CN101139604A - 草坪草矮化相关基因ga20 - Google Patents

Abstract

本发明从优良草坪草种结缕草中克隆了GA20氧化酶基因及构建了其植物表达载体。通过简并PCR和RACE的方法，从我国野生的结缕草中克隆出了GA20氧化酶基因，该基因全长1311bp，编码区长1109bp，编码区在96－1205bp之间，编码369个氨基酸。其与大麦、小麦和水稻等有65％的同源性。在GenBank上的登录号为：DQ645453。同时以pC1303为基础，分别构建了GA20氧化酶的正义和反义表达载体，该载体含GUS报告基因和潮霉素标记基因，可用于坪草的基因工程育种，以培育矮化型转基因草坪草。

Description

草坪草矮化相关基因GA20

一技术领域：

本发明属植物生物技术领域或作物育种领域。具体说，涉及结缕草的培养、RNA的提取、引物设计、基因克隆和载体构建的相关技术。从而从结缕草中获得了GA20氧化酶基因，并构建了该基因的正义和反义植物表达载体。

二背景技术：

草坪具有绿化美化、水土保持、调节小气候、观赏和运动等功能，对于居民休憩、娱乐及景观等具有举足轻重的作用。目前，北京已建植草坪4000多公顷，年增250多公顷，为北京的环境美化与首都人民生活质量提高发挥了重要的作用。然而，草坪修剪与灌溉等耗费了大量的人力和物力，通常30％～40％的管理费用于草坪草修剪。矮化的草坪草以其低修剪率、低耗水率而受到越来越多的重视，逐渐成为草坪草育种工作的一个方向。

赤霉素(GA)是调节和控制植物生长最基本的一种内源激素，它有许多与植物生长和发育相关的生理功能，如诱导α-淀粉酶的形成，促进禾谷类种子萌发、节间和叶片伸长，促使茎的伸长和植株增高，促进花器官、孤雌生殖和果实形成等。当植物体内GA的浓度过大时则会抑制植物生长。大多数植物体内的活性GAs以GA1或GA4为主，中间产物和非活性GAs(结合态GAs)有几十种。二十世纪60年代小麦矮化品种的育成推广是该时期农业增产的主要原因。这些小麦品种是因为基因突变导致其赤霉素作用靶位点正常感知能力失活，从而引起矮化国外已有科学家将目光关注于转基因矮化草坪草新品种的培育上，主要是应用矮化基因、系统选育和杂交育种等方法。而这方面结合赤霉素合成相关基因的研究目前还没有报道。

GA20氧化酶是一种双加氧酶，需要2-酮戊二酸和氧分子做为辅底物，Fe²⁺和抗坏血酸为辅因子，直接催化生成具有生物活性的GAs，而且在植物矮化型和徒长型突变体内表达丰度差别很大，因此GA-20氧化酶是最重要的也是目前研究最多的赤霉素生物合成的限速酶。GA-20氧化酶基因首先从南瓜中克隆出来，随后利用南瓜编码GA20氧化酶的cDNA片断合成异源探针，筛选拟南芥基因组文库获得拟南芥GA-0氧化酶基因。这之后，在菠菜、豌豆、烟草等多种植物中获得了该基因的克隆。目前已有20-30种GA20氧化酶基因被克隆出来。

北京林业大学草坪研究所针对国内草坪草基因工程育种研究缺乏自有基因资源，缺乏具有自主知识产权的有用基因，以及社会对优质矮化草坪草新品种的迫切需要等问题，从上世纪90年代初就开始进行国外优良草坪草的引进工作及国内草坪草种质资源的收集整理工作；同时，在国家“863”项目与国家植物转基因与产业化专项的资助下，进行了结缕草、早熟禾、高羊茅、黑麦草、翦股颖等材料的转基因抗逆性改良研究，获得了一批优质高抗逆性草坪草新品系。结缕草(Zoysia Japonica Steud.)是我国资源丰富的唯一不需要进口的草坪草种，具有适应性强，耐旱、抗热、抗寒、耐践踏和耐贫瘠等许多优良性状。本发明从调控植物生长的激素-赤霉素着手，从结缕草中克隆赤霉素生物合成过程中的关键酶-GA20氧化酶基因，研究其作用机制，进一步通过正义与反义表达载体的构建，为下一步获得矮化草坪草新品系(种)的转基因研究工作奠定了基础。

