitably used.
  • Delphinium (scientific name: Delphinium grandiflorum L., Japanese name: perennials) is a plant belonging to the genus Delphinium (genus Perennials).
  • an enzyme extracted from the petal of delphinium is particularly preferable.
  • the glycosyltransferase can be extracted by the same method as that extracted from the carnation petals described above.
  • the present invention also relates to a polyphenol glycosylation kit comprising a sugar donating reagent and a glycosyltransferase as described above.
  • glycosyltransferase of the present invention is a glycosyltransferase derived from the carnation or delphinium described above.
  • the glycosyltransferase of the present invention includes a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3.
  • the glycosyltransferase of the present invention includes proteins functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3.
  • the glycosyltransferase of the present invention comprises a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3, and having glycosyltransferase activity. It is also included.
  • Examples of conservative substitutions between amino acid residues include glycine (Gly) and proline (Pro), glycine and alanine (Ala) or valine (Val), leucine (Leu) and isoleucine (Ile), glutamic acid (Glu) and Between amino acids such as glutamine (Gln), aspartic acid (Asp) and asparagine (Asn), cysteine (Cys) and threonine (Thr), threonine and serine (Ser) or alanine, lysine (Lys) and arginine (Arg) The substitution of is known.
  • glycosyltransferase of the present invention has 80% or more identity, preferably 90% or more identity, more preferably 95% identity or more, more preferably 98% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3. And proteins having glycosyltransferase activity are also included.
  • the compound used by the glycosyltransferase of the present invention as a sugar donor is preferably a sugar donor compound having a structure represented by the above formula (A).
  • a sugar donor compound having a structure represented by the above formula (A) particularly compounds represented by any one of the formulas (I) to (V), in particular vanillic acid 1-O- ⁇ glucose, isovanillic acid 1-O- ⁇ glucose, p-hydroxy Benzoic acid 1-O- ⁇ glucose p-coumaric acid 1-O- ⁇ glucose, caffeic acid 1-O- ⁇ glucose, ferulic acid 1-O- ⁇ glucose and sinapinic acid 1-O- ⁇ glucose are sugar donor compounds As preferred.
  • the compound of formula (A) is as described above.
  • the glycosyltransferase of the present invention is suitable for glycosylation of polyphenols.
  • the glycosyltransferase of the present invention is particularly suitable for glycosylating flavonoids, especially anthocyanidins or anthocyanidin derivatives among polyphenols.
  • the glycosyltransferase of the present invention is suitable for glycosylation of cyanidin, pelargonidin or a derivative thereof.
  • glycosyltransferase of the present invention glycosylates (preferably with glucose) at the 3-position, 5-position or 7-position of anthocyanidin or a derivative thereof, particularly at the 5-position or 7-position of cyanidin or pelargonidin or a derivative thereof.
  • Suitable for These polyphenols are as described above.
  • glycosyltransferase gene of the present invention refers to the above-mentioned glycosyltransferase, ie, a protein having an activity of transferring sugar from a sugar donor to any compound (glycosylating any compound).
  • the glycosyltransferase gene of the present invention is a glycosyltransferase gene comprising a DNA encoding the glycosyltransferase described above.
  • Specific examples of the glycosyltransferase gene of the present invention include a gene comprising DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the glycosyltransferase gene of the present invention includes a gene functionally equivalent to a gene consisting of DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the “functionally equivalent gene” means that the protein encoded by the target gene has an equivalent biological function and biochemical function.
  • Methods well known to those skilled in the art for preparing genes functionally equivalent to a gene include hybridization techniques (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)).
  • the glycosyltransferase gene of the present invention encodes a protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 and has glycosyltransferase activity. Also included are genes consisting of DNA.
  • Stringent conditions refer to conditions in which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed, and include low stringency conditions and high stringency conditions. High stringency conditions are preferred. . Low stringent conditions are conditions for washing after hybridization, for example, at 42 ° C., 5 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably at 50 ° C., 5 ⁇ SSC, 0.1% SDS. is there. Highly stringent conditions are conditions for washing at, for example, 65 ° C., 0.1 ⁇ SSC and 0.1% SDS in the post-hybridization wash.
  • the glycosyltransferase gene of the present invention includes a degenerate isomer of a gene consisting of DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
  • degenerate isomers mean DNAs that differ only in degenerate codons and can encode the same protein.
  • the codon corresponding to any of its amino acids has been changed to a codon that is degenerate with this, more specifically, for example Asn A codon (AAC) that is changed to a codon that is degenerate (for example, AAT) is called a degenerate isomer.
  • AAC Asn A codon
  • the present invention also relates to a recombinant vector containing the glycosyltransferase gene described above.
  • the recombinant vector of the present invention can be constructed by introducing the glycosyltransferase gene described above into an appropriate vector.
  • the type of vector is not particularly limited, and includes pBI, pPZP, pSMA, pUC, pBR, pBluescript, pET, pGEM, pKS1, pTriEXTM (TAKARA), pTrcHis2-TOPO vector (Invitrogen), etc.
  • Vectors can be used.
  • viral vectors such as cauliflower mosaic virus (CaMV), kidney bean mosaic virus (BGMV), and tobacco mosaic virus (TMV) can also be used.
  • a binary vector such as pBI may be used.
  • the isolated DNA to be inserted is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and then inserted into a restriction enzyme site or a multiple cloning site of an appropriate vector DNA.
  • a method of linking to DNA is employed.
  • the above gene must be incorporated into a vector so that the function of the gene is exhibited.
  • the vector may contain components such as a promoter, intron, enhancer, translation termination codon, terminator, poly A addition signal, and 5′-UTR sequence upstream, inside, or downstream of the gene.
  • a selection marker gene may also be included. These can be used in combination with known ones.
  • Promoters that can operate in plant cells include cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, nopaline synthase gene promoter (Pnos), corn-derived ubiquitin promoter, rice-derived actin promoter, tobacco-derived PR protein promoter, petunia-derived EPSP Examples include a synthase promoter and a chsA promoter.
  • the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter is known as a systemic expression promoter.
  • Petunia EPSP synthase promoter and chsA promoter are known to function in petals.
  • Promoters that can operate in bacterial cells include Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene, Bacillus licheniformis ⁇ -amylase gene, Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene, Bacillus subtilis alkaline protease gene or Bacillus -Promoter of pumilus xylosidase gene, PR or PL promoter of phage lambda, lac, trp or tac promoter of E. coli.
  • promoters operable in yeast host cells include promoters derived from yeast glycolytic genes, alcohol dehydrogenase gene promoters, TPI1 promoters, ADH2-4c promoters, and the like.
  • Examples of the promoter operable in fungi include ADH3 promoter and tpiA promoter.
  • promoters operable in insect cells include polyhedrin promoter, P10 promoter, autographa calihornica polyhedrossis basic protein promoter, baculovirus immediate early gene 1 promoter, baculovirus 39K delayed early gene promoter, etc.
  • Examples of the promoter operable in mammals include SV40 promoter, MT-1 promoter, CMV promoter or adenovirus 2 major late promoter.
  • promoters that use the promoter of the Agrobacterium isopentenyl transferase (ipt) gene or nopaline synthase (nos) gene, the promoter of a highly expressed gene obtained from the genome of the plant that is the target of the transformed host (Genschik et al., Gene, 148, 195-202 (1994)). Furthermore, a chimeric promoter combining a plurality of the promoters described above and having significantly increased promoter activity (Plant J., 7, 661-676 (1995)) can also be used.
  • ipt isopentenyl transferase
  • nos nopaline synthase
  • a virus-derived translation enhancer or a plant-derived translation enhancer can be used as the enhancer.
  • translation enhancers derived from viruses include sequences such as tobacco mosaic virus, alfalfa mosaic virus RNA4, bromomosaic virus RNA3, potato virus X, tobacco etch virus (GallieGet al., Nuc. Acids Res., 15). 8693-8711-8 (1987)).
  • a translation enhancer of plant origin a sequence derived from soybean ⁇ -1,3 glucanase (Glu) (Ishida Isao, Satoshi Misawa, edited by Satoshi Kodansha Scientific, Introductory on Cell Engineering Experiments, Satoshi Kodansha, p.119 (1992 )), Sequences derived from tobacco ferredoxin-binding subunit (PsaDb) (Yamamoto et al., J. Biol. Chem., 270, 12466-12470 (1995)).
  • the enhancer include an enhancer region containing an upstream sequence in the CaMV 35S promoter, SV40 enhancer, CMV enhancer, and the like.
  • translation termination codons include sequences such as TAA, TAG, and TGA.
  • Terminators include nopaline synthase (NOS) gene terminator, octopine synthase (OCS) gene terminator, CaMV 35S terminator, E. coli lipopolyprotein lpp 3 'terminator, trp operon terminator, amyB terminator, ADH1 gene terminator, Etc.
  • NOS nopaline synthase
  • OCS octopine synthase
  • Selectable marker genes include drug resistance genes (tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, hygromycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, neomycin resistance gene, etc.), fluorescent or luminescent reporter Examples of the gene include luciferase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucuronidase (GUS), green fluorescence protein (GFP), neomycin phosphotransferase II (NPT II), and dihydrofolate reductase.
  • drug resistance genes tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, hygromycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, neomycin resistance gene, etc.
  • fluorescent or luminescent reporter examples include luciferase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucuronidase (GUS), green fluorescence protein (GFP),
  • Transformant The present invention further relates to a transformant that can be prepared by introducing a recombinant vector containing the glycosyltransferase gene described above into a suitable host.
  • Bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Aspergillus, Neurospora, Fusarium, Trichoderma Fungi, such as monocotyledonous or dicotyledonous plants, for example plant cells belonging to the family Brassicaceae, Camphoraceae, Vanillaceae, Solanum, Rosaceae, etc., insect cells such as sf9, sf21, HEK293 cells, HeLa cells, Chinese hamster ovary It may be a mammalian cell such as a cell.
  • the introduction of a gene or a recombinant vector includes known methods such as the Agrobacterium method, PEG-calcium phosphate method, electroporation method, liposome method, particle gun method, microinjection method and the like.
  • the introduced gene may be incorporated into the genomic DNA of the host, or may be present as it is contained in the foreign vector.
  • the present invention further includes a plant into which a glycosyltransferase gene has been introduced, obtained by transformation using a recombinant vector containing the glycosyltransferase gene described above, and this Relates to the progeny of the plant having the same properties.
  • target plants to be transformed using the gene encoding the novel glycosyltransferase of the present invention include monocotyledonous plants such as lily, orchid, and taro family, potato, chrysanthemum, rose, carnation, petunia, gypsophila, cyclamen , Dicotyledonous plants such as aster, salvia and gentian. Particularly preferred plant types include chrysanthemums, carnations, roses and petunias.
  • plants that do not have the activity possessed by the glycosyltransferase of the present invention that is, plants that do not have the glycosyltransferase of the present invention or sugars of the present invention.
  • examples include plants in which transferase is not functioning.
  • the plant material transformed with the gene of the present invention to produce a transformed plant body includes, for example, growth points, shoot primordia, meristem, leaf pieces, stem pieces, root pieces, tubers
  • Examples include cells such as pieces, petiole pieces, protoplasts, callus, buds, pollen, pollen tubes, flower pieces, flower stem pieces, petals, and sepals.
  • regeneration of transformed plant bodies from the obtained transformed cells may be performed by a known tissue culture method.
  • Such an operation can be easily performed by those skilled in the art by a method generally known as a method for regenerating plant cells from plant cells.
  • references such as “Plant Cell Culture Manual” (edited by Yasuyuki Yamada, Kodansha Scientific, 1984) can be referred to.
  • the transformed plant cells are sterilized by adding inorganic nutrients, vitamins, carbon sources, sugars as energy sources, plant growth regulators (plant hormones such as auxin and cytokinin), etc. Cultivated in to form dedifferentiated callus that grows indefinitely (hereinafter referred to as “callus induction”).
  • the callus thus formed is transferred to a new medium containing a plant growth regulator such as auxin, and further grown (subcultured).
  • redifferentiation induction When callus induction is performed in a solid medium such as agar and subculture is performed in, for example, liquid culture, each culture can be performed efficiently and in large quantities. Next, callus grown by the above subculture is cultured under appropriate conditions to induce organ redifferentiation (hereinafter referred to as “redifferentiation induction”), and finally regenerates a complete plant body. be able to.
  • Redifferentiation induction can be performed by appropriately setting the types and amounts of various components such as plant growth regulators such as auxin and cytokinin, and carbon sources, light, temperature and the like in the medium.
  • adventitious embryos, adventitious roots, adventitious shoots, adventitious shoots and the like are formed and can be grown to complete plants by culturing them.
  • storage or the like may be performed in a state before becoming a complete plant body (for example, encapsulated artificial seeds, dried embryos, freeze-dried cells and tissues), and the plant body may be regenerated by culture or the like as necessary.
  • transformed plant cells can be regenerated without callus by culturing and growing the transformed plant cells under conditions in which the types, amounts, light, temperature, etc. of the various components are appropriately set. It is.
  • offspring can be obtained from the plant by sexual reproduction or asexual reproduction. It is also possible to obtain a propagation material (for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc.) from the plant body, its descendants or clones, and mass-produce the plant body based on them. Is possible. It is also possible to produce cut flowers from the transformed plant of the present invention and its progeny or clones. The present invention also provides such cut flowers.
  • a cut flower generally refers to a flower cut with a branch or stem attached, but the cut flower in the present invention includes a flower without a branch or stem attached.
  • the present invention also relates to a method for producing a glycosyltransferase.
  • the glycosyltransferase of the present invention can be produced by culturing in an appropriate medium under conditions that allow expression of the introduced gene, depending on the host.
  • Examples of the medium include LB medium, M9 medium, YPD medium, YPG medium, YPM medium, YPDM medium, SMM medium, etc., carbon sources (for example, glucose, glycerin, mannitol, fructose, lactose, etc.), nitrogen sources (for example, ammonium sulfate) , Inorganic nitrogen such as ammonium chloride, casein degradation products, yeast extract, organic nitrogen sources such as polypeptone, bactotryptone, beef extract), inorganic salts (eg sodium diphosphate, potassium diphosphate, magnesium chloride, sulfuric acid) Magnesium, calcium chloride, etc.), vitamins (vitamin B1, etc.), drugs (ampicillin, tetracycline, kanamycin and other antibiotics), etc. Culture conditions are not particularly limited as long as they are appropriate for gene expression, but are usually cultured at 10 to 45 ° C. for several hours to several hundred hours with aeration and stirring as necessary.
  • the protein accumulated in the culture may be extracted by a known method and purified as necessary.
  • the enzyme of the present invention can be obtained by appropriately combining.
  • sugar donor reagent comprising a compound represented by by the formula (A)
  • sugar donor reagent polyphenols and glycosyltransferases which comprises reacting the sugar donor reagent and glycosyltransferases It is related with the polyphenol glycosylation kit containing.
  • the transglycosylation reaction can be performed without using a sugar nucleotide that is relatively expensive as a reagent, such as UDP-glucose.
  • glycosyltransferase reaction by the novel sugar donor compound of the present invention and glycosyltransferase has a reaction mechanism different from the glycosyltransferase reaction known so far. Therefore, according to the present invention, there is a possibility that a substrate that has been difficult to be glycosylated can be glycosylated.
  • a fat-soluble compound can be glycosylated to be soluble in water, and a water-soluble compound can also be glycosylated to improve stability.
  • the present invention can be used for the development of new pharmaceutical compounds or the development of new functional food materials.
  • a carnation-derived glycosyltransferase that catalyzes a transglycosylation reaction using the novel sugar-donating compound of the present invention as a sugar donor has a relatively low optimum pH for the reaction. It is considered that the transglycosylation reaction can be performed even in an acidic environment.
  • the glycosylation method of the present invention may be capable of glycosylating other compounds in addition to glycosylation of polyphenols.
  • the glycosylation method of the present invention is considered to be applicable to, for example, the synthesis of sugar chains.
  • the present invention also relates to a novel glycosyltransferase, a glycosyltransferase gene encoding the glycosyltransferase, a recombinant vector containing the glycosyltransferase gene, and a trait obtained by transforming a host cell using the recombinant vector.
  • the present invention relates to a transformant and a plant into which the glycosyltransferase gene has been introduced. According to the novel glycosyltransferase of the present invention, it is possible to efficiently carry out the novel glycosyltransferase reaction as described above by combining with a sugar donor reagent containing the compound represented by the formula (A) of the present invention. Become.
  • glycosyltransferase gene of the present invention a novel glycosyltransferase can be artificially produced. Furthermore, according to the glycosyltransferase gene of the present invention, for example, by introducing the gene into a plant that does not have the glycosyltransferase of the present invention, it is possible to produce a plant having an unprecedented petal color. It becomes.
  • Example 1 Preparation of crude enzyme solution of glycosyltransferase A pink petal of carnation (variety “Beam Cherry”) was ground in liquid nitrogen using a mortar and pestle until it became powdery. The powder was gradually added and dissolved in 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2) with stirring so as not to freeze. The insoluble fraction was then removed by centrifugation. To the obtained supernatant, a saturated ammonium sulfate solution was added to 80%, and the mixture was allowed to stand on ice for 5 minutes. The precipitated protein was collected by centrifugation, and 10 mM potassium phosphate buffer was added until the precipitate was completely dissolved. The resulting solution was desalted using Sephadex G-25 gel filtration carrier (GE Healthcare) to obtain a crude enzyme solution.
  • Sephadex G-25 gel filtration carrier GE Healthcare
  • Acetic acid was added to this fraction to a final concentration of 0.1%, and then applied to an ODS column (Wakosil C18, Wako Pure Chemical Industries) that had been equilibrated in advance with 0.1% aqueous acetic acid. After the column was washed with 0.1% acetic acid water 5 times the column packing volume, the fraction eluted with 0.1% acetic acid water containing 5% methanol was collected and concentrated under reduced pressure, and used as a sample for preparative HPLC. .
  • ODS column Wangil C18, Wako Pure Chemical Industries
  • Preparative HPLC is a reverse phase column, Develosil® RPAQUEOUS-AR-5 (particle size 5 ⁇ m, inner diameter x length: 10mm x 250mm, Nomura Chemical), eluent A (0.1% aqueous acetic acid) and eluent B (90% Methanol aqueous solution). Separation was performed at a flow rate of 5 ml / min and a linear gradient from B 7% to 30% (40 minutes), and the separated liquid was fractionated every 5 ml.
  • the glycosyltransferase activity was evaluated using a crude enzyme solution (evaluation method will be described later), and the fraction in which activity was observed (the 21st to 24th fractions) was collected and concentrated, Subjected to preparative HPLC.
  • the second preparative HPLC consisted of reverse phase column XTerra Prep MSC18 (particle size 10 ⁇ m, inner diameter x length: 10 ⁇ 250mm, Waters), eluent A (0.1% acetic acid aqueous solution) and eluent B (90% methanol aqueous solution). ). Separation was performed with a flow rate of 5 ml / min and a linear gradient from B 6% to 10% (40 minutes), and the separated liquid was fractionated every 5 minutes. For each fraction, the glycosyltransferase activity was evaluated using a crude enzyme solution (evaluation method will be described later), and the fractions in which the activity was recognized (the 21st to 25th fractions) were collected and concentrated. The sample was subjected to preparative HPLC.
  • the third preparative HPLC was performed using COSMOSIL HILIC Packed column (particle diameter 5 ⁇ m, inner diameter ⁇ length: 10 mm ⁇ 250 mm, Nacalai Tesque) and acetonitrile and pure water as eluents. Separation was performed with a flow rate of 5 ml / min and a linear gradient from 100% to 75% acetonitrile (40 minutes), and the liquid was fractionated every 5 minutes. For each fraction, glycosyltransferase activity was evaluated using a crude enzyme solution (evaluation method will be described later), and fractions in which activity was recognized (19th to 24th fractions) were collected and concentrated.
  • the purified extract was subjected to 1 H NMR, 13 C NMR HMQC, HMBC, and NOE analysis (ECX400, JEOL).
  • the results are shown in Table 1.
  • the purified extract was a compound in which the carboxyl group of vanillic acid had an ester bond with the hydroxyl group at the 1-position (anomeric carbon) of glucose.
  • HPLC analysis was performed using a Chromolith® Performance® RP-18e (4.6 ⁇ 100 mm, Merck) column and 1.5% phosphoric acid aqueous solution and acetonitrile as an eluent. Separation with a flow rate of 3 ml / min and a linear gradient (4 minutes) with a concentration of acetonitrile ranging from 17% to 40%, and confirmed the formation of cyanidin 3,5-diglucoside at an absorbance of 520 nm using an UV-visible detector did.
  • HPLC analysis was performed using an ODS column (inner diameter ⁇ length: 4.6 ⁇ 250 mm, Cosmosil 5C18-MS-II, Nacalai Tesque) and 1.5% phosphoric acid aqueous solution and acetonitrile as eluents. Separation was performed with a flow rate of 1 ml / min and a linear gradient (20 minutes) from 17% to 40% of acetonitrile, and detection was performed using a photodiode array detector. The result of HPLC analysis is shown in the upper diagram of FIG. A comparison of the result of the measurement in the same manner using a commercially available product (lower figure in FIG. 1) and the retention time revealed that the reaction product was cyanidin 3,5-O- ⁇ diglucoside. This means that a transglycosylation reaction has occurred: These results indicate that vanillic acid 1-O- ⁇ glucose functions as a sugar donor in a transglycosylation reaction catalyzed by an enzyme derived from carnation pink petals.
