JPWO2011016260A1 - 新規糖転移酵素、新規糖転移酵素遺伝子および新規糖供与体化合物 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)配列番号1または3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号1または3に記載のアミノ酸配列において1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖転移酵素活性を有するタンパク質。
(c)配列番号2または4に記載の塩基配列からなるDNA、
(d)配列番号2または4に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA、
(e)配列番号2または4に記載の塩基配列の縮重異性体からなるDNA。
バニリン酸1-O-βグルコースおよびイソバニリン酸1-O-βグルコースを含む式(I)で表される化合物は、天然物から抽出するのみならず、市販の試薬を用いて公知の方法に従って合成することも可能である。また、既知の糖転移酵素を用いて対応する芳香族カルボン酸に糖を転移させることによっても合成することができる。
本発明は式(A)で表される化合物を含む糖供与試薬に関する。本明細書において、糖供与試薬とは糖転移酵素と組み合わせて用いることにより任意の化合物を配糖化することができる試薬を意味する。
また別の側面において、本発明はポリフェノールに式(A)で表される化合物を含む糖供与試薬と糖転移酵素を反応させることを含むポリフェノールの配糖化方法に関する。ポリフェノールとしては、例えばフラボノイド系のポリフェノール、クロロゲン酸などのクロロゲン酸系のポリフェノール、タンニンなどのフェニルカルボン酸系のポリフェノール、エラグ酸などのエラグ酸系のポリフェノール、セサミンなどのリグナン系のポリフェノール、クルクミンなどのクルクミン系のポリフェノール、ならびにクマリンなどのクマリン系のポリフェノールが挙げられる。
本発明の糖転移酵素は、上述したカーネーションあるいはデルフィニウムに由来する糖転移酵素である。本発明の糖転移酵素としては、配列番号1あるいは3のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。本発明の糖転移酵素には、配列番号1あるいは3のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質も包含される。従って本発明の糖転移酵素には、配列番号1あるいは3のアミノ酸配列において1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖転移酵素活性を有するタンパク質も包含される。
本発明の糖転移酵素遺伝子とは、上述した糖転移酵素、すなわち糖供与体から任意の化合物へと糖を転移させる(任意の化合物を配糖化する)活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。具体的には、本発明の糖転移酵素遺伝子は、上述した糖転移酵素をコードするDNAからなる糖転移酵素遺伝子である。本発明の糖転移酵素遺伝子の具体例としては、配列番号2あるいは4の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子が挙げられる。
本発明はまた、上述した糖転移酵素遺伝子を含む組換えベクターに関する。本発明の組換えベクターは上述した糖転移酵素遺伝子を適当なベクターに導入することにより構築することができる。ベクターの種類は特に限定されず、pBI系、pPZP系、pSMA系、pUC系、pBR系、pBluescript、pET系、pGEM系、pKS1系、pTriEXTM系(TAKARA)、pTrcHis2-TOPOベクター(Invitrogen)などのベクターを用いることができる。また、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)、インゲンマメモザイクウイルス(BGMV)、タバコモザイクウイルス(TMV)等のウイルスベクターも用いることができる。また、pBI系などのバイナリーベクターを用いてもよい。
本発明はさらに、上述した糖転移酵素遺伝子を含む組換えベクターを適当な宿主に導入することによって作製することができる形質転換体に関する。
本発明はさらに、上述した糖転移酵素遺伝子を含む組換えベクターを用いて形質転換することによって得られる、糖転移酵素遺伝子が導入された植物およびこれと同じ性質を有する該植物の子孫に関する。
