CN111041056B

CN111041056B - 用莲类黄酮c-糖基转移酶ugt708n2合成类黄酮c-糖苷的方法

Info

Publication number: CN111041056B
Application number: CN201911289779.2A
Authority: CN
Inventors: 王亮生; 冯成庸; 李珊珊; 吴倩
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2039-12-13
Also published as: CN111041056A

Abstract

本发明公开了用莲类黄酮C‑糖基转移酶UGT708N2合成类黄酮C‑糖苷的方法。本发明所提供的制备类黄酮C‑糖苷的方法，是使用如下a)或b)所示的蛋白质催化底物合成类黄酮C‑糖苷：a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与类黄酮C‑糖苷合成相关的由a)衍生的蛋白质。本发明所提供的类黄酮C‑糖基转移酶UGT708N2是从莲中获得的，体内体外酶活实验证明，UGT708N2能够催化2‑羟基黄烷酮C‑葡萄糖苷生成2‑羟基黄烷酮双‑C‑糖苷，随后通过脱水反应形成黄酮双‑C‑糖苷；本发明获得的来源于莲的C‑糖基转移酶UGT708N2可用于发酵工程，通过生物转化的方式获得类黄酮C‑糖苷。

Description

用莲类黄酮C-糖基转移酶UGT708N2合成类黄酮C-糖苷的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及用莲类黄酮C-糖基转移酶UGT708N2合成类黄酮 C-糖苷的方法。

背景技术

类黄酮是广泛存在于植物界的次生代谢产物，由于其诸多健康益处，近年来引起了众多学者的关注。尽管核心骨架只有14个类型，但目前发现的类黄酮及其衍生物已超过9000 种。类黄酮的结构多样性源于化学修饰，例如羟基化，甲基化，酰基化，糖基化等。糖基化是最常见的修饰方式，可通过增加化合物的稳定性和溶解性，改变其生物活性，调节其运输和积累，降低其毒性在植物中发挥重要作用。糖通常会通过O-C或C-C键与类黄酮母核连接，从而形成O-糖苷或C-糖苷。与O-糖苷相比，类黄酮C-糖苷由于其独特的化学结构能在一定程度上抵御酸水解和酶降解作用。类黄酮C-糖苷具有丰富的生物学功能，包括抗氧化、抗细菌、抗真菌、紫外线防护等。此外，类黄酮C-糖苷的许多重要药理活性也已得到证实，包括抗炎、抗癌、抗肿瘤、抗糖尿病、抗肥胖、抗病毒、抗高血压以及保护肝脏等。研究表明，荭草苷和异荭草苷具有消炎活性，牡荆苷和异牡荆苷有抗糖尿病活性，夏福塔苷具有保护肝脏的作用(Xiao,J.,Capanoglu,E.,Jassbi,A.R.,and Miron,A. (2016).Advance on theflavonoid C-glycosides and health benefits.Critical reviews in food scienceand nutrition,56(sup1),S29-S45.)；异夏福塔苷具有降血压的功效(Gomes,A.C.C.,Sampaio,L.D.S.,Silva,P.A.D.,Lamas,M.E.,Sakuragui,C.M.,Junior,C.B.B.,Simas,N.K., and Kuster,R.M.(2014).In vitro effect of isoschaftoside isolated fromSyngonium podophyllum on pig kidney Na⁺,K⁺-ATPase.Química Nova,37(10),1606-1609.)；维采宁-1 有抗血小板凝集和防辐射的功效(Kandhare,A.D.,Bodhankar,S.L.,Mohan,V.,and Thakurdesai,P.A.(2016).Development and validation of HPLC methodfor vicenin-1 isolated from fenugreek seeds in rat plasma:application topharmacokinetic,tissue distribution and excretion studies.Pharmaceuticalbiology,54(11),2575-2583.)