  • the dialyzed solution was applied to TOYOPEARL-DEAE650M (Bed volume 400 ml) that had been equilibrated in advance. After washing with 5 mM (5 CV (column volume)) of 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2), the column is eluted with a linear gradient such that the NaCl concentration is 0 M to 0.8 M at 5 CV. The protein solution was fractionated every 25 ml. Glycosyltransferase activity was evaluated in the same procedure as in (3) above using 30 ⁇ l of each fraction and 3 ⁇ l of vanillic acid 1-O- ⁇ glucose. The fraction in which activity was observed (the 38th to 49th fractions) was collected and dialyzed against a sufficient amount of 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2).
  • Glycosyltransferase activity was evaluated in the same procedure as in (3) above using 30 ⁇ l of each fraction and 3 ⁇ l of vanillic acid 1-O- ⁇ glucose.
  • the active fraction 60th to 77th fraction was collected and dialyzed against a sufficient amount of 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2).
  • the dialyzed fraction was applied to Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow (high sub) (GE Healthcare, Bed volume 8ml) that had been equilibrated with Bz buffer (10 mM potassium phosphate, pH 7.2, 0.5 M NaCl). . After washing with 5 CV benzamidine buffer, elution was carried out with a linear gradient such that the p-benzamidine concentration was 12.5 CV and from 0 mM to 25 mM, and 2.5 ml of the eluted protein solution was fractionated. Glycosyltransferase activity was evaluated in the same procedure as in (3) above using 30 ⁇ l of each fraction and 3 ⁇ l of vanillic acid 1-O- ⁇ glucose. The active fractions (25th and 26th fractions) were collected. The collected fraction was concentrated using Amicon® Ultra-15 (10,000 MWCO, Millipore) and replaced with 10 mM potassium phosphate buffer.
  • the concentrated fraction was applied to a Superdex 200 10/300 GL column (GE Healthcare) that had been equilibrated in advance with a gel filtration buffer (10 mM potassium phosphate, pH 7.2, 150 mM NaCl). Fractionated the eluate by 0.7ml min, using each fraction 30 ⁇ l and vanillic acid 1-O-beta-glucose 3 [mu] l, it was evaluated glycosyltransferase activity in the above (3) and the same procedure. The active fraction (22nd to 25th fractions) was collected. The collected fraction was concentrated using Amicon® Ultra-4 (10,000 MWCO, Millipore) and replaced with 10 mM potassium phosphate buffer.
  • Amicon® Ultra-4 10,000 MWCO, Millipore
  • the gel filtration purified fraction was applied to a Resource Q 1 ml column that had been equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2) in advance. After washing with 5 CV of 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2), elution was performed with a linear gradient such that the NaCl concentration was 0 M to 0.5 M, and the eluted protein solution was fractionated by 0.2 ml. Glycosyltransferase activity was evaluated in the same procedure as in (3) above using 30 ⁇ l of each fraction and 3 ⁇ l of vanillic acid 1-O- ⁇ glucose. The active fraction (the 41st to 48th fractions) was collected.
  • the collected fraction was analyzed by SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis), and the molecular weight of the obtained protein was about 55 kDa. Further, when the optimum pH of the enzyme reaction was examined, the pH was around 5.0 to 5.5. Optimum reaction pH of the enzyme is lower compared glycosyltransferases are known conventionally as the range of about pH 7.5 ⁇ 8.0, the conventional Again enzymatic reaction in weakly acidic conditions such as not occurred reaction Is considered to progress.
  • the condensing agent 1-ethyl-3- (3-) is obtained by combining vanillic acid having a hydroxyl group at the 4-position with benzyl protection and 2,3,4,6-tetrabenzylglucose (Sigma-Aldrich) having a hydroxyl group other than the 1-position protected with benzyl.
  • EDCI dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • DMAP 4-dimethylaminopyridine
  • Et 3 N Wako Pure Chemical Industries
  • Condensation agents EDCI, DMAP, Et 3 N are used for gallic acid in which the hydroxyl groups at positions 3, 4 and 5 are benzyl protected and 2,3,4,6-tetrabenzyl glucose in which the hydroxyl groups other than position 1 are benzyl protected.
  • Condensation in a DMF solvent reaction temperature 60 ° C.
  • the resulting condensate was a mixture of ⁇ anomer: ⁇ anomer 3: 7.
  • Example 2 (1) Extraction of glycosyltransferase 400 ml (fresh weight) of petals of carnation (variety “Beam Cherry”) that had been quickly frozen in liquid nitrogen and stored at ⁇ 80 ° C., and 1500 ml of extraction buffer (100 mM potassium phosphate) , PH 7.2) using a mixer. All subsequent operations were performed on ice or at 4 ° C. unless otherwise specified. Furthermore, crushing was performed at 15,000 rpm for 10 minutes using a homogenizer (Polytron, KINEMATICA). Centrifugation was performed at 20,000 ⁇ g and 4 ° C. for 20 minutes, and the supernatant was recovered. The same operation was repeated twice to obtain about 3000 ml of crude extract from a total of 800 g of petals.
  • extraction buffer 100 mM potassium phosphate
  • the collected precipitate was dissolved in 3000 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 7.2), transferred to a dialysis membrane, and dialyzed against 6 L of 10 mM phosphate buffer (pH 7.2). After 4-12 hours, the phosphate buffer was changed. Finally, dialysis was performed with a phosphate buffer in an amount of 4000 times the amount of sample in the dialysis membrane.
  • the separated protein solution was fractionated by 25 ml. For each fraction, glucosidase activity was measured using cyanidin-3-O- ⁇ -glucoside as a substrate and vanillic acid 1-O- ⁇ glucose as a sugar donor, and the active fraction (31-45 Fractions were collected and dialyzed against a sufficient amount of 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2).
  • solution B 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2)
  • concentration of solution B is 0% to 100% at 1250 ml.
  • Proteins were separated with a linear gradient such that The separated protein solution was fractionated by 20 ml.
  • the glycosidase activity was measured using cyanidin-3-O- ⁇ -glucoside as the substrate and vanillic acid 1-O- ⁇ glucose as the sugar donor. Min) was collected, concentrated using Amicone-15ultra (Millipore), and replaced with 10 mM potassium phosphate buffer.
  • glucosidase activity was measured using cyanidin-3-O- ⁇ -glucoside as a substrate and vanillic acid 1-O- ⁇ glucose as a sugar donor. Fractions) were collected, concentrated using Amicone-15ultra, and replaced with 10 mM potassium phosphate buffer.
  • the separated protein solution was fractionated by 300 ⁇ l, and glucosidase activity was measured for each fraction using cyanidin-3-O- ⁇ -glucoside as a substrate and vanillic acid 1-O- ⁇ glucose as a sugar donor, Fractions with recognized activity (20-25 fractions) were collected, concentrated using Amicone-15ultra (Millipore), and exchanged with 10 mM potassium phosphate buffer.
  • solution A Butyl equilibration buffer
  • solution B Butyl elution buffer (10 mM potassium phosphate buffer, pH 7.2, 10% ethylene glycol) in 19 minutes
  • Proteins were separated with a linear gradient (flow rate 1 ml / min) such that the concentration of solution B was 0% to 100%.
  • the separated protein solution was fractionated by 300 ⁇ l.
  • the glycosidase activity was measured using cyanidin-3-O- ⁇ -glucoside as a substrate and vanillic acid 1-O- ⁇ glucose as a sugar donor. Fractions) were collected, concentrated using Amicone-15ultra (Millipore), and replaced with 10 mM potassium phosphate buffer.
  • the purified protein was separated by SDS-PAGE and visualized by silver staining for confirmation. The result is shown in FIG.
  • the fractionated fraction was subjected to buffer exchange with 100 mM citrate buffer (pH 5.6) using Sephadex G-25 (GE Healthcare) carrier.
  • 100 mM citrate buffer pH 5.6
  • Sephadex G-25 GE Healthcare
  • To 30 ⁇ l of the crude enzyme solution 3 ⁇ l of 10 mM vanillic acid 1-O- ⁇ glucose and 3 ⁇ l of 2 mM cyanidin 3-O- ⁇ -glucoside were added, and the reaction solution was allowed to stand at 30 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 2 ⁇ l of 20% phosphoric acid aqueous solution was added to stop the reaction. Insolubles were removed by centrifugation and HPLC analysis was performed.
  • RNA was extracted from the petals of carnation (variety “Beam Cherry”) using a modified GTC / CsCl density gradient centrifugation (Chirgwin et al., 1979). Each tissue piece is thoroughly crushed in liquid nitrogen using a mortar and pestle and transferred to a 50 ml polypropylene centrifuge tube. After completely evaporating liquid nitrogen at -80 ° C, 3 ml of GTC solution (4.23M Guanidine thiocyanate, 25 mM trisodium citrate, 100 mM 2-mercaptoethanol, 0.5% N-lauroyl sarcosine) were immediately added and mixed well.
  • GTC solution 4.23M Guanidine thiocyanate, 25 mM trisodium citrate, 100 mM 2-mercaptoethanol, 0.5% N-lauroyl sarcosine
  • RNA was suspended in 300 ⁇ l of TE-SDS buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.1% SDS).
  • Poly (A) + RNA was purified from the obtained total RNA using Oligotex-dT ⁇ super> (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan). The method followed the kit manual.
  • Full-length cDNA was synthesized from poly (A) + RNA based on the oligo capping method using GeneRacer TM Kit (Invitrogen corp., CA). The method followed the kit manual. The synthesized cDNA was aliquoted and stored at ⁇ 80 ° C. until just before use. CDNA for 3′-RACE was synthesized from the poly (A) + RNA described above using 3′-Full RACE Core Set (TaKaRa Bio Inc.). The method followed the kit manual.
  • the acquired cDNA fragments using the cloning vector pGEM-T easy (Promega) to Ligation Mix mighty (Takara Bio inc.) was ligated, and transformed into E. coli DH5 ⁇ strain. Plasmids were extracted from the obtained colonies, and their DNA base sequences were analyzed using a genetic analyzer ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems Japan Ltd., Tokyo, Japan). The obtained DNA base sequence was compared with a database using BLASTX of DNA-Databank-of-Japan (DDBJ). A series of DNA base sequences were analyzed using Genetyx WIN ver. 5.0 (Genetyx Corp., Tokyo, Japan).
  • PCR was performed using the primer “GGAAGTCGGGGGCCACCATTCTTCC (SEQ ID NO: 13)” designed from the DNA base sequence of the obtained cDNA fragment and GeneRacer 5′primer, using the previously synthesized full-length cDNA as a template.
  • the obtained PCR product was purified by ethanol precipitation.
  • Nested PCR was performed using the purified PCR product as a template and primers designed from the DNA base sequence of the cDNA fragment to obtain a cDNA fragment of about 550 bp.
  • the obtained cDNA fragment was cloned into the pGEM-Teasy vector in the same manner as described above, and the cDNA base sequence was determined.
  • FIG. 3 shows the determined cDNA sequence and the deduced base sequence (SEQ ID NO: 2) and the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) encoded by the base sequence.
  • the sequence (SEQ ID NO: 5 to 7) confirmed as a result of amino acid internal sequence analysis of the purified glycosyltransferase protein is underlined, and the amino acid sequence confirmed from the N-terminal amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) is underlined And bold.
  • the cDNA was 1749 bp in length and encoded a protein of 502 amino acid residues. From the results of cDNA nucleotide sequence analysis and N-terminal amino acid sequence analysis, it was considered that this enzyme was translated as 502 amino acid residues and then amino acids were removed by processing. In addition, the results of amino acid motif searches on the database suggested that this processed sequence contains a signal sequence for translocation to the vacuole.
  • the transformed E. coli was inoculated into 5 ml of LB medium containing 50 ⁇ l / ml ampicillin and cultured with shaking at 30 ° C. for 14 hours. Thereafter, IPTG was added to 1 mM, followed by shaking culture at 16 ° C. for 2 hours. The cultured Escherichia coli was collected by centrifugation at 1,800 ⁇ g, and the medium was removed. After adding 150 ⁇ l of 0.1 M citrate buffer (pH 5.6) and mixing well, use an ultrasonic crusher (UD-201, TOMY SEIKO Co., Ltd., Tokyo, Japan) on ice. Sonication for 2 seconds (output 4, duty 70) was repeated three times. After centrifugation at 20,000 ⁇ g, the supernatant was transferred to a new centrifuge tube to obtain a crude enzyme solution.
  • Example 3 Isolation of cDNA encoding glycosyltransferase (derived from delphinium) RNA was extracted from petals of delphinium (variety “Marine Blue”) using a modified GTC / CsCl density gradient centrifugation (Chirgwin et al., 1979). Each tissue piece is thoroughly crushed in liquid nitrogen using a mortar and pestle and transferred to a 50 ml polypropylene centrifuge tube.
  • GTC solution 4.23M Guanidine thiocyanate, 25 mM trisodium citrate, 100 mM 2-mercaptoethanol, 0.5% N-lauroyl sarcosine
  • GTC solution 4.23M Guanidine thiocyanate, 25 mM trisodium citrate, 100 mM 2-mercaptoethanol, 0.5% N-lauroyl sarcosine
  • This GTC extract was layered on a 5 ml ultracentrifuge sedimentation tube (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA) that had been pre-dispensed with 2.2 ml of cesium chloride solution (5.7 M CsCl, 0.1 M EDTA, pH 7.5). And ultracentrifuged at 70,000 rpm (TL-100 Ultracentrifuge, TLA110 roter, Beckman Coulter Inc.) for 3 hours. The precipitated total RNA was suspended in 300 ⁇ l of TE-SDS buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.1% SDS). Poly (A) + RNA was purified from the obtained total RNA using Oligotex-dT ⁇ super> (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan). The method followed the kit manual.
  • Full-length cDNA was synthesized from poly (A) + RNA based on the oligo capping method using GeneRacer TM Kit (Invitrogen corp., CA). The method followed the kit manual. The synthesized cDNA was aliquoted and stored at ⁇ 80 ° C. until just before use. CDNA for 3′-RACE was synthesized from the poly (A) + RNA described above using 3′-Full RACE Core Set (TaKaRa Bio Inc.). The method followed the kit manual.
  • the acquired cDNA fragments using the cloning vector pGEM-T easy (Promega) to Ligation Mix mighty (Takara Bio inc.) was ligated, and transformed into E. coli DH5 ⁇ strain. Plasmids were extracted from the obtained colonies, and their DNA base sequences were analyzed using a genetic analyzer ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems Japan Ltd., Tokyo, Japan). The obtained DNA base sequence was compared with a database using BLASTX of DNA-Databank-of-Japan (DDBJ). A series of DNA base sequences were analyzed using Genetyx WIN ver. 5.0 (Genetyx Corp., Tokyo, Japan).
  • PCR was performed using the primer “CTGGTTGCTTCAATATCTGCCCTCG (SEQ ID NO: 17)” designed from the DNA base sequence of the obtained cDNA fragment and GeneRacer 5′primer, using the previously synthesized full-length cDNA as a template.
  • the obtained PCR product was purified by ethanol precipitation.
  • Nested PCR was performed using the purified PCR product as a template and primers designed from the DNA base sequence of the cDNA fragment to obtain a cDNA fragment of about 550 bp.
  • the obtained cDNA fragment was cloned into the pGEM-Teasy vector in the same manner as described above, and the cDNA base sequence was determined.
  • FIG. 5 shows the determined cDNA sequence and the deduced base sequence (SEQ ID NO: 4) and the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) encoded by the base sequence.
  • the cDNA isolated as described above encoded a protein with a total length of 1701 bp and 505 amino acid residues.
  • the results of amino acid motif searches on the database suggested that the N-terminal 30 amino acid residues of this amino acid sequence contained a signal sequence for transition to vacuole.
  • the transformed E. coli was inoculated into 5 ml of LB medium containing 50 ⁇ l / ml ampicillin and cultured with shaking at 30 ° C. for 14 hours. Thereafter, IPTG was added to 1 mM, followed by shaking culture at 16 ° C. for 2 hours. The cultured Escherichia coli was collected by centrifugation at 1,800 ⁇ g, and the medium was removed. After adding 150 ⁇ l of 0.1 M citrate buffer (pH 5.6) and mixing well, use an ultrasonic crusher (UD-201, TOMY SEIKO Co., Ltd., Tokyo, Japan) on ice. Sonication for 2 seconds (output 4, duty 70) was repeated three times. After centrifugation at 20,000 ⁇ g, the supernatant was transferred to a new centrifuge tube to obtain a crude enzyme solution.
  • the product was not confirmed in the crude enzyme solution from Escherichia coli transformed with the vector introduced with the LacZ gene attached to the kit as a control.
  • Example 4 Analysis of the expression level of glycosyltransferase-encoding gene, glycosyltransferase activity, and accumulated anthocyanin level in the four stages of petal development, stem and leaf Expression of gene encoding glycosyltransferase in carnation (variety "Beam Cherry") The amount of change over time and organ specificity was examined. Four types of petals with different developmental stages were used as samples for analysis of changes over time. In addition, stems and leaves were also used as samples for analysis of organ specificity.
  • CDNA was synthesized from 500 ng of total RNA extracted from each sample by the same method as described in Examples 2 and 3. Oligo (dT) 15 primer (Promega) was used as a primer, and M-MLV ReverseTranscriptase (invitrogen) was used as a reverse transcriptase. Primers used for detection of each gene expression are as follows.
  • Carnation-derived UDP-glucose transferase (Dc3UGT): 5′-GGC ACC CAC GAC ACC ACC ATC CC-3 '(SEQ ID NO: 21), 5'-CAG GAT TGT CCA AGA TTA GAG TC-3' (SEQ ID NO: 22), Carnation-derived vanillate glucose transferase (DcVA5GT, enzyme of the present invention): 5'-GAG GGA GTT TAC TCC AAA GAA G-3 '(SEQ ID NO: 23), 5'-CAC CAT GAG TTC GAC ATC TTC C-3' ( SEQ ID NO: 24), carnation-derived actin (DcActin): 5'-CCC TAT TGA GCA CGG TAT CGT CAC C-3 '(SEQ ID NO: 25), 5'-CAG CAC TTG TGG TGA GGG AGT AAC C-3' Number 26).
  • PCR conditions are as follows: 94 ° C for 2 minutes, then 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 20 seconds 27, 32 or 37 cycles.
  • the PCR products were then separated by electrophoresis on an agarose gel. The amount of transcription of each sample was compared by the amount of light when the PCR product was irradiated with UV.
  • the glycosyltransferase activity was examined using the crude enzyme extracted from each sample in the same manner as in Example 1. Cyanidin-3-O- ⁇ -glucoside (final concentration 200 ⁇ M) as acceptor, vanillic acid 1-O- ⁇ glucose (final concentration 1 mM) as sugar donor, adjusted to pH 5.6 with citrate buffer, 30 ° C The glycosyltransferase reaction was performed for 15 minutes. After stopping the reaction with phosphoric acid (final concentration 1%), the insoluble material was removed by centrifugation, and the supernatant was analyzed using HPLC. (Refer to Example 1 (3) for HPLC conditions). The pkat per mg of the crude enzyme was calculated from the HPLC area based on cyanidin-3,5-O- ⁇ -diglucoside.
  • the accumulated amount of anthocyanin was quantified by measuring the absorbance at 520 nm of an extract obtained by extracting 0.1 g of a sample with 80% methanol containing 1% trifluoroacetic acid for 72 hours. The amount of anthocyanin per gram of sample was calculated based on the absorbance of pelargonidin-3,5-diglucoside.
  • Example 5 (1) Synthesis of 1-O- ⁇ -glucose of p-hydroxybenzoic acid Primer for PCR (DcA82atg) designed from DNA sequence information (DDBJ Accession No. AB294379) of carnation glycoside homologous gene (DcUGTA82) on DDBJ database : ATGGAGGAGGATAAACAAAAGCC (SEQ ID NO: 27), DcA82atgrt: ATGTGAAGTAACTTCTTCAATA (SEQ ID NO: 28)) and a 3'-RACE template cDNA synthesized by the method described in Example 2 to obtain a vanillic acid saccharifying enzyme gene by PCR. Amplified.
  • the amplified DNA was ligated to pTrcHis2-TOPO vector (Invitrogen) using pTrcHis2-TOPO TA expression Kit (Invitrogen), and transformed into E. coli JM109 strain.
  • DNA was extracted from the transformed Escherichia coli, and the DNA base sequence was analyzed in the same manner as in the previous method to confirm that the cDNA was introduced and that there was no base substitution by PCR.
  • the transformed E. coli was inoculated into 5 ml of LB medium containing 50 ⁇ l / ml ampicillin and cultured with shaking at 30 ° C. for 14 hours. Thereafter, IPTG was added to 1 mM, followed by shaking culture at 16 ° C. for 2 hours. The cultured Escherichia coli was collected by centrifugation at 1,800 ⁇ g, and the medium was removed. After adding 150 ⁇ l of crushing buffer (0.1 M potassium phosphate, pH 7.5, 7 mM 2-mercaptoethanol) and mixing well, an ultrasonic crusher (UD-201, TOMY SEIKO Co., Ltd. , Tokyo, Japan), and repeated ultrasonic treatment (output ⁇ 4, duty 70) for 10 seconds three times. After centrifugation at 20,000 ⁇ g, the supernatant was transferred to a new centrifuge tube to obtain a crude enzyme solution.
  • crushing buffer 0.1 M potassium phosphate, pH 7.5, 7 mM 2-mercaptoethanol
  • Reaction solution containing 20 ⁇ l of crude enzyme solution, 20 ⁇ l of disruption buffer (0.1 M potassium phosphate, pH 7.5, 7 mM 2-mercaptoethanol), 5 ⁇ l of 10 mM UDP-glucose, 5 ⁇ l of 10 mM vanillic acid or p-hydroxybenzoic acid
  • disruption buffer 0.1 M potassium phosphate, pH 7.5, 7 mM 2-mercaptoethanol
  • 5 ⁇ l of 10 mM UDP-glucose 5 ⁇ l of 10 mM vanillic acid or p-hydroxybenzoic acid
  • the reaction was allowed to proceed at 30 ° C. for 1 hour, and then 2.5 ⁇ l of 20% aqueous phosphoric acid solution was added to stop the reaction. After removing the insolubilized protein by centrifugation at 20,000 ⁇ g, the reaction product was confirmed by HPLC analysis.
  • HPLC analysis was performed using a Wakopak Handy ODS (4.6 ⁇ 250 mm, Wako Pure Chemical Industries) column, using 1.5% phosphoric acid aqueous solution and methanol as the eluent.
  • the reaction product was confirmed using a photodiode array detector after separation at a flow rate of 1 ml / min and a linear gradient (20 minutes) such that the methanol concentration was 22% to 55%.
  • Escherichia coli transformed with DcUGTA82 was cultured in 200 ml of LB medium at 30 ° C. for 14 hours, IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and further cultured at 16 ° C. for 3 hours.
  • the cultured Escherichia coli was collected by centrifugation at 6,000 ⁇ g and suspended in 10 ml of disruption buffer. After that, ultrasonic treatment (output 7, duty 70) was performed for 30 minutes on ice using an ultrasonic crusher. After centrifugation at 20,000 ⁇ g, the supernatant was transferred to a new centrifuge tube to obtain a crude enzyme solution. The enzyme reaction was carried out at 30 ° C.
  • HPLC analysis was performed using a Wakopak Handy ODS (4.6 ⁇ 250 mm, Wako Pure Chemical Industries) column, using 1.5% phosphoric acid aqueous solution and methanol as the eluent. Separation was performed with a flow rate of 1 ml / min and a linear gradient (20 minutes) such that the methanol concentration was 20% to 55%, and the reaction products were confirmed using a photodiode array detector.
  • glycosidase activity for cyanidin 3-O- ⁇ -glucoside was observed when either carnation or delphinium crude enzyme solution was used (FIG. 10: enzyme obtained from carnation petals, from above).
  • the first is when the addition of vanillic acid 1-O-beta-glucose
  • the second when the addition of 1-O-beta-glucose p- hydroxybenzoic acid
  • the third a case where not added sugar donor, respectively Fig.
  • Example 6 Verification of transglycosylation reaction using each compound as a sugar donor using enzyme purified from carnation Pink petals of carnation (variety “Beam Cherry”) by the method shown in Example 1 (1) and (2) 135 ng of enzyme purified from 200 mg of cyanidin 3-glucoside and sugar donor (1-O- ⁇ -D-glucose vanillate or Matsuba Y et al., Plant Biotechnology vol.25, No.4 (2008) pp.369 P-coumaric acid 1-O- ⁇ -D-glucose, caffeic acid 1-O- ⁇ -D-glucose, ferulic acid 1-O- ⁇ -D-glucose synthesized enzymatically according to the method described in JP-375 Alternatively, one of sinapinic acid 1-O- ⁇ -D-glucose) was subjected to an enzyme reaction at 30 ° C.
  • a sugar donation reaction can be performed without using a sugar nucleotide such as UDP-glucose.
  • a sugar nucleotide such as UDP-glucose.
  • an enzyme that catalyzes a glycosyltransferase reaction using a sugar donor other than a sugar nucleotide can be provided.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

