CN103695382A

CN103695382A - 郁金香类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶Tf3GT蛋白及其编码基因

Info

Publication number: CN103695382A
Application number: CN201310689950.5A
Authority: CN
Inventors: 袁媛; 史益敏; 唐东芹; 马晓红; 陶秀花
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2013-12-16
Filing date: 2013-12-16
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2033-12-16
Also published as: CN103695382B

Abstract

本发明公开了一种郁金香类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶Tf3GT蛋白及其编码基因；所述蛋白质为如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶活性的蛋白质。本发明还提供了一种编码上述蛋白质的如SEQ ID NO.1所示的核酸序列。利用本发明的郁金香类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶Tf3GT基因在大肠杆菌细胞中表达，重组的类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶蛋白能促使花色苷与UDP-葡萄糖进行反应，催化生成花色苷。利用本发明的Tf3GT编码序列，在利用转基因技术修饰花色方面具有应用价值。

Description

郁金香类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶Tf3GT蛋白及其编码基因

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种郁金香类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶Tf3GT蛋白及其编码基因。

背景技术

在植物花色形成过程中，UDP-葡萄糖：类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶(UDP-glucose：flavonoid 3-O-glucosyltransferase，UF3GT，EC 2.4.1.91)催化UDP-葡萄糖转移到花青素C环的C3羟基位置(Carolye EL，1996；Masako FM，2003)，使无色不稳定的花青素转化成有色稳定的花色素苷。花色素苷以水溶性形式存在于液泡中，所以UF3GT被认为花青素合成途径中不可或缺的酶，糖基化修饰一方面可以提高花青素的稳定性，另一方面可以影响花青素颜色变化。如红色葡萄果皮中能检测到UF3GT基因的大量表达，而白色葡萄果皮中虽然有UF3GT基因但不表达(Boss P K，1996)。此外，在植物中，糖基转移酶不仅影响植物基本的生理代谢，也在植物的防御和抗逆反应中起重要作用。

编码花色素苷的糖基转移酶基因在许多植物中已经克隆得到，包括龙胆(Gentianatriflora)、矮牵牛(Petunia hybrida)荷兰鸢尾(Iris hollandica)、香雪兰(Freesiahybrida)等。郁金香(Tulipa fosteriana)中类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因的克隆及其表达模式尚不清楚。目前，未有任何与郁金香UF3GT蛋白及其编码基因序列相关的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种郁金香类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶Tf3GT的蛋白及其编码基因。本发明公开了郁金香Tf3GT蛋白及其核苷酸序列在郁金香不同器官、不同发育阶段的表达模式；利用本发明的郁金香Tf3GT基因，在大肠杆菌细胞中表达重组的UF3GT蛋白，该蛋白能促使花色苷与UDP-葡萄糖进行反应，催化生成花色苷；利用本发明的Tf3GT编码序列，在利用转基因技术修饰花色方面具有应用价值；同时，通过各种常规筛选方法，可筛选出与Tf3GT发生相互用的物质、受体、抑制剂或拮抗剂等。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，

第一方面，本发明涉及一种具有郁金香类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶活性的蛋白质，所述蛋白质是由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶活性的由(a)衍生的蛋白质。该蛋白质在花朵花瓣的不同着色阶段、不同器官内的有无及活性大小存在较大差异。

优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1～20个以内氨基酸而得到的序列。

进一步优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中1～10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。

第二方面，本发明涉及一种编码上述蛋白质的核酸序列。

优选的，所述核酸序列具体为：

(a)碱基序列如SEQ ID NO.1第1～1371位所示；

或(b)与SEQ ID NO.1第1～1371位所示的核酸有至少70％的同源性的序列；

或(c)能与SEQ ID NO.1第1～1371位所示的核酸进行杂交的序列。

优选的，所述核酸序列具体为SEQ ID NO.1第1～1371位所示的核酸序列中1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加60个以内核苷酸形成的序列。

第三方面，本发明涉及一种检测上述的核酸序列的探针，所述探针为具有所述核酸序列8～100个连续核苷酸的核酸分子。该探针可用于检测样品中是否存在编码郁金香FLS相关的核酸分子。