糖基化是类黄酮C-糖苷生物合成途径末端的关键步骤之一。与O-糖苷类似，类黄酮C-糖苷也由尿苷二磷酸-糖依赖的糖基转移酶催化产生。迄今为止，已知的糖基转移酶被分为107个家族，所有UGT均属于GT家族1。通常，UGT的多肽在C末端具有保守区域，由44个氨基酸组成，也称为PSPG-box。该基序与糖的识别和结合有关，并且在动物，植物和微生物中高度保守。前人对植物类黄酮糖基转移酶的研究多集中在O-糖基转移酶上(OGT)。近年来，有少数学者对C-糖基转移酶(CGT)催化的分子机理进行了研究。目前，在植物中类黄酮C-糖苷生物合成途径主要有两条。其中一条是，黄烷酮首先在黄酮合酶的作用下形成黄酮，随后黄酮作为CGT的直接底物形成黄酮C-葡萄糖苷。另一条途径则是，黄烷酮首先在黄烷酮2-羟化酶(F2H)作用下形成2-羟基黄烷酮，随后作为 CGT的底物，产生2-羟基黄烷酮C-葡萄糖苷，再通过化学平衡和脱水反应形成黄酮C-葡萄糖苷。

目前，类黄酮C-糖苷主要采取从植物中分离纯化的方式得到。然而，从天然产物中分离纯化该类化合物难度较大且成本昂贵，因为天然产物中该类物质往往浓度较低，且杂质化合物难以去除。有研究人员报道了通过化学合成的方式来获取该类物质，但合成步骤十分复杂且产率较低。

莲，广泛种植于我国境内，具有重要的观赏价值，食用价值，药用价值，文化价值。根据《中国药典》的记载，莲子可清心安神，交通心肾，涩精止血。前期我们研究发现莲子心中含有丰富的黄酮C-糖苷，但其合成的分子机制尚不明晰。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的是提供一种通过生物合成制备类黄酮C-糖苷的方法。

本发明所提供的制备类黄酮C-糖苷的方法，是使用如下a)或b)所示的蛋白质催化底物合成类黄酮C-糖苷：

a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与类黄酮C-糖苷合成相关的由a)衍生的蛋白质。

所述底物为2-羟基黄烷酮C-葡萄糖苷和UDP-五碳糖。

所述2-羟基黄烷酮C-葡萄糖苷为2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷；所述UDP-五碳糖包括UDP-阿拉伯糖和UDP-木糖。

所述a)或b)所示的蛋白质催化底物2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷和UDP-阿拉伯糖合成 2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷-C-阿拉伯糖苷。

所述a)或b)所示的蛋白质催化底物2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷和UDP-木糖合成2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷-C-木糖苷。

本发明所提供的制备类黄酮C-糖苷的方法，包括如下步骤：

(1)将含有序列表中序列3所示核苷酸序列编码基因的重组载体转入工程菌中，得到含有重组载体的工程菌；将所述含有重组载体的工程菌添加至培养基中进行孵育并诱导重组蛋白表达，收集并重悬菌体，得到工程菌液；

(2)将底物加入所述步骤(1)得到的工程菌液中，进行孵育，收集上清，目标产物位于上清液中；将所述上清液进行酸化处理，随后洗脱、纯化，即得到类黄酮C-糖苷。

所述步骤(1)中的所述重组载体是将含有序列表中序列3所示核苷酸序列的编码基因转入pET28a(+)载体中得到的重组载体；所述工程菌为大肠杆菌Rosetta 2(DE3)。

所述步骤(2)中的底物为2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷。

所述步骤(1)中的孵育是在温度为37℃、转速为200rpm的条件下进行孵育，至OD₆₀₀为0.5～0.7之间；所述诱导重组蛋白表达是加入终浓度为0.3mM的异丙基1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，置于22℃和150rpm条件下诱导重组蛋白表达；所述重悬菌体是用含 2％木糖或阿拉伯糖的M9基本培养基重悬菌体使菌体溶液的吸光值OD₆₀₀介于3.0～6.0之间。

所述步骤(2)中的孵育是将工程菌液置于30℃和150rpm条件下孵育12h，每隔2 h向菌液中添加浓度为200μM的底物；所述洗脱是利用20-60％甲醇水进行线性梯度洗脱。