三发明内容：

本发明以中国野生结缕草为材料，采用简并PCR和RACE法获得了GA20氧化酶基因。在此基础上，以载体pC1303为基础，构建了GA20氧化酶基因的正义和反义植物表达载体。

本发明的主要步骤包括：以结缕草为植物材料，提取植物总RNA，反转录成cDNA，利用生物软件设计引物，经过简并PCR和RACE的方法获得了GA20氧化酶基因全长cDNA序列，并以pC1303为基础，分别构建了植物正义和反义表达载体。

四附图简要说明：

图1总RBA电泳图；图2目的基因中间片段电泳图；图3目的基因中间片段的核苷酸序列；图4目的基因3′片段基因电泳图；图5目的基因3’端的核苷酸序列；图6目的基因5’端基因电泳图；图7目的基因的5’端的核苷酸序列；图8目的基因全长电泳；图9目的基因全长核苷酸序列；图10GA20氧化酶基因与其同源基因的比较；图11GA20氧化酶基因载体构建图；图12GA20载体构建酶切检测电泳图；图13GA20载体构建PCR检测电泳图

四具体实施方式：

1材料的准备

结缕草取自北京东北旺北京林业大学草坪研究所试验站种质资源圃，采其匍匐茎，带回实验室种植在花盆中，精细管理，长出幼叶后用于实验。

2方法

2.1总RNA的提取和双链cDNA的合成

取结缕草细嫩的叶片，迅速放入液氮中研磨成粉未状，按照Tiangen公司TRNzol试剂盒的操作提取总RNA；cDNA的合成采用的是Takara公司的AMV反转录试剂盒，严格按照该说明书操作。

2.2目的基因片段的获得

2.2.1中间片断的获得

2.2.1.1简并引物的合成

根据已经在GenBank上发表的禾本科植物GA20-oxidase基因的cDNA序列设计简并引物GA20-1和GA20-2，进行PCR扩增。

GA20-1：5’-GSCACGGBTTCTTCCAGGTSG-3’

GA20-2：5’-GCSRWGAAGGTGTCGCCGATGTTG-3’

S＝G/C B＝G/C/T V＝A/C/G R＝A/G Y＝T/G/C W＝A/T

2.2.1.2PCR反应体系及程序

PCR反应体系：

ddH₂O                 17.5μL

Taq PCR Buffer        2μL

dNTP Mixture          2μL

Taq                   0.5μL

GA20-1                1μL

GA20-2                1μL

cDNA     1μL

Total    25μL

反应程序：先进行梯度PCR，找出最佳温度为62℃

94℃       3min

4℃

取5μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。并进行切胶回收目的片段。

2.2.1.3电泳目的基因片段的回收

按Tiangen公司的凝胶回收试剂盒说明书进行。

2.2.1.4连接与转化

连接

在0.2mL的离心管中加入以下各种成分：

PCR回收产物            4μL

pMD-18T载体            1μL

Ligation Solution I    5μL

Total                  10μL

轻缓混匀，16℃反应30min。

转化

试剂：IPTG 50mg/mL，X-gal 20mg/mL

(1)准备LB/Amp/IPTG/X-gal固体培养基。每板涂IPTG和X-gal分别为40μL和10μL，室温下放置2-3小时。

(2)取1管100μL的大肠杆菌JM109感受态细胞，放置在冰上融化。

(3)将连接液加入融化的感受态细胞中，在冰上放置30min，42℃热激1min，冰上放置2min；加入900μLLB溶液，37℃摇床100rpm培养1h，离心集菌，弃900μL上清，重悬沉淀，将剩下的100μL涂于含有100mmol/L氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12-16h进行蓝白斑筛选。