本発明はまた糖転移酵素の製造方法に関する。本発明の糖転移酵素は、宿主に応じて、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な培地中で培養されることによって、産生することができる。
(1)糖転移酵素の粗酵素液の調製
カーネーション(品種「ビームチェリー」)の桃色の花弁を乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中でパウダー状になるまで磨砕した。そのパウダーを50mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.2)に、凍結しないよう撹拌しながら徐々に加えて溶解させた。次いで遠心分離により不溶性画分を除去した。得られた上清に飽和硫酸アンモニウム溶液を80%となるように加えて、氷上で5分間静置した。析出したタンパク質を遠心分離により回収し、10mMリン酸カリウムバッファーを沈殿が完全に溶解するまで加えた。得られた溶液をSephadex G-25 ゲルろ過担体(GEヘルスケア)を用いて脱塩し粗酵素液を得た。
カーネーション(品種「Red Vital」)の赤色花弁を50%エタノール水溶液に一晩浸漬し、ろ紙を用いてろ過したろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。濃縮したろ液を合成吸着樹脂(ダイヤイオンHP20、三菱化学)にアプライし、素通り画分を回収した。さらに、合成吸着樹脂の5倍量の純水で合成吸着樹脂を洗浄し、先の素通り画分と合わせて減圧濃縮した。この画分に終濃度0.1%になるように酢酸を加えてから、あらかじめ0.1%酢酸水で平衡化しておいたODSカラム(Wakosil C18、和光純薬工業)にアプライした。カラムをカラム充填量の5倍量の0.1%酢酸水で洗浄した後、5%メタノールを含む0.1%酢酸水で溶出される画分を回収して減圧濃縮し、分取HPLCの試料として供した。
粗酵素液30μlに、HPLC画分を3μl、100mMのクエン酸バッファー(pH 5.6)を5μl、および2mMのシアニジン3-グルコシドを3μl加え、その反応溶液を30℃で40分間静置した。その後、20%リン酸水溶液を2.5μl加えて反応を停止させた。不溶物を遠心分離によって除去し、HPLC分析を行った。
カーネーション(品種「ビームチェリー」)の桃色の花弁を乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中でパウダー状になるまで磨砕した。そのパウダーを50mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.2)に、凍結しないよう撹拌しながら徐々に加えて溶解させた。次いで遠心分離により不溶性画分を除去した。得られた上清に飽和硫酸アンモニウム溶液を80%となるように加えて、氷上で5分間静置した。析出したタンパク質を遠心分離により回収し、10mMリン酸カリウムバッファーを沈殿が完全に溶解するまで加えた。得られた溶液をSephadex G-25 ゲルろ過担体(GEヘルスケア)を用いて脱塩し粗酵素液を得た。
カーネーション(品種「ビームチェリー」)の桃色の花弁を乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中でパウダー状になるまで磨砕した。そのパウダーを50mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.2)に、凍結しないよう撹拌しながら徐々に加えて溶解させた。ナイロンメッシュを用いてその溶液を搾り取り、細胞壁等の不溶性のものを取り除いた。その溶液に、さらに終濃度35%になるように硫酸アンモニウムを徐々に加えてよく撹拌し溶解させた。溶液を4℃で30分間静置した後、4℃、15,000×gで30分間遠心分離を行い、上清を回収した。そこにさらに終濃度が55%になるように硫酸アンモニウムを徐々に加えて完全に溶解した。一晩4℃に静置した後、4℃、15,000×gで30分間遠心分離を行った。得られた沈殿に10mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.2)を加えて完全に溶解した後、十分量の10mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.2)に対して透析を行い、粗酵素液を得た。なお、本実施例における全ての操作は、特に記載していない場合はすべて氷上または4℃で行った。
