CN103333868A - 百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白及其编码基因和探针 - Google Patents

百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白及其编码基因和探针 Download PDF

Info

Publication number
CN103333868A
CN103333868A CN2013102210508A CN201310221050A CN103333868A CN 103333868 A CN103333868 A CN 103333868A CN 2013102210508 A CN2013102210508 A CN 2013102210508A CN 201310221050 A CN201310221050 A CN 201310221050A CN 103333868 A CN103333868 A CN 103333868A
Authority
CN
China
Prior art keywords
agipanthus
apga20ox
protein
gene
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2013102210508A
Other languages
English (en)
Inventor
申晓辉
岳建华
张荻
任丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jiaotong University
Original Assignee
Shanghai Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiaotong University filed Critical Shanghai Jiaotong University
Priority to CN2013102210508A priority Critical patent/CN103333868A/zh
Publication of CN103333868A publication Critical patent/CN103333868A/zh
Priority to CN201410240613.2A priority patent/CN104017781B/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/827—Flower development or morphology, e.g. flowering promoting factor [FPF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/11—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with 2-oxoglutarate as one donor, and incorporation of one atom each of oxygen into both donors (1.14.11)

Abstract

本发明涉及一种百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白及其编码基因和探针，所述蛋白质为如下（a）或（b）的蛋白质：（a）由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有百子莲赤霉素合成双加氧酶活性的由（a）衍生的蛋白质。本发明还提供相应的核酸序列，以及检测探针；步骤如下：通过RACE技术分别扩增得到APGA20ox基因的3′和5′端，进行基因全长序列拼接和同源性分析，通过时空表达模式分析以及外源调控物质处理，分析APGA20ox基因表达差异情况进而验证基因的功能。本发明可调控百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox基因的时空表达特性，进而能够改变植物株高发育。

