CN114763551B

CN114763551B - 一种青稞矢车菊素糖基转移酶基因及其用途

Info

Publication number: CN114763551B
Application number: CN202111486970.3A
Authority: CN
Inventors: 羊海珍; 巴桑玉珍; 唐亚伟; 扎西罗布; 王玉林; 韦泽秀; 德青卓嘎; 杨春葆; 许从萍; 原红军; 徐齐君; 曾兴权
Original assignee: Institute Of Agricultural Resources And Environment Of Tibet Academy Of Agricultural And Animal Husbandry Sciences; Institute Of Agriculture Tibet Autonomous Region Academy Of Agriculture And Animal Husbandry
Current assignee: Institute Of Agricultural Resources And Environment Of Tibet Academy Of Agricultural And Animal Husbandry Sciences; Institute Of Agriculture Tibet Autonomous Region Academy Of Agriculture And Animal Husbandry
Priority date: 2021-12-07
Filing date: 2021-12-07
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2041-12-07
Also published as: CN114763551A

Abstract

本发明提供了一种青稞矢车菊素糖基转移酶基因及其用途，属于基因工程领域。本发明发现了青稞中的一种新的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，该基因表达的蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)可以将矢车菊素转化为矢车菊素3‑O葡萄糖苷，提高青稞的保健价值。本发明以该基因片段进行体外表达，获得了青稞矢车菊素糖基转移酶，在体外反应中将葡萄糖作为糖基供体，矢车菊素作为受体，成功地制备得到了矢车菊素3‑O葡萄糖苷。本发明将该基因转移到烟草中，使得烟草植株中表达矢车菊素糖基转移酶，进一步产生矢车菊素3‑O葡萄糖苷，提高了烟草植株的价值。本发明提供的新的基因，及其重组载体、重组菌、转基因植物均具有良好的应用前景。

Description

一种青稞矢车菊素糖基转移酶基因及其用途

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种青稞矢车菊素糖基转移酶基因及其用途。

背景技术

青稞(Hordeum vulgare Linn.var.nudum Hook.f.)是禾本科大麦属的一种禾谷类作物，因其内外颖壳分离，籽粒裸露，故又称裸大麦、元麦、米大麦。主要产自中国西藏、青海、四川、云南等地，是藏族人民的主要粮食。青稞有着广泛的药用以及营养价值，已推出了青稞挂面、青稞馒头、青稞营养粉等青稞产品。

花青素是从红、蓝、紫色的花果和叶片中提取的黄酮类化合物的总称，其中，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin-3-O-glucoside)被证实可通过多种途径减轻自由基损伤、抑制炎性反应、保护血管内皮细胞，从而达到脑保护作用。因此，开发出一种高产矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的青稞品种具有重要价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种青稞矢车菊素糖基转移酶基因及其用途。

本发明提供了一种基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种重组载体，它包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；优选地，所述重组载体是重组pGEX-6P-1。

本发明还提供了一种重组菌，它包含上述的重组载体；优选地，所述重组菌为重组大肠杆菌；更优选地，所述重组大肠杆菌为重组Transetta(DE3)。

本发明还提供了一种制备氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白的方法，它是采用上述的重组菌发酵制得的。

进一步地，所述方法包括以下步骤：

(1)取重组菌，活化，扩增，得活化菌液；

(2)将活化菌液接种到培养基中培养，3～4小时后加入诱导剂诱导表达，收集菌体；

(3)取菌体，破菌，离心，取上清纯化后得到氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白。

进一步地，步骤(1)中，所述活化菌液的浓度为1×10⁶～1×10⁷cfu/ml；

步骤(2)中，所述活化菌液与培养基的体积比为1:(10～100)，所述培养基为含抗生素的LB培养基，所述培养的温度为30～40℃，所述诱导剂为IPTG诱导剂，所述诱导表达的温度为15～25℃，诱导表达的时间为8～16小时；