市販のバニリン酸(シグマアルドリッチ)の4位の水酸基およびカルボン酸の水酸基を、臭化ベンジル(シグマアルドリッチ)を用いて、ジメチルホルムアミド(DMF,サーモフィッシャーサイエンティフィック)溶媒中でベンジル保護した。その後、オープンカラム(シリカゲル60(球状),関東化学)(ヘキサン/酢酸エチル=8/1)で未反応物を除去し、精製した。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.65(1H,dd,H-6),7.59(1H,d,H-2),7.41-7.26(9H,m,H-benzylic CH2),6.88(1H,d,H-5),5.33(2H,s,H-benzylic CH2),5.21(1H,s,H-benzylicCH2),3.92(3H,s,CH3)。収率100%。
市販の没食子酸(シグマアルドリッチ)の3,4,5位の水酸基およびカルボン酸の水酸基を、臭化ベンジルを用いてDMF溶媒中でベンジル保護した。その後オープンカラム(ヘキサン/酢酸エチル=8/1)で未反応物を除去し、精製した。
カーネーション(品種「ビームチェリー」)の桃色の花弁より得られた粗酵素61μg、シアニジン3-グルコシド200μMおよび糖供与体(カーネーションから抽出したバニリン酸1-O-βグルコース、または合成したバニリン酸1-O-グルコース(α体、β体)、イソバニリン酸1-O-グルコース(α体、β体)もしくは没食子酸1-O-グルコース(α体、β体)のいずれか)500μMをクエン酸バッファー(pH 5.6)で30μlとした反応溶液で30℃で15分間酵素反応を行った。リン酸の終濃度が1%となるように20%リン酸水溶液を反応液に加えて反応を止め、遠心後の上澄みを、HPLC(Chromolith SpeedROD、4.6×50mm、Merck)を用い、溶離液A(1.5%リン酸水溶液)および溶離液B(90%メタノール水溶液)のB液18%から28%までの直線勾配(5分間)で分離し、解析を行った(流速3.0ml/min、520nm)。各糖供与体に対する酵素の相対活性を、反応生成物(シアニジン3,5-O-βジグルコシド)の波長505nmにおけるHPLCクロマトグラムのエリアから算出した。その結果を以下の表に示す。
(1)糖転移酵素の抽出
液体窒素中で急速冷凍し、-80℃で保存してあったカーネーション(品種「ビームチェリー」)の花弁400g(生重量)を1500mlの抽出バッファー(100mMリン酸カリウム、pH7.2)中でミキサーを用いて十分に破砕した。なお、以降の操作は特に記載していない場合はすべて氷上もしくは4℃で行った。更にホモジナイザー(ポリトロン、KINEMATICA社)を用いて15,000rpmで10分間の破砕を行った。20,000×g、4℃で20分間の遠心分離を行って、上清を回収した。同じ操作を2回繰り返して、合計800gの花弁から約3000mlの粗抽出液を得た。
(a)硫酸アンモニウム沈殿による分画
マグネティックスターラーを用いて攪拌しながら、得られた粗抽出液に細粒硫酸アンモニウムを35%になるように、徐々に加えて完全に溶解した。4℃で2時間静置した後、20,000×g、4℃で20分間の遠心分離を行って上清を回収した。回収した上清に、マグネティックスターラーを用いて攪拌しながら、更に細粒硫酸アンモニウムを55%になるように徐々に加えて完全に溶解した。4℃で一晩静置したのち、20,000×g、4℃で20分間の遠心分離を行って沈殿を回収した。回収した沈殿物を3000mlの10mMリン酸バッファー(pH7.2)に溶解し、透析膜に移しいれて、6Lの10mMのリン酸バッファー(pH7.2)に対して透析を行った。4時間〜12時間後に、リン酸バッファーを交換した。最終的に透析膜内のサンプル量の4000倍となる量のリン酸バッファーで透析を行った。
(a)で透析したサンプル溶液を、あらかじめ10mMリン酸カリウムバッファー(pH7.2)で平衡化しておいたDEAE sepharose FFイオン交換体(GEヘルスケア)を充填したガラスカラム(ベッド体積:350ml)にアプライした。1250mlの10mMのリン酸バッファー(pH7.2)で洗浄した後に、A液:10mMのリン酸バッファー(pH7.2)、B液:0.8M NaClを含む10mMリン酸カリウムバッファー(pH7.2)を用いて、1000mlで、B液の濃度が0%〜100%になるような直線的勾配でタンパク質を分離した。分離したタンパク質溶液は25mlずつ分画した。各画分について、シアニジン-3-O-β-グルコシドを基質とし、バニリン酸1-O-βグルコースを糖供与体とした配糖化酵素活性を測定し、活性のあった画分(31-45画分)を集めて十分量の10mMリン酸カリウムバッファー(pH7.2)に対して透析を行った。