Description

百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白及其编码基因和探针
技术领域
本发明涉及百子莲赤霉素合成途径中的关键酶及其编码基因和探针，具体涉及一种百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白及其编码基因和探针。
背景技术
观赏植物的株型是决定商品价值和观赏价值的重要因素之一。改变和定向调控株型，创造矮化紧凑的株型，可以增加观赏植物的商品价值和观赏价值，通过增加株高可以获得良好的切花性状。赤霉素（Gibberellin,GA）是决定植物茎的伸长的最重要的植物激素，赤霉素的合成和代谢直接调控植物的株型发育。赤霉素种类多样，生物合成途径十分复杂，仅有少数种类的GAs具有生物活性，中间产物大多不具备生物活性，在转化为活性GAs的过程中，必须有GAs合成的双加氧酶类参与，其中GA20ox双加氧酶参与GAs生物合成反应的多个步骤，具有重要的作用，GA20ox的突变体由于GA生物合成途径受阻，多表现为矮化性状。一些研究表明，通过调控GA20ox的表达可以显著改变植物株高，提高农作物抗性和产量，提高观赏植物商品价值。
GA20ox在一些植物中已被分离，如：杨树（Populus tomentosa）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、陆地棉（Gossypium hirsutum）、水稻（Oryza sativa）、矮牵牛（Petunia hybrida Vilm）、大麦（Hordeum vulgare）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、玉米（Zea mays）等，但对于球根花卉百子莲（Agapanthus praecox），APGA20ox基因的克隆、表达模式及APGA20ox蛋白编码序列目前尚不清楚。在本发明被公布之前，未有任何与本专利申请中所提及的百子莲APGA20ox蛋白序列相关的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于填补赤霉素合成双加氧酶APGA20ox基因家族成员的克隆、表达以及赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白的空白，提供了一种赤霉素合成双加氧酶蛋白APGA20ox，本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列以及检测所述核酸序列的探针；本发明公开了百子莲APGA20ox蛋白及其核酸序列在百子莲不同器官、不同发育阶段的表达模式，为今后利用基因工程技术对APGA20ox基因表达的时空特性进行调控，从而改变株高、创造合理株型提供了理论依据，具有很大的应用价值。
一方面，本发明提供了具有百子莲赤霉素合成双加氧酶活性的蛋白质，所述蛋白质是由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有百子莲赤霉素合成双加氧酶活性的蛋白质。该多肽在百子莲发育的不同阶段，不同器官内的有无及活性大小存在较大差异。
优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1～20个以内氨基酸而得到的序列。
进一步优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中1～10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
另一方面，本发明提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列。
优选的，所述核酸序列具体为：（a）碱基序列如SEQ ID NO.1第1～1086位所示；或（b）与SEQ ID NO.1第1～1086位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或（c）能与SEQ ID NO.1第1～1086位所示的核酸进行杂交的序列。
优选的，所述核酸序列具体为SEQ ID NO.1第1～1086位所示的核酸序列中1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加60个以内核苷酸形成的序列。
此外，本发明还提供了一种检测上述核酸序列的探针，所述探针为具有上述核酸序列8～100个连续核苷酸的核酸分子，该探针可用于检测样品中是否存在编码百子莲APGA20ox相关的核酸分子。
本发明还涉及一种百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白编码基因的应用，其所述基因的碱基序列如SEQ ID NO.1第1～1086位所示，所示的应用是：通过基因工程对基因表达进行调控进而改变植株株高，获得新的百子莲株型。
优选地，所述应用具体为：通过常规手段提高APGA20ox蛋白编码基因的表达量，使得百子莲的株高增加，获得新的百子莲株型。
进一步优选地，所述应用具体为：使用GA处理百子莲，使得植株APGA20ox基因表达量提高，进而使得百子莲的株高增加，获得新的百子莲株型。
在本发明中，“分离的DNA”、“纯化的DNA”是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。
在本发明中，术语“百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白编码序列”指编码具有百子莲APGA20ox蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示的第1～1086位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1所示的第1～1086位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1所示的第1～1086位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所示的序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。
该术语还包括能编码天然百子莲APGA20ox蛋白的相同功能、SEQ ID NO.1所示序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：通常为1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加为60个以内核苷酸。
在本发明中，术语“百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白”指具有百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白活性的SEQ ID NO.2所示序列的多肽。该术语还包括具有与天然百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：通常为1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明的百子莲APGA20ox蛋白的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与百子莲APGA20ox相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用百子莲APGA20ox蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“百子莲APGA20ox保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val;Leu;Ile Val
Arg(R) Lys;Gln;Asn Lys
Asn(N) Gln;His;Lys;Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro;Ala Ala
His(H) Asn;Gln;Lys;Arg Arg
Ile(I) Leu;Val;Met;Ala;Phe Leu
Leu(L) Ile;Val;Met;Ala;Phe Ile
Lys(K) Arg;Gln;Asn Arg
Met(M) Leu;Phe;Ile Leu