　本発明は、糖ヌクレオチド以外の糖供与体化合物を含む糖供与試薬、ならびに糖ヌクレオチド以外の糖供与体化合物を利用した糖転移反応を触媒する酵素を提供することを課題とする。　本発明により、式(A): ［式中、R1はそれぞれ独立して水素、またはC1-6アルキル、C2-6アルケニルもしくはC2-6アルキニル（これらの基は、非置換であるか、あるいはC1-6アルキル、C2-6アルケニルもしくはC2-6アルキニル、OH、F、Cl、Br、I、CN、NO2またはSO2から選択される1個以上の基によって置換されていてもよい）から選択され、nは0、1、2、3、4または5であり、mは0または1であり、Xはアノマー炭素においてβ結合している単糖である］で表される化合物を含む糖供与試薬、ならびに該糖供与体を利用した糖転移反応を触媒する糖転移酵素および該糖転移酵素をコードするDNAからなる糖転移酵素遺伝子が提供される。

Description

新規糖転移酵素、新規糖転移酵素遺伝子および新規糖供与体化合物
　本発明は、新規糖転移酵素および該糖転移酵素をコードするDNAからなる糖転移酵素遺伝子およびその利用、ならびに糖転移反応に用いる新規糖供与体化合物に関する。
　一般に、ある化合物を配糖化して得られた配糖化化合物は、配糖化前の化合物よりも安定性および溶解性が高いことが多い。そのため種々の化合物を配糖化するための糖転移反応についての研究が盛んに行われている。また、糖転移反応は糖鎖の合成などにも応用可能であるため、注目されている研究テーマの一つである。
　自然界にみられる糖転移反応の一つとしては、植物の花弁や果実の色の発現に関与するものが知られている。例えば特許文献１には、アサガオに由来する遺伝子を他の植物に組み込んで3位に糖を有するフラボノイドの糖にグルコースを転移できるようにすることで、天然植物とは異なる色を有する花などをもたらす方法が記載されている。
　糖転移反応としては、UDP-グルコースなどの糖ヌクレオチドを糖供与体として用いるものが多く知られている。例えば、非特許文献１には、シソ、バーベナなどに由来するUDP-グルコース:アントシアニジン5-糖転移酵素が、UDP-グルコースを糖供与体として、アントシアニジンの5位のヒドロキシ基に糖を転移させる反応を触媒することが記載されている。非特許文献２には、シソ、トウモロコシ、リンドウ、ブドウなどに由来するUDP-グルコース:フラボノイド3-糖転移酵素が、UDP-グルコースを糖供与体として、フラボノイドあるいはアントシアニジンの3位のヒドロキシ基に糖を転移させる反応を触媒することが記載されている。特許文献２には、キンギョソウ由来の酵素が、UDP-グルコースを糖供与体として、カルコン類の4'位のヒドロキシ基に糖を転移させる反応を触媒することが記載されている。なお上記特許文献１においても、組み込んだ遺伝子によりコードされる糖転移酵素は、UDP-グルコースを糖供与体として、グルコースを転移させる反応を触媒している（特許文献１の実施例４を参照）。
特開2003-289884号公報 国際公開第2005/059141号公報
J. Biol. Chem., Vol. 274, No. 11 (1999) pp.7405-7411 J. Biol. Chem., Vol. 276, No. 6 (2001) pp.4338-4343
　上記のように、糖ヌクレオチドを糖供与体とする糖転移反応は数多く知られている。しかしながら、糖ヌクレオチド以外の化合物を糖供与体とする糖転移反応はほとんど知られていない。例えば植物の色素の研究において糖転移酵素の働きを調べるためには、糖供与体である糖ヌクレオチドが必要となる。しかし、糖ヌクレオチドは化学的に不安定で単離するのが困難であるため、試薬としては比較的高価であり、入手が困難な場合がある。そのため糖供与体として機能する糖ヌクレオチド以外の化合物が必要とされている。
　本発明者らは、カーネーションの花弁色素について研究している過程において、カーネーションではこれまで糖供与体として機能するとは知られていなかった化合物が糖供与体として用いられていることを見出した。
　カーネーションの花弁には様々な色素が含まれており、その主要なものにはアントシアニジン（特にペラルゴニジンやシアニジン）の3位や5位が配糖化されたアントシアニンが挙げられる。しかしながら本発明者らは、同じカーネーションであっても、品種によってはアントシアニジンの5位が配糖化されたアントシアニンを有しないものがあることに着目した。本発明者らは、カーネーションにはアントシアニジンの5位に糖を転移させる糖転移酵素があることを予想し、さらにアントシアニジンの5位が配糖化されたアントシアニンを有しないカーネーションには、その糖転移酵素が利用する糖供与体が蓄積されていると考えた。そこで本発明者らは5位が配糖化されたアントシアニンを有しないカーネーションの花弁の抽出物について研究したところ、その抽出物から糖供与体として機能している化合物を見出した。さらに、本発明者らはカーネーションの花弁の抽出物およびデルフィニウムの花弁の抽出物から、その新規な糖供与体を利用した糖転移反応を触媒する新規な糖転移酵素を発見し、該糖転移酵素をコードするDNAからなる糖転移酵素遺伝子を特定した。
　本発明は、上記の発見に基づき、新規糖転移酵素、該糖転移酵素をコードするDNAからなる糖転移酵素遺伝子およびその利用、新規糖供与体化合物を含む糖供与試薬、ならびに該糖供与試薬を用いた新規なポリフェノールの配糖化方法およびポリフェノール配糖化キットを提供する。
　本発明の要旨は以下に記載のとおりである。
(1)　以下の(a)または(b)のタンパク質：
　(a)配列番号１または３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
　(b)配列番号１または３に記載のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖転移酵素活性を有するタンパク質。
(2)　(1)に記載のタンパク質をコードするDNAからなる糖転移酵素遺伝子。
(3)　以下の(c)～(e)のいずれかのDNAからなる糖転移酵素遺伝子：
　(c)配列番号２または４に記載の塩基配列からなるDNA、
　(d)配列番号２または４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA、
　(e)配列番号２または４に記載の塩基配列の縮重異性体からなるDNA。
(4)　(2)または(3)に記載の糖転移酵素遺伝子を含む組換えベクター。
(5)　(4)に記載の組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
(6)　(2)または(3)に記載の糖転移酵素遺伝子が導入された植物もしくはこれと同じ性質を有する該植物の子孫。
(7)　(5)に記載の形質転換体を培養することを含む、(1)に記載の糖転移酵素の製造方法。
(8)　式(A)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 ［式中、R1とR2はそれぞれ独立して水素、またはC1-6アルキル、C2-6アルケニルもしくはC2-6アルキニル（これらの基は、非置換であるか、あるいはOH、F、Cl、Br、I、CN、NO2もしくはSO2から選択される1個以上の基によって置換されていてもよい）から選択され、nは0、1、2、3、4または5であり、mは0または1であり、Xは、アノマー炭素においてβ結合している単糖である］で表される化合物を含む糖供与試薬。
(9)　R1がそれぞれ独立して水素またはC1-6アルキル（C1-6アルキルは非置換であるか、あるいはOH、F、Cl、BrもしくはIから選択される1個以上の基によって置換されていてもよい）から選択される、(8)に記載の糖供与試薬。
(10)　Xがグルコース、グルクロン酸、ガラクトース、キシロース、アピオース、アロース、ラムノース、アラビノフラノースもしくはマンノースから選択される、(9)に記載の糖供与試薬。
(11)　式(I)または式(II)で表される化合物がバニリン酸1-O-βグルコース、イソバニリン酸1-O-βグルコース、p-ヒドロキシ安息香酸1-O-βグルコース、p-クマル酸1-O-βグルコース、カフェ酸1-O-βグルコース、フェルラ酸1-O-βグルコースまたはシナピン酸1-O-βグルコースである、(10)に記載の糖供与試薬。
(12)　ポリフェノールに(8)～(11)のいずれかに記載の糖供与試薬と糖転移酵素を反応させることを含む、ポリフェノールの配糖化方法。
(13)　ポリフェノールがフラボノイドである、(12)に記載の配糖化方法。
(14)　糖転移酵素が赤色ではない花弁を有するカーネーション由来あるいはデルフィニウム由来である、(12)または(13)に記載の配糖化方法。
(15)　糖転移酵素が(1)に記載の糖転移酵素である、(12)または(13)に記載の配糖化方法。
(16)　(8)～(11)のいずれかに記載の糖供与試薬と(1)に記載の糖転移酵素とを含む、ポリフェノール配糖化キット。
　本発明の糖供与試薬を用いることにより、UDP-グルコースのような糖ヌクレオチドを使用しないで糖供与反応を行うことができる。また本発明の糖転移酵素および糖転移酵素遺伝子によれば、糖ヌクレオチド以外の糖供与体を利用した糖転移反応を触媒する酵素を提供することができる。
　本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願第2009-011253号および日本国特許出願第2009-184030号の明細書、特許請求の範囲および図面に記載された内容を包含する。
バニリン酸1-O-βグルコースを糖供与体とする糖転移反応の結果、シアニジン3-O-βグルコシドからシアニジン3,5-O-βジグルコシドが生成したことを示すHPLC分析の結果を表す図である。 カーネーションから精製された糖転移酵素をSDS-PAGE法によって分離し、銀染色法によって可視化した結果を表す図である。 カーネーション由来の糖転移酵素のcDNA配列と推定される塩基配列（配列番号２）およびその塩基配列によってコードされる推定アミノ酸配列（配列番号１）を表す図である。 カーネーション由来の糖転移酵素遺伝子を用いて形質転換した大腸菌から得られた粗酵素液による糖転移反応の結果、シアニジン3-O-βグルコシドからシアニジン3,5-O-βジグルコシドが生成したことを示すHPLC分析の結果を表す図である。 デルフィニウム由来の糖転移酵素のcDNA配列と推定される塩基配列（配列番号４）およびその塩基配列によってコードされる推定アミノ酸配列（配列番号３）を表す図である。 デルフィニウム由来の糖転移酵素遺伝子を用いて形質転換した大腸菌から得られた粗酵素液による糖転移反応の結果、シアニジン3-O-βグルコシドからシアニジン3,5-O-βジグルコシドとは異なる生成物が生成したことを示すHPLC分析の結果を表す図である。 カーネーションの花弁の発達4段階、茎、葉における、糖転移酵素をコードする遺伝子の発現量、糖転移酵素活性および蓄積アントシアニン量の解析結果を表す図である。 バニリン酸を基質とし、UDP-グルコースを糖供与体とする糖転移酵素反応により、バニリン酸1-O-βグルコースが生成したことを示すHPLC分析の結果を表す図である。 p-ヒドロキシ安息香酸を基質とし、UDP-グルコースを糖供与体とする糖転移反応により、p-ヒドロキシ安息香酸1-O-βグルコースと思われる反応生成物が得られたことを示すHPLC分析の結果を表す図である。 カーネーションの花弁から得られた粗酵素液により、p-ヒドロキシ安息香酸1-O-βグルコースを糖供与体とする糖転移反応が起こり、シアニジン3-O-βグルコシドからシアニジン3,5-O-βジグルコシドが生成したことを示すHPLC分析の結果を表す図である。 デルフィニウムの花弁から得られた粗酵素液により、p-ヒドロキシ安息香酸1-O-βグルコースを糖供与体とする糖転移反応が起こり、シアニジン3-O-βグルコシドからシアニジン3,5-O-βジグルコシドが生成したことを示すHPLC分析の結果を表す図である。 組換えデルフィニウム由来糖転移酵素を用いた反応により生じたアントシアニンのNOE差スペクトル測定の結果を表す図である。
[1]糖供与体化合物
　本発明の新規糖供与体化合物は以下の式(A)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 に示す構造を有する。
　式(A)において、R1はそれぞれ独立して水素、またはC1-6アルキル（例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、t-ブチル、ペンチル、ヘキシルなど：以下、C1-6アルキルについて同様）、C2-6アルケニル（例えばビニル、1-プロペニル、2-プロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、3-ブテニル、1-メチル-2-プロペニル、1-ペンテニル、2-ペンテニル、3-ペンテニル、4-ペンテニル、1-メチル-2-ブテニル、2-メチル-3-ブテニル、1-ヘキセニル、2-ヘキセニル、3-ヘキセニル、4-ヘキセニル、5-ヘキセニル、1,1-ジメチル-2-ブテニル、2-メチル-3-ペンテニルなど：以下、C2-6アルケニルについて同様）もしくはC2-6アルキニル（例えばエチニル、1-プロピニル、2-プロピニル、1-ブチニル、2-ブチニル、3-ブチニル、1-メチル-2-プロピニル、1-ペンチニル、2-ペンチニル、3-ペンチニル、4-ペンチニル、1-メチル-2-ブチニル、1-ヘキシニル、2-ヘキシニル、3-ヘキシニル、4-ヘキシニル、5-ヘキシニル、1,1-ジメチル-2-ブチニル、2-メチル-3-ペンチニルなど：以下、C2-6アルキニルについて同様）から選択される。ここで、C1-6アルキル、C2-6アルケニルもしくはC2-6アルキニルは、それぞれ非置換であるか、あるいはOH、F、Cl、Br、I、CN、NO2、SO2、C1-6アルキル、C2-6アルケニルもしくはC2-6アルキニルから選択される1個以上の基によって置換されていてもよい。好ましくは、R1はそれぞれ独立して水素、またはC1-6アルキル（C1-6アルキルは非置換であるか、あるいはOH、F、Cl、BrもしくはIから選択される1個以上の基によって置換されていてもよい）から選択される。より好ましくはR1は水素、メチル、エチル、n-プロピルもしくはイソプロピル（これらの基は、それぞれ非置換であるか、OH、F、Cl、BrもしくはIから選択される1個以上の基によって置換されていてもよい）から選択される。特に好ましくは、R1は水素もしくはメチルから選択される。式(A)において、nは0、1、2、3、4または5であり、好ましくはnは0、1、2、3または4、特に好ましくはnは1、2または3である。式(A)においてmは0または1である。
　式(A)においてmが0である場合、本発明の新規糖供与体化合物は好ましくは以下の式(I)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 または式(II)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
 に示す構造を有する。
　式(I)および式(II)において、R1とR2はそれぞれ独立して水素、またはC1-6アルキル、C2-6アルケニルもしくはC2-6アルキニルから選択される。ここで、C1-6アルキル、C2-6アルケニルもしくはC2-6アルキニルは、それぞれ非置換であるか、あるいはOH、F、Cl、Br、I、CN、NO2、SO2、C1-6アルキル、C2-6アルケニルもしくはC2-6アルキニルから選択される1個以上の基によって置換されていてもよい。好ましくは、R1とR2はそれぞれ独立して水素、またはC1-6アルキル（C1-6アルキルは非置換であるか、あるいはOH、F、Cl、BrもしくはIから選択される1個以上の基によって置換されていてもよい）から選択される。より好ましくはR1とR2は水素、メチル、エチル、n-プロピルもしくはイソプロピル（これらの基は、それぞれ非置換であるか、OH、F、Cl、BrもしくはIから選択される1個以上の基によって置換されていてもよい）から選択される。特に好ましくは、R1とR2は水素もしくはメチルから選択される。式(I)において最も好ましくは、R1がメチルでありR2が水素であるか、あるいはR1が水素でありR2がメチルである。式(II)において最も好ましくはR1が水素である。
　式(A)においてmが1である場合、本発明の新規糖供与体化合物は好ましくは以下の式(III)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 または式(IV)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 または式(V)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 に示す構造を有する。
　式(III)、式(IV)および式(V)において、R1、R2およびR3はそれぞれ独立して水素、またはC1-6アルキル、C2-6アルケニルもしくはC2-6アルキニルから選択される。ここで、C1-6アルキル、C2-6アルケニルもしくはC2-6アルキニルは、それぞれ非置換であるか、あるいはOH、F、Cl、Br、I、CN、NO2、SO2、C1-6アルキル、C2-6アルケニルもしくはC2-6アルキニルから選択される1個以上の基によって置換されていてもよい。好ましくは、R1とR2はそれぞれ独立して水素、またはC1-6アルキル（C1-6アルキルは非置換であるか、あるいはOH、F、Cl、BrもしくはIから選択される1個以上の基によって置換されていてもよい）から選択される。より好ましくはR1、R2およびR3は水素、メチル、エチル、n-プロピルもしくはイソプロピル（これらの基は、それぞれ非置換であるか、OH、F、Cl、BrもしくはIから選択される1個以上の基によって置換されていてもよい）から選択される。特に好ましくは、R1、R2およびR3は水素もしくはメチルから選択される。式(III)において最も好ましくは、R1は水素である。式(IV)において最も好ましくは、R1が水素であり、R2が水素またはメチルである。式(V)において最も好ましくは、R1が水素であり、R2およびR3がメチルである。
　また、式(A)ならびに式(I)～式(V)において、Xはアノマー炭素においてβ結合している単糖を示す。本明細書において糖が「アノマー炭素においてβ結合している」とは、糖のアノマー炭素上のヒドロキシ基に、糖X以外の部分（アグリコン）が糖に対してβ位を占めるようにエーテル結合していることをいう。単糖としては、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースといったヘキソース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソースといったペントース、エリトロース、トレオースといったテトロース、グリセルアルデヒドといったトリオースが挙げられる。また本明細書において、糖にはその誘導体も含まれる。糖の誘導体としては、例えば糖アルコール、デオキシ糖、グリカール等の還元誘導体、アルドン酸、ウロン酸、アルダル酸等の酸化誘導体、グリコセエン、アンヒドロ糖等の脱水誘導体、ならびにリン酸エステル化物、酢酸エステル化物、アミノ糖、チオ糖、糖タンパク、糖エステル、糖エーテルなどが挙げられる。好ましくは、単糖はグルコース、グルクロン酸、ガラクトース、キシロース、アピオース、アロース、ラムノース、アラビノフラノースもしくはマンノースから選択される。より好ましくは、単糖はグルコース、グルクロン酸、ガラクトース、キシロース、アピオースもしくはアロースから選択される。最も好ましくは、単糖はグルコースである。なお、単糖はD体でもL体でもかまわないが、D体のものがより好ましい。
　特に好ましい式(I)の化合物のひとつは、以下の式で表されるバニリン酸1-O-βグルコースである：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 バニリン酸1-O-βグルコースは、例えばカーネーションの花弁（特に赤色、とりわけ日本園芸植物標準色票の0406明赤に近い色の花弁が好ましい）から、メタノール、エタノールもしくはプロパノールといったアルコール類もしくはアセトニトリル等の有機溶媒またはその水溶液、あるいはそれらにギ酸やトリフルオロ酢酸といった有機酸を加えた溶液を用いて抽出し、例えばODSカラムなどの逆相カラムを用いたHPLCで精製することによって調製することができる。また、上記のバニリン酸1-O-βグルコースの異性体であるイソバニリン酸1-O-βグルコース：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 も、特に好ましい式(I)の化合物のひとつである。
バニリン酸1-O-βグルコースおよびイソバニリン酸1-O-βグルコースを含む式(I)で表される化合物は、天然物から抽出するのみならず、市販の試薬を用いて公知の方法に従って合成することも可能である。また、既知の糖転移酵素を用いて対応する芳香族カルボン酸に糖を転移させることによっても合成することができる。
　特に好ましい式(II)の化合物のひとつは、以下の式で表されるp-ヒドロキシ安息香酸1-O-βグルコースである：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 p-ヒドロキシ安息香酸1-O-βグルコースを含む式(II)で表される化合物も、天然物から抽出するのみならず、市販の試薬を用いて公知の方法に従って合成することが可能である。また、既知の糖転移酵素を用いて対応する芳香族カルボン酸に糖を転移させることによっても合成することができる。
　特に好ましい式(III)の化合物のひとつは、以下の式で表されるp-クマル酸1-O-βグルコースである：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 特に好ましい式(IV)の化合物のひとつは、以下の式で表されるカフェ酸1-O-βグルコースである：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 特に好ましい式(IV)の化合物のひとつは、以下の式で表されるフェルラ酸1-O-βグルコースである：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
特に好ましい式(V)の化合物のひとつは、以下の式で表されるシナピン酸1-O-βグルコースである：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 p-クマル酸1-O-βグルコース、カフェ酸1-O-βグルコース、フェルラ酸1-O-βグルコースまたはシナピン酸1-O-βグルコースを含む式(III)～式(V)で表される化合物も、天然物から抽出するのみならず、市販の試薬を用いて公知の方法に従って合成することが可能である。また、例えばMatsuba Y et al., Plant Biotechnology vol.25, No.4 (2008) pp.369-375に記載されているような酵素学的な方法によって合成することもできる。
[2]糖供与試薬
　本発明は式(A)で表される化合物を含む糖供与試薬に関する。本明細書において、糖供与試薬とは糖転移酵素と組み合わせて用いることにより任意の化合物を配糖化することができる試薬を意味する。
　本発明の糖供与試薬を用いて配糖化する化合物はどのようなものであってもよいが、本発明の糖供与試薬は、特にポリフェノールを配糖化するのに適している。ポリフェノールとしては、例えばフラボノイド系のポリフェノール、クロロゲン酸などのクロロゲン酸系のポリフェノール、タンニンなどのフェニルカルボン酸系のポリフェノール、エラグ酸などのエラグ酸系のポリフェノール、セサミンなどのリグナン系のポリフェノール、クルクミンなどのクルクミン系のポリフェノール、ならびにクマリンなどのクマリン系のポリフェノールが挙げられる。
　本発明の糖供与試薬は、ポリフェノールの中でも特にフラボノイドを配糖化するのに適している。フラボノイドは1,3-ジフェニルプロパンを基本骨格とする化合物群の総称であり、植物に各種の色調を与える主要な色素化合物であることが知られている。フラボノイドとしては、例えばカルコン、フラボン、フラボノール、フラバン、フラバノン、フラバノール、フラバノノール、イソフラボンもしくはアントシアニジンが挙げられる。
　本発明の糖供与試薬は、フラボノイドの中でも特にアントシアニジンあるいはアントシアニジン誘導体を配糖化するのに適している。アントシアニジンは配糖化されることで植物界に広く存在する色素であるアントシアニンを形成する化合物であり、-OHや-OMeなどの置換基の配置の違いにより様々な種類が存在する。本発明の糖供与試薬により配糖化可能なアントシアニジンは特に限定されないが、ペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジン、オーランチニジン、ルテオリニジン、ペオニジン、マルビジン、ペチュニジン、ヨーロピニジンもしくはロシニジン、あるいはこれらの誘導体から選択されるアントシアニジンが好ましい。特に好ましいアントシアニジンはシアニジンもしくはペラルゴニジンあるいはその誘導体である。シアニジンおよびペラルゴニジンは以下の式で表される構造を有する化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　本発明の糖供与試薬によりアントシアニジンあるいはその誘導体を配糖化する場合、配糖化される位置は糖が結合可能な位置であればいずれの位置であってもよい。しかしながら本発明の糖供与試薬は、アントシアニジンあるいはその誘導体の3位、5位もしくは7位、特にシアニジンもしくはペラルゴニジンあるいはその誘導体の5位もしくは7位を（好ましくはグルコースにより）配糖化させることに優れている。
　なお、本明細書においてアントシアニジンの誘導体とは、アントシアニジンの少なくとも1個のヒドロキシ基に単糖、オリゴ糖もしくは多糖がエーテル結合したもの、あるいはアントシアニジンの水素原子もしくはヒドロキシ基の少なくとも1個がハロ、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、カルボニル、エステル、エーテル、アミド、アミノ、シアノ、ニトロ、スルホニル、スルフィニルといった置換基によって置換されているものを意味する。
[3]配糖化方法および配糖化キット
　また別の側面において、本発明はポリフェノールに式(A)で表される化合物を含む糖供与試薬と糖転移酵素を反応させることを含むポリフェノールの配糖化方法に関する。ポリフェノールとしては、例えばフラボノイド系のポリフェノール、クロロゲン酸などのクロロゲン酸系のポリフェノール、タンニンなどのフェニルカルボン酸系のポリフェノール、エラグ酸などのエラグ酸系のポリフェノール、セサミンなどのリグナン系のポリフェノール、クルクミンなどのクルクミン系のポリフェノール、ならびにクマリンなどのクマリン系のポリフェノールが挙げられる。
　本発明の配糖化方法は、ポリフェノールの中でも、特にフラボノイドを配糖化するのに適している。フラボノイドとしては、例えばカルコン、フラボン、フラボノール、フラバン、フラバノン、フラバノール、フラバノノール、イソフラボンもしくはアントシアニジンが挙げられる。
　本発明の配糖化方法は、フラボノイドの中でも、特にアントシアニジンあるいはアントシアニジン誘導体を配糖化するのに適している。本発明の配糖化方法により配糖化可能なアントシアニジンは特に限定されないが、ペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジン、オーランチニジン、ルテオリニジン、ペオニジン、マルビジン、ペチュニジン、ヨーロピニジンもしくはロシニジン、あるいはこれらの誘導体から選択されるアントシアニジンが好ましい。特に好ましいアントシアニジンはシアニジンもしくはペラルゴニジンあるいはその誘導体である。
　本発明の配糖化方法によりアントシアニジンあるいはその誘導体を配糖化する場合、配糖化される位置は糖が結合可能な位置であればいずれの位置であってもよい。しかしながら本発明の配糖化方法は、アントシアニジンあるいはその誘導体の3位、5位もしくは7位、特にシアニジンもしくはペラルゴニジンあるいはその誘導体の5位もしくは7位を（好ましくはグルコースにより）配糖化させることに優れている。
　本発明の配糖化方法に用いる糖転移酵素としては、式(A)の化合物を糖供与体として糖転移反応を触媒する酵素であれば特に限定されないが、カーネーションに由来する酵素を好適に用いることができる。カーネーション(学名：Dianthus caryophyllus）は、ナデシコ目ナデシコ科ナデシコ属に属する植物であり、観賞用として広く販売されている。本発明の配糖化方法に用いる糖転移酵素としては、カーネーションの花弁から抽出したものが特に好ましい。糖転移酵素の抽出は、例えば花弁を液体窒素中でパウダー状になるまで磨砕したものをリン酸カリウムバッファーに溶解させ、さらに硫酸アンモニウム溶液を加えてタンパク質を析出させるといった方法により行うことができる。抽出した糖転移酵素は、必要に応じて透析やHPLCなどにより精製してから用いてもよい。精製は、例えばpH5.6～7.2付近において、陰イオン交換体（Resouce Q(GEヘルスケア)やDEAE sepharose(GEヘルスケア)など）に吸着させ、NaCl水溶液を用いた直線濃度勾配溶出法によって溶出することにより行うことができる。あるいは、アフィニティークロマトグラフィー担体の一種であるベンザミジン-セファロース担体（Benzamidine sepharose、GEヘルスケア）にpH7.2のリン酸バッファーを用いて吸着させ、4-アミノベンズアミジンを用いた直線濃度勾配溶出法によって溶出することにより行うことができる。 