(b)で透析した画分に、細粒硫酸アンモニウムを20%になるように徐々に加えて溶解した。このサンプル溶液をあらかじめButyl平衡化バッファー(10mMリン酸カリウム、20%硫酸アンモニウム、pH7.2)で平衡化しておいたTOYOPEARL-Butyl-650M担体(東ソー)カラム(50mm×100mm、ベッド体積:250ml)にアプライした。1250mlのButyl平衡化バッファーでカラムを洗浄した後、A液:Butyl平衡化バッファー、B液:10mMリン酸カリウムバッファー(pH7.2)を用いて、1250mlでB液の濃度が0%〜100%になるような直線的勾配でタンパク質を分離した。分離したタンパク質溶液を20mlずつ分画した。各画分についてシアニジン-3-O-β-グルコシドを基質とし、バニリン酸1-O-βグルコースを糖供与体とした配糖化酵素活性を測定し、活性のあった画分(63-85画分)を回収してAmicone-15ultra(ミリポア)を用いて濃縮し、10mMのリン酸カリウムバッファーに交換した。
(c)で透析したサンプルを、あらかじめBz洗浄バッファー(10mMリン酸カリウム、pH7.2、0.5M NaCl)で平衡化しておいたBenzamidine Sepharose 4 Fast Flow カラム(ベッド体積:8ml)にアプライした。カラムを40mlのBz洗浄バッファーで洗浄した後、A液:Bz洗浄バッファー、B液:Bz溶出バッファー(10mMリン酸カリウム、pH7.2、0.5M NaCl、20mM 4-アミノベンズアミジン)を用いて、80mlでB液の濃度が0%〜100%になるような直線的勾配でタンパク質を分離した。分離したタンパク質溶液を2mlずつ分画した。各画分についてシアニジン-3-O-β-グルコシドを基質とし、バニリン酸1-O-βグルコースを糖供与体とした配糖化酵素活性を測定し、活性の認められた画分(27-33画分)を回収し、Amicone-15ultraを用いて濃縮し、10mMのリン酸カリウムバッファーに交換した。
(d)で得られたサンプル溶液を、あらかじめゲルろ過バッファー(10mMリン酸カリウム、pH7.2、150mM NaCl)で平衡化しておいたSuperdex 7510/300GL(GEヘルスケア)にアプライした。タンパク質を、ゲルろ過バッファーを流速0.5ml/minで通液することにより分離した。分離したタンパク質を500μlずつ分画し、各画分についてシアニジン-3-O-β-グルコシドを基質とし、バニリン酸1-O-βグルコースを糖供与体とした配糖化酵素活性を測定し、活性の認められた画分(29-32画分)を回収してAmicone-15ultra(ミリポア)を用いて濃縮し、10mMのリン酸カリウムバッファーに交換した。
(e)で得られたタンパク質溶液をあらかじめETH平衡化バッファー(10mMリン酸カリウム、pH7.2、35%硫酸アンモニウム)で平衡化しておいたResouce ETH(GEヘルスケア)にアプライした。ETH平衡化バッファーでカラムを洗浄した後、A液:ETH平衡化バッファー、B液:ETH溶出バッファー(10mMリン酸カリウム、pH7.2、15%硫酸アンモニウム)を用いて、19分間でB液の濃度が0%〜100%になるような直線的勾配(流速0.8ml/min)でタンパク質を分離した。分離したタンパク質溶液を300μlずつ分画し、各画分についてシアニジン-3-O-β-グルコシドを基質とし、バニリン酸1-O-βグルコースを糖供与体とした配糖化酵素活性を測定し、活性の認められた画分(20-25画分)を回収してAmicone-15ultra(ミリポア)を用いて濃縮し、10mMのリン酸カリウムバッファーに交換した。
(f)で得られたタンパク質溶液に飽和硫酸アンモニウム水溶液を終濃度20%となるように加えた。このサンプル溶液をあらかじめButyl平衡化バッファー(10mMリン酸カリウム、20%硫酸アンモニウム、pH7.2)で平衡化しておいたHiTrap Butyl(GEヘルスケア)にアプライした。5mlのButyl平衡化バッファーでカラムを洗浄した後、A液:Butyl平衡化バッファー、B液:Butyl溶出バッファー(10mMリン酸カリウムバッファー、pH7.2、10%エチレングリコール)を用いて19分間で、B液の濃度が0%〜100%になるような直線的勾配(流速1ml/min)でタンパク質を分離した。分離したタンパク質溶液は300μlずつ分画した。各画分についてシアニジン-3-O-β-グルコシドを基質とし、バニリン酸1-O-βグルコースを糖供与体とした配糖化酵素活性を測定し、活性の認められた画分(43-48画分)を回収してAmicone-15ultra(ミリポア)を用いて濃縮し、10mMのリン酸カリウムバッファーに交換した。
上記(b)〜(g)における、シアニジン-3-O-β-グルコシドを基質としバニリン酸1-O-βグルコースを糖供与体とした配糖化酵素活性測定は、以下の手順に従って行った。