本发明所提供的类黄酮C-糖基转移酶是从莲中获得的，属于UGT家族。体内体外酶活实验证明，UGT708N2能够催化2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷生成2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷-C-阿拉伯糖苷或2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷-C-木糖苷，随后通过脱水反应形成异夏福塔苷和夏福塔苷或维采宁-1和维采宁-3。得到的异夏福塔苷可用于制备降血压的产品；夏福塔苷可用于制备保护肝脏的产品；维采宁-1可用于制备抗血小板凝集和防辐射的产品。

本发明获得的来源于莲的C-糖基转移酶UGT708N2还可用于发酵工程，通过生物转化的方式获得类黄酮C-糖苷。本发明所提供的制备类黄酮C-糖苷的方法，简单高效，获得的产物纯度高。

附图说明

为了说明而非限制的目的，现在将根据本发明的优选实施例、特别是参考附图来描述本发明，其中：

图1为莲候选C-糖基转移酶(CGTs)的氨基酸序列比对结果。

图2为蛋白印迹验证候选CGTs重组蛋白表达结果。

图3为使用重组NnCGTs进行酶活反应产物分析结果。

图4为纯化重组NnCGTs酶学特征。

图5为使用NnCGTs瞬时表达的烟草叶片无细胞提取物进行酶活反应分析结果。

图6不同器官和组织中NnCGTs转录本qRT-PCR分析。

具体实施方式

实施例1、获得莲类黄酮C-糖基转移酶UGT708N2

1、莲候选CGTs分析

前期我们研究发现类黄酮C-糖苷在莲子心中特异积累，在其他组织器官中检测不到 (Li,S.S.,Wu,J.,Chen,L.G.,Du,H.,Xu,Y.J.,Wang,L.J.,Zhang,H.J.,Zheng,X.C.,andWang,L.S.(2014).Biogenesis of C-glycosyl flavones and profiling of flavonoidglycosides in lotus(Nelumbo nucifera).PLoS One,9(10),e108860.)。鉴于此，我们首先尝试通过差异表达基因(DEGs)来筛选候选CGTs。利用幼嫩的莲子心和花被片进行比较转录组分析。当倍差异倍数(FC)值等于或大于4时，我们获得了7个UGTs作为候选CGTs。所有7个候选CGTs(XP_010241747.1，XP_010260356.1，XP_010273391.1，XP_010257044.1， XP_010254573.1，XP_010265663.2和XP_010263455.1)在C端均含有PSPG-box(图1 和表1)。同时，以水稻CGT(OsCGT)为查询序列，通过blastp检索莲的基因组，获得了另一个候选CGT(XP_010258947.1，e值为4e-144)。将8个候选CGTs基因克隆到pET-28a (+)载体(购自德国默克公司)上，并导入大肠杆菌Rosetta(DE3)(购自北京博迈德公司)中研究相应蛋白的酶促活性。最后，XP_010258947.1(NnCGT1，也称为UGT708N1) 和XP_010265663.2(NnCGT2，也称为UGT708N2)被证明具有CGT活性。其中重组蛋白UGT708N1的氨基酸序列如序列表中序列2所示，其编码基因UGT708N1的核苷酸序列如序列表中序列1所示；重组蛋白UGT708N2的氨基酸序列如序列表中序列4所示，其编码基因UGT708N1的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

表1候选CGT基因在基因库中编号及克隆过程中使用的引物序列

2、候选CGTs基因的克隆

按照天根公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书进行植物材料的总RNA提取。该过程中使用的所有研钵、离心管、枪头、ddH₂O等均为RNase-free。具体操作步骤如下：

1.取新鲜植物材料(莲子心)，在液氮中预冷后研磨成粉末(越细越好)，时间不宜过长，避免植物材料中RNA降解。取约100mg粉末加入至2mL离心管中，加入500μL 含5％β-巯基乙醇的SL裂解液(最好现配现用)，立即旋涡振荡并混匀。室温条件下12,000 rpm离心2min。

2.将所得的上清液转移至过滤柱CS中(过滤柱CS放在收集管中)，室温条件下12,000 rpm离心2min。

3.将收集管中的上清液吸取至新的2mL离心管中，缓慢加入0.4倍上清液体积的无水乙醇后混匀。将得到的溶液以及可能出现的沉淀一起转移到吸附柱CR3中，室温条件下12,000rpm离心30s。