　カーネーションには様々な種類があり花弁の色も種類によって異なるが、本発明の配糖化方法に用いる糖転移酵素としては、赤色（特に日本園芸植物標準色票の0406明赤に近い赤色）以外の色、例えば白色、黄色、桃色、紫色など、特に桃色（とりわけ日本園芸植物標準色票の0107鮮紅に近い色）あるいは紫色（とりわけ日本園芸植物標準色票の9207鮮赤紫に近い色）のカーネーション花弁から抽出したものが好ましい。花弁の色が上記のようでさえあれば、カーネーションの品種自体は問わない。なお既述のように、カーネーションの花弁の色は日本園芸植物標準色票（財団法人日本色彩研究所発行）を基準として判断する。本発明の配糖化方法に用いる糖転移酵素としては、桃色（とりわけ日本園芸植物標準色票の0107鮮紅に近い色）のカーネーション花弁から抽出したものが特に好ましい。そのような桃色の花弁を有するカーネーションとしては、例えば品種「ビームチェリー」、「シンデレラ」、「ベルマウス」などが挙げられる。本発明の配糖化方法に用いる糖転移酵素としては、上記のような桃色のカーネーション花弁から抽出される糖転移酵素のうち、SDS-PAGE（SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）解析において約55kDaの分子量を有し、かつ反応至適pHがpH5.0～5.5である糖転移酵素が最も好ましい。
　本発明の配糖化方法に用いる糖転移酵素としては、デルフィニウムに由来する酵素も好適に用いることができる。デルフィニウム（学名：Delphinium grandiflorum L.、和名：オオヒエンソウ）は、キンポウゲ科デルフィニウム属（オオヒエンソウ属）に属する植物である。本発明の配糖化方法に用いる糖転移酵素としては、デルフィニウムの花弁から抽出した酵素が特に好ましい。糖転移酵素の抽出は、上述したカーネーションの花弁から抽出した方法と同様の方法により行うことができる。
　また別の側面において、本発明は上述したような糖供与試薬と糖転移酵素とを含むポリフェノール配糖化キットにも関する。
[4]糖転移酵素
　本発明の糖転移酵素は、上述したカーネーションあるいはデルフィニウムに由来する糖転移酵素である。本発明の糖転移酵素としては、配列番号１あるいは３のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。本発明の糖転移酵素には、配列番号１あるいは３のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質も包含される。従って本発明の糖転移酵素には、配列番号１あるいは３のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖転移酵素活性を有するタンパク質も包含される。
　ここで数個とは、２～５個、好ましくは２～３個を意味する。上記各配列番号で表されるアミノ酸配列における、１または数個のアミノ酸の欠失、付加、挿入または置換は、常用される技術、例えば、部位特異的変異誘発法（Zoller et al., Nucleic Acids Res. 10 6478-6500, 1982）により、各配列番号で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNAの配列を改変することにより実施することができる。上記におけるアミノ酸残基の置換は保存的置換であることが好ましい。アミノ酸残基間の保存的置換の例としては、グリシン（Gly）とプロリン（Pro）、グリシンとアラニン（Ala）またはバリン（Val）、ロイシン（Leu）とイソロイシン（Ile）、グルタミン酸（Glu）とグルタミン（Gln）、アスパラギン酸（Asp）とアスパラギン（Asn）、システイン（Cys）とスレオニン（Thr）、スレオニンとセリン（Ser）またはアラニン、リジン（Lys）とアルギニン（Arg）等のアミノ酸の間での置換が知られている。
　本発明の糖転移酵素には、配列番号１あるいは３のアミノ酸配列と80％以上の同一性、好ましくは90％以上の同一性、より好ましくは95％以上の同一性、さらに好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖転移酵素活性を有するタンパク質も包含される。
　本発明の糖転移酵素が糖供与体として用いる化合物は、好ましくは上述した式(A)で示される構造を有する糖供与体化合物である。式(A)の化合物のなかでも、特に式(I)～式(V)のいずれかで示される化合物、とりわけバニリン酸1-O-βグルコース、イソバニリン酸1-O-βグルコース、p-ヒドロキシ安息香酸1-O-βグルコースp-クマル酸1-O-βグルコース、カフェ酸1-O-βグルコース、フェルラ酸1-O-βグルコースおよびシナピン酸1-O-βグルコースが糖供与体化合物として好ましい。式(A)の化合物については上述したとおりである。
　本発明の糖転移酵素はポリフェノールを配糖化するのに適している。本発明の糖転移酵素は、ポリフェノールの中でも特にフラボノイド、とりわけアントシアニジンあるいはアントシアニジン誘導体を配糖化するのに適している。具体的には、本発明の糖転移酵素はシアニジンもしくはペラルゴニジンあるいはその誘導体を配糖化するのに適している。より具体的には、本発明の糖転移酵素はアントシアニジンあるいはその誘導体の3位、5位もしくは7位、特にシアニジンもしくはペラルゴニジンあるいはその誘導体の5位もしくは7位を（好ましくはグルコースにより）配糖化するのに適している。これらのポリフェノール類に関しては上述したとおりである。
[5]糖転移酵素遺伝子
　本発明の糖転移酵素遺伝子とは、上述した糖転移酵素、すなわち糖供与体から任意の化合物へと糖を転移させる（任意の化合物を配糖化する）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。具体的には、本発明の糖転移酵素遺伝子は、上述した糖転移酵素をコードするDNAからなる糖転移酵素遺伝子である。本発明の糖転移酵素遺伝子の具体例としては、配列番号２あるいは４の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子が挙げられる。
　本発明の糖転移酵素遺伝子には、配列番号２あるいは４の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子も包含される。ここで「機能的に同等の遺伝子」とは、対象となる遺伝子によってコードされるタンパク質が、同等の生物学的機能、生化学的機能を有することをさす。ある遺伝子と機能的に同等の遺伝子を調製する当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press (1989)）を利用する方法が挙げられる。従って、本発明の糖転移酵素遺伝子には、配列番号２あるいは４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子も包含される。
　ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、低ストリンジェントな条件および高ストリンジェントな条件が挙げられるが、高ストリンジェントな条件が好ましい。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば42℃、5×SSC、0.1% SDSで洗浄する条件であり、好ましくは50℃、5×SSC、0.1% SDSで洗浄する条件である。高ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば65℃、0.1×SSCおよび0.1% SDSで洗浄する条件である。上記のようなストリンジェントな条件下では、配列番号２あるいは４の塩基配列と高い相同性（相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは98%以上、または同一性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98%以上）を有する塩基配列からなるDNAが、該DNAと相補的な塩基配列からなるDNAとハイブリダイズすることができる。
　本発明の糖転移酵素遺伝子には、配列番号２あるいは４の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子の縮重異性体も包含される。ここで縮重異性体とは、縮重コドンにおいてのみ異なっていて同一のタンパク質をコードすることのできるDNAを意味する。例えば、配列番号２あるいは４の塩基配列を有するDNAに対して、そのアミノ酸のどれかに対応するコドンがこれと縮重関係にあるコドンに変わったもの、より具体的には、例えばAsnに対応するコドン（AAC）がこれと縮重関係にあるコドン（例えばAAT）に変わったものを縮重異性体という。
[6]糖転移酵素遺伝子を含む組換えベクター
　本発明はまた、上述した糖転移酵素遺伝子を含む組換えベクターに関する。本発明の組換えベクターは上述した糖転移酵素遺伝子を適当なベクターに導入することにより構築することができる。ベクターの種類は特に限定されず、pBI系、pPZP系、pSMA系、pUC系、pBR系、pBluescript、pET系、pGEM系、pKS1系、pTriEXTM系（TAKARA）、pTrcHis2-TOPOベクター（Invitrogen）などのベクターを用いることができる。また、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）、インゲンマメモザイクウイルス（BGMV）、タバコモザイクウイルス（TMV）等のウイルスベクターも用いることができる。また、pBI系などのバイナリーベクターを用いてもよい。
　ベクターに遺伝子を挿入するには、まず、単離された挿入しようとするDNAを適当な制限酵素で切断し、次いで適当なベクターDNAの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入することにより、ベクターのDNAに連結する方法などが採用される。
　上記の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込むことが必要である。そのためには、ベクターには、遺伝子の上流、内部、または下流に、プロモーター、イントロン、エンハンサー、翻訳終止コドン、ターミネーター、ポリA付加シグナル、5'-UTR配列等の構成要素を含ませればよい。また、選択マーカー遺伝子を含ませてもよい。これらは、公知のものを適宜組み合わせて用いることができる。
　植物細胞で作動可能なプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Pnos）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来PRタンパク質プロモーター、ペチュニア由来のEPSP合成酵素プロモーターやchsAプロモーターなどが挙げられる。このうち、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーターは全身発現型プロモーターとして知られている。また、ペチュニアのEPSP合成酵素プロモーターやchsAプロモーターは花弁で機能することが知られている。
　細菌細胞で作動可能なプロモーターとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、またはファージ・ラムダのPRもしくはPLプロモーター、大腸菌のlac、trpもしくはtacプロモーターなどが挙げられる。
　酵母宿主細胞で作動可能なプロモーターとしては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、TPI1プロモーター、ADH2－4cプロモーターなどが挙げられる。真菌で作動可能なプロモーターとしては、ADH3プロモーター、tpiAプロモーターなどが挙げられる。昆虫細胞で作動可能なプロモーターとしては、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーター、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパク質プロモーター、バキュロウイルス即時型初期遺伝子1プロモーター、バキュロウイルス39K遅延型初期遺伝子プロモーターなどが挙げられる。哺乳動物で作動可能なプロモーターとしては、SV40プロモーター、MT－1プロモーター、CMVプロモーターまたはアデノウイルス2主後期プロモーターなどが挙げられる。
　また、アグロバクテリウムのイソペンテニルトランスフェラーゼ（ipt）遺伝子もしくはノパリン合成酵素（nos）遺伝子のプロモーター、形質転換宿主の対象となる植物のゲノムから取得した高発現遺伝子のプロモーター等を利用したプロモーター（Genschik et al., Gene, 148, 195-202 (1994)）を用いてもよい。さらに、上記のプロモーターを複数個組み合わせたキメラ型プロモーターであって、プロモーター活性が著しく上昇したもの（Plant J., 7, 661-676 (1995)）を用いることもできる。
　エンハンサーとしては、ウイルス起源の翻訳エンハンサーや植物起源の翻訳エンハンサーを用いることができる。ウイルス起源の翻訳エンハンサーとしては、例えば、タバコモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルスRNA4、ブロモモザイクウイルスRNA3、ポテトウイルスＸ、タバコエッチウイルスなどの配列が挙げられる（Gallie et al., Nuc. Acids Res., 15, 8693-8711 (1987)）。また、植物起源の翻訳エンハンサーとして、ダイズのβ-1,3グルカナーゼ（Glu）由来の配列（石田功, 三沢典彦著, 講談社サイエンティフィク編, 細胞工学実験操作入門, 講談社, p.119 (1992)）、タバコのフェレドキシン結合性サブユニット（PsaDb）由来の配列（Yamamoto et al., J. Biol. Chem., 270, 12466-12470 (1995)）などが挙げられる。またエンハンサーとしては、CaMV 35Sプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域、SV40エンハンサー、CMVエンハンサーなどが挙げられる。翻訳終止コドンとしてはTAA，TAG，TGAなどの配列が挙げられる。
　ターミネーターとしては、ノパリン合成酵素（NOS）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（OCS）遺伝子のターミネーター、CaMV 35Sターミネーター、大腸菌リポポリプロテインlppの3’ターミネーター、trpオペロンターミネーター、amyBターミネーター、ADH1遺伝子のターミネーター、などが挙げられる。
　選択マーカー遺伝子としては、薬剤耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子など）、蛍光または発光レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニターゼ（GUS）、グリーンフルオレッセンスプロテイン（GFP）など）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（NPT II）、ジヒドロ葉酸レダクターゼなどの酵素遺伝子が挙げられる。
[7]形質転換体
　本発明はさらに、上述した糖転移酵素遺伝子を含む組換えベクターを適当な宿主に導入することによって作製することができる形質転換体に関する。
　宿主は、導入された遺伝子が発現可能であれば限定されず、大腸菌や枯草菌などの細菌、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ピヒア・パストリスなどの酵母、アスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、トリコデルマなどの真菌、または単子葉または双子葉植物、例えばアブラナ科、クスノキ科、バンレイシ科、ナス科、バラ科などに属する植物細胞、sf9、sf21などの昆虫細胞、HEK293細胞、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの哺乳動物細胞でもよい。
　遺伝子または組換えベクターの導入は、公知の方法、例えばアグロバクテリウム法、PEG-リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。導入された遺伝子は、宿主のゲノムDNA中に組み込まれてもよいし、外来ベクターに含有されたままで存在していてもよい。
[8]糖転移酵素遺伝子が導入された植物
　本発明はさらに、上述した糖転移酵素遺伝子を含む組換えベクターを用いて形質転換することによって得られる、糖転移酵素遺伝子が導入された植物およびこれと同じ性質を有する該植物の子孫に関する。
　形質転換植物体を調製する際には、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができ、その好ましい例として、例えば、生物学的方法としては、ウイルス、アグロバクテリウムのTiプラスミド、Riプラスミド等をベクターとして用いる方法が挙げられ、物理学的方法としては、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール、パーティクルガン、マイクロインジェクション（Plant Genetic Transformation and Gene Expression; a laboratory manual, J. Draper et al. 編, Blackwell Scientific Publication (1988)）、シリコンウイスカー（Euphytica, 85, 75-80 (1995); In Vitro Cell. Dev. Biol., 31, 101-104 (1995); Plant Science, 132, 31-43 (1998)）によって遺伝子を導入する方法等が挙げられる。当該導入方法については、当業者であれば適宜選択し、使用することができる。
　本発明の新規糖転移酵素をコードする遺伝子を用いて形質転換する対象植物としては、ユリ、ラン、サトイモ科の観葉植物等の単子葉植物、バレイショ、キク、バラ、カーネーション、ペチュニア、カスミソウ、シクラメン、アスター、サルビア、リンドウ等の双子葉植物などが挙げられる。特に好ましい植物の種類としては、キク、カーネーション、バラやペチュニアなどが挙げられる。本発明の糖転移酵素を用いて形質転換する対象植物としては、これらの中でも本発明の糖転移酵素が有する活性を有しない植物、すなわち本発明の糖転移酵素を持たない植物または本発明の糖転移酵素が機能していない植物が挙げられる。
　本発明において、形質転換植物体を作成するために、本発明の遺伝子を用いて形質転換する植物材料としては、例えば、生長点、苗条原基、分裂組織、葉片、茎片、根片、塊茎片、葉柄片、プロトプラスト、カルス、葯、花粉、花粉管、花柄片、花茎片、花弁、がく片等の細胞が挙げられる。
　植物細胞を対象とする場合において、得られた形質転換細胞からの形質転換植物体の再生は既知の組織培養法により行えばよい。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生の方法については、例えば、「植物細胞培養マニュアル」（山田康之編著、講談社サイエンティフィク、1984）等の文献を参照することができる。
　具体的には、まず、形質転換した植物細胞を無機栄養素、ビタミン、炭素源、エネルギー源としての糖類、植物生長調節物質（オーキシン、サイトカイニン等の植物ホルモン）等を加えて滅菌したカルス形成用培地中で培養し、不定形に増殖する脱分化したカルスを形成させる（以下「カルス誘導」という）。このように形成されたカルスをオーキシン等の植物生長調節物質を含む新しい培地に移しかえて更に増殖（継代培養）させる。
　カルス誘導は寒天等の固型培地で行い、継代培養は例えば液体培養で行うと、それぞれの培養を効率良くかつ大量に行うことができる。次に、上記の継代培養により増殖したカルスを適当な条件下で培養することにより器官の再分化を誘導し（以下、「再分化誘導」という）、最終的に完全な植物体を再生させることができる。再分化誘導は、培地中のオーキシンやサイトカイニン等の植物生長調節物質、炭素源等の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することにより行うことができる。再分化誘導により、不定胚、不定根、不定芽、不定茎葉等が形成され、これを培養することにより完全な植物体へと育成させることができる。あるいは、完全な植物体になる前の状態（例えばカプセル化された人工種子、乾燥胚、凍結乾燥細胞および組織等）で貯蔵等を行い、必要に応じて培養等により植物体を再生させてもよい。また、形質転換した植物細胞を前記の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定した条件で培養・生育させることによりカルスを経ることなく、形質転換植物体を再生させることも可能である。
　ゲノム内に本発明の糖転移酵素遺伝子が導入された形質転換植物体がいったん得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。また、本発明の形質転換植物体やその子孫あるいはクローンから切り花を生産することも可能である。本発明は、このような切り花もまた提供するものである。切り花とは、一般的には枝や茎のついたまま切りとった花を指すが、本発明における切り花には、枝や茎のついていない花も含む。
[9]糖転移酵素の製造方法
　本発明はまた糖転移酵素の製造方法に関する。本発明の糖転移酵素は、宿主に応じて、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な培地中で培養されることによって、産生することができる。
　培地は、例えばLB培地、M9培地、YPD培地、YPG培地、YPM培地、YPDM培地、SMM培地などが挙げられ、炭素源（例えばグルコース、グリセリン、マンニトール、フルクトース、ラクトースなど）、窒素源（例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機窒素、カゼイン分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン、ビーフ抽出物などの有機窒素源）、無機塩（例えば二リン酸ナトリウム、二リン酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムなど）、ビタミン（ビタミンB1など）、薬剤（アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシンなどの抗生物質）などを適宜含有する。培養条件は、遺伝子の発現に適切であれば特に限定されないが、通常10～45℃で、必要に応じて通気、攪拌しながら、数時間～数百時間、培養する。
　培養物（培養上清または培養された形質転換体を含む）から本発明の酵素を採取するには、培養物に蓄積されたタンパク質を公知の方法で抽出し、必要に応じて精製すればよい。例えば溶媒抽出法、塩析法、溶媒沈殿法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独で、あるいは適宜組み合わせて、本発明の酵素を得ることができる。
　以上、本発明は式(A)で表される化合物を含む糖供与試薬、ならびにその糖供与試薬と糖転移酵素を反応させることを含むポリフェノールの配糖化方法およびその糖供与試薬と糖転移酵素を含むポリフェノール配糖化キットに関する。本発明によれば、UDP-グルコースのような、試薬としては比較的高価である糖ヌクレオチドを使用しないで糖転移反応を行うことができる。
　また、本発明の新規糖供与体化合物と糖転移酵素による糖転移反応は、これまで知られている糖転移反応と異なる反応機構を有していることが予想される。よって本発明によれば、従来配糖化が困難であった基質を配糖化することができる可能性がある。一般に、脂溶性化合物を配糖化することにより水に可溶にすることができ、また水溶性化合物も配糖化することで安定性を向上させることが知られている。例えば本発明は、新規医薬化合物の開発あるいは新規機能性食品素材開発などに利用することができると考えられる。特に、本発明の新規糖供与化合物を糖供与体として糖転移反応を触媒するカーネーション由来の糖転移酵素は反応至適pHが比較的低いため、これまでは糖転移反応を行うのが困難であった酸性環境下でも糖転移反応を行うことができると考えられる。さらに本発明の配糖化方法は、ポリフェノールを配糖化する以外にも、他の化合物を配糖化することができる可能性がある。本発明の配糖化方法は、例えば糖鎖の合成にも応用可能であると考えられる。
　また、本発明は新規糖転移酵素、該糖転移酵素をコードする糖転移酵素遺伝子、該糖転移酵素遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体、ならびに該糖転移酵素遺伝子が導入された植物に関する。本発明の新規糖転移酵素によれば、本発明の式(A)で表される化合物を含む糖供与試薬と組み合わせることで、上述したような新規の糖転移反応を効率よく行うことが可能となる。
　本発明の糖転移酵素遺伝子によれば、新規糖転移酵素を人為的に生産することが可能となる。また、本発明の糖転移酵素遺伝子によれば、例えば本発明の糖転移酵素を有しない植物に該遺伝子を導入することにより、これまでに無い花弁の色を有した植物を作出することが可能となる。
　以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
(1)糖転移酵素の粗酵素液の調製
　カーネーション（品種「ビームチェリー」）の桃色の花弁を乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中でパウダー状になるまで磨砕した。そのパウダーを50mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.2)に、凍結しないよう撹拌しながら徐々に加えて溶解させた。次いで遠心分離により不溶性画分を除去した。得られた上清に飽和硫酸アンモニウム溶液を80％となるように加えて、氷上で5分間静置した。析出したタンパク質を遠心分離により回収し、10mMリン酸カリウムバッファーを沈殿が完全に溶解するまで加えた。得られた溶液をSephadex G-25 ゲルろ過担体（GEヘルスケア）を用いて脱塩し粗酵素液を得た。
(2)糖供与体化合物の抽出
　カーネーション（品種「Red Vital」）の赤色花弁を50%エタノール水溶液に一晩浸漬し、ろ紙を用いてろ過したろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。濃縮したろ液を合成吸着樹脂（ダイヤイオンHP20、三菱化学）にアプライし、素通り画分を回収した。さらに、合成吸着樹脂の5倍量の純水で合成吸着樹脂を洗浄し、先の素通り画分と合わせて減圧濃縮した。この画分に終濃度0.1%になるように酢酸を加えてから、あらかじめ0.1%酢酸水で平衡化しておいたODSカラム（Wakosil C18、和光純薬工業）にアプライした。カラムをカラム充填量の5倍量の0.1%酢酸水で洗浄した後、5%メタノールを含む0.1%酢酸水で溶出される画分を回収して減圧濃縮し、分取HPLCの試料として供した。
　分取HPLCは逆相カラムであるDevelosil RPAQUEOUS-AR-5（粒子径5μm，内径×長さ:10mm×250mm，野村化学）と、溶離液A（0.1%酢酸水溶液）および溶離液B（90%メタノール水溶液）を用いて行った。流速5ml/minおよびB液7%から30%までの直線勾配（40分間）で分離し、分離された液を5mlごとに分画した。それぞれの画分について粗酵素液を用いて糖転移酵素活性を評価し（評価方法は後述）、活性がみられた画分（21から24番目の画分）を回収して濃縮し、次の分取HPLCに供した。
　2回目の分取HPLCは、逆相カラムXTerra Prep MSC18（粒子径10μm、内径×長さ:10×250mm、Waters）と、溶離液A（0.1%酢酸水溶液）および溶離液B（90%メタノール水溶液）を用いて行った。流速5ml/minおよびB液6%から10%までの直線勾配（40分間）で分離し、分離された液を5分間ごとに分画した。それぞれの画分について粗酵素液を用いて糖転移酵素活性を評価し（評価方法は後述）、活性が認められた画分（21番目から25番目の画分）を回収して濃縮し、次の分取HPLCに供した。
　3回目の分取HPLCは、COSMOSIL HILIC Packed column（粒子径5μm、内径×長さ:10mm×250mm、ナカライテスク）と、溶離液としてアセトニトリルおよび純水を用いて行った。流速5ml/minおよびアセトニトリル100%から75%までの直線勾配（40分間）で分離し、液を5分間ごとに分画した。それぞれの画分について粗酵素液を用いて糖転移酵素活性を評価し（評価方法は後述）、活性が認められた画分（19番目から24番目の画分）を回収し濃縮した。
　上記のようにして精製したカーネーションの赤色花弁抽出物を、高解像度HR-ESI-TOF質量分析装置（AccuTOF JML-T100LC spectrometer、日本電子）に供した。ポジティブモードでm/z=353.08313の分子イオンピークが、ネガティブモードでm/z=329.29592の分子イオンピークが検出されたことから、分子量330の化合物であることが推定された。
　次に、精製した同抽出物を1H NMR、13C NMR HMQC、HMBC、NOE解析（ECX400、日本電子）に供した。その結果を表１に示す。解析の結果、精製した同抽出物はバニリン酸のカルボキシル基にグルコースの1位（アノマー炭素）のヒドロキシ基がエステル結合している化合物であることが示された。また1H NMRのアノマー位のカップリング定数(J=7.8)から、グルコースはβ結合していることが示され、精製した同抽出物がバニリン酸1-O-βグルコースであることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
(3)HPLC画分の粗酵素液を用いた糖転移酵素活性評価
　粗酵素液30μlに、HPLC画分を3μl、100mMのクエン酸バッファー(pH 5.6)を5μl、および2mMのシアニジン3-グルコシドを3μl加え、その反応溶液を30℃で40分間静置した。その後、20%リン酸水溶液を2.5μl加えて反応を停止させた。不溶物を遠心分離によって除去し、HPLC分析を行った。