精製した糖転移酵素タンパク質のアミノ酸配列の解析を、アプロサイエンス社(徳島県鳴門市)の高感度タンパク質内部配列分析受託サービス、ならびに通常感度N末端アミノ酸配列分析受託サービスを利用して行った。タンパク質内部配列解析の結果、「GLEYYNNLVNA(配列番号5)」、「GTQPHVTLLH(配列番号6)」、「FTPXETELLTG(配列番号7)」、の3種類のアミノ酸配列が存在していることが分かった。また、N末端アミノ酸配列分析の結果から、このタンパク質は「SEFDRLDFPK(配列番号8)」というアミノ酸配列から始まるタンパク質である事が明らかとなった。また、N末端アミノ酸配列分析においては、上記のほかに2種類のアミノ酸配列「EFDRLDFPKH(配列番号9)」「PSEFDRLDFP(配列番号10)」が含まれていることが分かり、精製の過程でN末端が分解したか、植物体内でのプロセシングする酵素の基質特異性が低いことが考えられた。
カーネーション(品種「ビームチェリー」)の花弁からRNAの抽出を、改変GTC/CsCl密度勾配遠心法(Chirgwin et al., 1979)を用いて行った。各組織片を液体窒素中で、乳鉢と乳棒を用いてよく破砕し、50mlのポリプロピレン製遠心沈殿管に移し、-80℃で完全に液体窒素を気化させた後に、3mlのGTC溶液(4.23Mチオシアン酸グアニジン、25mMクエン酸三ナトリウム、100mM 2-メルカプトエタノール、0.5% N-ラウロイルサルコシン)を加え直ちによく混合した。室温で30分放置した後、20,000×gで20分間遠心し、上清を新しい遠沈管に移してもう一度20,000×gで20分間遠心して完全に不溶物を除去した。このGTC抽出液を予め2.2mlの塩化セシウム溶液(5.7M CsCl, 0.1M EDTA, pH7.5)を分注しておいた5ml超遠心沈殿管(Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA)に重層し、70,000rpm(TL-100 Ultracentrifuge, TLA110 roter, Beckman Coulter Inc.)で、3時間超遠心した。沈殿したtotal RNAを300μlのTE-SDS buffer(10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA, 0.1% SDS)に縣濁した。得られたtotal RNAからOligotex-dT<super>(TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan)を用いてpoly(A)+RNAを精製した。方法はキットのマニュアルに従った。
糖転移酵素のN末端アミノ酸配列解析の結果明らかになったN末端に翻訳開始のためのメチオニン残基が付加されるように設計したセンスプライマー「ATGTCGGAGTTTGACCGCCTTGACTTTC(配列番号15)」と、ストップコドンを含まないように設計したアンチセンスプライマー「GTAGAAGTACGTATGTG(配列番号16)」を用いてPCRを行い、pTrcHis2-TOPO TA expression Kit(Invitrogen)を用いてpTrcHis2-TOPOベクター(Invitrogen)に連結し、大腸菌JM109株に形質転換した。形質転換した大腸菌からDNAを抽出して先の方法と同様にしてDNA塩基配列を解析し、cDNAの導入された向きとPCRによる塩基置換がないことを確認した。
(1)糖転移酵素をコードするcDNAの単離(デルフィニウム由来)
デルフィニウム(品種「マリンブルー」)の花弁からRNAの抽出を、改変GTC/CsCl密度勾配遠心法(Chirgwin et al., 1979)を用いて行った。各組織片を液体窒素中で、乳鉢と乳棒を用いてよく破砕し、50mlのポリプロピレン製遠心沈殿管に移し、-80℃で完全に液体窒素を気化させた後に、3mlのGTC溶液(4.23Mチオシアン酸グアニジン、25mMクエン酸三ナトリウム、100mM 2-メルカプトエタノール、0.5% N-ラウロイルサルコシン)を加え直ちによく混合した。室温で30分放置した後、20,000×gで20分間遠心し、上清を新しい遠沈管に移してもう一度20,000×gで20分間遠心して完全に不溶物を除去した。このGTC抽出液を予め2.2mlの塩化セシウム溶液(5.7M CsCl, 0.1M EDTA, pH7.5)を分注しておいた5ml超遠心沈殿管(Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA)に重層し、70,000rpm(TL-100 Ultracentrifuge, TLA110 roter, Beckman Coulter Inc.)で、3時間超遠心した。沈殿したtotal RNAを300μlのTE-SDS buffer(10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA, 0.1% SDS)に縣濁した。得られたtotal RNAからOligotex-dT<super>(TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan)を用いてpoly(A)+RNAを精製した。方法はキットのマニュアルに従った。