步骤(3)中，所述纯化方法为GST标签融合蛋白纯化方法。

进一步地，步骤(2)中，所述活化菌液与培养基的体积比为1:50，所述抗生素的为氨苄西林，所述培养的温度为37℃，所述诱导表达的温度为20℃，诱导表达的时间为10～14小时；

步骤(3)中，所述纯化方法为：取上清上树脂柱，穿流2次；先用Lysis buffer冲洗树脂去除杂蛋白；然后用还原型谷胱甘肽溶液洗脱，得蛋白。

本发明还提供了一种生产高产矢车菊素3-O葡萄糖苷转基因植物的方法，它是将上述基因转入植物中，获得表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示蛋白的植物。

进一步地，所述转入植物的方法是农杆菌法、基因枪法、电转法、PEG介导法、脂质体法、磷酸钙-DNA共沉淀法中的一种；所述植物为烟草或青稞。

本发明中，诱导过夜指诱导12±2小时。

本发明还提供了上述基因、上述重组载体、上述重组菌在制备高产矢车菊素3-O葡萄糖苷转基因植物中的用途；所述植物优选为烟草或青稞。

本发明首次发现了青稞中的一种新的基因：青稞矢车菊素糖基转移酶基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，该基因表达的蛋白——青稞矢车菊素糖基转移酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)可以将矢车菊素转化为矢车菊素3-O葡萄糖苷，提高青稞的保健价值。本发明以该基因片段进行体外表达，获得了青稞矢车菊素糖基转移酶，在体外反应中将葡萄糖作为糖基供体，矢车菊素作为受体，成功地制备得到了矢车菊素3-O葡萄糖苷。本发明将该基因转移到烟草中，使得烟草植株中表达矢车菊素糖基转移酶，进一步产生矢车菊素3-O葡萄糖苷，提高了烟草植株的价值。本发明提供的新的基因，及其重组载体、重组菌、转基因植物均具有良好的应用前景。

本发明的新的基因，及其重组载体、重组菌可以用来提高青稞对矢车菊素3-O葡萄糖苷的合成，实现青稞的定向改良。本发明的转基因植物构建方法，为青稞的定向改良提供了重要的参考。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为目的蛋白的SDS-PAGE电泳图，左侧Marker：100,70,55,40,35,25KDa。

图2为体外催化反应的LC-MS图，图中，Cyanidin为矢车菊素，Cyanidin3-O-galactoside为矢车菊素3-O葡萄糖苷。

图3为转基因烟草提取物中矢车菊素3-O葡萄糖苷的质谱图。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

实施例1目的基因的制备和目的蛋白的表达

1、目的基因HOVUSG6216800的制备

称取2克青稞新鲜叶片，提取青稞RNA，用Thermo Fisher公司的M-MLV ReverseTranscriptase(反转录酶)合成互补DNA(cDNA)，利用以下引物对进行PCR扩增，得到目的基因HOVUSG6216800(又称青稞矢车菊素糖基转移酶基因)，PCR产物用胶回收试剂盒(GelExtraction Kit D2500-02，OMEGA)纯化。