(4)挑取白斑，在含有100mmol/L氨苄青霉素的LB平板划线培养10-12h。

2.2.1.5菌落PCR鉴定阳性克隆

挑划线后的菌做模板，以GA20-1和GA20-2做引物，用Taq酶进行PCR反应。

反应体系和反应程序同前。将PCR鉴定为阳性克隆的菌斑保种测序，测序在上海生工进行。

2.2.2 3’未端的获得

2.2.2.1 3’RACE引物

B26是在oligdT5’端加上18个碱基作为锚定引物，其序列为：

5’-GAC TCG AGT CGA CAT CGA TTT TTT TTT TTT TTT TTT-3’

根据中间片段的测序结果，在靠近3’端处设计两个PCR引物GA20-3和GA20-4，通过嵌套PCR扩增GA20氧化酶的3’端片段。

GA20-3：5’-TCATGCGGCTCAACTACTAC-3’

GA20-4：5’-CGTCCCTCACCATCCTCCACC-3’

2.2.2.2 3’RACE嵌套PCR的体系和程序

第一圈反应体系如下：

PCR反应

ddH₂O             17.5μL

Taq Pcr Buffer    2μL

dNTP Mixture      2μL

Taq               0.5μL

B26               1μL

GA20-3            1μL

cDNA              1μL

Total             25μL

反应程序

94℃             3min

72℃             10min

4℃

第二圈：将第一圈PCR产物稀释10倍，取1μL做为模板用B26和GA20-4引物做第二轮PCR，体系与程序与第一轮相同。PCR产物的回收，与体载体的连接，菌斑检测，提取质粒酶切检测方法如前，送交上海生工公司测序。

2.2.3 5’未端的获得

SMART RACE(CLONETECH)

2.2.3.1 5’RACE所用引物

SMART II Oligonucleotide：

5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGG-3’

5’RACE CDS primer

5’-(T)₂₅N_-1N-3’(N＝A C G or T；N_-1＝A C G)

10×Universal Primer MixA(UPM)：

Long(0.4μM)：

5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’

Short(2μM)：

5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’

Nested Universal Primer：

5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGG-3’

5’特异引物(根据中间片段设计)：GA20-5：5’-AGCTCCGTGGTGCCGGTAGTCCTCT-3’

2.2.3.2反转录加尾反应

(1)在0.5ml的离心管中加入下列物质：

1-3μL         RNA样品

1μL           5’CDS引物

1μL           SMART II Oligo

(2)加水至5μL，混匀，稍离心，70℃水浴2分钟，立即放入冰水浴中2分钟，稍离心，将溶液收集到管底。

(3)在反应管中加入下列物质：

2μL    5×第一链合成Buffer

1μL    DTT(20mM)

1μL    dNTP Mix(10mM)

1μL    PowerScript Reverse Transcriptase

(4)混匀，稍离心，42℃温浴90分钟。

(5)将100μLTricine-EDTA Buffer加入离心管中，轻轻混匀，72℃水浴7min，将产物分装保存在-20℃。

2.2.3.3 5’RACE PCR反应体系及程序

PCR反应体系：

PCR-Grade Water                      34.5μL

10×BD Advantage 2PCR Buffer         5μL

dNTP Mix                             1μL

50×BD Advantage 2 Polymerase Mix    1μL

5’-RACE-Ready cDNA                  2.5μL

UPM                                  5μL

GA5                                  1μL

Total                                50μL

反应程序：

94℃             3min

72℃             10min

4℃

PCR产物的同收，与体载体的连接，菌斑检测，提取质粒酶切检测方法如前，送交上海生工公司测序2.2.3全长cDNA的获得

在获得的5’端ATG起始密码子前设计5’端特异引物，3’端TAG这后设计3’序列保守区引物，序列如下：

GA20-6：5’-CCAGCCGTCGCCTGTGTGTTCGCTTC-3’