DgVA7GTの液胞移行シグナルと予想されたN末端28アミノ酸残基を除いた配列に翻訳開始のためのメチオニン残基が付加されるように設計したセンスプライマー「ATG CCC GAA TTT AAT GTC AG(配列番号19)」と、ストップコドンを含まないように設計したアンチセンスプライマー「CTG TGA AGA GTA CGA TAT C(配列番号20)」を用いてPCRを行い、pTrcHis2-TOPO TA expression Kit(Invitrogen)を用いてpTrcHis2-TOPOベクター(Invitrogen)に連結し、大腸菌JM109株に形質転換した。形質転換した大腸菌からDNAを抽出して先の方法と同様にしてDNA塩基配列を解析し、cDNAの導入された向きとPCRによる塩基置換がないことを確認した。
花弁の発達4段階、茎、葉における、糖転移酵素をコードする遺伝子の発現量、糖転移酵素活性および蓄積アントシアニン量の解析
カーネーション(品種「ビームチェリー」)における糖転移酵素をコードする遺伝子の発現量の経時変化および器官特異性を調べた。経時変化の解析のために、それぞれ異なる発達段階の4種類の花弁をサンプルとして用いた。加えて、器官特異性の解析のために、茎と葉もサンプルとして用いた。
(1)p-ヒドロキシ安息香酸1-O-β-グルコースの合成
DDBJデータベース上のカーネーション配糖化酵素相同遺伝子(DcUGTA82)のDNA配列情報(DDBJアクセッションNo.AB294379)から設計したPCR用プライマー(DcA82atg: ATGGAGGAGGATAAACAAAAGCC(配列番号27)、DcA82atgrt: ATGTGAAGTAACTTCTTCAATA(配列番号28))と、実施例2に記述した方法で合成した3'-RACE用の鋳型cDNAを用いてPCR法によってバニリン酸配糖化酵素遺伝子を増幅した。増幅したDNAをpTrcHis2-TOPO TA expression Kit(Invitrogen)を用いてpTrcHis2-TOPOベクター(Invitrogen)に連結し、大腸菌JM109株に形質転換した。形質転換した大腸菌からDNAを抽出して先の方法と同様にしてDNA塩基配列を解析し、cDNAの導入された向きとPCRによる塩基置換がないことを確認した。
カーネーション(品種「ビームチェリー」)の桃色の花弁あるいはデルフィニウム(品種「マリンブルー」)の花弁から実施例1と同様の方法により抽出した粗酵素液を用いて糖転移酵素活性を調べた。シアニジン-3-O-β-グルコシド(終濃度200μM)を受容体、p-ヒドロキシ安息香酸1-O-β-グルコース(終濃度1mM)を糖供与体とし、クエン酸バッファーでpH5.6に調整し、30℃、15分間、糖転移酵素反応を行った。リン酸(終濃度1%)で反応を止めた後、遠心して不溶物を除き、上清をHPLCを用いて解析した。HPLC分析はWakopak Handy ODS(4.6×250 mm、和光純薬工業)カラムを用いて、溶離液として1.5%リン酸水溶液およびメタノールを用いて行った。流速1ml/minおよびメタノールの濃度が20%から55%となるような直線勾配(20分間)で分離し、フォトダイオードアレイ検出器を用いて反応生成物を確認した。
実施例3の(2)に示した方法で製造した組換えデルフィニウム由来糖転移酵素を用いて、シアニジン-3-O-β-グルコシドを糖受容体、p-ヒドロキシ安息香酸1-O-β-グルコースを糖供与体とした糖転移酵素反応をおこなった。この反応によって生じたシアニジン-3,7-O-β-ジグルコシドと考えられる生成物を、ODSカラムを用いた中圧クロマトグラフィーによって精製した。精製したサンプル(乾燥重量約 5 mg)を重メタノールに溶解してNOE差スペクトルを測定した。その結果を図12に示す。図中の化学式の矢印は、NOE差スペクトル測定によって示された相関を示したものである。シアニジン骨格のC8位のプロトンとグルコース1位のプロトン、ならびにC6位のプロトンとグルコース1位のプロトンとの間に相関が示されたことから、この糖転移反応によって生じたアントシアニンは、シアニジン3-グルコシドの7位の水酸基にグルコースが転移したシアニジン3,7-ジグルコシドであることが示された。