Phe(F) Leu;Val;Ile;Ala;Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr;Phe Tyr
Tyr(Y) Trp;Phe;Thr;Ser Phe
Val(V) Ile;Leu;Met;Phe;Ala Leu
发明还包括百子莲APGA20ox蛋白或多肽的类似物。这些类似物与百子莲APGA20ox相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如β、γ-氨基酸）的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。
修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶（如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析百子莲APGA20ox基因产物的表达模式，即分析百子莲APGA20ox基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
本发明检测样品中是否存在百子莲APGA20ox相关核苷酸序列的检测方法，包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于百子莲APGA20ox相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15～50个核苷酸。
此外，根据本发明的百子莲APGA20ox核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选百子莲APGA20ox相关同源基因或同源蛋白。
为了得到与百子莲APGA20ox相关基因的点阵，可以用DNA探针筛选百子莲cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用32P对百子莲APGA20ox相关的全部或部分做放射活性标记而得的。适合于筛选的cDNA文库是来自百子莲的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech,Stratagene,Palo Alto,Cal.。这种筛选方法可以识别与百子莲APGA20ox相关的基因家族的核苷酸序列。
本发明的百子莲APGA20ox相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产（Stewart等人，（1969）固相多肽合成，WH Freeman Co.,San Francisco;Merrifield J.（1963）J.Am Chem.Soc85：2149-2154）。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪（Foster City，CA）来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
利用本发明的百子莲APGA20ox蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与百子莲APGA20ox蛋白相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。
百子莲为世界著名切花之一，观赏价值极高，应用广泛，人们对高品质观赏价值的新品种的需求也越来越大。因此，本发明具有很大的应用价值。本发明首次克隆百子莲植物体内赤霉素生物合成途径中的关键酶百子莲APGA20ox蛋白的编码序列，并采用荧光实时定量PCR的方法分析APGA20ox基因的表达模式，为今后利用基因工程技术调控APGA20ox基因的时空表达，从而改变株高、创造新株型提供了理论依据，具有很大的应用价值。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的百子莲APGA20ox基因与簇毛麦赤霉素合成双加氧酶基因mRNA的核苷酸序列的同源比较(GAP)结果；
图2为本发明的百子莲APGA20ox蛋白与簇毛麦赤霉素合成双加氧酶的氨基酸序列的同源比较（FASTA）结果，其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。
图3为本发明的百子莲APGA20ox蛋白表达量与百子莲株高调控之间的关系。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York：Cold Spring HarborLaboratory Press,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox基因的克隆
1.植物材料的获得
百子莲于2000年由南非引入我国，并在上海进行引种试验。孙博在2011年发表的硕士学位论文《百子莲盆栽矮化的研究》一文中，对百子莲的基本生物学特性，引种历史等进行了较为详细的介绍。本实施例涉及的百子莲材料可以通过公开的渠道获得。愈伤组织、胚性愈伤组织、体胚、幼苗由组培室培育并保存，用于提取RNA。将健康、大小一致的百子莲植株于温室栽植并进行常规管理，待花朵花蕾形成，花瓣即将开裂时采集各个器官和组织，用于提取RNA。
2.RNA的抽提
用“RNA prep pure植物总RNA提取试剂盒”抽提总RNA（RNA prep pure PlantKit：上海莱枫生物科技有限公司）。用甲醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计（Thermo Scientific NANODROP 1000 Spectrophotometer）上测定RNA的纯度及浓度。
3.基因的全长克隆
根据GA20ox基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法（SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit：Clontech Laboratories,Inc.）进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：
（1）RT-PCR获得基因中间片段
将提取RNA进行反转录（Prime ScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit：宝生物工程（大连）有限公司）；
以第一链cDNA为模板，利用引物：
F1：5′-CTTGAGCCTGGAGGATGTATT-3′；（SEQ ID NO.3）
和R1：5′-AACCTCATCGTCGAATCGTTC-3′。（SEQ ID NO.4）
进行PCR，扩增得到467bp片段，回收并连接到pMD18-T Simple vector载体上，用RV-M和M13-47作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye,Perkin-Elmer,USA)的方法，在ABI377测序仪（Perkin-Elmer,USA）上进行测序。测序结果通过在NCBI网站进行BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比对已有的数据库（Genebank），知其核酸序列及编码蛋白与已知的簇毛麦属赤霉素合成双加氧酶基因GA20ox的同源性很高，故初步认为它是一个赤霉素合成双加氧酶基因。
（2）3′RACE
以3′RACE ready cDNA为模板，二轮巢式PCR完成3′末端序列的扩增。
第一轮：UPM+APGA20ox3-1：
5′-CGACGATGAGGTTGAACTATTATCCGCCT-3′；（SEQ ID NO.5）
第二轮：NUP+APGA20ox3-2：
5′-CGGAGATACTTTCACGGCACTGTCTAATG-3′。（SEQ ID NO.6）
得到APGA20ox3′末端序列（444bp），回收，连接到pMD18-T Simple vector载体上，用RV-M和M13-47作为通用引物，采用终止物荧光标记（Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪（Perkin-Elmer，USA）上进行测序。测序结果通过在NCBI网站进行BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比对已有的数据库（Genebank），知其核酸序列及编码蛋白与已知的簇毛麦属赤霉素合成双加氧酶基因的同源性很高。