GA20-7：5’-CAGAATCATTCCCGGCCAACCAACAACT-3’

PCR反应体系：

ddH₂O                17μL

Pfu Pcr Buffer       2.5μL

dNTP Mixture               2μL

Pfu                        0.5μL

GA20-6                     1μL

GA20-7                     1μL

cDNA                       1μL

Total                      25μL

反应程序：

94℃           3min

72℃           10min

PCR产物的回收，与体载体的连接，菌斑检测，提取质粒酶切检测方法如前，送交上海生工公司测序。

2.3载体构建

对全长基因序列进行分析，以载体pC1303为基础，在上游引物的5’端加上BamH I酶切位点，下游引物的5’端加上HindIII酶切位点来构建正义表达载体，命名为pC1303-GA20+；在上游引物的5’端加上HindIII酶切位点，下游引物的5’端加上BamH I酶切位点来构建正反表达载体，命名为pC1303-GA20-。制备已经测过序的带GA20氧化酶基因已经加上酶切位点的PMD-18T-GA20的正义和反义质粒，分别用BamHI和HindIII酶切pC1303和PMD-18T-GA20，反应体系如下：

ddH₂O                   8μL

PMD-18T-GA20            6μL

Buffer                  2μL

10×BSA                 2μL

BamH I                  1μL

HindIII                 1μL

Total                   20μL

ddH₂O                   8μL

pCU1303                 6μL

Buffer                  2μL

10×BSA                 2μL

BamH I                  1μL

HindIII                 1μL

Total                   20μL

酶切反应温度均为37℃，时间为3-4小时。

回收切下的GA20氧化酶基因片段和pCU1303片段，进行连接，连接体系如下：

T4 DNA Ligase 10×Buffer            1μL

pC1303                              6μL

目的基因回收产物                    2μL

T4 DNA Ligase                       1μL

Total                               10μL

4℃过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109，提取质粒，通过PCR和酶切反应检测阳性克隆pCU1303-GA20正义和反义表达载体，操作方法同前。

3结果与分析

3.1RNA的提取与反转录

将提取的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如附图1。28S，18S，5S三条带十分清晰，证明获得了较完整的总RNA，基本没有降解。RNA的光密度比值为：A₂₆₀/A280＝1.83。证明提取的总RNA没有多糖和蛋白质等污染，纯度较高，可以用于反转录。

3.2中间片段的克隆

根据小麦、拟南芥、水稻、大麦等同源基因的氨基酸保守序列设计兼并引物进行RT-PCR扩增，得到了一个约600bp的目的片段(附图2)，与预测的大小一致。将扩增到的约600bp片段与pMD-18T载体连接，然后转化大肠杆菌。先通过菌落PCR快速筛选到阳性克隆，再对阳性克隆进行酶切鉴定。对该片段进行序列测定后，用Blast软件将该cDNA序列与GenBank中的所有序列进行同源性比较，发现其核苷酸序列(附图3)与小麦GA20氧化酶基因的同源性大约在85％左右。表明我们已经从结缕草叶片中分离出GA20氧化酶基因片段。

3.3 GA20氧化酶基因3’端片段的分离

根据已分离出的序列设计特异引物GA20-3和GA20-4进行3’RACE PCR，扩增出约600bp大小的DNA片段(附图4)。进行进行切胶回收、连接和测序，用Blast软件将测序结果与GenBank中的所有序列进行同源性比较，发现其核苷酸序列(附图5)与小麦GA20氧化酶基因的同源性较高。

3.4GA20氧化酶基因5’端片段的分离

用公用引物longP和UPM引物对SMART反转录产物进行扩增，为了减少非特异带，所用引物较长28nt，GC％含量高于50％，Tm值达到了65℃以上。PCR扩增出了大约500bp大小的带(附图6)，进行切胶回收、连接、酶切和测序等，测序结果(附图7)分析是GA20氧化酶基因。