　HPLC分析はChromolith Performance RP-18e（4.6x100mm、Merck）カラムを用いて、溶離液として1.5%リン酸水溶液およびアセトニトリルを用いて行った。流速3ml/minおよびアセトニトリルの濃度が17%から40%となるような直線勾配（4分間）で分離し、紫外可視検出器を用いて波長520nmの吸光度でシアニジン3,5-ジグルコシドの生成を確認した。
(4)バニリン酸1-O-βグルコースを糖供与体とする糖転移反応の検出
　カーネーション（品種「ビームチェリー」）の桃色の花弁を乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中でパウダー状になるまで磨砕した。そのパウダーを50mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.2)に、凍結しないよう撹拌しながら徐々に加えて溶解させた。次いで遠心分離により不溶性画分を除去した。得られた上清に飽和硫酸アンモニウム溶液を80％となるように加えて、氷上で5分間静置した。析出したタンパク質を遠心分離により回収し、10mMリン酸カリウムバッファーを沈殿が完全に溶解するまで加えた。得られた溶液をSephadex G-25 ゲルろ過担体（GEヘルスケア）を用いて脱塩し粗酵素液を得た。
　粗酵素液15μlに500μMのバニリン酸1-O-βグルコースを5μl、100mMのクエン酸バッファー（pH5.6）を30μlおよび2mMのシアニジン3-グルコシドを5μl加え、その反応溶液を30℃で40分間静置した。その後、20％リン酸水溶液を2.5μl加えて反応を停止させた。不溶物を遠心分離によって除去し、HPLC分析を行った。
　HPLC分析はODSカラム（内径×長さ:4.6×250mm、Cosmosil 5C18-MS-II, ナカライテスク）と、溶離液として1.5%リン酸水溶液およびアセトニトリルを用いて行った。流速1ml/minおよびアセトニトリルの濃度が17％から40％までの直線勾配（20分間）で分離し、フォトダイオードアレイ検出器を用いて検出を行った。HPLC分析の結果を図１の上図に示す。市販品を標品として同様に測定した結果（図１の下図）とリテンションタイムを比較したところ、反応生成物はシアニジン3,5-O-βジグルコシドであることがわかった。このことは、すなわち下記の式のような糖転移反応が起こったことを意味する：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 この結果により、バニリン酸1-O-βグルコースがカーネーションの桃色花弁由来の酵素に触媒される糖転移反応において糖供与体として機能することがわかった。
(5)糖転移酵素の精製およびその理化学的性質
　カーネーション（品種「ビームチェリー」）の桃色の花弁を乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中でパウダー状になるまで磨砕した。そのパウダーを50mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.2)に、凍結しないよう撹拌しながら徐々に加えて溶解させた。ナイロンメッシュを用いてその溶液を搾り取り、細胞壁等の不溶性のものを取り除いた。その溶液に、さらに終濃度35%になるように硫酸アンモニウムを徐々に加えてよく撹拌し溶解させた。溶液を4℃で30分間静置した後、4℃、15,000×gで30分間遠心分離を行い、上清を回収した。そこにさらに終濃度が55%になるように硫酸アンモニウムを徐々に加えて完全に溶解した。一晩4℃に静置した後、4℃、15,000×gで30分間遠心分離を行った。得られた沈殿に10mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.2)を加えて完全に溶解した後、十分量の10mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.2)に対して透析を行い、粗酵素液を得た。なお、本実施例における全ての操作は、特に記載していない場合はすべて氷上または4℃で行った。
　透析した溶液をあらかじめ平衡化しておいたTOYOPEARL-DEAE650M（Bed volume 400ml）にアプライした。カラム充填量の5倍量（5CV（カラムボリューム））の10mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.2)で洗浄した後、NaCl濃度が5CVで0Mから0.8Mとなるような直線勾配で溶出し、溶出されたタンパク質溶液を25mlごとに分画した。それぞれの画分30μlとバニリン酸1-O-βグルコース3μlを用い、上記(3)と同様の手順で糖転移酵素活性を評価した。活性がみられた画分（38～49番目の画分）を回収して、十分量の10mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.2)に対して透析を行った。
　透析した画分に対して終濃度20%になるように硫酸アンモニウムを徐々に加えて完全に溶解した。予め20%硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸バッファー(pH 7.2)で平衡化しておいたTOYOPEARL-Butyl650M（Bed volume 80ml）にアプライした。5CVの20%硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸バッファー(pH 7.2）で洗浄した後に、硫酸アンモニウム濃度が10CVで20%から0%となるような直線勾配で溶出し、溶出されたタンパク質溶液を10mlごとに分画した。それぞれの画分30μlとバニリン酸1-O-βグルコース3μlを用い、上記(3)と同様の手順で糖転移酵素活性を評価した。活性のあった画分（60～77番目の画分）を回収して、十分量の10mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.2)に対して透析を行った。
　透析した画分を、予めBzバッファー（10mMリン酸カリウム、pH7.2、0.5M NaCl）で平衡化しておいたBenzamidine Sepharose 4 Fast Flow (high sub)（GEヘルスケア、Bed volume 8ml)にアプライした。5CVのベンズアミジンバッファーで洗浄した後に、p-ベンザミジン濃度が12.5CVで0mMから25mMとなるような直線勾配で溶出し、溶出されたタンパク質溶液を2.5mlずつ分画した。それぞれの画分30μlとバニリン酸1-O-βグルコース3μlを用い、上記(3)と同様の手順で糖転移酵素活性を評価した。活性のあった画分（25、26番目の画分）を回収した。回収した画分をAmicon Ultra-15（10,000MWCO、ミリポア）を用いて濃縮し、10mMリン酸カリウムバッファーに置換した。
　濃縮した画分を、予めゲルろ過バッファー（10mMリン酸カリウム、pH7.2、150mM NaCl）で平衡化しておいたSuperdex 200 10/300 GLカラム（GEヘルスケア）にアプライした。溶出液を0.7mlずつ分画し、それぞれの画分30μlとバニリン酸1-O-βグルコース3μlを用い、上記(3)と同様の手順で糖転移酵素活性を評価した。活性のあった画分（22～25番目の画分）を回収した。回収した画分をAmicon Ultra-4（10,000MWCO、ミリポア）を用いて濃縮し、10mMリン酸カリウムバッファーに置換した。
　ゲルろ過精製画分を、予め10mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.2)で平衡化しておいたResource Q 1mlカラムにアプライした。5CVの10mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.2)で洗浄した後に、NaCl濃度が0M～0.5Mとなるような直線勾配で溶出し、溶出されたタンパク質溶液を0.2mlずつ分画した。それぞれの画分30μlとバニリン酸1-O-βグルコース3μlを用い、上記(3)と同様の手順で糖転移酵素活性を評価した。活性のあった画分（41～48番目の画分）を回収した。
　回収された画分をSDS-PAGE（SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって解析したところ、得られたタンパク質の分子量は約55kDaであった。また、酵素の反応至適pHについて検討したところ、pH5.0～5.5付近であった。この酵素の反応至適pHは、従来知られている糖転移酵素がpH7.5～8.0程度であるのと比較して低いため、従来では反応が起こらなかったような弱酸性条件でもこの酵素反応は進行すると考えられる。
(6)バニリン酸グルコースの合成
　市販のバニリン酸（シグマアルドリッチ）の4位の水酸基およびカルボン酸の水酸基を、臭化ベンジル（シグマアルドリッチ）を用いて、ジメチルホルムアミド（DMF，サーモフィッシャーサイエンティフィック）溶媒中でベンジル保護した。その後、オープンカラム（シリカゲル60(球状)，関東化学）（ヘキサン/酢酸エチル=8/1）で未反応物を除去し、精製した。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ7.65(1H,dd,H-6)，7.59(1H,d,H-2)，7.41-7.26(9H,m,H-benzylic CH2)，6.88(1H,d,H-5)，5.33(2H,s,H-benzylic CH2)，5.21(1H,s,H-benzylicCH2)，3.92(3H,s,CH3)。収率100%。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　次に水酸化リチウム（和光純薬工業）存在下、THF（関東化学）:H2O:MeOH（和光純薬工業）=3:2:1溶媒中で加水分解を行い、カルボン酸の水酸基を保護したベンジル基を外した。その後、オープンカラム（ヘキサン/酢酸エチル=10/1、4/1、0/1と濃度比を変えた）で精製し、未反応物とベンジルアルコールを除去した。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ7.68(1H,dd,H-6)，7.60(1H,d,H-2)，7.45-7.25(5H,m,H-benzylic CH2)，6.90(1H,d,H-5)，5.25(2H,s,H-benzylic CH2)，3.92(3H,s,CH3)。収率58%。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　4位の水酸基がベンジル保護されたバニリン酸と、1位以外の水酸基がベンジル保護された2,3,4,6-テトラベンジルグルコース（シグマアルドリッチ）を縮合剤1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI，国産化学）、4-ジメチルアミノピリジン（DMAP，東京化成工業）、トリエチルアミン（Et3N，和光純薬工業）を用いてDMF溶媒中（反応温度60℃）で縮合した。得られた縮合体はαアノマー：βアノマーが1:2の混合物であった。オープンカラム（ヘキサン/酢酸エチル=6/1、5/1と濃度比を変えた）で精製し、未反応原料は除去した。Molecular MS [M+Na]+ m/z 803.14、1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ7.60(1H,dd,H-6)，7.59(1H,d,H-2)，7.45-7.26(60H,m,H-benzylic CH2)，6.90(1H,d,H-5)，6.55(1H,d,H-Glc1α,J=3.21)，5.84(1H,d,H-Glc1β,J=7.65)，5.25(10H,s,H-benzylic CH2)，4.96-3.56(94H,m,CH3,H-Glc)。収率84%。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　次に、水酸化パラジウムチャコール（シグマアルドリッチ）触媒を用いた水素添加によりベンジル基を脱保護し、α体バニリン酸グルコースとβ体バニリン酸グルコースの混合物を得た（収率81%）。水酸化パラジウムはセライトろ過することで除去した。得られた混合物を分取HPLC（Develosil C30，10×250mm，野村化学）を用い、溶離液A（0.1%酢酸水溶液）および溶離液B（90%メタノール水溶液）のB液10%（40分間）で分離し、バニリン酸1-O-αグルコース（精製度99.6%）およびバニリン酸1-O-βグルコース（精製度98.9%）をそれぞれ得た。精製度はHPLCのエリアを指標に算出した。Molecular MS [M+Na]+ m/z 352.9、α体 1H NMR(400MHz,CD3CD)：δ7.62(1H,dd,H-6)，7.58(1H,d,H-2)，6.83(1H,d,H-5)，6.28(1H,d,H-Glc1,J=3.66)，3.89(3H,s,CH3)，3.83-3.33(5H,m,H-Glc)、β体 1H NMR(400MHz,CD3CD)：δ7.62(1H,dd,H-2)，7.60(1H,d,H-6)，6.83(1H,d,H-5)，5.67(1H,d,H-Glc1,J=7.79)，3.89(3H,s,CH3)，3.83-3.33(5H,m,H-Glc)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
(7)イソバニリン酸グルコースの合成
　市販のイソバニリン酸（シグマアルドリッチ）の3位の水酸基およびカルボン酸の水酸基を、臭化ベンジルを用いてDMF溶媒中でベンジル保護した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　次に水酸化リチウム存在下、THF:H2O:MeOH=3:2:1溶媒中で加水分解を行い、カルボン酸の水酸基を保護したベンジル基を外した。その後、オープンカラム（ヘキサン/酢酸エチル=10/1、4/1、0/1と濃度比を変えた）で精製し、未反応物とベンジルアルコールを除去した。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ7.75(1H,dd,H-6)，7.65(1H,d,H-2)，7.45-7.25(5H,m,H-benzylic CH2)，6.90(1H,d,H-5)，5.15(2H,s,H-benzylic CH2)，3.90(3H,s,CH3)。収率86%。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　3位の水酸基がベンジル保護されたイソバニリン酸と、1位以外の水酸基がベンジル保護された2,3,4,6-テトラベンジルグルコースを縮合剤EDCI、DMAP、Et3Nを用いてDMF溶媒中（反応温度60℃）で縮合した。得られた縮合体はαアノマー：βアノマーが3:2の混合物であった。オープンカラム（ヘキサン/酢酸エチル=6/1、5/1と濃度比を変えた）で精製し、未反応原料は除去した。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ7.82(1H,dd,H-6)，7.72(1H,d,H-2)，7.52-7.26(60H,m,H-benzylic CH2)，6.90(1H,d,H-5)，6.67(1H,d,H-Glc1α,J=3.64)，5.96(1H,d,H-Glc1β,J=8.16)，5.25-3.71(H,m,CH3,H-Glc)。収率60%。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　次に、水酸化パラジウムチャコール触媒を用いた水素添加によりベンジル基を脱保護し、α体イソバニリン酸グルコースとβ体イソバニリン酸グルコースの混合物を得た（収率100%）。水酸化パラジウムはセライトろ過することで除去した。得られた混合物を分取HPLC（Develosil C30，10×250mm）を用い、溶離液A（0.1%酢酸水溶液）および溶離液B（90%メタノール水溶液）のB液10%（40分間）で分離し、イソバニリン酸1-O-αグルコースおよびイソバニリン酸1-O-αグルコースをそれぞれ得た。Molecular MS [M+Na]+ m/z 353.0，1H NMR(300MHz,CD3CD)：δ7.63(1H,dd,H-6)，7.60(1H,d,H-2)，7.00(1H,d,H-5)，6.30(1H,d,H-Glc1α,J=3.60)，5.67(1H,d,H-Glc1β,J=8.10)，3.91(3H,s,CH3)，3.88-2.88(5H,m,H-Glc)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
(8)没食子酸グルコースの合成
　市販の没食子酸（シグマアルドリッチ）の3,4,5位の水酸基およびカルボン酸の水酸基を、臭化ベンジルを用いてDMF溶媒中でベンジル保護した。その後オープンカラム（ヘキサン/酢酸エチル=8/1）で未反応物を除去し、精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　次に水酸化リチウム存在下、THF:H2O:MeOH=3:2:1溶媒中で加水分解を行い、カルボン酸の水酸基を保護したベンジル基を外した。その後、オープンカラム（ヘキサン/酢酸エチル=10/1、4/1、0/1と濃度比を変えた）で精製し、未反応物とベンジルアルコールを除去した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　3,4,5位の水酸基がベンジル保護された没食子酸と、1位以外の水酸基がベンジル保護された2,3,4,6-テトラベンジルグルコースを縮合剤EDCI、DMAP、Et3Nを用いてDMF溶媒中（反応温度60℃）で縮合した。オープンカラム（ヘキサン/酢酸エチル=6/1、5/1と濃度を変えた）で精製し、未反応原料は除去した。得られた縮合体はαアノマー：βアノマーが3:7の混合物であった。Molecular MS [M+Na]+m/z 985.18、1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ7.40-7.11(92H,m,H-2,6,5,H-benzylic CH2)，6.52(1H,d,H-Glc1α,J=2.40)，5.85(1H,d,H-Glc1β,J=7.50)，5.16(18H,s,H-benzylic CH2)，4.99-3.64(28H,m,H-Glc,H-benzylic CH2)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　次に、水酸化パラジウムチャコール触媒を用いた水素添加によりベンジル基を脱保護し、α体没食子酸グルコースとβ体没食子酸グルコースの混合物を得た。水酸化パラジウムはセライトろ過することで除去した。得られた混合物を分取HPLC（Develosil C30，10×250mm，野村化学）を用い、溶離液A（0.1%酢酸水溶液）および溶離液B（90%メタノール水溶液）のB液10%（40分間）で分離し、没食子酸1-O-αグルコースおよび没食子酸1-O-βグルコースをそれぞれ得た。Molecular MS [M+Na]+m/z 354.9、α体 1H NMR(400MHz,CD3CD)：δ7.10(2H,s,H-2,6)，6.25(1H,d,H-Glc1,J=3.66)，3.82-3.32(5H,m,H-Glc)、β体 1H NMR(400MHz,CD3CD)：δ7.10(2H,s,H-2,6)，5.63(1H,d,H-Glc1,J=7.79)，3.84-3.32(5H,m,H-Glc)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
(8)各化合物を糖供与体とした糖転移反応の検証
　カーネーション（品種「ビームチェリー」）の桃色の花弁より得られた粗酵素61μg、シアニジン3-グルコシド200μMおよび糖供与体（カーネーションから抽出したバニリン酸1-O-βグルコース、または合成したバニリン酸1-O-グルコース（α体、β体）、イソバニリン酸1-O-グルコース（α体、β体）もしくは没食子酸1-O-グルコース（α体、β体）のいずれか）500μMをクエン酸バッファー(pH 5.6)で30μlとした反応溶液で30℃で15分間酵素反応を行った。リン酸の終濃度が1%となるように20%リン酸水溶液を反応液に加えて反応を止め、遠心後の上澄みを、HPLC（Chromolith SpeedROD、4.6×50mm、Merck）を用い、溶離液A（1.5%リン酸水溶液）および溶離液B（90%メタノール水溶液）のB液18%から28%までの直線勾配（5分間）で分離し、解析を行った（流速3.0ml/min、520nm）。各糖供与体に対する酵素の相対活性を、反応生成物（シアニジン3,5-O-βジグルコシド）の波長505nmにおけるHPLCクロマトグラムのエリアから算出した。その結果を以下の表に示す。
［実施例２］
(1)糖転移酵素の抽出
　液体窒素中で急速冷凍し、-80℃で保存してあったカーネーション（品種「ビームチェリー」）の花弁400g（生重量）を1500mlの抽出バッファー（100mMリン酸カリウム、pH7.2）中でミキサーを用いて十分に破砕した。なお、以降の操作は特に記載していない場合はすべて氷上もしくは4℃で行った。更にホモジナイザー（ポリトロン、KINEMATICA社）を用いて15,000rpmで10分間の破砕を行った。20,000×g、4℃で20分間の遠心分離を行って、上清を回収した。同じ操作を2回繰り返して、合計800gの花弁から約3000mlの粗抽出液を得た。
(2)糖転移酵素の精製
(a)硫酸アンモニウム沈殿による分画
　マグネティックスターラーを用いて攪拌しながら、得られた粗抽出液に細粒硫酸アンモニウムを35%になるように、徐々に加えて完全に溶解した。4℃で2時間静置した後、20,000×g、4℃で20分間の遠心分離を行って上清を回収した。回収した上清に、マグネティックスターラーを用いて攪拌しながら、更に細粒硫酸アンモニウムを55%になるように徐々に加えて完全に溶解した。4℃で一晩静置したのち、20,000×g、4℃で20分間の遠心分離を行って沈殿を回収した。回収した沈殿物を3000mlの10mMリン酸バッファー（pH7.2）に溶解し、透析膜に移しいれて、6Lの10mMのリン酸バッファー（pH7.2）に対して透析を行った。4時間～12時間後に、リン酸バッファーを交換した。最終的に透析膜内のサンプル量の4000倍となる量のリン酸バッファーで透析を行った。
(b)DEAE sepharose Fast Flowによる分離
　(a)で透析したサンプル溶液を、あらかじめ10mMリン酸カリウムバッファー（pH7.2）で平衡化しておいたDEAE sepharose FFイオン交換体（GEヘルスケア）を充填したガラスカラム（ベッド体積：350ml）にアプライした。1250mlの10mMのリン酸バッファー（pH7.2）で洗浄した後に、A液：10mMのリン酸バッファー（pH7.2）、B液：0.8M NaClを含む10mMリン酸カリウムバッファー（pH7.2）を用いて、1000mlで、B液の濃度が0%～100%になるような直線的勾配でタンパク質を分離した。分離したタンパク質溶液は25mlずつ分画した。各画分について、シアニジン-3-O-β-グルコシドを基質とし、バニリン酸1-O-βグルコースを糖供与体とした配糖化酵素活性を測定し、活性のあった画分（31-45画分）を集めて十分量の10mMリン酸カリウムバッファー（pH7.2）に対して透析を行った。
(c)TOYOPEARL-Butylによる分離
　(b)で透析した画分に、細粒硫酸アンモニウムを20%になるように徐々に加えて溶解した。このサンプル溶液をあらかじめButyl平衡化バッファー（10mMリン酸カリウム、20%硫酸アンモニウム、pH7.2）で平衡化しておいたTOYOPEARL-Butyl-650M担体（東ソー）カラム（50mm×100mm、ベッド体積：250ml）にアプライした。1250mlのButyl平衡化バッファーでカラムを洗浄した後、A液：Butyl平衡化バッファー、B液：10mMリン酸カリウムバッファー（pH7.2）を用いて、1250mlでB液の濃度が0%～100%になるような直線的勾配でタンパク質を分離した。分離したタンパク質溶液を20mlずつ分画した。各画分についてシアニジン-3-O-β-グルコシドを基質とし、バニリン酸1-O-βグルコースを糖供与体とした配糖化酵素活性を測定し、活性のあった画分（63-85画分）を回収してAmicone-15ultra（ミリポア）を用いて濃縮し、10mMのリン酸カリウムバッファーに交換した。
(d)Benzamidine Sepharoseによる分離
　(c)で透析したサンプルを、あらかじめBz洗浄バッファー（10mMリン酸カリウム、pH7.2、0.5M NaCl）で平衡化しておいたBenzamidine Sepharose 4 Fast Flow カラム（ベッド体積：8ml）にアプライした。カラムを40mlのBz洗浄バッファーで洗浄した後、A液：Bz洗浄バッファー、B液：Bz溶出バッファー（10mMリン酸カリウム、pH7.2、0.5M NaCl、20mM 4-アミノベンズアミジン）を用いて、80mlでB液の濃度が0%～100%になるような直線的勾配でタンパク質を分離した。分離したタンパク質溶液を2mlずつ分画した。各画分についてシアニジン-3-O-β-グルコシドを基質とし、バニリン酸1-O-βグルコースを糖供与体とした配糖化酵素活性を測定し、活性の認められた画分（27-33画分）を回収し、Amicone-15ultraを用いて濃縮し、10mMのリン酸カリウムバッファーに交換した。
(e)ゲルろ過による分離
　(d)で得られたサンプル溶液を、あらかじめゲルろ過バッファー（10mMリン酸カリウム、pH7.2、150mM NaCl）で平衡化しておいたSuperdex 7510/300GL（GEヘルスケア）にアプライした。タンパク質を、ゲルろ過バッファーを流速0.5ml/minで通液することにより分離した。分離したタンパク質を500μlずつ分画し、各画分についてシアニジン-3-O-β-グルコシドを基質とし、バニリン酸1-O-βグルコースを糖供与体とした配糖化酵素活性を測定し、活性の認められた画分（29-32画分）を回収してAmicone-15ultra（ミリポア）を用いて濃縮し、10mMのリン酸カリウムバッファーに交換した。
(f)Resouce ETHによる分離
　(e)で得られたタンパク質溶液をあらかじめETH平衡化バッファー（10mMリン酸カリウム、pH7.2、35%硫酸アンモニウム）で平衡化しておいたResouce ETH（GEヘルスケア）にアプライした。ETH平衡化バッファーでカラムを洗浄した後、A液：ETH平衡化バッファー、B液：ETH溶出バッファー（10mMリン酸カリウム、pH7.2、15%硫酸アンモニウム）を用いて、19分間でB液の濃度が0%～100%になるような直線的勾配（流速0.8ml/min）でタンパク質を分離した。分離したタンパク質溶液を300μlずつ分画し、各画分についてシアニジン-3-O-β-グルコシドを基質とし、バニリン酸1-O-βグルコースを糖供与体とした配糖化酵素活性を測定し、活性の認められた画分（20-25画分）を回収してAmicone-15ultra（ミリポア）を用いて濃縮し、10mMのリン酸カリウムバッファーに交換した。
(g)HiTrap Butylによる分離
　(f)で得られたタンパク質溶液に飽和硫酸アンモニウム水溶液を終濃度20%となるように加えた。このサンプル溶液をあらかじめButyl平衡化バッファー（10mMリン酸カリウム、20%硫酸アンモニウム、pH7.2）で平衡化しておいたHiTrap Butyl（GEヘルスケア）にアプライした。5mlのButyl平衡化バッファーでカラムを洗浄した後、A液：Butyl平衡化バッファー、B液：Butyl溶出バッファー（10mMリン酸カリウムバッファー、pH7.2、10%エチレングリコール）を用いて19分間で、B液の濃度が0%～100%になるような直線的勾配（流速1ml/min）でタンパク質を分離した。分離したタンパク質溶液は300μlずつ分画した。各画分についてシアニジン-3-O-β-グルコシドを基質とし、バニリン酸1-O-βグルコースを糖供与体とした配糖化酵素活性を測定し、活性の認められた画分（43-48画分）を回収してAmicone-15ultra（ミリポア）を用いて濃縮し、10mMのリン酸カリウムバッファーに交換した。
　精製されたタンパク質をSDS-PAGE法によって分離し、銀染色法によって可視化して確認した。その結果を図２に示す。
(h)各画分における配糖化酵素活性測定
　上記(b)～(g)における、シアニジン-3-O-β-グルコシドを基質としバニリン酸1-O-βグルコースを糖供与体とした配糖化酵素活性測定は、以下の手順に従って行った。
　分画した画分をSephadexG-25（GEヘルスケア）担体を用いて100mMクエン酸バッファー（pH5.6）にバッファー交換を行った。粗酵素液30μlに、10mMバニリン酸1-O-βグルコースを3μl、および2mMのシアニジン3-O-β-グルコシドを3μl加え、その反応溶液を30℃で30分間静置した。その後、20%リン酸水溶液を2μl加えて反応を停止させた。不溶物を遠心分離によって除去し、HPLC分析を行った。
　HPLC分析はChromolith PerformanceRP-18e（4.6×100mm、Merck）カラムを用いて、溶離液として1.5%リン酸水溶液および90％メタノール水溶液を用いて行った。流速3ml/minおよび90％メタノール水溶液の濃度が17%から40%となるような直線勾配（4分間）で分離し、紫外可視検出器を用いて波長520nmの吸光度でシアニジン3,5-O-β-ジグルコシドの生成を確認した。
(3)糖転移酵素タンパク質のアミノ酸配列解析