第四方面，本发明涉及一种上述的核酸序列在制备重组类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶中的用途。

优选地，所述制备包括如下步骤：构建含所述核酸序列的原核表达载体，将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导培养，得到重组类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶。

第五方面，本发明涉及一种重组类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶，所述重组类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶是通过如下方法制备而得的：构建含上述核酸序列的原核表达载体，将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导培养，即得所述重组类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶。

本发明提供的分离出的DNA分子，该分子包括：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的DNA分子；或者编码具有郁金香Tf3GT蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且与SEQ ID NO.3所示序列有至少70％的同源性；或者能与SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸序列杂交。

在本发明中，“分离的DNA”、“纯化的DNA”是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。

在本发明中，术语“郁金香类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶蛋白编码序列”指编码具有郁金香Tf3GT蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1所示序列中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ IDNO.1所示序列的同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1所示序列中从核苷酸第1～1371位的核苷酸序列的同源性至少70％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的郁金香Tf3GT相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：通常为1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加为60个以内核苷酸。

在本发明中，术语“郁金香类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶Tf3GT蛋白”是指具有郁金香Tf3GT蛋白活性的SEQ ID NO.2所示序列的多肽。该术语还包括具有与天然郁金香Tf3GT相关相同功能的、SEQ ID NO.2所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：通常为1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括郁金香Tf3GT蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的郁金香Tf3GT多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与郁金香Tf3GT相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用郁金香Tf3GT多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“郁金香Tf3GT保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.2所示序列的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys

Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
			Asp(D)	Glu	Glu
Cys(C)	Ser	Ser
			Gln(Q)	Asn	Asn
Glu(E)	Asp	Asp
			Gly(G)	Pro；Ala	Ala
His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
			Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
			Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
			Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

发明还包括郁金香Tf3GT蛋白或多肽的类似物。这些类似物与郁金香Tf3GT相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析郁金香Tf3GT基因产物的表达模式，即分析Tf3GT基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

本发明检测样品中是否存在郁金香Tf3GT相关核苷酸序列的检测方法，包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于郁金香Tf3GT相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15～50个核苷酸。

此外，根据本发明的郁金香Tf3GT核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选郁金香Tf3GT相关同源基因或同源蛋白。

为了得到与郁金香Tf3GT相关基因的点阵，可以用DNA探针筛选郁金香cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用³²P对郁金香Tf3GT相关的全部或部分做放射活性标记而得的。适合于筛选的cDNA文库是来自郁金香的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与郁金香Tf3GT相关的基因家族的核苷酸序列。

本发明的郁金香Tf3GT相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

在获得了有关序列后，可用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)固相多肽合成，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的郁金香Tf3GT蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与郁金香Tf3GT发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。

本发明涉及的大肠杆菌DH5α，BL21菌株已在《萨姆布鲁克J，拉塞尔D W.分子克隆实验指南[M].黄培堂，王嘉玺，朱厚础，等译.第3版.北京：科学出版社，2002》中公开；大肠杆菌DH5α、Pet 28a(+)、BL21(DE3)等可通过公开市售的商业渠道取得。

郁金香为世界十大切花之一，观赏价值极高，应用广泛，人们对新花色的需求也越来越大。本发明具有的有益效果为：首次克隆郁金香花瓣类黄酮合成通路中类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶Tf3GT蛋白及其编码基因，并将本发明中Tf3GT通过构建原核表达载体转化到大肠杆菌中，发现重组的类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶蛋白能促使花色苷元与UDP-葡萄糖进行反应，催化生成对应的花色苷。本发明提供的Tf3GT为利用基因工程修饰花色提供了一种有效的技术手段。此外，利用本发明的郁金香Tf3GT蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与郁金香Tf3GT发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为原核表达载体pET-28a(+)-Tf3GT的构建过程流程图；

图2为本发明的郁金香Tf3GT蛋白体外酶活反应的高效液相检测结果；其中，a：氯化天竺葵苷元(pelargonidin chloride)标准品的液相色谱图；b：使用Tf3GT蛋白进行的体外酶活反应产物；c：阴性对照反应；d：天竺葵3-氯化葡萄糖苷(pelargonidin3-O-glucoside)标准品液相色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、郁金香Tf3GT基因的克隆