3.5全长基因的获得

根据3’和5’端序列信息，设计了全长基因的特异引物，对测序结果分析，PCR扩增出大约1300bp的还(附图8)，序列(附图9)分析该基因全长1311bp，编码区长1109bp，在96-1205p之间，编码369个氨基酸。GA20氧化酶是由小的多基因家族编码，其氨基酸序列在不相关的物种中同源性较低，为50％～60％，而基因家庭成员间有65％～85％的同源性，结缕草中的GA20氧化酶与大麦、小麦和水稻等的GA20氧化酶基因有65％的同源性(附图10)。比较几种植物的GA20氧化酶氨基酸序列发现，它们都有一些共同的保守基元，如与结合2酮戊二酸有关的保守一致序列NYYPXCQKP，结缕草的为NYYPPCQRP，有与GA底物结合有关的LPWKET基元。结缕草GA20氧化酶基因在GenBank上核苷酸序列的登录号为：DQ645453。

3.6正义和反义表达载体构建

对全长基因进行分析，以载体pC1303为基础，在上游引物的5’端加上BamH I酶切位点，下游引物的5’端加上HindIII酶切位点来构建正义表达载体，命名为pC1303-GA20+；在上游引物的5’端加上HindIII酶切位点，下游引物的5’端加上BamH I酶切位点来构建正反表达载体，命名为pC1303-GA20-(如图10)。分别进行PCR，连到PMD-18T载体上(PMD-18T-GA20)，再进行酶切、连接。构建后分别进行酶切和PCR检测(如附图11和12)。载体构建为下一步转基因工作打下了基础。

4结论

4.1经过RT-PCR和RACE方法，从我国野生结缕草中克隆到GA20氧化酶基因，该基因全长1311bp，编码区长1109bp，在96-1205bp之间，编码369个氨基酸。其与大麦、小麦和水稻等的GA20氧化酶基因有65％的同源性。在GenBank上的登录号为：DQ645453。

4.2以pC1303为基础，分别构建了GA20氧化酶的正义和反义表达载体，该载体含GUS报告基因和潮霉素标记基因，可用于坪草的基因工程育种，以培育矮化型转基因草坪草。

Claims (7)

1.草坪草矮化相关基因GA20，包括该基因的克隆与其表达载体：

(1)克隆引物；

(2)目的基因；

(3)表达载体。

2.按照权利要求1所述，其特征在于，所用草坪草种可以是：结缕草，高羊茅，多年生黑麦草，草地早熟禾。

3.按照权利要求1所述，其特征在于，克隆引物包括中间片段引物，为GA20-1：5’-GSCACGGBTTCTTCCAGGTSG-3’和GA20-2：5’-GCSRWGAAGGTGTCGCCGATGTTG-3’。

4.按照权利要求1所述，其特征在于，克隆引物还包括3’端嵌套引物，为GA20-3：5’-TCATGCGGCTCAACTACTAC-3’和GA20-4：5’-CGTCCCTCACCATCCTCCACC-3’；克隆引物还包括5’端引物，为GA20-5：5’-AGCTCCGTGGTGCCGGTAGTCCTCT-3’。

5.按照权利要求1所述，其特征在于，克隆引物还包括全长引物，为GA20-6：5’-CCAGCCGTCGCCTGTGTGTTCGCTTC-3’和GA20-7：5’-CAGAATCATTCCCGGCCAACCAACAACT-3’。

6.按照权利要求1所述，其特征在于，目的基因全长1311bp，编码区长1109bp，在96-1205bp之间，编码369个氨基酸。其与大麦、小麦和水稻等有65％的同源性。其核苷酸序列在GenBank上的登录号为：DQ645453。

7.按照权利要求1所述，其特征在于，以pC1303为基础引入BamH I和HindIII酶切位点，分别构建了GA20氧化酶的正义和反义表达载体，该载体含GUS报告基因和潮霉素标记基因，可用于草坪草的基因工程育种，以培育矮化型转基因草坪草。

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