目的基因HOVUSG6216800的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)为：

ATGGCCGCGGTGCCGCACGTCGTGGTGATCACCTTCCCCTTCGCCTCCCACGCGGTGAAGCTGTTCCGCCTGGCGCGCGCCCTGGCCGCGGCGGCGCCGGCAGCCACCTTCTCCTTCCTCTCCACCGCCGGCTCCATCGCGCAGCTGCAGGAGAAGAACCAGGAGAATGCCCTCGAGCCCAACCTACGCTTCGTGGAGGTCCCGGACGGGCTGGTGTCGCCGAGCTCGGGTGGCGCCGGGACGACGCCGCCGCCCAACCATATGGCACGTCTCGGGCTCTTCTTGGCCGCCGCTGAGGCCGGCGGGGTGAGGGTGGCCCTGGAGACGGCTCGCGCCGCCGCGGGCGGCGCCAGGGTCACCTGCGTCGTCGGCGACGCGTTCGTCTGGATGGCCGCTGAGGCGGCCGCCGCGGTCGGGGCGCCGTGGGTTCCCGTCTGGACCGGCGGCCCCAGCGCGCTCCTTGCGCACCTCCAAGGCGACGCGCTGCGCGACGACATCGGCGACAAAGCGGCGAGCCGAGCGGACGATGTGCTGACGGCGCACCCGGGCCTAGGAAGCTACCGCGTCCGGGACCTCCCCGACGGCTGCGTCTTCGGCGACATGCACCTGCCCATCGTCGCCCTCTTCCGCCGCGTCGCCGACCAGCTGCACGTTCCCGGCGCGGCCACCGCCGTCGCCCTCAACACCTTCCCGGGCCTCCTCCCCGACGACGTCACCGCCGCCCTCGCCGCCGAGCTCCCGCAGGTCCTCCCCATCGGCCCCTTCCACCTTCTCCCGGTCCCCGGCGACGACAACGACGTGGCCGACCCGCACGGATGCCTCGCCTGGCTCGACGGCCACGCGGCCCGCGCCGTCGCGTACGCCAGCTTCGGCACGGTGGTCACCGCCGTGGTGGGCGGGCAGGAGGAGCTGCGCGAGCTCGCGGCCGGGCTGGAGGCCTCCGGCGCGCCGTTCCTCTGGTCGCTGCCCAAGGAGTACTGGCCGCTGCTCCCGACGGGGTTCCTCGACCTCGACCGCGCCAAGGTGGTGCCGTGGGCGCCGCAGGCCGCCGTGCTGCGGCACGCGTCGGCGGGCGCCTTCGTGACGCACGCGGGGTGGGCCTCCGTGCTGGAGGGCGTGGCCGGCGGGGTGCCCATGGCTTGCCGTCCCTTCTTCAGCGACCAGAGGATGAACGCGCGGATGGTGGCGCACGTATGGGGCTTCGGCACCGTCTTCGAGCAGCCCATGACGCGCGGGGCCGTGGCGGAGGCGGTGTCGTCGCTCCTGCTCCTCGCCGGCGGCGACCAAGGCATGGCCCGGATGCAGGAGATGCGGGACATGGCGGCCAACGCGTTCATGCTGCCCGACGGCGGCAGCAGGAGGAACCTGGATAAGCTTCTTAAGATAGTCTGTCCACCATCATCATCATCAGAAGAAGAAGATGATCATGTCGACGAAGCGGAAGCAGAGATGACGAGATGCACACCACCGACGACACATGAACATGATCTGCTGCTTGGTGCCAGCAGCCGTGCACGCACCGTGGCCGACTGA。

本发明的目的基因HOVUSG6216800可以通过上述方法获得，也可以直接进行合成。

2、载体的构建

将目的基因HOVUSG6216800转入载体pGEX-6P-1中，得到重组载体。

3、重组菌株的构建

将重组载体转入大肠杆菌Transetta(DE3)中，得到含有目的基因的重组菌株。

4、目的蛋白的表达

1.PCR检测阳性克隆，抽提质粒测序。

2.将测序正确的质粒载体热击转化大肠杆菌transeta(DE3)，抗性CN。

3.随机挑取2个正常大小克隆于5mL含有氨苄西林(Amp)的LB培养基中，37℃摇瓶培养7小时。将4mL活化菌液(浓度为1×10⁶～10⁷cfu/ml)按照1:50比例转接到200mL大瓶LB培养基中，37℃摇床培养，转速200rpm。3～4小时后，在200mL培养基中加入2uL 1M的IPTG诱导剂，于20℃，160rpm条件下诱导过夜。剩余1mL菌液用来保菌。

4.第二天早上收集菌体，装入500mL离心瓶中于4000rpm下离心10min。

5.用50mL Lysis buffer重悬菌体，涡旋混匀，转入50mL离心管中，分别加入50uLPMSF，10uLβ-巯基乙醇，混匀放置冰上。

6.采用高压破碎仪破碎大肠杆菌细胞。

7.取20ul破碎后的样品作为总蛋白样品。再取1mL破碎后的样品于4℃，13000rpm下离心10min，取20uL上清作为上清液样品。在上清液样品中加入等体积载样缓冲液(Loading buffer)，煮沸5min，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。剩余上清暂冻存于-20℃冰箱。剩余破碎后未离心样品冻存于-80℃冰箱。

