CN109097377B

CN109097377B - 一种五碳糖糖基转移酶及其用途

Info

Publication number: CN109097377B
Application number: CN201811015270.4A
Authority: CN
Inventors: 徐齐君; 原红军; 王玉林; 曾兴权; 韦泽秀; 扎桑; 顿珠加布; 于明寨; 杨春葆; 尼玛扎西
Original assignee: Institute Of Agriculture Tibet Autonomous Region Academy Of Agriculture And Animal Husbandry; Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Tibet Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences
Current assignee: Institute Of Agriculture Tibet Autonomous Region Academy Of Agriculture And Animal Husbandry; Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Tibet Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2018-08-31
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2038-08-31
Also published as: CN109097377A

Abstract

本发明提供了一种五碳糖糖基转移酶基因HVUL1H37998，本发明还提供了包含该基因的重组载体、重组菌的制备方法，本发明还提供了五碳糖糖基转移酶及其制备方法。本发明五碳糖糖基转移酶可以合成中药单体根皮素8‑阿拉伯糖苷，应用前景优良。

Description

一种五碳糖糖基转移酶及其用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种五碳糖糖基转移酶的基因的应用。

背景技术

根皮素是一类具有抗氧化、抗自由基、抗炎、免疫抑制活性的黄酮类物质，五碳糖基化的根皮素是根皮素的一种稳定形式。

青稞是禾本科大麦属的一种禾谷类作物，因其内外颖壳分离，籽粒裸露，故又称裸大麦、元麦、米大麦。主要产自中国西藏、青海、四川、云南等地，是藏族人民的主要粮食。

青稞还具有一定的药用价值，现有技术尚未公开其中的五碳糖基化黄酮的存在。

发明内容

为了更好地利用和提升青稞的药用价值，本发明提供了一种利用UDP戊糖苷催化形成C戊烯化的黄酮类化合物的酶。

本发明提供了一种基因(根皮素8-阿拉伯糖苷酰基转移酶基因HVUL1H37998)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了一种重组载体，它包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

前述的重组载体，所述重组载体是重组pGEX-6P-1(Novagen)。

前述的重组菌，它包含前述的重组载体。

前述的重组菌，所述重组菌为Transetta(DE3)。

本发明还提供了一种蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

前述蛋白的方法，它是采用前述重组菌发酵制备。

前述蛋白的方法，步骤如下：

(1)取前述重组菌，活化，得菌液；

(2)将菌液接种到LB培养基中培养，3～4h后，加入IPTG诱导剂诱导培养，收集菌体；

(3)破菌，离心，取上清，纯化，即可。

步骤(1)中，所述菌液的浓度为1×10⁶～10⁷cfu/ml；优选地，所述活化是采用含有Amp的LB培养基培养培养，培养时间是6-10小时，培养温度为37℃；

和/或，步骤(2)中，所述菌液的接种比例为1:50；所述培养的温度是37℃，转速为200rpm；所述IPTG的浓度为1mol/L，加入量为培养液的1/100000；诱导培养的温度是20℃，转速为160rpm；

和/或，步骤(3)中，所述分离纯化的方法为GST标签融合蛋白纯化方法；优选地，所述纯化方法为：取上清，上树脂柱，穿流2次；采用Lysis buffer冲洗树脂去除杂蛋白；用15mmol/L还原型谷胱甘肽溶液洗脱，得蛋白；进一步优选地，所述树脂是GlutathioneSepharoseTM 4B树脂；所述还原型谷胱甘肽溶液是还原型谷胱甘肽溶于Lysis buffer得到的溶液。

前述的基因片段、重组载体、重组菌、蛋白在制备根皮素8-阿拉伯糖苷方面的用途。

本发明还提供了一种制备根皮素8-阿拉伯糖苷的方法，它是采用前述的基因片段、重组载体、重组菌、蛋白，以UDP戊糖苷作为糖供体，根皮素作为糖受体，制备根皮素8-阿拉伯糖苷。