4.倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3重新放回收集管中。加入80μL DNase I工作液(现配现用，包含10μL DNase I和70μL RDD)，室温条件下静置15min。

5.向吸附柱CR3中加入350μL的去蛋白液RW1，室温条件下12,000rpm，离心30s。

6.倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3重新放回收集管中。加入500μL的漂洗液RW，室温条件下12,000rpm离心30s。重复此操作步骤一次。

7.倒掉废液，室温条件下12,000rpm离心2min。将CR3放入一个新的1.5mL离心管中，向吸附膜中间部位滴加30μL RNase-Free ddH₂O，室温条件下放置2min，随后12,000rpm离心1min，得到RNA溶液。

8.采用Nanodrop 2000C测定RNA浓度和纯度；利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。将RNA溶液存于-80℃冰箱保存备用。

使用天根公司FastQuant cDNA第一链合成试剂盒进行RNA反转录。为防止RNA降解，以下操作步骤均在冰上进行：

1.按照下述体系配制基因组DNA去除体系混合液：5×gDNA Buffer 3.0μL，总RNA1200ng，RNase-Free ddH₂O补足至15.0μL。简短离心混匀后，置于42℃水浴中3min。

2.冰浴中依次加入以下成分：10×Fast RT Buffer 2.0μL，FQ-RT Primer Mix2.0μL， RT Enzyme Mix 1.0μL。简短离心混匀后，置于PCR仪中，42℃孵育15min，95℃孵育3min。待反应结束后，将得到的cDNA溶液置于-20℃冰箱保存备用。

使用天根公司的高保真PCR试剂盒(Fast HiFidelity PCR Kit)，以莲子心cDNA为模板，设计引物(表1，下划线表示限制性内切酶位点)对候选到的8个CGTs基因进行全长克隆。50μL反应体系如下：5×Fast HiFidelity Buffer 10.0μL，Primer F(10μM)2.0μL，Primer R(10μM)2.0μL，Fast HiFidelity Polymerase(2.5U/μL)1.0μL，cDNA模板1.0 μL，20×Enhancer(2.5μM)2.5μL，ddH₂O 31.5μL。使用如下的PCR扩增条件。预变性： 94℃，2min。扩增：94℃，15s；57℃，10s；68℃，40s；共35个循环。终延伸：68℃， 5min。

3、在大肠杆菌中表达重组蛋白NnCGTs

以莲子心cDNA为模板，获得8个候选CGTs的全长编码序列。随后，将这些基因连接到载体pET-28a(+)中，并分别转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中以诱导蛋白质表达。与6×组氨酸标签融合的重组蛋白用镍亲和柱纯化，并通过蛋白质印迹证实融合蛋白的表达(图2)。具体方法如下：

用限制性内切酶对带酶切位点的候选CGTs进行双酶切，然后连接到载体pET-28a(+) 上。将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导融合蛋白表达。将含有重组质粒的1mL大肠杆菌添加至100mL含有100μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，立即将菌液置于37℃和200rpm下孵育，至OD₆₀₀约为0.6。加入终浓度为0.3mM的异丙基1-硫代-β-D- 半乳糖苷(IPTG)，置于16℃和120rpm条件下诱导重组蛋白表达。孵育24小时后，收集菌体，用缓冲液A(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，10mM咪唑，pH 7.5)重悬菌体。加入溶菌酶(终浓度为1mg/mL)，将混合物在冰上孵育30min，随后在冰上超声破碎10min，离心收集上清。采用Ni-NTA琼脂糖柱对重组蛋白进行纯化。纯化步骤如下：

(1)装柱，根据实验需要，准备合适高度(本实验中约1cm)的Ni-NTA层析柱，将其与带有流速控制关卡的流出管相连，悬挂置于4℃备用。上样前先打开控制阀，使填料悬浮液流尽，用5倍柱体积的Binding buffer平衡层析柱，待溶液流干后关闭控制阀；