8.SDS-PAGE电泳完毕，加入考马斯亮蓝染色液，微波炉煮沸1min后染色半小时，加入脱色液脱色。每隔1h换一次脱色液，直至蛋白条带清晰，转至清水中。

9.GST标签融合蛋白纯化。将剩余破碎后未离心的所有样品离心，上清与1mL树脂(Glutathione SepharoseTM 4B，GE公司)在4℃混匀仪上混合3h。混匀后，将混合液穿过层析柱，穿流2次。先用预冷的Lysis buffer冲洗树脂，同时用Bradford assay(考马斯亮蓝法)检测流出液，直至不变蓝色表示杂蛋白冲洗干净。然后，用15mmol/L还原型谷胱甘肽溶液(0.09g溶解于20mL lysis buffer)洗脱目的蛋白，每次加入1mL，层析柱底部用1.5mL的离心管收集，每管约1mL，分别记为E1、E2、E3、E4、E5、E6，直至Bradford Assay检测洗脱液中不含目的蛋白。

10.收集的目的蛋白用SDS-PAGE检测，得到82kDa的条带(图1)，GST标签的分子量为26kDa，剩余目的蛋白的分子量为56kDa，与氨基酸计算的分子量相同，说明本发明制备得到了分子量82kDa、带有GST标签的目的蛋白。

目的蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)为：

MAAVPHVVVITFPFASHAVKLFRLARALAAAAPAATFSFLSTAGSIAQLQEKNQENALEPNLRFVEVPDGLVSPSSGGAGTTPPPNHMARLGLFLAAAEAGGVRVALETARAAAGGARVTCVVGDAFVWMAAEAAAAVGAPWVPVWTGGPSALLAHLQGDALRDDIGDKAASRADDVLTAHPGLGSYRVRDLPDGCVFGDMHLPIVALFRRVADQLHVPGAATAVALNTFPGLLPDDVTAALAAELPQVLPIGPFHLLPVPGDDNDVADPHGCLAWLDGHAARAVAYASFGTVVTAVVGGQEELRELAAGLEASGAPFLWSLPKEYWPLLPTGFLDLDRAKVVPWAPQAAVLRHASAGAFVTHAGWASVLEGVAGGVPMACRPFFSDQRMNARMVAHVWGFGTVFEQPMTRGAVAEAVSSLLLLAGGDQGMARMQEMRDMAANAFMLPDGGSRRNLDKLLKIVCPPSSSSEEEDDHVDEAEAEMTRCTPPTTHEHDLLLGASSRARTVAD。

实施例2转基因烟草的构建

①用含有目的基因的瞬时表达载体(瞬时表达载体pEAQ，来自John InnesCentre)转化农杆菌(EHA105)；

②挑取阳性农杆菌克隆于500ul含有相应抗生素(kn)的LB中，培养20-24小时；

③转接200ul于5ml含有相应抗生素(kn)的LB培养基中，28℃摇床培养(220rpm)至OD值＝2.0左右。

④10000rpm常温离心2min后收集菌体，用提前配制的转化缓冲液进行菌体的重悬，摇床震荡3h；转化缓冲液成分以及浓度如下：10mM MES(pH5.7)，10mM MgCl₂，100μUDP-葡萄糖。

⑤将1ml的注射器去掉针头，选取出口光滑的注射器吸入菌液，取1月龄的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)，用手按住叶片，从叶片反面注射菌液，使农杆菌渗透进去。