1.植物材料的获得

将健康、大小一致的郁金香球茎(Tulipa fosteriana ‘Shangnongzaoxia’，已通过上海市农作物品种审定委员会审定。编号：沪农品认花卉2011第004号)按常规种植并进行田间管理，待花朵完全开放，花瓣完全着色时采集花瓣组织，用于提取RNA。

2.RNA的抽提

利用“RNA prep pure植物总RNA提取试剂盒”抽提总RNA(RNA prep pure PlantKit：天根生化科技(北京)有限公司)。用甲醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计(Thermo Scientific NANODROP 1000 Spectrophotometer)上测定RNA的纯度及浓度。

3.基因的全长克隆

根据其它物种中FLS基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(3’-Full RACE Core Set Ver.2.0：宝生物工程(大连)有限公司，SMARTer^TM RACEcDNA Amplification Kit：Clontech Laboratories，Inc.)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

(1)RT-PCR获得基因中间片段

将提取的RNA进行反转录(Prime Script II lst Strand cDNA Synthesis Kit：宝生物工程(大连)有限公司)，以第一链cDNA为模板，利用兼并引物Tf3GT-F(5’-CYTRTGRCCGTYCTRGCSWTYCC-3’)(序列如SEQ ID NO.3所示)和Tf3GT-R(5’-GMGGAGCRCAWYCMACSACA-3’)(序列如SEQ ID NO.4所示)进行PCR，扩增得中间片段，回收并连接到pMD18-T vector载体上，用RV-M和M13-47作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果通过在NCBI网站进行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对已有的数据库(GenBank)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的荷兰鸢尾(Iris hollandica)类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因的同源性很高，故初步认为它是一个类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因。

(2)3’RACE

3’端的序列通过使用试剂盒3’-Full RACE Core Set Ver.2.0(宝生物工程(大连)有限公司)进行巢式PCR扩增获得。第一轮PCR上游引物为Tf3GT31(5’-TATGAGCGGCAAGGCTGTAAGGTCC-3’)(序列如SEQ ID NO.5所示)，下游引物为试剂盒提供的Outer primer。将第一轮PCR产物稀释50倍，取2μl为模板进行第二轮PCR，上游引物为Tf3GT32(5’-TCCCAGCAAACCAGATAAAAGCGTC-3’)(序列如SEQ ID NO.6所示)，下游引物为试剂盒提供的Inner primer。

将3’RACE得到Tf3GT的3’末端序列回收，连接到pMD18-T vector载体上，以RV-M和M13-47为引物，送上海Invitrogen公司进行测序。测序结果通过在NCBI网站进行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对已有的数据库(GenBank)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的荷兰鸢尾(Iris hollandica)类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因的同源性高。

(3)5’RACE

5’端的序列通过使用SMARTer^TMRACE cDNA Amplification Kit获得，以5’RACEready cDNA为模板，通过PCR获得Tf3GT的5’端序列。上游引物为为试剂盒提供的UPM，下游引物为Tf3GT51(5’-GTGTTCCGATGATTTGCCGACCCTTTC-3’)(序列如SEQ ID NO.7所示)。将5’RACE扩增获得Tf3GT的5’末端序列进行回收、连接、测序。测序结果通过在NCBI网站进行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对已有的数据库(GenBank)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的荷兰鸢尾(Iris hollandica)类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因的同源性高。

将通过上述3种方法获得的序列的测序结果进行拼接，将拼接序列提交BLAST分析，结果证明从郁金香中新得到的Tf3GT基因确为一个与类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶相关的基因。将测序结果结合NCBI的ORF Finding(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf)预测，发现了郁金香Tf3GT基因的起始密码子与终止密码子，根据获得的序列，分别从起始密码子和终止密码子处设计特异性引物ORF-F(5’-ATGGGCTCCACCGGAAACCCCCA-3’)(序列如SEQ ID NO.8所示)，ORF-R(5’-TCAGTATCCACAAATGACCTCCAC-3’)(序列如SEQ ID NO.9所示)，以郁金香cDNA为模板进行PCR，扩增得到1371bp郁金香Tf3GT蛋白的全长编码基因序列(SEQ ID NO.1)。