　精製した糖転移酵素タンパク質のアミノ酸配列の解析を、アプロサイエンス社（徳島県鳴門市）の高感度タンパク質内部配列分析受託サービス、ならびに通常感度N末端アミノ酸配列分析受託サービスを利用して行った。タンパク質内部配列解析の結果、「GLEYYNNLVNA（配列番号５）」、「GTQPHVTLLH（配列番号６）」、「FTPXETELLTG（配列番号７）」、の3種類のアミノ酸配列が存在していることが分かった。また、N末端アミノ酸配列分析の結果から、このタンパク質は「SEFDRLDFPK（配列番号８）」というアミノ酸配列から始まるタンパク質である事が明らかとなった。また、N末端アミノ酸配列分析においては、上記のほかに２種類のアミノ酸配列「EFDRLDFPKH（配列番号９）」「PSEFDRLDFP（配列番号１０）」が含まれていることが分かり、精製の過程でN末端が分解したか、植物体内でのプロセシングする酵素の基質特異性が低いことが考えられた。
(4)糖転移酵素をコードするcDNAの単離（カーネーション由来）
　カーネーション（品種「ビームチェリー」）の花弁からRNAの抽出を、改変GTC/CsCl密度勾配遠心法（Chirgwin et al., 1979）を用いて行った。各組織片を液体窒素中で、乳鉢と乳棒を用いてよく破砕し、50mlのポリプロピレン製遠心沈殿管に移し、-80℃で完全に液体窒素を気化させた後に、3mlのGTC溶液（4.23Mチオシアン酸グアニジン、25mMクエン酸三ナトリウム、100mM 2-メルカプトエタノール、0.5% N-ラウロイルサルコシン）を加え直ちによく混合した。室温で30分放置した後、20,000×gで20分間遠心し、上清を新しい遠沈管に移してもう一度20,000×gで20分間遠心して完全に不溶物を除去した。このGTC抽出液を予め2.2mlの塩化セシウム溶液（5.7M CsCl, 0.1M EDTA, pH7.5）を分注しておいた5ml超遠心沈殿管（Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA）に重層し、70,000rpm（TL-100 Ultracentrifuge, TLA110 roter, Beckman Coulter Inc.）で、3時間超遠心した。沈殿したtotal RNAを300μlのTE-SDS buffer（10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA, 0.1% SDS）に縣濁した。得られたtotal RNAからOligotex-dT<super>（TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan）を用いてpoly(A)+RNAを精製した。方法はキットのマニュアルに従った。
　完全長cDNAはGeneRacer(商標)Kit（Invitrogen corp., CA）を使用し、オリゴキャッピング法に基づいてpoly(A)+RNAから合成した。方法はキットのマニュアルに従った。合成したcDNAは小分けして使用直前まで-80℃で保存した。3'-RACE用のcDNAは、3'-Full RACE Core Set（TaKaRa Bio Inc.）を用いて前述のpoly(A)+RNAから合成した。方法はキットのマニュアルに従った。
　糖転移酵素タンパク質のアミノ酸内部配列解析によって得られたアミノ酸配列「GTQPHVTLLH（配列番号６）」、「FTPXETELLTG（配列番号７）」から設計した縮重プライマー「GGN ACN CAR CCN CAY GTN AC（配列番号１１）」、「TTY ACN CCN GAY GAR ACN GA（配列番号１２）」を用いて、先に合成した3'-RACE用のcDNAを鋳型としてPCR法（94℃, 30秒、46℃, 30秒、72℃, 1分）を行い、約600bpのcDNA断片を獲得した。獲得したcDNA断片をクローニングベクターpGEM-T easy（Promega）にLigation Mix mighty （Takara Bio inc.）を用いて連結し、大腸菌DH5α株に形質転換した。得られたコロニーからプラスミドを抽出し、ジェネティックアナライザABI PRISM 3100（Applied Biosystems Japan Ltd., Tokyo, Japan）を用いてDNA塩基配列を解析した。得られたDNA塩基配列はDNA Databank of Japan（DDBJ）のBLASTXを用いてデータベースとの比較を行った。一連のDNA塩基配列の解析はGenetyx WIN ver. 5.0（Genetyx Corp., Tokyo, Japan）を用いて行った。
　得られたcDNA断片のDNA塩基配列から設計したプライマー「GGAAGTCGGGGGCCACCATTCTTCC（配列番号１３）」とGeneRacer5'primerを用い、先に合成した完全長cDNAを鋳型としてPCRを行った。得られたPCR産物をエタノール沈殿法で精製した。精製したPCR産物を鋳型とし、cDNA断片のDNA塩基配列から設計したプライマーを用いてnested PCRを行い、約550bpのcDNA断片を獲得した。獲得したcDNA断片は上記と同様の方法でpGEM-Teasyベクターにクローニングし、cDNA塩基配列を決定した。
　決定したcDNA5'端断片からfist ATGを含むように設計したプライマー「ATGAACATGTCATGCAAGTTTGAAATTG（配列番号１４）」と3 site 3'adaptor primer（Takara Bio inc.）とを用いて、先に合成した3'-RACE用のcDNAを鋳型としたPCR法で糖転移酵素タンパク質のfirst ATG以下のcDNAを獲得した。獲得したcDNAを上記の方法でクローニングし、DNA塩基配列を決定した。決定したcDNA配列と推定される塩基配列（配列番号２）およびその塩基配列によってコードされる推定アミノ酸配列（配列番号１）を図３に示す。
　図３において、精製した糖転移酵素タンパク質のアミノ酸内部配列解析の結果確認された配列（配列番号５～７）を下線で示し、N末端アミノ酸配列から確認されたアミノ酸配列（配列番号８）を下線と太字で示した。cDNAは全長1749bpで502アミノ酸残基のタンパク質をコードしていた。cDNA塩基配列解析結果と、N末端アミノ酸配列分析結果より、この酵素は502アミノ酸残基として翻訳された後にアミノ酸がプロセシングによって除去されていると考えられた。また、データベース上のアミノ酸モチーフ検索の結果から、このプロセシングされた配列は液胞への移行シグナル配列を含んでいることが示唆された。
(5)カーネーション由来糖転移酵素遺伝子の大腸菌での発現
　糖転移酵素のN末端アミノ酸配列解析の結果明らかになったN末端に翻訳開始のためのメチオニン残基が付加されるように設計したセンスプライマー「ATGTCGGAGTTTGACCGCCTTGACTTTC（配列番号１５）」と、ストップコドンを含まないように設計したアンチセンスプライマー「GTAGAAGTACGTATGTG（配列番号１６）」を用いてPCRを行い、pTrcHis2-TOPO TA expression Kit（Invitrogen）を用いてpTrcHis2-TOPOベクター（Invitrogen）に連結し、大腸菌JM109株に形質転換した。形質転換した大腸菌からDNAを抽出して先の方法と同様にしてDNA塩基配列を解析し、cDNAの導入された向きとPCRによる塩基置換がないことを確認した。
　形質転換した大腸菌を50μl/mlのアンピシリンを含む5mlのLB培地に植菌し、14時間、30℃で振蕩培養した。その後、1mMとなるようにIPTGを加えてから16℃で2時間振蕩培養した。培養した大腸菌は1,800×gの遠心分離で集菌し、培地を除去した。そこに150μlの0.1Mクエン酸バッファー（pH5.6）を加えてよく混合した後、氷上にて超音波破砕機（UD-201, TOMY SEIKO Co., Ltd., Tokyo, Japan）を用いて10秒間の超音波処理（output 4, duty 70）を3回繰り返した。20,000×gで遠心分離した後、上清を新しい遠心管に移し粗酵素液とした。
　20μlの粗酵素液、20μlの0.1Mクエン酸バッファー（pH5.6）、5μlのシアニジン-3-O-βグルコシド、5μlのバニリン酸1-O-βグルコースを含む反応液内で、30℃で、3時間反応させた後、2.5μlの20%リン酸水溶液を加えて反応を停止した。20,000×gの遠心分離で不溶化したタンパク質を除去した後、HPLC分析によって反応生成物を確認した。HPLC分析はDevelosil ODS-SR-5カラム（4.6×250 mm、野村化学）を用いて、溶離液として1.5%リン酸水溶液およびメタノールを用いて行った。流速1ml/minおよびメタノールの濃度が22%から60%となるような直線勾配（20分間）で分離し、フォトダイオードアレイ検出器を用いて波長520nmの吸光度でシアニジン-3,5-O-β-ジグルコシドの生成を確認した（図４）。コントロールとして行った、キット付属のLacZ遺伝子を導入したベクターを形質転換した大腸菌からの粗酵素液では生成物は確認されなかった。このことから、図３に示した塩基配列（配列番号２）を持つ遺伝子がバニリン酸グルコースを糖供与体としてアントシアニン骨格の5位にグルコースを転移する酵素タンパク質をコードしていることが示された。
［実施例３］
(1)糖転移酵素をコードするcDNAの単離（デルフィニウム由来）
　デルフィニウム（品種「マリンブルー」）の花弁からRNAの抽出を、改変GTC/CsCl密度勾配遠心法（Chirgwin et al., 1979）を用いて行った。各組織片を液体窒素中で、乳鉢と乳棒を用いてよく破砕し、50mlのポリプロピレン製遠心沈殿管に移し、-80℃で完全に液体窒素を気化させた後に、3mlのGTC溶液（4.23Mチオシアン酸グアニジン、25mMクエン酸三ナトリウム、100mM 2-メルカプトエタノール、0.5% N-ラウロイルサルコシン）を加え直ちによく混合した。室温で30分放置した後、20,000×gで20分間遠心し、上清を新しい遠沈管に移してもう一度20,000×gで20分間遠心して完全に不溶物を除去した。このGTC抽出液を予め2.2mlの塩化セシウム溶液（5.7M CsCl, 0.1M EDTA, pH7.5）を分注しておいた5ml超遠心沈殿管（Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA）に重層し、70,000rpm（TL-100 Ultracentrifuge, TLA110 roter, Beckman Coulter Inc.）で、3時間超遠心した。沈殿したtotal RNAを300μlのTE-SDS buffer（10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA, 0.1% SDS）に縣濁した。得られたtotal RNAからOligotex-dT<super>（TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan）を用いてpoly(A)+RNAを精製した。方法はキットのマニュアルに従った。
　完全長cDNAはGeneRacer(商標)Kit（Invitrogen corp., CA）を使用し、オリゴキャッピング法に基づいてpoly(A)+RNAから合成した。方法はキットのマニュアルに従った。合成したcDNAは小分けして使用直前まで-80℃で保存した。3'-RACE用のcDNAは、3'-Full RACE Core Set（TaKaRa Bio Inc.）を用いて前述のpoly(A)+RNAから合成した。方法はキットのマニュアルに従った。
　糖転移酵素タンパク質のアミノ酸内部配列解析によって得られたアミノ酸配列「GTQPHVTLLH（配列番号６）」、「FTPXETELLTG（配列番号７）」から設計した縮重プライマー「GGN ACN CAR CCN CAY GTN AC（配列番号１１）」、「TTY ACN CCN GAY GAR ACN GA（配列番号１２）」を用いて、先に合成した3'-RACE用のcDNAを鋳型としてPCR法（94℃, 30秒、46℃, 30秒、72℃, 1分）を行い、約600bpのcDNA断片を獲得した。獲得したcDNA断片をクローニングベクターpGEM-T easy（Promega）にLigation Mix mighty （Takara Bio inc.）を用いて連結し、大腸菌DH5α株に形質転換した。得られたコロニーからプラスミドを抽出し、ジェネティックアナライザABI PRISM 3100（Applied Biosystems Japan Ltd., Tokyo, Japan）を用いてDNA塩基配列を解析した。得られたDNA塩基配列はDNA Databank of Japan（DDBJ）のBLASTXを用いてデータベースとの比較を行った。一連のDNA塩基配列の解析はGenetyx WIN ver. 5.0（Genetyx Corp., Tokyo, Japan）を用いて行った。
　得られたcDNA断片のDNA塩基配列から設計したプライマー「CTGGTTGCTTCAATATCTGCCCTCG（配列番号１７）」とGeneRacer5'primerを用い、先に合成した完全長cDNAを鋳型としてPCRを行った。得られたPCR産物をエタノール沈殿法で精製した。精製したPCR産物を鋳型とし、cDNA断片のDNA塩基配列から設計したプライマーを用いてnested PCRを行い、約550bpのcDNA断片を獲得した。獲得したcDNA断片は上記と同様の方法でpGEM-Teasyベクターにクローニングし、cDNA塩基配列を決定した。
　決定したcDNA5'端断片からfist ATGを含むように設計したプライマー「ATGTGCCCCTCTTTTCTAGTGACTC（配列番号１８）」と3 site 3'adaptor primer（Takara Bio inc.）とを用いて、先に合成した3'-RACE用のcDNAを鋳型としたPCR法で糖転移酵素タンパク質のfirst ATG以下のcDNAを獲得した。獲得したcDNAを上記の方法でクローニングし、DNA塩基配列を決定した。決定したcDNA配列と推定される塩基配列（配列番号４）およびその塩基配列によってコードされる推定アミノ酸配列（配列番号３）を図５に記載したとおりである。
　上述のようにして単離したcDNAは全長1701bpで505アミノ酸残基のタンパク質をコードしていた。データベース上のアミノ酸モチーフ検索の結果から、このアミノ酸配列のN末端30アミノ酸残基内には液胞への移行シグナル配列を含んでいることが示唆された。
(2)デルフィニウム由来糖転移酵素遺伝子の大腸菌での発現
　DgVA7GTの液胞移行シグナルと予想されたN末端28アミノ酸残基を除いた配列に翻訳開始のためのメチオニン残基が付加されるように設計したセンスプライマー「ATG CCC GAA TTT AAT GTC AG（配列番号１９）」と、ストップコドンを含まないように設計したアンチセンスプライマー「CTG TGA AGA GTA CGA TAT C（配列番号２０）」を用いてPCRを行い、pTrcHis2-TOPO TA expression Kit（Invitrogen）を用いてpTrcHis2-TOPOベクター（Invitrogen）に連結し、大腸菌JM109株に形質転換した。形質転換した大腸菌からDNAを抽出して先の方法と同様にしてDNA塩基配列を解析し、cDNAの導入された向きとPCRによる塩基置換がないことを確認した。
　形質転換した大腸菌を50μl/mlのアンピシリンを含む5mlのLB培地に植菌し、14時間、30℃で振蕩培養した。その後、1mMとなるようにIPTGを加えてから16℃で2時間振蕩培養した。培養した大腸菌は1,800×gの遠心分離で集菌し、培地を除去した。そこに150μlの0.1Mクエン酸バッファー（pH5.6）を加えてよく混合した後、氷上にて超音波破砕機（UD-201, TOMY SEIKO Co., Ltd., Tokyo, Japan）を用いて10秒間の超音波処理（output 4, duty 70）を3回繰り返した。20,000×gで遠心分離した後、上清を新しい遠心管に移し粗酵素液とした。
　20μlの粗酵素液、20μlの0.1Mクエン酸バッファー（pH5.6）、5μlのシアニジン-3-O-βグルコシド、5μlのバニリン酸1-O-βグルコースを含む反応液内で、30℃で、3時間反応させた後、2.5μlの20%リン酸水溶液を加えて反応を停止した。20,000×gの遠心分離で不溶化したタンパク質を除去した後、HPLC分析によって反応生成物を確認した。HPLC分析はWakopak Handy ODS(4.6×250 mm、和光純薬工業)カラムを用いて、溶離液として1.5%リン酸水溶液およびメタノールを用いて行った。流速1ml/minおよびメタノールの濃度が22%から55%となるような直線勾配（20分間）で分離し、フォトダイオードアレイ検出器を用いて波長520nmの吸光度でシアニジン-3,5-O-β-ジグルコシドとは異なるリテンションタイムに新たなピーク生成を確認した（図６）。デルフィニウムの青色の花弁中にはアントシアニンジンの3位と7位がグルコースで修飾されたアントシアニンが蓄積していることが知られていることから、この反応で生成したアントシアニンはシアニジン-3,7-O-β-ジグルコシドであると推定された。コントロールとして行った、キット付属のLacZ遺伝子を導入したベクターを形質転換した大腸菌からの粗酵素液では生成物は確認されなかった。このことから、図５に示した塩基配列（配列番号４）を持つ遺伝子がバニリン酸グルコースを糖供与体としてアントシアニン骨格の7位にグルコースを転移する酵素タンパク質をコードしていることが示された。
［実施例４］
花弁の発達4段階、茎、葉における、糖転移酵素をコードする遺伝子の発現量、糖転移酵素活性および蓄積アントシアニン量の解析
　カーネーション（品種「ビームチェリー」）における糖転移酵素をコードする遺伝子の発現量の経時変化および器官特異性を調べた。経時変化の解析のために、それぞれ異なる発達段階の4種類の花弁をサンプルとして用いた。加えて、器官特異性の解析のために、茎と葉もサンプルとして用いた。
　発現解析はRT-PCRで行った。実施例２および３で述べた方法と同様の方法により各サンプルより抽出したtotal RNA 500ngよりcDNAを合成した。プライマーは、Oligo(dT)15 primer (Promega)、逆転写酵素はM-MLV ReverseTranscriptase(invitrogen)を用いた。各遺伝子発現の検出に用いたプライマーは以下の通りである。カーネーション由来UDP-グルコーストランスフェラーゼ(Dc3UGT)：5'-GGC ACC CAC GAC ACC ACC ATC CC-3'（配列番号２１）、5'-CAG GAT TGT CCA AGA TTA GAG TC-3'（配列番号２２）、カーネーション由来バニリン酸グルコーストランスフェラーゼ(DcVA5GT、本発明の酵素) ：5'-GAG GGA GTT TAC TCC AAA GAA G-3'（配列番号２３）、5'-CAC CAT GAG TTC GAC ATC TTC C-3'（配列番号２４）、カーネーション由来アクチン(DcActin)：5'-CCC TAT TGA GCA CGG TAT CGT CAC C-3'（配列番号２５）、5’-CAG CAC TTG TGG TGA GGG AGT AAC C-3’（配列番号２６）。PCRのコンディションは以下の通りである：94℃で2分、その後 94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で20秒を27、32または37サイクル。次いで、PCR産物をアガロースゲルで電気泳動することで分離した。各サンプルの転写量は、PCR産物をUV照射した際の光量で比較した。
　各サンプルより実施例１と同様にして抽出した粗酵素を用いて糖転移酵素活性を調べた。シアニジン-3-O-β-グルコシド（終濃度200μM）を受容体、バニリン酸1-O-βグルコース（終濃度1mM）を糖供与体とし、クエン酸バッファーでpH5.6に調整し、30℃、15分間、糖転移酵素反応を行った。リン酸（終濃度1%）で反応を止めた後、遠心して不溶物を除き、上清をHPLCを用いて解析した。（HPLC条件は実施例１(3)参照）。粗酵素1mgあたりのpkatは、シアニジン-3,5-O-β-ジグルコシドを基準に、HPLCのエリアより算出した。
　アントシアニンの蓄積量は、サンプル0.1gを1%トリフルオロ酢酸を含む80%メタノールで72時間抽出した抽出液の520nmにおける吸光度を測定することで定量した。サンプル1gあたりのアントシアニン量は、ペラルゴニジン-3,5-ジグルコシドの吸光度を基準にして算出した。
　これらの解析の結果を図７に示す。これらの結果より、この配糖化遺伝子はカーネーションの植物体内においてカーネーションが持つアントシアニン色素合成にかかわっていることがわかる。
［実施例５］
(1)p-ヒドロキシ安息香酸1-O-β-グルコースの合成
　DDBJデータベース上のカーネーション配糖化酵素相同遺伝子（DcUGTA82）のDNA配列情報（DDBJアクセッションNo.AB294379）から設計したPCR用プライマー（DcA82atg: ATGGAGGAGGATAAACAAAAGCC（配列番号２７）、DcA82atgrt: ATGTGAAGTAACTTCTTCAATA（配列番号２８））と、実施例２に記述した方法で合成した3'-RACE用の鋳型cDNAを用いてPCR法によってバニリン酸配糖化酵素遺伝子を増幅した。増幅したDNAをpTrcHis2-TOPO TA expression Kit（Invitrogen）を用いてpTrcHis2-TOPOベクター（Invitrogen）に連結し、大腸菌JM109株に形質転換した。形質転換した大腸菌からDNAを抽出して先の方法と同様にしてDNA塩基配列を解析し、cDNAの導入された向きとPCRによる塩基置換がないことを確認した。
　形質転換した大腸菌を50μl/mlのアンピシリンを含む5mlのLB培地に植菌し、14時間、30℃で振蕩培養した。その後、1mMとなるようにIPTGを加えてから16℃で2時間振蕩培養した。培養した大腸菌は1,800×gの遠心分離で集菌し、培地を除去した。そこに150μlの破砕バッファー（0.1Mリン酸カリウム、pH7.5、7mM 2-メルカプトエタノール）を加えてよく混合した後、氷上にて超音波破砕機（UD-201, TOMY SEIKO Co., Ltd., Tokyo, Japan）を用いて10秒間の超音波処理（output 4, duty 70）を3回繰り返した。20,000×gで遠心分離した後、上清を新しい遠心管に移し粗酵素液とした。
　20μlの粗酵素液、20μlの破砕バッファー（0.1Mリン酸カリウム、pH7.5、7mM 2-メルカプトエタノール）、5μlの10mM UDP-グルコース、5μlの10mMバニリン酸あるいはp-ヒドロキシ安息香酸を含む反応液内で、30℃で、1時間反応させた後、2.5μlの20%リン酸水溶液を加えて反応を停止した。20,000×gの遠心分離で不溶化したタンパク質を除去した後、HPLC分析によって反応生成物を確認した。HPLC分析はWakopak Handy ODS(4.6×250 mm、和光純薬工業)カラムを用いて、溶離液として1.5%リン酸水溶液およびメタノールを用いて行った。流速1ml/minおよびメタノールの濃度が22%から55%となるような直線勾配（20分間）で分離し、フォトダイオードアレイ検出器を用いて反応生成物を確認した。
　基質としてバニリン酸を用いた場合、糖供与体であるUDP-グルコースを含む場合には新たなピークが検出された（図８：上図はUDP-グルコースを加えた場合、中図は糖供与体を加えなかった場合をそれぞれ示す）。この化合物はリテンションタイム、DADスペクトルが化学的に合成したバニリン酸1-O-β-グルコースと一致したことから、この酵素はバニリン酸などの芳香族有機酸にグルコースをβ型でエステル結合させる酵素であることが証明された。同様にp-ヒドロキシ安息香酸を基質としてUDP-グルコースを糖供与体として反応させたところ、HPLCクロマトグラム上に新たなピークが検出された（図９：上図はUDP-グルコースを加えた場合、下図は糖供与体を加えなかった場合をそれぞれ示す）。これはp-ヒドロキシ安息香酸1-O-β-グルコースであると考えられた。
　次に、DcUGTA82を形質転換した大腸菌を200mlのLB培地中、30℃で14時間培養したのち、IPTGを終濃度1mMとなるように加えてから更に16℃で3時間培養した。培養した大腸菌を6,000×gの遠心分離で集菌し、10mlの破砕バッファーに懸濁した。その後氷上にて超音波破砕機を用いて30分間の超音波処理（output 7, duty 70）を行った。20,000×gで遠心分離した後、上清を新しい遠心管に移し粗酵素液とした。酵素反応は10mlの粗酵素液と、終濃度1mMのp-ヒドロキシ安息香酸と終濃度1mMのUDP-グルコースを含む全量30mlの反応液中で30℃で3時間行った。その後、終濃度1％となるようにリン酸を加えて反応を停止させてから、20,000×gの遠心分離で不溶化したタンパク質を除去した。この上清に含まれるp-ヒドロキシ安息香酸1-O-β-グルコースをODSカラム（ODS-SM, 26×100mm）を用いたフラッシュクロマトグラフィー（YFLC-AI-580, YAMAZEN corp.）で精製した。精製したp-ヒドロキシ安息香酸1-O-β-グルコースの濃度は紫外可視分光度計を用いてp-ヒドロキシ安息香酸の255nmにおける吸光度から算出した。
(2)p-ヒドロキシ安息香酸1-O-βグルコースを糖供与体とする糖転移反応の検出
　カーネーション（品種「ビームチェリー」）の桃色の花弁あるいはデルフィニウム（品種「マリンブルー」）の花弁から実施例１と同様の方法により抽出した粗酵素液を用いて糖転移酵素活性を調べた。シアニジン-3-O-β-グルコシド（終濃度200μM）を受容体、p-ヒドロキシ安息香酸1-O-β-グルコース（終濃度1mM）を糖供与体とし、クエン酸バッファーでpH5.6に調整し、30℃、15分間、糖転移酵素反応を行った。リン酸（終濃度1%）で反応を止めた後、遠心して不溶物を除き、上清をHPLCを用いて解析した。HPLC分析はWakopak Handy ODS(4.6×250 mm、和光純薬工業)カラムを用いて、溶離液として1.5%リン酸水溶液およびメタノールを用いて行った。流速1ml/minおよびメタノールの濃度が20%から55%となるような直線勾配（20分間）で分離し、フォトダイオードアレイ検出器を用いて反応生成物を確認した。
　その結果、カーネーションおよびデルフィニウムのいずれの粗酵素液を用いた場合においても、シアニジン3-O-β-グルコシドに対する配糖化酵素活性が認められた（図１０：カーネーション花弁から得られた酵素、上から1番目はバニリン酸1-O-β-グルコースを加えた場合、2番目はp-ヒドロキシ安息香酸1-O-β-グルコースを加えた場合、3番目は糖供与体を加えなかった場合をそれぞれ示す。図１１：デルフィニウム花弁から得られた酵素、上図はバニリン酸1-O-β-グルコースを加えた場合、中図はp-ヒドロキシ安息香酸1-O-β-グルコースを加えた場合、下図は糖供与体を加えなかった場合をそれぞれ示す。）。このことから、これらの配糖化酵素はバニリン酸1-O-β-グルコースのみならずp-ヒドロキシ安息香酸1-O-β-グルコースも糖供与体として認識できることが示された。
(3)デルフィニウム由来糖転移酵素を用いた反応によって生成したアントシアニンのグルコース結合位置の確認
　実施例３の(2)に示した方法で製造した組換えデルフィニウム由来糖転移酵素を用いて、シアニジン-3-O-β-グルコシドを糖受容体、p-ヒドロキシ安息香酸1-O-β-グルコースを糖供与体とした糖転移酵素反応をおこなった。この反応によって生じたシアニジン-3,7-O-β-ジグルコシドと考えられる生成物を、ODSカラムを用いた中圧クロマトグラフィーによって精製した。精製したサンプル（乾燥重量約 5 mg）を重メタノールに溶解してNOE差スペクトルを測定した。その結果を図１２に示す。図中の化学式の矢印は、NOE差スペクトル測定によって示された相関を示したものである。シアニジン骨格のC8位のプロトンとグルコース1位のプロトン、ならびにC6位のプロトンとグルコース1位のプロトンとの間に相関が示されたことから、この糖転移反応によって生じたアントシアニンは、シアニジン3-グルコシドの7位の水酸基にグルコースが転移したシアニジン3,7-ジグルコシドであることが示された。
［実施例６］
カーネーションから精製した酵素を用いた、各化合物を糖供与体とした糖転移反応の検証
　実施例２の(1)および(2)に示した方法でカーネーション（品種「ビームチェリー」）の桃色の花弁から精製した酵素135ng、シアニジン3-グルコシド200μMおよび糖供与体（バニリン酸1-O-β-D-グルコース、またはMatsuba Y et al., Plant Biotechnology vol.25, No.4 (2008) pp.369-375に記載の方法に従って酵素学的に合成したp-クマル酸1-O-β-D-グルコース、カフェ酸1-O-β-D-グルコース、フェルラ酸1-O-β-D-グルコースもしくはシナピン酸1-O-β-D-グルコースのいずれか）500μMをクエン酸バッファー(pH 5.6)で30μlとした反応溶液で30℃で15分間酵素反応を行った。リン酸の終濃度が1%となるように20%リン酸水溶液を反応液に加えて反応を止め、遠心後の上澄みを、HPLC（Chromolith SpeedROD、4.6×50mm、Merck）を用い、溶離液A（1.5%リン酸水溶液）および溶離液B（90%メタノール水溶液）のB液18%から28%までの直線勾配（5分間）で分離し、解析を行った（流速3.0ml/min、520nm）。各糖供与体に対する酵素の相対活性を、反応生成物（シアニジン3,5-O-βジグルコシド）の波長505nmにおけるHPLCクロマトグラムのエリアから算出した。その結果を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
　本発明の糖供与試薬を用いることにより、UDP-グルコースのような糖ヌクレオチドを使用しないで糖供与反応を行うことができる。また本発明の糖転移酵素および糖転移酵素遺伝子によれば、糖ヌクレオチド以外の糖供与体を利用した糖転移反応を触媒する酵素を提供することができる。
　本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