(3)5′RACE
以5′RACE ready cDNA为模板，通过二轮巢式PCR完成5′末端序列的扩增。第一轮：UPM+APGA20ox5-1：
5′-AGGGTGCCTTGAGCCTGGAGGATGTA-3′；（SEQ ID NO.7）
第二轮：NUP+APGA20ox5-2：
5′-AGGCGGATAATAGTTCAACCTCATCGTCG-3′。（SEQ ID NO.8）
得到APGA20ox5′末端序列（769bp），回收连接，用与3′RACE相同的方法进行测序。
将通过上述3种方法获得的序列的测序结果进行拼接，将拼接序列提交BLAST分析，结果证明从百子莲中新得到的APGA20ox基因的确为一个与赤霉素生物合成酶相关的基因。
将测序结果结合NCBI的ORF Fingding（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf）网页预测，发现了百子莲APGA20ox基因的起始密码子与终止密码子。根据获得的序列，分别从起始密码子和终止密码子处设计特异性引物：
ORF-F：5′-ATGGTGCTTCAACCCTTCGTGTTCG-3′；（SEQ ID NO.9）
ORF-R：5′-TCATTTGTGCAGGGTGCCTTGAGCCT-3′。（SEQ ID NO.10）
以百子莲cDNA为模板进行PCR，扩增得到1086bp百子莲赤霉素合成双加氧酶GA20ox蛋白的全长编码序列（SEQ ID NO.1）。
实施例2、百子莲APGA20ox基因的序列信息与同源性分析
本发明新的百子莲APGA20ox全长CDS开放读框序列为1086bp，详细序列见SEQ IDNO.1第一条序列。根据CDS开放读码框序列推导出百子莲APGA20ox的氨基酸序列，共361个氨基酸残基，分子量为41050.8道尔顿，等电点（pI）为6.73。详细序列见SEQ IDNO.2所示序列；
将百子莲APGA20ox的CDS开放读框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与簇毛麦GA20ox基因（EU142949.1）在核苷酸水平上具有67%的相同性。如图1所示（Query：百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox的编码基因序列；Sbjct：簇毛麦赤霉素合成双加氧酶的mRNA序列）；在氨基酸水平上，它与簇毛麦GA20ox基因（GenBank登录号ACU40937.1）也有69%的一致性，如图2所示（Query：百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox的氨基酸序列；Sbjct：簇毛麦赤霉素合成双加氧酶的氨基酸序列）。由此可见，百子莲APGA20ox基因与簇毛麦GA20ox基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。
实施例3、百子莲APGA20ox基因在不同发育阶段以及在百子莲不同组织中的表达差异性
1.材料的获得：在百子莲体胚发育的不同阶段（愈伤组织；肧性愈伤组织；体胚分化；幼苗形成），利用实验室组培材料为研究对象，同时在实验温室取成年植株的主根、侧根、茎、花葶、老叶、新叶、小花梗、花瓣、花丝、花药、子房、种子，将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用。将GA和多效唑（Paclobutrazol，PBZ）喷施处理过的百子莲植株叶片取样用于RNA提取。
2.RNA的提取：利用RNA prep pure植物总RNA提取试剂盒”（RNA prep pure PlantKit：上海莱枫生物科技有限公司）提取百子莲不同发育阶段以及不同组织中的RNA。
3.RNA的完整性、纯度、浓度的确定：用普通琼脂糖凝胶电泳（胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15min）检测完整性。电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示rRNA样品的降解。纯度较好的RNA，A260/A280以及A260/A230约为2.0左右。用分光光度计测定OD值并计算RNA含量。
4.cDNA的获得：以500ng的总RNA为模板，按照宝生物公司TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒操作说明进行反转录获得cDNA备用。
5.设计特异性引物以进行实时荧光定量PCR分析基因在各器官与组织中的表达量。根据已经获得的百子莲APGA20ox基因序列，利用引物设计软件设计用于Real-timePCR中APGA20ox基因定量分析的特异性引物，
GA20ox-F：5′-GGTCTGCTCTACTTGAAT-3′；（SEQ ID NO.11）
GA20ox-R：5′-GAAGGAACTACAGGAGAA-3′。（SEQ ID NO.12）
内参基因为Actin，其引物为
Actin-F：5′-CAGTGTCTGGATTGGAGG-3′；（SEQ ID NO.13）
Actin-R：5′-TAGAAGCACTTCCTGTG-3′。（SEQ ID NO.14）
6.制作目的基因及内参基因的标准曲线。用EASY Dilution（试剂盒提供）将标准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行Real-time PCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线。分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单一的PCR扩增产物。通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数。
7.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析。以合成的cDNA第一条链为模板，分别用目的基因与内参照基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-time PCR反应在BIO-RAD Chromo4实时定量仪上进行，反应体系为20μL。反应采用三步法，94℃变性20s，接着40个循环：94℃15s；56℃15s；72℃25s。每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是否为特异产生。
8.采用2-△△Ct法作相对定量分析。结果表明百子莲APGA20ox基因的表达水平在体胚发育过程中逐渐上升，幼苗的表达量最高，愈伤组织时期的表达量最低，其中最高表达量为最低表达量的4.15倍。说明该基因的表达与百子莲生长过程，特别是与伸长生长有明显的相关性，是由于APGA20ox参与的GA合成引起植物的伸长生长。APGA20ox基因在主根、侧根、茎、花葶、老叶、新叶、小花梗、花瓣、花丝、花药、子房、种子中均有表达，在根中表达量最高，花瓣中表达量最低。侧根比主根表达量高，新叶比老叶表达量高，幼嫩的种子表达量较高。这说明APGA20ox基因的表达具有明显的空间差异性，其中生长旺盛的部位表达量较高，表明该基因主要参与了植物的生长和发育。
如图3所示，通过GA处理的植株APGA20ox基因在叶片的表达量比CK高了492.96%，同时株高比CK增加了32.53%，表明GA处理能够显著增加活性GA的含量,加强了GA信号转导途径下游相关基因的表达,增加了百子莲植株的株高生长，而APGA20ox基因正是调控百子莲GA生物合成的最重要的氧化酶类,其通过调控活性GA的生物合成来调控植物株高的生长。而经过PBZ处理由于GA合成受阻，APGA20ox的表达量在反馈调节机制下与CK相比降低了28.98%，同时植株的高度比CK减少了28.63%，以上结果表明APGA20ox基因在百子莲生长过程中对植株发育具有重要的调控作用，尤其是对分裂旺盛的部位和株高作用更为显著，其作用机制主要是通过调控具有生物活性的GA的生物合成，该基因表达产物对定向调控植物株高具有应用价值。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Figure IDA00003300463300011
Figure IDA00003300463300021
Figure IDA00003300463300041
Figure IDA00003300463300051
Figure IDA00003300463300071