实施例2、郁金香Tf3GT基因的序列信息与同源性分析

郁金香Tf3GT全长CDS开放读码框序列为1371bp，详细序列见SEQ ID NO.1所示序列；根据CDS开放读码框序列推导出郁金香Tf3GT的氨基酸序列，共456个氨基酸残基，分子量为48492道尔顿，等电点(pI)为6.02，详细序列见SEQ ID NO.2所示序列。

将郁金香Tf3GT的CDS开放读码框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索。表2为本发明的郁金香Tf3GT基因与荷兰鸢尾(Iris hollandica)UF3GT基因mRNA的核苷酸序列的同源比较(GAP)结果；由表2可知，它与荷兰鸢尾(Irishollandica)类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因(GenBank登陆号AB161175.1)在核苷酸水平上具有64％的相似性；表3为本发明的郁金香Tf3GT基因与荷兰鸢尾(Irishollandica)UF3GT基因mRNA的氨基酸序列的同源比较(FASTA)结果，其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出；由表3可知，在氨基酸水平上，它与荷兰鸢尾(Iris hollandica)类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因(GenBank登陆号BAD83701.1)也有68％的一致性和53％的相似性；由表2和表3可知，郁金香Tf3GT基因与荷兰鸢尾类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。

表2

表3

实施例3、郁金香Tf3GT基因在花朵不同发育阶段及在郁金香不同组织中的表达差异性

1.材料的获得

在郁金香花朵的4个不同发育阶段(花蕾，花瓣未着色；花蕾，花瓣开始着色；花朵部分开放，花瓣未完全着色；花朵完全开放，花瓣完全着色)，于田问采取其球茎、地上茎、叶片以及花瓣(各着色阶段花瓣的混合样)，将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用。

2.RNA的提取

利用RNA prep pure植物总RNA提取试剂盒(RNA prep pure Plant Kit：天根生化科技(北京)有限公司)提取郁金香不同发育阶段花朵的花瓣以及不同组织中的RNA。

3.RNA的完整性、纯度、浓度的确定

用普通琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1.2％；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15min)检测完整性；电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示rRNA样品的降解。纯度较好的RNA，A₂₆₀/A₂₈₀以及A₂₆₀/A₂₃₀约为2.0左右；用分光光度计测定OD值并计算RNA含量。

4.cDNA的获得

以500ng的总RNA为模板，按照宝生物公司TaKaRa PrimeScript^TMRT reagent KitPerfect Real Time试剂盒操作说明进行反转录获得cDNA备用。

5.实时荧光定量PCR分析Tf3GT基因在各器官与组织中的表达量

根据已经获得的郁金香TFLS基因的序列，利用引物设计软件primer premier 5.0设计用于Real-time PCR中郁金香Tf3GT基因定量分析的特异性引物：Tf3GT-qF(5’-AACTCCGCCCGCTCAAAC-3’)(序列如SEQ ID NO.10所示)和Tf3GT-qR(5’-CCTTCTCCATCGCCTCCC-3’)(序列如SEQ ID NO.11所示)，内参基因为Actin(GenBank登陆号AB456684)，其引物为Actin-F(5’-AGTCAGTCATACAGTGCCAATC-3’)(序列如SEQ IDNO.12所示)，Actin-R(5’-TCATAAGAGAGTCGGTCAAATCC-3’)(序列如SEQ ID NO.13所示)。

6.制作目的基因及内参基因的标准曲线

用EASY Dilution(试剂盒提供)将标准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行Real-time PCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线；分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单一的PCR扩增产物；通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数。

7.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析

以合成的cDNA第一条链为模板，分别用目的基因与内参照基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-time PCR反应在BIO-RAD Chromo 4实时定量仪上进行，反应体系为20μL，反应采用三步法，94℃变性20s，接着41个循环：94℃15s；60℃25s；72℃20s；每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是否为特异产生。