カーネーションから精製した酵素を用いた、各化合物を糖供与体とした糖転移反応の検証
実施例2の(1)および(2)に示した方法でカーネーション(品種「ビームチェリー」)の桃色の花弁から精製した酵素135ng、シアニジン3-グルコシド200μMおよび糖供与体(バニリン酸1-O-β-D-グルコース、またはMatsuba Y et al., Plant Biotechnology vol.25, No.4 (2008) pp.369-375に記載の方法に従って酵素学的に合成したp-クマル酸1-O-β-D-グルコース、カフェ酸1-O-β-D-グルコース、フェルラ酸1-O-β-D-グルコースもしくはシナピン酸1-O-β-D-グルコースのいずれか)500μMをクエン酸バッファー(pH 5.6)で30μlとした反応溶液で30℃で15分間酵素反応を行った。リン酸の終濃度が1%となるように20%リン酸水溶液を反応液に加えて反応を止め、遠心後の上澄みを、HPLC(Chromolith SpeedROD、4.6×50mm、Merck)を用い、溶離液A(1.5%リン酸水溶液)および溶離液B(90%メタノール水溶液)のB液18%から28%までの直線勾配(5分間)で分離し、解析を行った(流速3.0ml/min、520nm)。各糖供与体に対する酵素の相対活性を、反応生成物(シアニジン3,5-O-βジグルコシド)の波長505nmにおけるHPLCクロマトグラムのエリアから算出した。その結果を以下の表に示す。
Claims (16)
- 以下の(a)または(b)のタンパク質:
(a)配列番号1または3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号1または3に記載のアミノ酸配列において1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖転移酵素活性を有するタンパク質。 - 請求項1に記載のタンパク質をコードするDNAからなる糖転移酵素遺伝子。
- 以下の(c)〜(e)のいずれかのDNAからなる糖転移酵素遺伝子:
(c)配列番号2または4に記載の塩基配列からなるDNA、
(d)配列番号2または4に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA、
(e)配列番号2または4に記載の塩基配列の縮重異性体からなるDNA。 - 請求項2または3に記載の糖転移酵素遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項4に記載の組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
- 請求項2または3に記載の糖転移酵素遺伝子が導入された植物もしくはこれと同じ性質を有する該植物の子孫。
- 請求項5に記載の形質転換体を培養することを含む、請求項1に記載の糖転移酵素の製造方法。
- R1がそれぞれ独立して水素またはC1-6アルキル(C1-6アルキルは非置換であるか、あるいはOH、F、Cl、BrもしくはIから選択される1個以上の基によって置換されていてもよい)から選択される、請求項8に記載の糖供与試薬。
- Xがグルコース、グルクロン酸、ガラクトース、キシロース、アピオース、アロース、ラムノース、アラビノフラノースもしくはマンノースから選択される、請求項8または9に記載の糖供与試薬。
- 式(A)で表される化合物がバニリン酸1-O-βグルコース、イソバニリン酸1-O-βグルコース、p-ヒドロキシ安息香酸1-O-βグルコース、p-クマル酸1-O-βグルコース、カフェ酸1-O-βグルコース、フェルラ酸1-O-βグルコースまたはシナピン酸1-O-βグルコースである、請求項10に記載の糖供与試薬。
- ポリフェノールに請求項8〜11のいずれか1項に記載の糖供与試薬と糖転移酵素を反応させることを含む、ポリフェノールの配糖化方法。
- ポリフェノールがフラボノイドである、請求項12に記載の配糖化方法。
- 糖転移酵素が赤色ではない花弁を有するカーネーション由来あるいはデルフィニウム由来である、請求項12または13に記載の配糖化方法。
- 糖転移酵素が請求項1に記載のタンパク質である、請求項12または13に記載の配糖化方法。
- 請求項8〜11のいずれか1項に記載の糖供与試薬と請求項1に記載のタンパク質とを含む、ポリフェノール配糖化キット。
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