⑥将注射农杆菌后的本氏烟草在黑暗处培养24小时，然后移至烟草培养箱中光照培养24-48小时，即得转基因烟草。

以下通过试验例的方式来说明本发明的有益效果。

试验例1目的蛋白的酶活检测

1.实验方法

1.1目的蛋白的获取

按照实施例1的方法制备得到目的蛋白。

1.2酶活检测

在100μlL Tris-HCl缓冲液(100mM，pH 7.4)中加入矢车菊素(作为糖基受体)使其终浓度为200μM，加入UDP-葡萄糖(作为糖基供体)使其终浓度为100μM，然后加入500ng目的蛋白进行反应，孵育10min后，加入300μL冰甲醇停止反应。将反应混合物通过0.2μm的过滤器(微孔)过滤后用液相色谱质谱质谱联用仪(LC-MS)分析。

2.实验结果

分析结果显示反应后生成的物质是矢车菊素3-O-葡萄糖苷(图2)。说明本发明目的蛋白能够将矢车菊素糖基化，转换为矢车菊素3-O-葡萄糖苷。

试验例2转基因烟草生产矢车菊素3-O-葡萄糖苷

1.实验方法

1.1转基因烟草的构建

按照实施例2的方法构建转基因烟草。

1.2产物收集和纯化

剪取转基因烟草农杆菌渗透区域的叶片，放在已称重的装有钢珠的EP管中，做好标记，迅速放置液氮中，进行冻干。取冻干后的样本，利用研磨仪在30Hz条件下研磨60s，将研磨好的样本粉末装入2ml EP管内。用电子天平称取每个EP管的重量并记录；将已研磨好的样本取适量(范围30-60mg)于EP管中，称量并记录，算出所有EP管中样本的净重。已知每份样本的净重，按体积V＝样本净重(mg)*12μL/mg在4℃冰上加入70％MeOH溶液。混匀，涡旋15s，每隔半小时涡旋一次，共涡旋4次，放4℃冰箱内提取12h以上，然后离心。离心时，先将离心机开机预冷到4℃，设置时间10min和转速12000rpm，将样本涡旋后放入离心。离心后吸取上清液。将上清液用微孔滤膜(0.22μm)过滤，装入上样瓶中，进行LC-MS检测。

1.3目的产物检测

将装有待测提取液的进样瓶放入自动进样器内的样品盘，并记录每个进样瓶编号所对应的进样孔位置。同时打开软件Analyst Software，双击Hardware Configuration，选择LCMS-V(有切换阀模式)，点击Activate Profile，并选择Acquire Mode模式，点击Acquire，点击图上方的Equilibrate键，一般设定时间为3min，此操作目的是预热仪器，使高压输液泵、色谱柱、柱温箱、离子源温度等达到方法中设置的条件。待各仪器部件状态Ready后，功能区Start Sample键成为可点击状态，此时表明仪器正常，分析条件正常，然后点击Start Sample开始跑样，首次跑样前先提交4针空白样。

2.实验结果

质谱图中矢车菊素3-O-葡萄糖苷的峰度值为2.0E+06(图3)，表明转基因烟草中目的蛋白的活性高。

上述实验结果说明，本发明将目的基因HOVUSG6216800转移到烟草中，使得烟草植株可以表达矢车菊素糖基转移酶，并诱导烟草积累矢车菊素3-O-葡萄糖苷，提高了烟草的应用价值，同时为高产矢车菊素3-O-葡萄糖苷的青稞的品种制备提供依据。

综上，本发明首次发现了青稞中的一种新的基因：青稞矢车菊素糖基转移酶基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，该基因表达的蛋白——青稞矢车菊素糖基转移酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)可以将矢车菊素转化为矢车菊素3-O葡萄糖苷，提高青稞的保健价值。本发明以该基因片段进行体外表达，获得了青稞矢车菊素糖基转移酶，在体外反应中将葡萄糖作为糖基供体，矢车菊素作为受体，成功地制备得到了矢车菊素3-O葡萄糖苷。本发明将该基因转移到烟草中，使得烟草植株中表达矢车菊素糖基转移酶，进一步产生矢车菊素3-O葡萄糖苷，提高了烟草植株的价值。本发明提供的新的基因，及其重组载体、重组菌、转基因植物均具有良好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 西藏自治区农牧科学院农业研究所