Claims (10)

1.一种如下（a）或（b）的蛋白质：
（a）由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有百子莲赤霉素合成双加氧酶活性的由（a）衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1～20个以内氨基酸而得到的序列。
3.如权利要求2所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中1～10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
4.一种编码权利要求1所述蛋白质的核酸序列。
5.如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为：
（a）碱基序列如SEQ ID NO.1第1～1086位所示；
或（b）与SEQ ID NO.1第1～1086位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；
或（c）能与SEQ ID NO.1第1～1086位所示的核酸进行杂交的序列。
6.如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为SEQ ID NO.1第1～1086位所示的核酸序列中1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在5′和/或3′端添加60个以内核苷酸形成的序列。
7.一种用于检测如权利要求4所述核酸序列的探针，其特征在于，所述探针为包含有所述核酸序列8～100个连续核苷酸的核酸分子。
8.一种百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白编码基因的应用，其特征在于，所述基因的碱基序列如SEQ ID NO.1第1～1086位所示，所示的应用是：通过基因工程对基因表达进行调控进而改变植株株高，获得新的百子莲株型。
9.如权利要求8所述的百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白编码基因的应用，其特征在于，所述应用具体为：通过常规手段提高APGA20ox蛋白编码基因的表达量，使得百子莲的株高增加，获得新的百子莲株型。
10.如权利要求9所述的百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白编码基因的应用，其特征在于，所述应用具体为：使用GA处理百子莲，使得植株APGA20ox基因表达量提高，进而使得百子莲的株高增加，获得新的百子莲株型。
CN2013102210508A 2013-06-04 2013-06-04 百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白及其编码基因和探针 Pending CN103333868A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2013102210508A CN103333868A (zh) 2013-06-04 2013-06-04 百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白及其编码基因和探针
CN201410240613.2A CN104017781B (zh) 2013-06-04 2014-05-30 百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白及其编码基因和探针

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2013102210508A CN103333868A (zh) 2013-06-04 2013-06-04 百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白及其编码基因和探针

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103333868A true CN103333868A (zh) 2013-10-02

Family

ID=49242072

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2013102210508A Pending CN103333868A (zh) 2013-06-04 2013-06-04 百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白及其编码基因和探针
CN201410240613.2A Expired - Fee Related CN104017781B (zh) 2013-06-04 2014-05-30 百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白及其编码基因和探针

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410240613.2A Expired - Fee Related CN104017781B (zh) 2013-06-04 2014-05-30 百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白及其编码基因和探针

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN103333868A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109553670A (zh) * 2019-01-17 2019-04-02 信阳农林学院 百子莲赤霉素负调控因子ApGAI蛋白及编码基因