Claims (16)

  1. 　以下の(a)または(b)のタンパク質：
    (a)配列番号１または３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    (b)配列番号１または３に記載のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖転移酵素活性を有するタンパク質。
  2. 　請求項１に記載のタンパク質をコードするDNAからなる糖転移酵素遺伝子。
  3. 　以下の(c)～(e)のいずれかのDNAからなる糖転移酵素遺伝子：
    (c)配列番号２または４に記載の塩基配列からなるDNA、
    (d)配列番号２または４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA、
    (e)配列番号２または４に記載の塩基配列の縮重異性体からなるDNA。
  4. 　請求項２または３に記載の糖転移酵素遺伝子を含む組換えベクター。
  5. 　請求項４に記載の組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
  6. 　請求項２または３に記載の糖転移酵素遺伝子が導入された植物もしくはこれと同じ性質を有する該植物の子孫。
  7. 　請求項５に記載の形質転換体を培養することを含む、請求項１に記載の糖転移酵素の製造方法。
  8. 　式(A)：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、R1はそれぞれ独立して水素、またはC1-6アルキル、C2-6アルケニルもしくはC2-6アルキニル（これらの基は、非置換であるか、あるいはOH、F、Cl、Br、I、CN、NO2もしくはSO2から選択される1個以上の基によって置換されていてもよい）から選択され、
    　nは0、1、2、3、4または5であり、
    　mは0または1であり、
    　Xは、アノマー炭素においてβ結合している単糖である］
    で表される化合物を含む糖供与試薬。
  9. 　R1がそれぞれ独立して水素またはC1-6アルキル（C1-6アルキルは非置換であるか、あるいはOH、F、Cl、BrもしくはIから選択される1個以上の基によって置換されていてもよい）から選択される、請求項８に記載の糖供与試薬。
  10. 　Xがグルコース、グルクロン酸、ガラクトース、キシロース、アピオース、アロース、ラムノース、アラビノフラノースもしくはマンノースから選択される、請求項８または９に記載の糖供与試薬。
  11. 　式(A)で表される化合物がバニリン酸1-O-βグルコース、イソバニリン酸1-O-βグルコース、p-ヒドロキシ安息香酸1-O-βグルコース、p-クマル酸1-O-βグルコース、カフェ酸1-O-βグルコース、フェルラ酸1-O-βグルコースまたはシナピン酸1-O-βグルコースである、請求項１０に記載の糖供与試薬。
  12. 　ポリフェノールに請求項８～１１のいずれか１項に記載の糖供与試薬と糖転移酵素を反応させることを含む、ポリフェノールの配糖化方法。
  13. 　ポリフェノールがフラボノイドである、請求項１２に記載の配糖化方法。
  14. 　糖転移酵素が赤色ではない花弁を有するカーネーション由来あるいはデルフィニウム由来である、請求項１２または１３に記載の配糖化方法。
  15. 　糖転移酵素が請求項１に記載のタンパク質である、請求項１２または１３に記載の配糖化方法。
  16. 　請求項８～１１のいずれか１項に記載の糖供与試薬と請求項１に記載のタンパク質とを含む、ポリフェノール配糖化キット。
PCT/JP2010/050674 2009-08-07 2010-01-21 新規糖転移酵素、新規糖転移酵素遺伝子および新規糖供与体化合物 WO2011016260A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2010800436082A CN102549155A (zh) 2009-08-07 2010-01-21 新型糖基转移酶、新型糖基转移酶基因和新型糖供体化合物
US13/389,233 US8722868B2 (en) 2009-08-07 2010-01-21 Glycosyltransferase, novel glycosyltransferase gene, and novel sugar donor compound
EP10806260.5A EP2463366B1 (en) 2009-08-07 2010-01-21 Novel glycosyltransferase, novel glycosyltransferase gene, and novel glycosyl donor compound
JP2011525808A JP5761718B2 (ja) 2009-08-07 2010-01-21 新規糖転移酵素、新規糖転移酵素遺伝子および新規糖供与体化合物