本发明还提供了前述的基因片段、重组载体、重组菌在制备高产根皮素8-阿拉伯糖苷青稞品种的用途。

本发明发现了青稞中的一种新的基因：青稞五碳糖糖基转移酶基因，该基因表达的蛋白——青稞五碳糖糖基转移酶，可以将根皮素和UDP戊糖苷转化为根皮素-8阿拉伯糖苷，提高青稞的保健价值；本发明还以该基因片段进行体外表达，获得了青稞五碳糖糖基转移酶，在体外反应中，成功地将UDP戊糖苷作为糖供体，根皮素作为糖受体，生成根皮素8-阿拉伯糖苷。本发明提供的新的基因，及其重组载体、重组菌、转基因植物均具有良好的应用前景。

本发明可以避开药用植物提取途径，来实现根皮素8-阿拉伯糖苷的合成，具有较好的可持续性。

本发明的基因片段和重组载体，可以用来提高青稞对根皮素8-阿拉伯糖苷的合成，实现青稞的定向改良。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为HVUL1H37998蛋白的SDS-PAGE电泳图，Marker：130，100,70,55,40KDa。

图2A为体外催化反应的LC-MS检测的色谱图：Phloretin，根皮素；Phloretin-C-arabinose，根皮素8-阿拉伯糖苷。

图2B为体外催化反应的LC-MS检测的质谱图：Phloretin-C-arabinose，根皮素8-阿拉伯糖苷。

具体实施方式

实施例本发明HVUL1H37998基因的分离及其表达

本实施例主要是HVUL1H37998基因获得、载体构建及表达的方法。

(1)基因片段和载体的构建

称取1克青稞新鲜叶片，提取青稞RNA，用Thermo Fisher公司的M-MLV ReverseTranscriptase合成cDNA，设计引物，如下：

F：CGCGGATCCATGCAGCACCAGACACTCGCC

R：ATAAGAATGCGGCCGCAGCTGAGCGTGGCAAGGAACTC

进行PCR扩增，得到目的条带大小的片段(结果如图1所示)。PCR产物用胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit D2500-02，OMEGA)纯化。

扩增得到的目的片段HVUL1H37998基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)为：

ATGCAGCACCAGACACTCGCCAGCTCTCTCGCACTCCTCACAAACCAAGCTAACTCGTCAATGGCTCCCGTAGCGAAGCAGGGCGGAGGCGCACCGCACCTCGTCTTCATCCCGAGCGCCGGCATGGGCCACCTGCTCCCCTTCTCCCGCTTCATCGGCGCCCTCGCCAGCGAGGGCGTCTTCGACATCTCCGTCGTCACCGCCCTCCCGACGGTCTCGGAGGCCGAGGCCGAGCAGTTGGCCGCCCTCTTCGCCTCCTTCCCCGCCATCCGGCGCATCGACTTCAACCTCCTGCCGCTCGACGACGCCACCCTTGCCGGCACGGACCCCTTCTTCCTGCGCTGGGAGTCCCTGCGCCGCTCCGCTCATCTCCTCGGGCCGCTCATCGCCGGCGCCACGCCACGCGCGTCGGCCATCGTCACCGACGTCACTCTCGCTTCCCAGGTCATCCCCATAGCCAAGGACGAGCTGCAGCTCCCGTGCCACATCCTCTTCATCTCCTGCGCGACCATGCTGTCATTCCTCGCCTACTTCCCCACCTACCTCGACGAAACCAACACAGACCACCTCGCTGGTGACGTCCACGTCCCAGCCATTGGACACATCCCCGTGGATTACCCCCCGCAGGTGCTGCGCAACCCCGACAGCCTCTTCACCAAGCAGTTCATCGCCAACGGCCGCGAGATCACCGAGGCAGACGGCATTCTCGTCAACACGTTCCACGCCTTGGAGCCAGAGGCACTCACCGCCCTGCGTGACGGCAAGGTCGTCCCCGGATTCCCTCCGGTGTTCGCAGTCGGCCCGCTCAAGTCGACGACCACAGGTAAGGAGGAGGCGGCCTCTGCACCTATTGCCTGGCTCGGAGAGCAGCCGGCGCGGTCGGTGGTGTACGTGGCCTTCGGCAACCGCAACGCGGCGGCGCTGGACCAGATCCGCGAGATCGGCGCCGGGCTGGAGGCGAGCGGCTGCCGGTTCCTGTGGGTGGTGAAGACGACGGTGGTGGACCGCGATGACACCGCGGAGCTGAACGACGTGCTAGGCGACGGGTTCCTGGCGCGTGTGCATGGGCGCGGCCTGGTGACCAAGGAGTGGGTGGACCAGGAGGCGGTCCTCAAGCACCCGGCCGTGGGTCTGTACCTGAGCCACTGCGGGTGGAACTCGGTGACGGAGTCGGCCGCGTACGGCGTGCCGATGCTGGCATGGCCGACGCTGGGCGACCAGCGCCTGATCTCCACGGTGATAAGGAGCGGCGGCTTCGGTCTGTGGGTGGAGCACTGGAGCTGGGACGGCGGGGAGGACTCGCTGGTCCGCGGCGCGGAGATAGCGGAGAAGGTGAAGGAGGTGATGGGCGACGAGGCGATCTCGGCGAAGGCCAAGGAAATCAGCCAGGCGGCGGCCAAGGCCGTCGCCGAAGGCGGGTCCAGCTACCGGAGCATGCAGGAGTTCCTTGCCACGCTCAGCTGA

前述核苷酸序列所述的HVUL1H37998基因可以通过采用上述方法获得，也可以直接合成。

得到的基因片段转入载体pGEX-6P-1中，后重组载体转入Transetta(DE3)菌株中，得到含有目的片段的重组菌株。

(2)基因的表达

1.PCR检测阳性克隆，抽提质粒测序。

2.将测序正确的质粒载体热击转化大肠杆菌transeta(DE3)，抗性CN。

3.早上9点左右随机挑取2个正常大小克隆于5mL含有Amp的LB培养基中，37℃摇至下午4点左右。选其中一个，将4mL活化菌液按照1:50比例转接到200mL大瓶LB中，大摇床37℃培养，转速200rpm。3～4小时后，200mL培养基中加入2uL 1M IPTG诱导剂。20℃，160rpm条件下诱导过夜。剩余1mL菌液用来保菌。

4.第二天早上8点收集菌体。500mL离心瓶，4000rpm离心10min即可。

5.50mL Lysis buffer重悬菌体，涡旋混匀，转入50mL离心管中，分别加入50uLPMSF,10uLβ-巯基乙醇，混匀放置冰上。

6.采用高压破碎仪进行大肠杆菌细胞破碎实验。

7.破碎完成后样品，取20ul作为总蛋白样品。再取1mL样品4℃，13000rpm离心10min，取20uL上清作为上清液样品。加入等体积2*Loading buffer，煮沸5min,SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。剩余上清可暂冻存于-20℃冰箱。剩余未离心样品可冻存于-80℃冰箱。

8.SDS-PAGE电泳完毕，加入考马斯亮蓝染色液，微波炉煮沸1min后染色半小时，加入脱色液脱色。每隔1h换一次脱色液，直至蛋白条带清晰，转至清水中。

9.GST标签融合蛋白纯化。将破碎未离心的所有样品离心，上清与1mL树脂在4℃混匀仪上混合3h。混匀结束后，将混合液穿过层析柱，穿流2次效果更佳。先用预冷的Lysisbuffer冲洗树脂(Glutathione SepharoseTM 4B，GE公司)，同时流出液用Bradford Assay检测，直至不变蓝色表示杂蛋白冲洗干净。然后，用15mmol/L还原型谷胱甘肽溶液(0.09g溶解于20mL lysis buffer)洗脱目的蛋白，每次加入1mL,层析柱底部用1.5mL的离心管收集，每管约1mL，分别记为E1、E2、E3、E4、E5、E6，直至Bradford Assay检测洗脱液中不含蛋白。未用完的还原型谷胱甘肽溶液继续全部洗脱树脂，然后分别用Lysis buffer，ddH2O 20％乙醇冲洗，保存于20％乙醇中。