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105755046A (zh) * 2016-03-18 2016-07-13 南京晓庄学院 一种沉默植物基因表达的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1416468A (zh) * 2000-03-07 2003-05-07 瑞典树木基因改良公司 具有提高了的生长、生物物质产量和本质部纤维长度的转基因树木及其生产方法
CN101489375A (zh) * 2006-05-23 2009-07-22 雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司 沉默赤霉素2-氧化酶的表达的组合物及其用途
CN102174519A (zh) * 2011-02-25 2011-09-07 中国农业科学院作物科学研究所 一种矮败水稻培育方法及其所用到的dna
CN102757486A (zh) * 2011-04-27 2012-10-31 中国农业大学 植物发育相关蛋白GA20ox及其编码基因和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103014031B (zh) * 2013-01-17 2015-01-21 东北林业大学 白桦GA20ox1基因BpGA20ox1及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1416468A (zh) * 2000-03-07 2003-05-07 瑞典树木基因改良公司 具有提高了的生长、生物物质产量和本质部纤维长度的转基因树木及其生产方法
CN101489375A (zh) * 2006-05-23 2009-07-22 雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司 沉默赤霉素2-氧化酶的表达的组合物及其用途
CN102174519A (zh) * 2011-02-25 2011-09-07 中国农业科学院作物科学研究所 一种矮败水稻培育方法及其所用到的dna
CN102757486A (zh) * 2011-04-27 2012-10-31 中国农业大学 植物发育相关蛋白GA20ox及其编码基因和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAI P.等: "ACU40937.1", 《GENBANK》, 23 August 2012 (2012-08-23) *
刘英华等: "簇毛麦GA20ox基因的分离和鉴定", 《应用与环境生物学报》, vol. 15, no. 4, 31 December 2009 (2009-12-31), pages 479 - 482 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109553670A (zh) * 2019-01-17 2019-04-02 信阳农林学院 百子莲赤霉素负调控因子ApGAI蛋白及编码基因
CN109553670B (zh) * 2019-01-17 2023-04-18 信阳农林学院 百子莲赤霉素负调控因子ApGAI蛋白及编码基因

Also Published As

Publication number Publication date
CN104017781B (zh) 2016-03-02
CN104017781A (zh) 2014-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Stacey et al. Genetics and functional genomics of legume nodulation
CN103333233B (zh) 百子莲生长素受体蛋白tir1及其编码基因和探针
CN105837670B (zh) 百子莲生长素响应因子ApARF2及其编码基因和探针
CN103342741B (zh) 百子莲赤霉素受体APGID1b蛋白及其编码基因和探针
CN104745560B (zh) 茄子查尔酮合成酶SmCHS1蛋白及其编码基因
CN108603198A (zh) 操纵植物发育的组合物和方法
CN102994463A (zh) 郁金香黄烷酮-3-羟化酶TfF3H蛋白及其编码基因和探针
CN105441396A (zh) 茄子组成型光形态建成SmCOP1蛋白及其编码基因
CN103333232B (zh) 百子莲赤霉素受体APGID1a蛋白及其编码基因和探针
CN102978194A (zh) 郁金香查尔酮异构酶TfCHI蛋白及其编码基因和探针
CN102965349A (zh) 郁金香二氢黄酮醇-3′-羟化酶TfF3′H蛋白及其编码基因和探针
CN103333868A (zh) 百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白及其编码基因和探针
CN104745561B (zh) 茄子查尔酮异构酶SmCHI蛋白及其编码基因
CN104961815B (zh) 百子莲生长素信号转录调控蛋白Aux/IAA1及其编码基因和探针
CN105085642B (zh) 百子莲生长素信号转录调控蛋白Aux/IAA2及其编码基因和探针
CN104961814B (zh) 百子莲生长素信号转录调控蛋白Aux/IAA3及其编码基因和探针
CN103483437A (zh) 百子莲光周期开花途径关键基因ApCO蛋白及其编码基因和探针
CN103074307B (zh) 郁金香TfbHLH1蛋白及其编码基因和探针
CN103288942A (zh) 百子莲开花相关基因ApFT蛋白编码基因和探针
CN106946986B (zh) 百子莲y2sk2型脱水素蛋白及其编码基因和探针
CN103087168B (zh) 郁金香TfMYB2蛋白及其编码基因和探针
CN101679968B (zh) 增强植物耐缺铁性的多肽及其应用
CN109553670B (zh) 百子莲赤霉素负调控因子ApGAI蛋白及编码基因
CN110029125A (zh) 水稻基因ORYsa;SQD1的基因工程应用
CN105001313B (zh) 狗牙根‘C299’脱水素蛋白Dehydrin-S及其编码基因和探针

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20131002