采用2^-ΔΔt法作相对定量分析，结果表明Tf3GT基因的表达水平随着花朵的发育而持续不断上升，在第4阶段的表达量为第1阶段表达量的8.6倍，与花色苷的积累和花色的着色变化趋势一致，表明Tf3GT与花色苷的积累和花朵呈色正相关。同时，Tf3GT基因在球茎、地上茎、叶、花瓣中均有表达，但在花、地上茎中的表达量显著高于叶，在球茎中的表达量最低，其中在花瓣中的表达量分别为在地上茎、叶、球茎中表达量的1.8、4.2、9.4倍，表明Tf3GT基因在花色素积累越多的部位表达量高，在花色素积累少或无花色素积累的部位表达量很低，具有空间差异性。

实施例4、郁金香Tf3GT酶功能验证

1.原核表达载体的构建

pET-28a(+)-Tf3GT原核表达载体的构建过程如图1所示。

在扩增Tf3GT基因ORF片断的上下游引物两端分别加上BamH I和Sal I酶切位点。上游引物序列为5’-AAGGATCCATGGGCTCCACCGGAAACCC-3’(序列如SEQ ID NO.14所示)，下游引物为5’-GCGTCGACTCAGTATCCACAAATGACCTC-3’(序列如SEQ ID NO.15所示)。下划线部分是分别为BamH I和Sal I酶切识别序列。

通过PCR分别扩增Tf3GT cDNA的ORF片断，电泳后在紫外灯下割取目的条带，用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)回收，连接至pMD 18-Tvector，构建pMD 18-Tf3GT克隆载体，连接体系见说明书(如图1所示)。冻融法转化大肠杆菌DH5α感受态，在含100mg·l^-1氨苄的LB固体平板培养基上37℃培养过夜。LB培养基的配方为：胰蛋白胨10g·l^-1，酵母提取物5g·l^-1，氯化钠10g·l^-1。调节pH至7.0，灭菌。LB固体培养基配方为在LB液体培养基中，加入15g·l^-1琼脂粉，灭菌。挑取单菌落PCR鉴定，送阳性菌落测序确定测序的正确性。将测序正确的含pMD 18-Tf3GT载体的DH5α菌落，加入2ml含100mg·l^-1氨苄的LB液体培养基过夜培养到OD₆₀₀值约为1.0。使用质粒提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取pMD 18-Tf3GT载体，具体操作参照试剂盒说明书。

使用

的限制性内切酶BamH I和Sal I同时对pMD 18-Tf3GT载体和原核表达载体pET-28a(+)(美国Novagen公司)在37℃进行双酶切，时间15min。酶切体系参照酶切说明书。对酶切产物进行凝胶电泳，回收。

使用DNA Ligation Kit试剂盒(TaKaRa，China)对酶切后的Tf3GT片断和pET-28a(+)进行连接，连接方法参见试剂盒说明书。将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态。在含50mg·l^-1氨卞的LB固体平板培养基上37℃培养过夜。挑取单菌落，PCR鉴定阳性后送测序确认Tf3GT片断与pET-28a(+)成功连接。

2.Tf3GT的融合蛋白诱导

挑选生长状态良好的BL21(DE3)菌株单克隆，转接至10ml含50mg·l^-1氨卞的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养。按1∶50的比例转接至300ml含50mg·l^-1氨卞的LB液体培养中37℃，200rpm培养至OD₆₀₀为0.6左右。将培养物转入20℃的摇床中200rpm，振荡培养1小时。加入1ml 1M IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)(终浓度为1mM)，继续培养6h诱导融合蛋白表达。

将过夜培养物4℃，12000rpm离心10min，收集菌体，弃上清。按5∶1的比例用PBS(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄)溶解离心收集菌体，超声波(200w-300w)破碎菌体，超声/间隔＝10sec/sec，6次。用buffer B(8M尿素，0.1M磷酸钠缓冲液，0.01M Tris-Cl，其余为蒸馏水，pH 8.0)重悬菌体沉淀(20-200ml细胞培养物)，buffer B用量为5ml/g湿重，室温搅拌至溶液呈半透明状。4℃，10000rpm离心30min，弃掉沉淀，收集上清用于上柱纯化。