西藏自治区农牧科学院农业资源与环境研究所

<120> 一种青稞矢车菊素糖基转移酶基因及其用途

<130> GY462-2021P0114334CC

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1533

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggccgcgg tgccgcacgt cgtggtgatc accttcccct tcgcctccca cgcggtgaag 60

ctgttccgcc tggcgcgcgc cctggccgcg gcggcgccgg cagccacctt ctccttcctc 120

tccaccgccg gctccatcgc gcagctgcag gagaagaacc aggagaatgc cctcgagccc 180

aacctacgct tcgtggaggt cccggacggg ctggtgtcgc cgagctcggg tggcgccggg 240

acgacgccgc cgcccaacca tatggcacgt ctcgggctct tcttggccgc cgctgaggcc 300

ggcggggtga gggtggccct ggagacggct cgcgccgccg cgggcggcgc cagggtcacc 360

tgcgtcgtcg gcgacgcgtt cgtctggatg gccgctgagg cggccgccgc ggtcggggcg 420

ccgtgggttc ccgtctggac cggcggcccc agcgcgctcc ttgcgcacct ccaaggcgac 480

gcgctgcgcg acgacatcgg cgacaaagcg gcgagccgag cggacgatgt gctgacggcg 540

cacccgggcc taggaagcta ccgcgtccgg gacctccccg acggctgcgt cttcggcgac 600

atgcacctgc ccatcgtcgc cctcttccgc cgcgtcgccg accagctgca cgttcccggc 660

gcggccaccg ccgtcgccct caacaccttc ccgggcctcc tccccgacga cgtcaccgcc 720

gccctcgccg ccgagctccc gcaggtcctc cccatcggcc ccttccacct tctcccggtc 780

cccggcgacg acaacgacgt ggccgacccg cacggatgcc tcgcctggct cgacggccac 840

gcggcccgcg ccgtcgcgta cgccagcttc ggcacggtgg tcaccgccgt ggtgggcggg 900

caggaggagc tgcgcgagct cgcggccggg ctggaggcct ccggcgcgcc gttcctctgg 960

tcgctgccca aggagtactg gccgctgctc ccgacggggt tcctcgacct cgaccgcgcc 1020

aaggtggtgc cgtgggcgcc gcaggccgcc gtgctgcggc acgcgtcggc gggcgccttc 1080

gtgacgcacg cggggtgggc ctccgtgctg gagggcgtgg ccggcggggt gcccatggct 1140

tgccgtccct tcttcagcga ccagaggatg aacgcgcgga tggtggcgca cgtatggggc 1200

ttcggcaccg tcttcgagca gcccatgacg cgcggggccg tggcggaggc ggtgtcgtcg 1260

ctcctgctcc tcgccggcgg cgaccaaggc atggcccgga tgcaggagat gcgggacatg 1320

gcggccaacg cgttcatgct gcccgacggc ggcagcagga ggaacctgga taagcttctt 1380

aagatagtct gtccaccatc atcatcatca gaagaagaag atgatcatgt cgacgaagcg 1440

gaagcagaga tgacgagatg cacaccaccg acgacacatg aacatgatct gctgcttggt 1500

gccagcagcc gtgcacgcac cgtggccgac tga 1533

<210> 2

<211> 510

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Ala Val Pro His Val Val Val Ile Thr Phe Pro Phe Ala Ser

1 5 10 15

His Ala Val Lys Leu Phe Arg Leu Ala Arg Ala Leu Ala Ala Ala Ala

20 25 30

Pro Ala Ala Thr Phe Ser Phe Leu Ser Thr Ala Gly Ser Ile Ala Gln

35 40 45

Leu Gln Glu Lys Asn Gln Glu Asn Ala Leu Glu Pro Asn Leu Arg Phe

50 55 60

Val Glu Val Pro Asp Gly Leu Val Ser Pro Ser Ser Gly Gly Ala Gly

65 70 75 80

Thr Thr Pro Pro Pro Asn His Met Ala Arg Leu Gly Leu Phe Leu Ala

85 90 95

Ala Ala Glu Ala Gly Gly Val Arg Val Ala Leu Glu Thr Ala Arg Ala

100 105 110

Ala Ala Gly Gly Ala Arg Val Thr Cys Val Val Gly Asp Ala Phe Val

115 120 125

Trp Met Ala Ala Glu Ala Ala Ala Ala Val Gly Ala Pro Trp Val Pro

130 135 140

Val Trp Thr Gly Gly Pro Ser Ala Leu Leu Ala His Leu Gln Gly Asp

145 150 155 160

Ala Leu Arg Asp Asp Ile Gly Asp Lys Ala Ala Ser Arg Ala Asp Asp

165 170 175

Val Leu Thr Ala His Pro Gly Leu Gly Ser Tyr Arg Val Arg Asp Leu

180 185 190

Pro Asp Gly Cys Val Phe Gly Asp Met His Leu Pro Ile Val Ala Leu

195 200 205

Phe Arg Arg Val Ala Asp Gln Leu His Val Pro Gly Ala Ala Thr Ala

210 215 220

Val Ala Leu Asn Thr Phe Pro Gly Leu Leu Pro Asp Asp Val Thr Ala

225 230 235 240

Ala Leu Ala Ala Glu Leu Pro Gln Val Leu Pro Ile Gly Pro Phe His

245 250 255

Leu Leu Pro Val Pro Gly Asp Asp Asn Asp Val Ala Asp Pro His Gly

260 265 270

Cys Leu Ala Trp Leu Asp Gly His Ala Ala Arg Ala Val Ala Tyr Ala

275 280 285

Ser Phe Gly Thr Val Val Thr Ala Val Val Gly Gly Gln Glu Glu Leu

290 295 300

Arg Glu Leu Ala Ala Gly Leu Glu Ala Ser Gly Ala Pro Phe Leu Trp

305 310 315 320

Ser Leu Pro Lys Glu Tyr Trp Pro Leu Leu Pro Thr Gly Phe Leu Asp

325 330 335

Leu Asp Arg Ala Lys Val Val Pro Trp Ala Pro Gln Ala Ala Val Leu

340 345 350

Arg His Ala Ser Ala Gly Ala Phe Val Thr His Ala Gly Trp Ala Ser

355 360 365

Val Leu Glu Gly Val Ala Gly Gly Val Pro Met Ala Cys Arg Pro Phe

370 375 380

Phe Ser Asp Gln Arg Met Asn Ala Arg Met Val Ala His Val Trp Gly

385 390 395 400

Phe Gly Thr Val Phe Glu Gln Pro Met Thr Arg Gly Ala Val Ala Glu

405 410 415

Ala Val Ser Ser Leu Leu Leu Leu Ala Gly Gly Asp Gln Gly Met Ala

420 425 430

Arg Met Gln Glu Met Arg Asp Met Ala Ala Asn Ala Phe Met Leu Pro

435 440 445

Asp Gly Gly Ser Arg Arg Asn Leu Asp Lys Leu Leu Lys Ile Val Cys

450 455 460

Pro Pro Ser Ser Ser Ser Glu Glu Glu Asp Asp His Val Asp Glu Ala

465 470 475 480

Glu Ala Glu Met Thr Arg Cys Thr Pro Pro Thr Thr His Glu His Asp

485 490 495

Leu Leu Leu Gly Ala Ser Ser Arg Ala Arg Thr Val Ala Asp

500 505 510

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atagtctgtc caccatcatc at 22

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tctcgtcatc tctgcttcc 19

Claims

1.一种生产矢车菊素3-O葡萄糖苷的转基因植物的构建方法，其特征在于，它是将SEQID NO.1所述基因转入植物中，获得表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示蛋白的植物，所述植物为烟草或青稞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转入植物的方法是农杆菌法、基因枪法、电转法、PEG介导法、脂质体法、磷酸钙-DNA共沉淀法中的一种。

3. 一种基因在制备生产矢车菊素3-O葡萄糖苷转基因植物中的用途，其特征在于，基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述植物为烟草或青稞。