10.收集的蛋白用SDS-PAGE检测，得到77kDa的条带(图1)，GST标签的分子量为26kDa，剩余目的蛋白的分子量为51kDa，与氨基酸计算的分子量相同，说明本发明制备得到了带有GST标签的目的蛋白。

目的蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)如下：

MQHQTLASSLALLTNQANSSMAPVAKQGGGAPHLVFIPSAGMGHLLPFSRFIGALASEGVFDISVVTALPTVSEAEAEQLAALFASFPAIRRIDFNLLPLDDATLAGTDPFFLRWESLRRSAHLLGPLIAGATPRASAIVTDVTLASQVIPIAKDELQLPCHILFISCATMLSFLAYFPTYLDETNTDHLAGDVHVPAIGHIPVDYPPQVLRNPDSLFTKQFIANGREITEADGILVNTFHALEPEALTALRDGKVVPGFPPVFAVGPLKSTTTGKEEAASAPIAWLGEQPARSVVYVAFGNRNAAALDQIREIGAGLEASGCRFLWVVKTTVVDRDDTAELNDVLGDGFLARVHGRGLVTKEWVDQEAVLKHPAVGLYLSHCGWNSVTESAAYGVPMLAWPTLGDQRLISTVIRSGGFGLWVEHWSWDGGEDSLVRGAEIAEKVKEVMGDEAISAKAKEISQAAAKAVAEGGSSYRSMQEFLATLS

试验例HVUL1H37998蛋白体外催化产生根皮素8-阿拉伯糖苷

1.方法

1.1HVUL1H37998蛋白的获取

按照实施例1方法制备得到的分子量77kDa的、带有GST标签的目的蛋白。

1.2酶活检测

在Tris-HCl缓冲液(100mM，pH 7.4)中，以含有1.5m M UDP戊糖苷作为糖供体、200μM根皮素作为糖受体、5mM MgCl2和纯化蛋白500ng的三氯化氢缓冲液(100mM，pH 7.4)在37℃下孵育15分钟。后加入300μL冰冷甲醇，停止反应。然后将反应混合物通过0.2μm的过滤器(微孔)过滤，然后用于LC-MS分析。

2.结果

经过上述催化反应后，显示生成了根皮素8-阿拉伯糖苷(图2)，说明本发明HVUL1H37998蛋白具有体外催化根皮素和UDP戊糖苷、产生根皮素8-阿拉伯糖苷的能力，应用前景良好。

序列表

<110> 西藏自治区农牧科学院农业研究所

西藏自治区农牧科学院

<120> 一种五碳糖糖基转移酶及其用途

<130> GY462-18P1457

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1464

<212> DNA

<213> Hordeum vulgare

<400> 1

atgcagcacc agacactcgc cagctctctc gcactcctca caaaccaagc taactcgtca 60

atggctcccg tagcgaagca gggcggaggc gcaccgcacc tcgtcttcat cccgagcgcc 120

ggcatgggcc acctgctccc cttctcccgc ttcatcggcg ccctcgccag cgagggcgtc 180

ttcgacatct ccgtcgtcac cgccctcccg acggtctcgg aggccgaggc cgagcagttg 240

gccgccctct tcgcctcctt ccccgccatc cggcgcatcg acttcaacct cctgccgctc 300

gacgacgcca cccttgccgg cacggacccc ttcttcctgc gctgggagtc cctgcgccgc 360

tccgctcatc tcctcgggcc gctcatcgcc ggcgccacgc cacgcgcgtc ggccatcgtc 420

accgacgtca ctctcgcttc ccaggtcatc cccatagcca aggacgagct gcagctcccg 480

tgccacatcc tcttcatctc ctgcgcgacc atgctgtcat tcctcgccta cttccccacc 540

tacctcgacg aaaccaacac agaccacctc gctggtgacg tccacgtccc agccattgga 600

cacatccccg tggattaccc cccgcaggtg ctgcgcaacc ccgacagcct cttcaccaag 660

cagttcatcg ccaacggccg cgagatcacc gaggcagacg gcattctcgt caacacgttc 720

cacgccttgg agccagaggc actcaccgcc ctgcgtgacg gcaaggtcgt ccccggattc 780

cctccggtgt tcgcagtcgg cccgctcaag tcgacgacca caggtaagga ggaggcggcc 840

tctgcaccta ttgcctggct cggagagcag ccggcgcggt cggtggtgta cgtggccttc 900

ggcaaccgca acgcggcggc gctggaccag atccgcgaga tcggcgccgg gctggaggcg 960

agcggctgcc ggttcctgtg ggtggtgaag acgacggtgg tggaccgcga tgacaccgcg 1020

gagctgaacg acgtgctagg cgacgggttc ctggcgcgtg tgcatgggcg cggcctggtg 1080

accaaggagt gggtggacca ggaggcggtc ctcaagcacc cggccgtggg tctgtacctg 1140

agccactgcg ggtggaactc ggtgacggag tcggccgcgt acggcgtgcc gatgctggca 1200

tggccgacgc tgggcgacca gcgcctgatc tccacggtga taaggagcgg cggcttcggt 1260

ctgtgggtgg agcactggag ctgggacggc ggggaggact cgctggtccg cggcgcggag 1320

atagcggaga aggtgaagga ggtgatgggc gacgaggcga tctcggcgaa ggccaaggaa 1380

atcagccagg cggcggccaa ggccgtcgcc gaaggcgggt ccagctaccg gagcatgcag 1440

gagttccttg ccacgctcag ctga 1464

<210> 2

<211> 487

<212> PRT

<213> Hordeum vulgare

<400> 2

Met Gln His Gln Thr Leu Ala Ser Ser Leu Ala Leu Leu Thr Asn Gln

1 5 10 15

Ala Asn Ser Ser Met Ala Pro Val Ala Lys Gln Gly Gly Gly Ala Pro

20 25 30

His Leu Val Phe Ile Pro Ser Ala Gly Met Gly His Leu Leu Pro Phe

35 40 45

Ser Arg Phe Ile Gly Ala Leu Ala Ser Glu Gly Val Phe Asp Ile Ser

50 55 60

Val Val Thr Ala Leu Pro Thr Val Ser Glu Ala Glu Ala Glu Gln Leu

65 70 75 80

Ala Ala Leu Phe Ala Ser Phe Pro Ala Ile Arg Arg Ile Asp Phe Asn

85 90 95

Leu Leu Pro Leu Asp Asp Ala Thr Leu Ala Gly Thr Asp Pro Phe Phe

100 105 110

Leu Arg Trp Glu Ser Leu Arg Arg Ser Ala His Leu Leu Gly Pro Leu

115 120 125

Ile Ala Gly Ala Thr Pro Arg Ala Ser Ala Ile Val Thr Asp Val Thr

130 135 140

Leu Ala Ser Gln Val Ile Pro Ile Ala Lys Asp Glu Leu Gln Leu Pro

145 150 155 160

Cys His Ile Leu Phe Ile Ser Cys Ala Thr Met Leu Ser Phe Leu Ala

165 170 175

Tyr Phe Pro Thr Tyr Leu Asp Glu Thr Asn Thr Asp His Leu Ala Gly

180 185 190

Asp Val His Val Pro Ala Ile Gly His Ile Pro Val Asp Tyr Pro Pro

195 200 205

Gln Val Leu Arg Asn Pro Asp Ser Leu Phe Thr Lys Gln Phe Ile Ala

210 215 220

Asn Gly Arg Glu Ile Thr Glu Ala Asp Gly Ile Leu Val Asn Thr Phe

225 230 235 240

His Ala Leu Glu Pro Glu Ala Leu Thr Ala Leu Arg Asp Gly Lys Val

245 250 255

Val Pro Gly Phe Pro Pro Val Phe Ala Val Gly Pro Leu Lys Ser Thr

260 265 270

Thr Thr Gly Lys Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Ile Ala Trp Leu Gly

275 280 285

Glu Gln Pro Ala Arg Ser Val Val Tyr Val Ala Phe Gly Asn Arg Asn

290 295 300

Ala Ala Ala Leu Asp Gln Ile Arg Glu Ile Gly Ala Gly Leu Glu Ala

305 310 315 320

Ser Gly Cys Arg Phe Leu Trp Val Val Lys Thr Thr Val Val Asp Arg

325 330 335

Asp Asp Thr Ala Glu Leu Asn Asp Val Leu Gly Asp Gly Phe Leu Ala

340 345 350

Arg Val His Gly Arg Gly Leu Val Thr Lys Glu Trp Val Asp Gln Glu

355 360 365

Ala Val Leu Lys His Pro Ala Val Gly Leu Tyr Leu Ser His Cys Gly

370 375 380

Trp Asn Ser Val Thr Glu Ser Ala Ala Tyr Gly Val Pro Met Leu Ala

385 390 395 400

Trp Pro Thr Leu Gly Asp Gln Arg Leu Ile Ser Thr Val Ile Arg Ser

405 410 415

Gly Gly Phe Gly Leu Trp Val Glu His Trp Ser Trp Asp Gly Gly Glu

420 425 430

Asp Ser Leu Val Arg Gly Ala Glu Ile Ala Glu Lys Val Lys Glu Val

435 440 445

Met Gly Asp Glu Ala Ile Ser Ala Lys Ala Lys Glu Ile Ser Gln Ala

450 455 460

Ala Ala Lys Ala Val Ala Glu Gly Gly Ser Ser Tyr Arg Ser Met Gln

465 470 475 480

Glu Phe Leu Ala Thr Leu Ser

485

Claims

1.一种基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组载体，其特征在于：它包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是重组pGEX-6P-1。

4.一种重组菌，其特征在于：它包含权利要求2所述的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为Transetta (DE3)。

6.一种蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

7.一种制备权利要求6所述蛋白的方法，其特征在于：它是采用权利要求4或5所述重组菌发酵制备。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤如下：

（1）取权利要求4或5所述重组菌，活化，得菌液；

（2）将菌液接种到LB培养基中培养，3~4h后，加入IPTG诱导剂诱导培养，收集菌体；

（3）破菌，离心，取上清，纯化，即可。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于：步骤（1）中，所述菌液的浓度为1×10⁶~10⁷cfu/ml。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述活化是采用含有Amp的LB培养基培养，培养时间是6-10小时，培养温度为37℃。

11.根据权利要求8所述方法，其特征在于：步骤（2）中，所述菌液的接种比例为1:50；所述培养的温度是37℃，转速为200rpm；所述IPTG的浓度为1mol/L，加入量为培养液的1/100000；诱导培养的温度是20℃，转速为160rpm。

12.根据权利要求8所述方法，其特征在于：步骤（3）中，所述纯化的方法为GST标签融合蛋白纯化方法。

13.根据权利要求12所述方法，其特征在于：所述纯化方法为：取上清，上树脂柱，穿流2次；采用Lysis buffer冲洗树脂去除杂蛋白；用15mmol/L还原型谷胱甘肽溶液洗脱，得蛋白。

14.根据权利要求13所述方法，其特征在于：所述树脂是Glutathione SepharoseTM 4B树脂；所述还原型谷胱甘肽溶液是还原型谷胱甘肽溶于Lysis buffer得到的溶液。

15.权利要求1~5任一所述的基因片段、重组载体、重组菌在制备高产根皮素8-阿拉伯糖苷青稞品种的用途。