悬浮50％Ni-NTA溶液，装柱，避免气泡。Ni-NTA用量为5-10mg蛋白/mL树脂。等树脂自然沉降，用5倍柱体积ddH₂O过柱清洗层析柱，再加入5-10倍柱体积的1×Ni-NTA buffer B平衡层析柱。样品上柱，用5-10倍体积的1×Ni-NTA buffer B洗柱，1ml/min流速，收集流出液。用5-10倍柱体积的1×Ni-NTA buffer C(8M尿素，0.1M磷酸钠缓冲液，0.01M Tris-Cl，其余为蒸馏水，pH 6.3)洗柱，收集流出液。用5倍体积的1×Ni-NTA buffer E(8M尿素，0.1M磷酸钠缓冲液，0.01M Tris-Cl，其余为蒸馏水，pH 4.5)洗柱，对目标蛋白进行洗脱。

将纯化浓缩后的Tf3GT蛋白进行体外活性检测，反应体系为120μl，含2nM天竺葵苷元(用50％的DMSO溶解)、20μl Tf3GT融合蛋白、50mM咪唑盐酸、14mM巯基乙醇、10％甘油、24nM UDP-Glu(购于Amersham公司，USA)。反应条件为37℃水浴40min，加入20μl浓度为6M的盐酸终止反应。反应结束后用400μl乙酸乙酯萃取一次。将萃取液经0.22μm滤膜过滤。

测定采用美国Waters公司的超高效液相色谱-二极管阵列器(Ultraperformance liquid chromatography with a photodiode array detector，UPLC-PAD)检测，该系统装备有高压二元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、色谱工作站(Masslynx V4.1数据处理软件)。色谱柱为ACQUITY UPLCBEH的C18柱(2.1mm×100mm，1.7μm)分析条件：柱温45℃，流速0.5ml·min^-1，进样体积2μl。流动相A液为0.1％的甲酸溶液(V_甲酸∶V_水＝0.1∶99.9)；B液为含0.1％甲酸的乙腈(V_甲酸∶V_乙腈＝0.1∶99.9)。梯度洗脱程序：0min，93％A，7％B；1min，93％A，7％B；11min，82％A，18％B；11.5min，10％A，90％B；13min，10％A，90％B；13.1min，93％A，7％B；15min，93％A，7％B。在520nm处检测产物。标准品氯化天竺葵苷元(Pelargonidin chloride)购于SIGMA，标准品天竺葵素-3-氯化葡萄糖苷(Pelargonidin 3-O-glucoside)购于国家标准物质网。

将纯化得到的Tf3GT蛋白经过复性后，用于体外酶活实验，而未加IPTG诱导的重组质粒菌种产生的蛋白作为阴性对照。高效液相检测结果如图2所示，表明：Tf3GT体外酶活反应检测到天竺葵素-3-葡萄糖苷的生成，而阴性对照中仍只有天竺葵苷元，没有天竺葵素-3-葡萄糖苷的生成，说明原核表达制备的重组Tf3GT蛋白有葡萄糖基转移酶的活性，初步证明我们分离的基因是UDP-葡萄糖：类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims

1.一种如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1～20个以内氨基酸而得到的序列。

3.如权利要求2所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中1～10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。

4.一种编码权利要求1所述蛋白质的核酸序列。

5.如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为：

(a)碱基序列如SEQ ID NO.1第1～1371位所示；

或(c)能与SEQ ID NO.1第1～1371位所示的核酸进行杂交的序列。

6.如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为SEQ ID NO.1第1～1371位所示的核酸序列中1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在5’和/或3’端添加60个以内核苷酸形成的序列。

7.一种检测如权利要求4所述的核酸序列的探针，其特征在于，所述探针为具有所述核酸序列8～100个连续核苷酸的核酸分子。

8.一种如权利要求4所述的核酸序列在制备重组类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述制备包括如下步骤：构建含所述核酸序列的原核表达载体，将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导培养，得到重组类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶。

10.一种重组类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶，其特征在于，所述重组类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶是通过如下方法制备而得的：构建含如权利要求4所述核酸序列的原核表达载体，将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导培养，即得所述重组类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶。