CN103014031B - 白桦GA20ox1基因BpGA20ox1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了白桦GA20ox1基因BpGA20ox1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示。过表达BpGA20ox1基因的烟草综纤维素含量和纤维长度比对照组均有不同程度的提高，而Klason木质素含量并无明显变化。可培育出生长速度快、纸浆性状得到显著改善的转BpGA20ox1基因的纸浆用材林木新品种，这对于通过分子育种手段加速纸浆材林木新品种培育进程意义重大。

Description

白桦GA20ox1基因BpGA20ox1及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及的是白桦GA20ox1基因BpGA20ox1及其应用。

背景技术

赤霉素（Gibberellins,简称GAs）是高等植物整个生命周期中极为重要的生长调节剂，可影响植物整个生命周期中的生长和发育过程，主要包括促进种子发芽、嫩芽和茎的伸长、叶片扩展、毛状体发育、花和果实发育等过程，而且在树木木材形成过程中也具有重要作用。GA20氧化酶（GA20ox）是具有生物活性GAs生物合成调控酶，属于可溶性的双加氧酶，它能在GAs生物合成的最后阶段催化从GA12到GA9及GA53到GA20一系列的氧化反应，经连续氧化失去CO₂的过程，最后形成具有生物活性的GA4和GA1。合成GA20ox功能缺失的突变体具有半矮化的表型，而过量表达GA20氧化酶则能导致赤霉素的过量合成和植株生长速度的明显加快。因此，GA20-氧化酶是GAs合成过程中关键的限速酶。随着分子生物学的不断发展，对GA20氧化酶基因的研究是了解赤霉素的作用机理的重要基础之一。编码GA20ox的基因在许多植物中已经被克隆并进行深入的表达分析，例如拟南芥、土豆（Solanum tuberosum）、水稻（Oryza sativa）、南瓜（Cucurbita moschata）、向日葵（Helianthus annuus）、玉米、苹果（Malus x domestica）、棉花（Gossypium hirsutum）等。如Carrera等人通过遗传修饰GA20ox基因水平来改变土豆体内的GA含量，研究证实，与对照相比，在转基因土豆中，GA20ox基因正义转化可使其植株高度增加、节间增长以及块茎休眠时间缩短，而反义转化植株则相反，植物整体的生长和发育模式受到了抑制。

白桦(Betula platyphylla)为我国东北与内蒙古地区的先锋树种，是非常优良的短周期阔用材树种。目前，对白桦内源激素相关基因的分子机理研究尚无报道。因此，本项研究将通过克隆与分析白桦GA20ox1基因，对其系统分析和研究，为培育出生长速度快、纸浆性状得到显著改善的转GA20ox1基因纸浆用材新品种奠定基础，这对于通过分子育种手段加速纸浆材林木新品种具有较大意义。

发明内容

为了加速白桦(Betulaplatyphylla)木材分子育种的进程，本研究对对白桦GA20氧化酶基因克隆和功能研究。

本发明的技术方案如下：

白桦GA20ox1基因BpGA20ox1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示。

所述的白桦GA20ox1基因BpGA20ox1应用，可以应用于纸浆用材林木新品种的育种。

本发明首先克隆并获得白桦GA20ox1基因。利用已知的与白桦亲缘关系较近的几个物种的GA20ox基因序列，根据保守区设计兼并引物克隆出了白桦GA20氧化酶基因片段，之后利用RACE技术获得一条1586bp的cDNA序列。经序列比对分析，其与欧洲GA20ox1蛋白的同源性高达99%，将该基因命名为BpGA20ox1基因，该基因全长编码序列为1164bp，共编码387个氨基酸，BpGA20ox1蛋白的分子量为44.3kDa，理论等电点为6.5，是2OG-FeII_Oxy基因家族的成员。

然后，本发明利用荧光实时定量PCR研究了BpGA20ox1在顶端分生组织、嫩叶、成熟叶、叶柄、、未成熟木质部、成熟木质部、节间和韧皮部的表达情况，结果发现，BpGA20ox1在成熟木质部中表达丰度最高，在幼嫩叶片中的表达量较高，在未成熟木质部、韧皮部、顶端分生组织和成熟叶中则表达丰度中等，而在叶柄中有少量表达，在节间组织中表达丰度相对最低。

本发明还构建了正义植物表达载体pROK2-GA20ox1，并通过农杆菌介导法将其转入烟草，对转化植株的PCR检测初步证明外源基因已经整合到烟草基因组中。对转BpGA20ox1基因烟草植株及未转基因烟草植株的综纤维素含量和Klason木质素含量测定和分析表明，过表达BpGA20ox1基因的烟草综纤维素含量和纤维长度比对照组均有不同程度的提高，而Klason木质素含量并无明显变化。这表明通过基因技术，可培育出生长速度快、纸浆性状得到显著改善的转BpGA20ox1基因的纸浆用材林木新品种，这对于通过分子育种手段加速纸浆材林木新品种培育进程意义重大。

附图说明

图1为白桦茎木质部总RNA的电泳检测。

图2为BpGA20ox1基因片段PCR扩增产物的电泳检测。

图3为BpGA20ox1基因片段转化子PCR鉴定电泳检测，M为DNA MarkerDL2000；1~8为随机挑取的单菌落PCR产物。

图4为5’RACE扩增产物电泳检测。

图5为5’RACE扩增产物转化子电泳检测。

图6为3’RACE扩增产物电泳检测。

图7为3’RACE扩增产物转化子电泳检测，M为DNA Marker DL2000；1~7为随机挑取的单菌落PCR产物。

图8为白桦BpGA20ox1蛋白的保守区预测。

图9为不同物种的GA20ox1基因编码氨基酸的系统进化树分析。

图10为带酶切位点的BpGA20ox1基因电泳检测。

图11为BpGA20ox1基因与pROK2双酶切电泳检测，M为DNA Marker DL2000；1为pROK2质粒；2为酶切后pROK2质粒；3为BpGA20ox1基因；4为酶切后BpGA20ox1基因。

图12为pROK2-GA20ox重组质粒PCR产物电泳检测。

图13为pROK2-GA20ox重组质粒酶切产物电泳检测，M为DNA Marker DL2000；1为酶切后BpGA20ox1基因；2和3为酶切后重组质粒。

图14为重组质粒（pROK2-GA20ox1）农杆菌转化鉴定电泳检测。

图15为非转基因烟草和转基因烟草生长不同时期的对比，M为DNA MarkerDL2000；1~8为随机挑取的转化子PCR产物。

图16为部分转BpGA20ox1基因烟草PCR鉴定，M为DNAMarker DL2000；P为阳性对照；W为水对照；ck为非转基因植株；其余为转基因烟草株系。

图17为部分转BpGA20ox1烟草的综纤维素含量。

图18为部分转BpGA20ox1烟草的木质素含量。

图19为部分转BpGA20ox1烟草的纤维素长度，ck为野生型烟草；其余为转基因烟草。

图20为定量PCR引物电泳检测。

图21为实时定量RT-PCR分析BpGA20ox1基因在白桦不同组织中的表达，1为叶柄；2为顶端分生组织；3为嫩叶；4为成熟叶；5为未成熟木质部；6为成熟木质部；7为韧皮部；8为节间。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例一、基因克隆

1材料与方法

1.1.1材料

东北林业大学试验林场15年生白桦，白桦地上茎20cm以上截取40cm茎段，剥皮后，有刀片轻轻刮去木质部最外的一层透明状形成层后，再用刀片刮木质部组织直至有较重摩擦感时停止，收集材料后液氮将其冷冻，置于-80℃冰箱。

1.1.2菌种与载体

DH5α大肠杆菌（Escherichia coli）感受态（购自天为时代）、pMD18-T载体（购自大连宝生物公司）。

1.1.3试剂和药品

质粒提取试剂盒（天根）、琼脂糖（Sigma）、牛肉膏（Sigma）、蛋白胨（Sigma）；实时定量RT-PCR试剂盒、RACE cDNAAmplification试剂盒、LA Taq酶、DNA分子量标准DL2000均购自TaKaRa公司；DNA消化酶、胶回收试剂盒购自Promega公司。其它试剂为国产或进口分析纯。

1.1.4主要仪器设备

PCR仪（GeneAmpPCRsystem9700）；核酸测定仪（Eppendof）；凝胶成像系统（UVP）；高速台式冷冻离心机（Heraeus）；微量台式高速离心机（HITAICH）；-70℃超低温冰箱（Harris）；-20℃低温冰箱（海尔）；超净工作台（AIR TECH）；高压灭菌锅（SANYO）；超纯水仪（Millipore）；微量移液器（Eppendof）；AF100制冰机（Scotsman）；荧光定量PCR仪（MJ Research）；电子天平（Sartorius）；HH-BII型电热恒温培养箱（上海文进医疗器械厂生产）；HZQ-X100型空气振荡培养箱（哈尔滨市东明医疗仪器厂）。

1.2试验方法

1.2.1白桦木质部总RNA提取

（1）向1.5mL Eppendorf管中加入0.6mL2×SDS，0.1mLβ-mercaptoethanol，0.35mL的Tris饱和酚，0.35mL氯仿；

（2）取-80℃保存备用的白桦木质部组织于液氮中充分研磨，迅速加入到提取液中，振荡混匀；

（3）12000r/min4℃离心15min；

（4）取上清，加入0.35mL的Tris饱和酚和0.35mL氯仿，振荡混匀，12000r/min4℃离心10min；

（5）取上清，加入0.7mL的氯仿，振荡混匀，12000r/min4℃离心10min；

（6）取上清，加入1/2体积的无水乙醇和1/2体积8M/L LiCl，冰上放置10min，沉淀RNA；

（7）12000r/min4℃离心10min，弃上清，用70%无水乙醇洗沉淀，气干后沉淀溶于50μL DEPC水中；

（8）6管合并成1管，加等体积Tris酚/氯仿，振荡混匀，12000r/min4℃离心3min；

（9）取上清，加入等体积的氯仿，振荡混匀，12000r/min4℃离心5min；

（10）取上清，加入3倍体积的无水乙醇，终浓度为0.3mol/L的NaAc，-70℃放置15min；

（11）12000r/min4℃离心15min，气干后沉淀溶于适量DEPC水中；

（12）加入DNaseⅠ去除DNA；

（13）取少量RNA采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，用紫外分光光度计进行纯度检测及定量。

1.2.2cDNA第一链的合成

反转录体系：

反应程序：37℃15min，85℃5s。产物稀释10倍，作为后续PCR模板。

1.2.3BpGA20ox1基因片段的克隆

1.2.3.1引物设计：

根据GenBank中登录的板栗（Castanea mollissima），苹果（Malus domestica），欧洲山杨（Populus tremula）银白杨（Populus alba）夹竹桃（Nerium oleander）、欧洲山毛榉（Fagus sylvatica）等物种的GA20ox基因序列，依照基因的同源性设计简并引物：

GA20F1：TC(CT)AA(AG)(CT)T(TG)CCATGGAAAG

GA20R1：ACTTG(AG)TCTTG(AG)TGAAG(GT)AT

1.2.3.2RT-PCR反应：

反应体系：

反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳检测。

1.2.3.3PCR产物与克隆载体pMD18-T连接

将PCR产物进行胶回收（Promega胶回收试剂盒），然后连接到pMD18-T上。

连接体系：

反应条件：16℃，过夜。

1.2.3.4重组质粒转化大肠杆菌

（1）在已融化的大肠杆菌感受态细胞（50μl/管）中加入5μl目的片段，吸打混匀，冰置30min；

（2）将感受态细胞放入42℃水浴中热激90s，后快速置于冰上2~3min；

（3）在上述感受态细胞中加入500μLLB液体培养基，37℃振床培养1h；

（4）将100mL LB固体培养基熔化，分别加入1mL氨卞青霉素(100mg/mL)、1mLIPTG(23mg/mL)和2mL X-gal（20mg/mL）混匀，倒入培养皿，使之冷却；

（5）取100μL已转化的感受态细胞加到已有培养基的培养皿中，用涂布棒涂匀，倒置培养皿，37℃培养12~16h；

1.2.3.5菌落检测

挑取白色单菌落置于三角瓶中，37℃振床培养6h；菌液PCR检测转化子，反应体系及条件同本实施例1.2.3.2；之后菌液送至北京华大六合生物公司测序。

1.2.4扩增产物的5’端和3’端RACE

1.2.4.1RACE引物

根据本节1.2.3中扩增片段的测序结果分别合成5’和3’端的特异性引物Outer GSP和Inner GSP，5’和3’RACE通用引物由5’和3’RACE试剂盒（TaKaRa）提供。详见表1：

表1RACE扩增引物序列

1.2.4.25’RACE过程

（1）使用Alkaline Phosphatase（Calfintestine）去掉总RNA中裸露的5′磷酸基团；

（2）使用Tobacco Acid Pyrophosphatase去掉mRNA的5′帽子结构，保留一个磷酸基团；

（3）使用T4RAALigase将5’RACEAdaptor连接到去帽后的mRAA上；

（4）以上述的mRAA作为模板，使用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-），Random9mers进行反转录反应合成cDNA。

反转录体系为：

反应条件为：30℃，10min；42℃，1hr；70℃，15min。

（5）使用下游外侧特异性引物Outer GSP和5’RACE Outer Primer进行Outer PCR反应，再使用下游内侧特异引物Inner GSP和5’RACE Inner Primer进行Inner PCR反应。

Outer PCR反应体系：

反应条件：94℃，3min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，1min，20个循环；72℃延伸10min。

Inner PCR反应体系：

反应条件：94℃，3min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃延伸10min。

（6）电泳检测扩增产物并回收目的片段，然后连接到pMD18-T上测序，参照本实施例1.2.3。

1.2.4.33’RACE过程

（1）以总RNA为模板，使用3’RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成第一链cDNA。

反转录体系为：

反应条件：42℃，1hr；70℃，15min。

（2）使用上游外侧特异性引物3’Outer GSP和3’RACE Outer Primer进行Outer PCR反应。如果Outer PCR反应未能得到目的产物，再使用上游内侧特异性引物3’Inner GSP和3’RACE Inner Primer进行Inner PCR反应。

Outer PCR反应体系：

反应条件：94℃，3min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，1min，20个循环；72℃延伸10min。

Inner PCR反应体系：

反应条件：94℃，3min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃延伸10min。

（3）电泳检测扩增产物并回收目的片段，然后连接到pMD18-T克隆载体上测序，参照1.2.3。

1.2.5序列拼接获得完整基因

用Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列拼接。将拼接完的序列与GenBank中其它物种GA20ox1基因进行比对，确定其是否为全长序列。

1.2.6白桦BpGA20ox1基因全长的克隆

1.2.6.1引物设计

根据白桦BpGA20ox1基因全长cDNA序列设计引物，所用引物为：

GA20F2：5’-ATGGCAATAGATTGCATC-3’;

GA20R2：5’-TCAGCTAAAACTTTGTTGAT-3’。

1.2.6.2PCR反应

参照1.2.3.2的反应体系与反应条件，琼脂糖凝胶电泳，检测结果。

1.2.6.3PCR产物与克隆载体pMD18-T连接

参照1.2.3.3将PCR产物进行胶回收并与pMD18-T克隆载体连接，命名为pMD18-T-GA20ox。

1.2.6.4重组质粒（pMD18-T-GA20ox）转化大肠杆菌

参照1.2.3.4将连有目的片段的重组质粒pMD18-T-GA20ox转化到大肠杆菌DH5α中。

1.2.6.5菌落检测

参照1.2.3.5检测白色菌斑，并将带有目的片段的转化子保存并测序。

1.2.7白桦BpGA20ox1基因的生物信息学分析

白桦BpGA20ox1基因全长cDNA序列用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）的Blast程序进行核酸和氨基酸序列相似性比较；用ORF查找程序（ORF FOUNDER）寻找其开放读码框；用ProtParam（http://au.expasy.org/tools/protparam.html）计算蛋白的分子量、等电点；用NCBI的Conserved Domains程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测蛋白的保守区。选取其他植物的GA20ox氨基酸序列，用ClustalX(1.83)多序列比较程序进行多序列比对，并构建系统进化树。

1.3结果与分析

1.3.1白桦总RNA提取

利用CTAB法提取白桦总RNA，并用DNase消化总RNA溶液中的DNA，经过紫外分光光度检测，A₂₆₀/A₂₈₀在1.8~2.0。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1，总RNA28S rRNA和18S rRNA的条带清晰，无降解，且28Sr RNA亮度明显高于18S rRNA，质量满足cDNA的合成的要求。

1.3.2BpGA20ox1基因片段的克隆

根据设计的引物GA20F1和GA20R1从白桦叶片cDNA第1链中扩增出一段长为349bp的中间片段（图2），胶回收后与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，转化子检测（如图3）后测序。测序结果在NCBI网站blastx分析表明，该片段与欧洲黑杨（Populus ngra）和板粟（Castanea mollssima）的GA20氧化酶的同源性分别为97%和90%。BpGA20ox1基因片段序列如下：

TCTAAACTTCCATGGAATGAAACGCTTTCTTTTCGCTACACAGCTGAGAAGAATTCATCAAACCACATCGAGGAATACTTTCATAACAGAATGGGGGAAGATTTCGCTGAATTCGGGAGGGTGTATCAGGACTACTGTGAGGTCCATGAGCACTTTGTCGCTAGGGATCATCCAGCTATTAGGCAAATGAGCCTTGAGTGTGAGCAGAGAACATTTCAGGGAATTCTTTAATGAGAATGATTCAATAATGTGGCTCAACTACTACCCTCCATGCAAAAAACCTGACCTTACTTTAGGCACCGGTCCTCATTGTGATCCAACTTCTTTAACCATCCTTCATCAAGACCAA

1.3.35’端和3’端RACE

1.3.3.15’端RACE

使用5’RACE试剂盒对总RNA进行去除5’帽子结构后与5’RACE Adaptor连接，反转录合成cDNA，进行套式PCR反应扩增出一条长为785bp的片段（图4），其中含非编码区107bp，编码区678bp。胶回收后与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，转化子检测后（如图5）测序。测序结果在NCBI网站blastx分析表明，该片段与欧洲黑杨（Populus nigra）和板粟（Castanea mollssima）的GA20氧化酶的同源性分别为96%和89%,与扩增得到的中间片段序列具有重叠部分。

1.3.3.23’端RACE

对总RNA进行反转录合成cDNA，进行套式PCR反应（图6），产物胶回收后与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，转化子检测后测序（图7）。测序结果得到一条长为820bp的片段，在NCBI网站blastx分析表明该片段含编码区425bp，非编码区395bp，该片段与欧洲黑杨（Populus nigra）和板粟（Castanea mollissima）的GA20氧

化酶的同源性分别为98%和93%,，与扩增得到的中间片段序列具有重叠部分。

1.3.4白桦BpGA20ox1基因全长的克隆

1.3.4.1序列拼接获得完整基因

将获得的三段碱基序列进行序列拼接，得到一条长为1586bp的cDNA序列。

1gaattccctc aaatgttctc tgcaccctgc ctctcaaacc tcacacaatc acaatcacaa

61tcacatacat acatacatac atacatacat atatatatat atggcgattg attgcattaa

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841cctgggcacc ggcccgcatt gcgatccgac cagcctgacc attctgcatc aggatcaggt

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961gtttgtggtg aacattggcg atacctttat ggcgctgagc aacggcattt ataaaagctg

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1141cccgcgtatt tatccggatt ttacctggcc gatgctgctg gaatttaccc agaaacatta

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1441tgcatgaaga gatctcaaaa gtaattagag gccaattctt atttatgtcc atagatctgg

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1561taaagagttg gatgaaaaaa aaaaaa

1.3.4.2白桦BpGA20ox1基因的生物信息学分析

在NCBI网站上用ORF六框翻译找到了该cDNA序列的开放读码框，该基因cDNA编码区序列自101位的ATG起，止于1264位的TGA，全长1164bp，编码387个氨基酸，其中，5’端含非编码区100bp，3’端含非编码区322bp。通过ExPASY网站（http://us.expasy.org/tools/pi_tool.htm）在线分析，计算该基因编码蛋白的分子量为44.3kDa，理论等电点为6.5。用NCBI的Conserved Domains程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测蛋白的保守区，发现该蛋白是2OG-FeII_Oxy基因家族的成员（图8）。

为了分析白桦GA20ox与其他植物GA20ox蛋白的系统发育进化关系，选取拟南芥、夹竹桃、陆地棉、向日葵（Helianthus annuus）、欧洲山毛榉、欧洲山杨、毛果杨、小叶杨、银白杨（Populus alba）、毛白杨（Populus tomentosa）、玉米（Zea mays）、小麦（Triticum aestivum）17种植物GA20ox氨基酸序列，用ClustalX（2.1）进行多序列比对分析后构建了不同物种GA20ox蛋白的进化树（图9）。

实施例二、转基因检测

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和载体

大肠杆菌感受态DH5α购自天为时代生物技术公司；植物表达载体pROK2和农杆菌菌株EHA105均为本实验保存；pMD18-T-GA20ox载体由实施例1中1.2.6.3实验获得。

1.1.2主要试剂

Taq酶（Fermentas）；DNA Marker DL2000（TaKaRa）；琼脂糖（Sigma）；利福平（sigma）；卡那霉素、头孢噻肟钠购自北京鼎国生物技术有限责任公司；限制性内切酶XbaI和SacI、T₄DNA连接酶、胶回收试剂盒等购自Promega公司；其它试剂为国产或进口分析纯。

1.1.3主要仪器设备

高压灭菌锅（SANYO）；超净工作台（AIR TECH）；冷冻离心机（Heraeus）；培养箱HAQ-X100；水平电泳槽（北京六一仪器厂）；凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；显微镜（Motic）；AF100制冰机（Scotsman）；-70℃超低温冰箱（Harris）；-20℃低温冰箱（海尔）；紫外可见分光光度计7500（上海天美科学仪器有限公司）；电子天平（Sartorius）；Milli-Q超纯水制备系统（美国Millipore公司）；PCR仪（GeneAmpPCRsystem9700）；比色皿、光照培养箱（哈尔滨）。

1.2方法

1.2.1植物表达载体pROK2-GA20ox的构建

1.2.1.1引物设计

根据BpGA20ox1基因序列，设计植物正义表达载体引物：

GA20oxF4:5’-CGCTCTAGAATGGCAATAGATTGCATC-3’（下划线为XbaI酶切位点）GA20oxR4:5’-CTAGAGCTCTCAGCTAAAACTTTGTT-3’（下划线为SacI酶切位点）

1.2.1.2扩增带酶切位点的BpGA20ox1基因序列

用PCR的方法引入带XbaI和SacI双酶切位点的BpGA20ox1全长基因，PCR反应体系如下：

反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳检测。

1.2.1.3PCR产物和表达载体pROK2双酶切

将上述PCR产物（含XbaI和SacI限制性内切酶位点），经胶回收试剂盒纯化后，与表达载体pROK2同时进行双酶切。

双酶切体系如下：

反应条件：37℃，保温4h以上。将双酶切产物用胶回收试剂盒纯化后，电泳检测效果，并测其浓度。

1.2.1.4目的产物与载体双酶切产物的连接

将双酶切产物GA20ox和pROK2相连接，连接体系如下：

反应条件：16℃，过夜。连接产物命名为pROK2-GA20ox。

1.2.1.5重组质粒的转化与鉴定

将上述重组质粒（pROK2-GA20ox）转化入大肠杆菌感受态DH5α，涂布于含卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养12~16h。随机挑选单克隆扩大培养，进行PCR和双酶切检测。PCR检测参照本实施例中1.2.1.2扩增带酶切位点的BpGA20ox1基因序列，双酶切检测参照3.2.1.3PCR产物和表达载体pROK2双酶切。

1.2.2重组质粒转化农杆菌

1.2.2.1农杆菌感受态的制备

（1）将保存的农杆菌EHA105菌株在含50mg/L利福平的LB固体培养基上划线，28℃培养48h；

（2）挑取单克隆，于20mL含50mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；

（3）当OD600达到0.5~0.7时，5000rpm4℃离心10min收集菌体；

（4）用预冷的10%无菌甘油洗菌体3次；

（5）用2mL预冷的10%无菌甘油重悬沉淀，分装后液氮速冻，于-70℃保存备用；

1.2.2.2电击转化及检测

（1）取重组质粒（pROK2-GA20ox）2μL，加入100μL EHA105感受态细胞中混匀；

（2）将混合液放入预冷的电击杯中，1800V电击；

（3）电击完成后迅速加入500μL LB液体培养基，吸打混匀，将混合液移入无菌的离心管中，28℃摇菌3h复苏；

（4）取200μL菌液涂布于含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB固体培养基上，28℃培养48h；

（5）挑取单菌落于含卡那的液体LB培养基中，28℃培养24h；

（6）用BpGA20ox1基因两端特异引物进行菌液PCR扩增，确定重组质粒是否转入农杆菌EH105中，方法参照本实施例中1.2.1.2扩增带酶切位点的BpGA20ox1基因序列。

1.2.3烟草的遗传转化

1.2.3.1无菌苗的获得

取非转基因烟草种子消毒，播种于MS基本培养基上，于25±2℃、2500Lux、12h/d光照下培养，取长出子叶的小苗接种于培养瓶中，待无菌苗长出4~5片叶子时即可作为遗传转化的受体材料。

1.2.3.2根癌农杆菌介导的烟草遗传转化

（1）农杆菌培养：于超净工作台中，将工程菌菌液（OD600=0.6左右）转入离心管中，4000rpm，离心5min，去除上清液，将收集的菌体用灭菌蒸馏水稀释至终浓度为OD600=0.05，即可用于侵染；

（2）侵染：在超净工作台中，将无菌叶片切成2×2cm²的小块，在菌液中浸泡1min，取出叶片用无菌滤纸吸去多余菌液；

（3）共培养：将浸染过的叶片接种在不含抗生素的分化培养基上，于25±2℃暗培养条件下共培养2~3天；

（4）脱菌：将共培养叶片转移至含100mg/L卡那霉素和300mg/L头孢霉素的MS分化培养基上，第一周每隔两天脱一次菌，之后每5天脱一次菌，脱菌5次以后，半个月换一次培养基；直至分化出小苗；

（5）生根培养：待不定芽长到1cm左右时将其切下，移入生根培养基上（含100mg/L卡那霉素和300mg/L头孢霉素）进行生根培养；

（6）转基因植株的移栽：选择健壮的转基因烟草和非转基因对照烟草的无菌苗，打开培养瓶瓶盖，室内练苗2~3d，然后洗去附着在根部的培养基，移栽到含肥料的土壤中，每天浇水两次，大约一周后烟草即可成活。

1.2.4转基因烟草的PCR检测

1.2.4.1CTAB法提取烟草基因组DNA

（1）1.5mL离心管中加入600μL2%CTAB提取液，65℃预热；

（2）取转基因及对照组烟草叶片加液氮研磨至细粉状，加入上述预热的CTAB中，振荡混匀，65℃恒温水浴20min，不时摇匀；

（3）冷却至室温后，加入等体积的氯仿和Tris饱和酚，振荡5min，12000rpm离心10min；

（4）上清转入另一个离心管中，重复（3）一次；

（5）取上清液，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置20min，12000rpm离心10min，弃上清；

（6）用75%乙醇洗涤DNA沉淀，室温干燥，加入100μL0.1×TE缓冲液溶解DNA，于-20℃保存，备用。

1.2.4.2转基因植株的PCR鉴定

以中间载体质粒pMD18-T-GA20ox为阳性对照，未经转化的烟草组培苗总DNA作为阴性对照模板，同时设水对照，对转化植株进行PCR鉴定。反应体系及条件参照本实施例中1.2.1.2扩增带酶切位点的BpGA20ox1基因序列。

1.3转基因烟草综纤维素含量测定

选取PCR检测为阳性的卡那抗性烟草植株及未转基因烟草植株,移栽至花盆中,培养2个月后截取茎秆，烘干后研磨成粉状。

参照国家标准GB2677.10-81进行测定，具体方法如下：

（1）准确称取2g（称准至0.0001g）干粉置于三角瓶中，加65mL蒸馏水、0.5mL冰乙酸和0.6g NaClO2（亚氯酸钠）摇匀，75℃恒温水浴1h，间隔混匀；

（2）1小时后再加入0.5mL冰乙酸和0.6g NaClO2摇匀，继续75℃恒温水浴1小时，如此反复，直到试样变白即可，即木质素含量在2%-4%；

（3）三角瓶冷却后，将全部液体及残渣进行过滤，冷水冲洗至滤液pH值为中性；

（4）用丙酮冲洗残渣3次，置于干燥箱烘至恒重，利用万分之一电子天平测残渣质量。

综纤维素含量为最后每克样品中残渣所占的毫克数，每个样品设3个重复，取其平均值作为测定结果。

1.4转基因烟草Klason木质素含量测定

选取PCR检测为阳性的卡那抗性烟草植株及未转基因烟草植株，移栽至花盆中，培养2个月后截取茎秆，烘干后研磨成粉状。

按照国家标准GB/T2677.8-1994进行测定，具体方法如下：

（1）即精确称取1g（称准至0.0001g）干粉，用定性滤纸包好并用棉线捆牢，进行苯醇抽提，最后将试样包风干；

（2）将苯醇抽提过的试样移入三角瓶中，加入浓度72％的硫酸15mL，使试样全部为酸液所浸透。然后将三角瓶置在30℃下保温2h，并不时摇荡锥形瓶，以使瓶内反应均匀进行；

（3）向上述三角瓶内容物加入蒸馏水稀释至600mL，保存总体积为560mL煮沸2h；

（4）静置，待三角瓶冷却后，将全部液体及残渣过滤，剩余难溶解的固体残渣经蒸馏水洗涤至洗液不呈酸性为止，置于干燥箱烘至恒重，利用万分之一电子天平测残渣质量。

木质素含量即为每克样品中剩余残渣所占的毫克数，每个样品设3个重复，取其平均值作为测定结果。

1.5转基因烟草纤维长度测定

选取PCR检测为阳性的卡那抗性烟草植株及未转基因烟草植株，移栽至花盆中，培养2个月后截取茎秆备用。纤维长度的测量采用硝酸铬酸混合离析方法，具体方法如下：

（1）将烟草茎外皮去掉，烘干，制成2cm左右的茎段；

（2）取3～4根放入试管中，倒入10%硝酸和10%铬酸等量混合溶液，离析大约6~8个小时；

（3）离析后倒掉混合酸液，用清水冲洗试管直至液体呈澄清状态，用玻璃棒搅拌，纤维就会自动分离出来；

（4）然后用离析针挑出适量的纤维置于载玻片上，制成临时切片；

（5）将临时切片置于Motic光学显微镜测量，每个样品测量值取30个数据，取其平均值作为测量结果。

2植物表达载体正义pROK2-GA20ox的构建

2.1重组质粒的构建

用引物GA20oxF4和GA20oxR4扩增带XbaI和SacI酶切位点的BpGA20ox1基因（图10），之后对BpGA20ox1基因和pROK2质粒同时进行双酶切（图10）。利用T4连接酶将目的基因双酶切产物的正义连接到pROK2上，得到植物表达载体正义pROK2-GA20ox重组质粒。

2.2重组质粒的转化与鉴定

将重组质粒pROK2-GA20ox转化大肠杆菌DH5α，提取重组质粒，用带酶切位点的基因特异性引物进行PCR，并对重组质粒进行双酶切鉴定，PCR产物和酶切产物条带大小与含酶切位点的BpGA20ox1基因一致（图12和图13）。同时用pROK2特异性引物对重组质粒pROK2-GA20ox测序，测序结果得到的序列与BpGA20ox1基因完全一致。

2.3农杆菌转化子PCR鉴定

利用电击法，将构建好的植物表达载体（pROK2-GA20ox）转化到农杆菌EHA105中。PCR检测结果表明，重组质粒pROK2-GA20ox已成功地转入农杆菌中（图14），可以用于侵染烟草。

2.4转基因植株的获得

利用农杆菌介导法对烟草进行遗传转化，获得了大量烟草卡那霉素抗性芽。通过在分化、生根培养基上对这些不定芽的筛选，获得40株转BpGA20ox1基因的卡那霉素抗性烟草（部分转基因植株见图15）。表型观测发现，转正义BpGA20ox1基因烟草的生长速度快于非转基因烟草，株高均有不同程度的增高，开花时间也明显提前。

2.5转基因烟草的PCR检测

从卡那抗性烟草中筛选出10个长势优良的株系，提取总DNA，作为PCR检测的模板，同时分别以非转基因烟草和水为阴性对照、重组质粒pROK2-GA20ox为阳性对照，用基因特异性引物（GA20F2和GA20R2）进行PCR扩增。扩增产物于1%琼脂糖凝胶上电泳，结果如图16所示。在转GA20ox基因的10个株系中，得到了与预期大小的特异性扩增条带，与重组质粒PCR产物条带大小一致，而阴性对照没有条带，初步证明了外源基因已经整合到烟草基因组中。对这10个株系进行命名，分别为L1、L4、L8、L9、L10、L14、L15、L30、L32和L40。

2.6转基因烟草综纤维素含量测定

参照国家标准GB2677.10-81测定了部分转基因株系和非转基因烟草的综纤维素含量，每个样品重复三次，方差分析结果如图17，每个转基因株系的纤维素含量相对于非转基因烟草均有不同程度的提高，其中25、26、28和40号植株的P值大于0.05，相对于ck差异不显著，其余转基因株系比非转基因烟草的综纤维素含量显著增加。

2.7转基因烟草木质素含量测定

参照国家标准GB/T2677.8-1994测定了部分转基因株系和非转基因烟草的Klason木质素含量，每个样品重复三次，方差分析结果如图18，转基因株系的P值均大于0.05，可见其木质素含量相对于非转基因烟草并无明显变化。

2.8转基因烟草纤维长度测定

利用硝酸铬酸混合离析方法测定部分转基因株系和非转基因烟草的纤维长度，每个样品测定40个值，取其平均值，方差分析结果如图19，每个转基因株系的纤维长度相对于非转基因烟草均有不同程度的增加，其P值均小于0.05，差异显著。

实施例三白桦BpGA20ox1基因的组织表达特异性分析

为了研究白桦BpGA20ox1基因在不同组织中的表达情况，以白桦的节间、韧皮部、未成熟木质部、成熟木质部、叶柄、成熟叶、嫩叶、顶端分生组织的cDNA为模板，引物检测结果如图，不同组织的PCR产物琼脂糖电泳条带亮度均有所差别（图20）。选用α-actin基因作为内参基因，进行实时荧光定量RT-PCR，用2^-ΔΔCt方法进行基因的相对表达量分析。

从图21中可以看出，白桦BpGA20ox1基因在所选的8个不同组织中均有表达，但其相对表达量不同：BpGA20ox1在成熟木质部中表达丰度最高，在幼嫩叶片中的表达量较高，在未成熟木质部、韧皮部、顶端分生组织和成熟叶中则表达丰度中等，而在叶柄中有少量表达，在节间组织中表达丰度相对最低。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.白桦(Betula platyphylla)GA20oxl基因BpGA20oxl，其核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。

2.根据权利要求1所述的白桦GA20oxl基因BpGA20oxl的应用，其特征在于，应用于纸浆用材林木新品种的育种。