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009-184030 2009-08-07
JP2009184030 2009-08-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011016260A1 true WO2011016260A1 (ja) 2011-02-10

Family

ID=43544164

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/050674 WO2011016260A1 (ja) 2009-08-07 2010-01-21 新規糖転移酵素、新規糖転移酵素遺伝子および新規糖供与体化合物

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8722868B2 (ja)
EP (1) EP2463366B1 (ja)
JP (1) JP5761718B2 (ja)
CN (1) CN102549155A (ja)
WO (1) WO2011016260A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016504023A (ja) * 2012-12-06 2016-02-12 上海 インスティテューツ フォー バイオロジカル サイエンシーズ、チャイニーズ アカデミー オブ サイエンシーズＳｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ Ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ Ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 一連の糖転移酵素およびその応用
JP2016044139A (ja) * 2014-08-22 2016-04-04 学校法人東京電機大学 タケ類抽出物及び新規配糖体
US10870861B2 (en) 2015-07-01 2020-12-22 Suntory Holdings Limited Creation of chrysanthemum with blue flower color
US11299742B2 (en) 2016-03-31 2022-04-12 Suntory Holdings Limited Plant having blue flower color and breeding method therefor
CN114958796A (zh) * 2022-06-26 2022-08-30 上海龙殷生物科技有限公司 一种姜黄素的糖基化方法

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2014273088A1 (en) * 2013-05-29 2015-11-12 Universitat Hamburg Enzymes catalyzing the glycosylation of polyphenols
CN105087618B (zh) * 2014-04-30 2019-03-12 中国科学院上海生命科学研究院 3ggt基因及其编码蛋白在特异性糖基化花青素-3-o-葡糖苷中的应用
CN105779473A (zh) * 2014-12-19 2016-07-20 上海交通大学 鼠李糖异黄酮的合成基因簇及其应用
US20190203240A1 (en) * 2016-01-15 2019-07-04 Universitaet Hamburg Methods for the production of rhamnosylated flavonoids
WO2018034984A1 (en) * 2016-08-19 2018-02-22 Yale University Transgene and mutational control of sexuality in maize and related grasses
CN109207448B (zh) * 2017-06-30 2022-08-16 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 新型黄酮异戊烯基转移酶及其应用
AU2018354418A1 (en) * 2017-10-27 2020-05-14 Immunebridge Inc. Compositions and methods of making expanded hematopoietic stem cells using derivatives of fluorene
CN108572223B (zh) * 2018-04-23 2021-01-26 南京明捷生物医药检测有限公司 一种测定多肽中活性诱导物质的方法
CN112029741B (zh) * 2020-08-26 2022-04-22 中国中医科学院中药研究所 银杏中生长素n糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用
CN114763551B (zh) * 2021-12-07 2023-09-15 西藏自治区农牧科学院农业研究所 一种青稞矢车菊素糖基转移酶基因及其用途
CN117343919B (zh) * 2023-10-07 2024-04-19 广州佰数生物科技有限公司 一种类黄酮双羟基位点糖基转移酶及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10113184A (ja) * 1996-10-15 1998-05-06 Tokyo Gas Co Ltd フラボノイド配糖化酵素遺伝子
JP2003289884A (ja) 2002-01-31 2003-10-14 Suntory Ltd 新規糖転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子
WO2005059141A1 (ja) 2003-12-17 2005-06-30 Suntory Limited フラボノイド合成系の制御による黄色の花の作製方法
WO2006046780A1 (ja) * 2004-10-29 2006-05-04 International Flower Developments Proprietary Limited アントシアニンの３’位への芳香族アシル基転移酵素をコードする遺伝子を用いたアントシアニン色素の安定化ならびに青色化方法
WO2007046148A1 (ja) * 2005-10-20 2007-04-26 Aomori Prefecture 新規芳香族アシル基転移酵素遺伝子
JP2009011253A (ja) 2007-07-05 2009-01-22 Tokyo Tobari Kk 乗越防止柵及び返し部材
JP2009184030A (ja) 2008-02-04 2009-08-20 Toyota Motor Corp ロボットハンド及びロボットハンドの制御方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10113184A (ja) * 1996-10-15 1998-05-06 Tokyo Gas Co Ltd フラボノイド配糖化酵素遺伝子
JP2003289884A (ja) 2002-01-31 2003-10-14 Suntory Ltd 新規糖転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子
WO2005059141A1 (ja) 2003-12-17 2005-06-30 Suntory Limited フラボノイド合成系の制御による黄色の花の作製方法
WO2006046780A1 (ja) * 2004-10-29 2006-05-04 International Flower Developments Proprietary Limited アントシアニンの３’位への芳香族アシル基転移酵素をコードする遺伝子を用いたアントシアニン色素の安定化ならびに青色化方法
WO2007046148A1 (ja) * 2005-10-20 2007-04-26 Aomori Prefecture 新規芳香族アシル基転移酵素遺伝子
JP2009011253A (ja) 2007-07-05 2009-01-22 Tokyo Tobari Kk 乗越防止柵及び返し部材
JP2009184030A (ja) 2008-02-04 2009-08-20 Toyota Motor Corp ロボットハンド及びロボットハンドの制御方法

Non-Patent Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Plant Cell Culture Manual", 1984, KODANSHA SCIENTIFIC LTD.
"Plant Genetic Transformation and Gene Expression; a laboratory manual", 1988, BLACKWELL SCIENTIFIC PUBLICATION
EUPHYTICA, vol. 85, 1995, pages 75 - 80
GALLIE ET AL., NUC. ACIDS RES., vol. 15, 1987, pages 8693 - 8711
GENSCHIK ET AL., GENE, vol. 148, 1994, pages 195 - 202
ISAO ISHIDA; NORILNKO MISAWA: "Manuals for Cell Engineering Experimental Operations", 1992, KODANSHA LTD., pages: 119
J. BIOL. CHEM., vol. 274, no. 11, 1999, pages 7405 - 7411
J. BIOL. CHEM., vol. 276, no. 6, 2001, pages 4338 - 4343
JUN OGATA ET AL.: "Carnation no Hanairo Hatsugen ni Kakawaru Idenshi no Kaiseki (Dai 3 Po) Carnation Kaben ni Okeru Flavonoid Haitotaika Koso ni Tsuite", JOURNAL OF THE JAPANESE SOCIETY FOR HORTICULTURAL SCIENCE, vol. 72, 4 April 2003 (2003-04-04), pages 358, XP008151357 *
MATSUBA Y E, PLANT BIOTECHNOLOGY, vol. 25, no. 4, 2008, pages 369 - 375
MATSUBA Y ET AL., PLANT BIOTECHNOLOGY, vol. 25, no. 4, 2008, pages 369 - 375
MATSUBA Y. ET A: "Enzymatic preparation of 1-0-hydroxycinnamoyl-beta-D-glucoses and their application to the study of 1-0-hydroxycinnamoyl-beta-D-glucose-dependent acyltransferase in anthocyanin-producing cultured cells of Daucus carota and Glehnia littoralis", PLANT BIOTECHNOLOGY, vol. 25, no. 4, July 2008 (2008-07-01), pages 369 - 375, XP008151344 *
PLANT J., vol. 7, 1995, pages 661 - 676
PLANT SCIENCE, vol. 132, 1998, pages 31 - 43
SAMBROOK, J ET AL.: "Molecular Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LAB. PRESS
See also references of EP2463366A4
VITRO CELL. DEV. BIOL., vol. 31, 1995, pages 101 - 104
YAMAMOTO ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 270, 1995, pages 12466 - 12470
ZOLLER ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 10, 1982, pages 6478 - 6500

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016504023A (ja) * 2012-12-06 2016-02-12 上海 インスティテューツ フォー バイオロジカル サイエンシーズ、チャイニーズ アカデミー オブ サイエンシーズＳｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ Ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ Ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 一連の糖転移酵素およびその応用
US9976167B2 (en) 2012-12-06 2018-05-22 Shanghai Institutes For Biological Sciences, Chinese Academy Of Sciences Group of glycosyltransferases and use thereof
JP2016044139A (ja) * 2014-08-22 2016-04-04 学校法人東京電機大学 タケ類抽出物及び新規配糖体
US10870861B2 (en) 2015-07-01 2020-12-22 Suntory Holdings Limited Creation of chrysanthemum with blue flower color
US11299742B2 (en) 2016-03-31 2022-04-12 Suntory Holdings Limited Plant having blue flower color and breeding method therefor
CN114958796A (zh) * 2022-06-26 2022-08-30 上海龙殷生物科技有限公司 一种姜黄素的糖基化方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2463366A9 (en) 2013-01-16
EP2463366B1 (en) 2015-08-12
US8722868B2 (en) 2014-05-13
EP2463366A1 (en) 2012-06-13
JPWO2011016260A1 (ja) 2013-01-10
US20120135469A1 (en) 2012-05-31
CN102549155A (zh) 2012-07-04
EP2463366A4 (en) 2013-09-25
JP5761718B2 (ja) 2015-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5761718B2 (ja) 新規糖転移酵素、新規糖転移酵素遺伝子および新規糖供与体化合物
JP5598830B2 (ja) アントシアニンの３’位への芳香族アシル基転移酵素をコードする遺伝子を用いたアントシアニン色素の安定化ならびに青色化方法
Isayenkova et al. Cloning and functional characterisation of two regioselective flavonoid glucosyltransferases from Beta vulgaris
EP3906301A1 (en) Recombinant host cells with improved production of tetraketide derivatives
KR20210153670A (ko) 변이체 효소를 통한 스테비올 글리코사이드 레바우디오사이드 i의 생합성 생산
WO2013108794A1 (ja) 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用
JP6602291B2 (ja) 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用
JP5936553B2 (ja) 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用
EP1816193B1 (en) Lignan glycosidase and utilization of the same
US6420142B1 (en) Method for enzymatic splitting of rutinosides
Noguchi et al. cDNA cloning of glycosyltransferases from Chinese wolfberry (Lycium barbarum L.) fruits and enzymatic synthesis of a catechin glucoside using a recombinant enzyme (UGT73A10)
US20110283424A1 (en) Gene Encoding Lignan Methylation Enzyme
Liu et al. Identification and functional application of a new malonyltransferase NbMaT1 towards diverse aromatic glycosides from Nicotiana benthamiana
JP4418865B2 (ja) 新規グルコシル基転移酵素遺伝子
JP5766334B2 (ja) 青いバラに含まれる新規化合物
WO2022107857A1 (ja) フラボン４&#39;－ｏ－メチル基転移酵素遺伝子及びその使用
EP2246418A1 (en) Lignan hydroxylase
CN111019919B (zh) 用莲类黄酮c-糖基转移酶ugt708n1合成类黄酮c-糖苷的方法
Masih Application of glycosyltransferases for natural product glycosylation: towards engineering of a promiscuous C-glycosyltransferase through site-directed mutagenesis of O-glycosyltransferases

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201080043608.2

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10806260

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011525808

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13389233

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010806260

Country of ref document: EP