(2)将蛋白破碎后上清液加入层析柱，4℃静置3～4h(或静置过夜)，以保证蛋白与层析柱填料充分结合；

(3)以小于1mL/min的流速排出层析柱中的液体；

(4)用10倍柱体积的Wash buffer冲洗层析柱，控制流速小于1mL/min，洗去柱子中的杂蛋白；

(5)用10倍柱体积的Elution buffer洗脱目的蛋白，以小于1mL/min的流速排出并收集蛋白洗脱液，用以后续的蛋白浓缩；

(6)继续用Elution buffer冲洗纯化柱，并将填料保存在Elution buffer中以便下次重复使用。

随后，用Amicon Ultra-15 Ultra 10K(购自德国默克公司)完成重组蛋白的缓冲液置换。纯化和缓冲液替换均在4℃或在冰上进行。通过蛋白质印迹法确认蛋白质的表达，方法参见以下博士论文：顾钊宇.苹果S-RNase介导花粉管γ-硫堇蛋白的防御应答机制研究 [D].北京.中国农业大学，2016.)，并使用Bradford蛋白测定试剂盒(Beyotime)测定蛋白的浓度。

4、重组蛋白的酶学特征

为了进行酶学分析，建立了总体积为50μL的反应体系，其中包括缓冲液B(50mM 磷酸钾，0.01％BSA，5mMβ-巯基乙醇，pH 6.5)，3μg纯化蛋白，1mM供体底物和200 μM受体底物。将混合物在30℃孵育30min，添加50μL 1M HCl或无水甲醇终止反应，4℃和12 000×g条件下离心15min，然后进行HPLC和UPLC-MS/MS分析。

HPLC和UPLC-MS/MS分析条件如下：

用Agilent 1260系统对酶活产物进行HPLC分析。色谱柱为ODS-80Ts QA C18色谱柱(250mm×4.6mm)，水相为2％甲酸水(体积比)，有机相为无水甲醇。梯度洗脱程序如下：0min，15％B；10min，27％B；55min，45％B；60min，15％B。流速为0.8mL/min，柱温控制在35℃，检测波长为280nm，扫描范围为200-800nm。

在配备Xevo^TM TQ-MS三重四极杆质谱仪(Waters)的ACQUITY超高效液相色谱仪(UPLC I-CLASS，Waters，Waters，MA，USA)上进行UPLC-MS/MS分析。对于莲子心，在25℃条件下，以0.2mL/min的流速在

ACQUITYTM BEH C18色谱柱(100 mm×2.1mm，内径1.7μm，Waters)上进行化合物洗脱。水相为0.1％甲酸水(体积比)，有机相为无水乙腈。使用以下线性梯度洗脱程序：0min，5％B；1min，13％B；4min， 24％B；7min，33％B。对于花被片，在

ACQUITYTM HSS C18色谱柱(100mm× 2.1mm，内径1.7μm，Waters)上进行化合物的洗脱，柱温为35℃，流速为0.4mL/min。水相为10％甲酸水(体积比)，有机相为10％甲酸乙腈(体积比)。梯度洗脱程序如下： 0min，5％B；1min，17％B；4min，27％B；5min，90％B；7min，5％B。质谱检测器的参数设置如下：毛细管电压，PI模式为3.00kV，NI模式为2.50kV；锥孔电压，PI模式为10V，NI模式为70V；脱溶剂气流，650L/h；锥孔气流，50L/h；碰撞气流，0.12mL/min；碰撞能量，PI模式为15eV，NI模式为30eV；去溶剂温度350℃；源温度150℃；扫描范围100-1000(m/z)。利用UPLC-MS/MS对酶活产物进行分析时，条件与莲子心的分析条件相同。

利用HPLC和UPLC-MS/MS进行酶活产物分析结果见(图3)。以不添加重组蛋白的酶活反应作为对照(图3中a和图3中b)。我们首先确定了UGT708N1对2-羟基黄烷酮的CGT活性。通过添加甲醇或HCl终止酶活反应。对于以甲醇终止的酶活反应，以2- 羟基柚皮素为底物时，在产物中检测到一个主峰(P1)(图3中c)。在类黄酮C-糖苷中，糖残基部分优先发生断裂，导致出现[(M-H)-120]^-，[(M-H)-90]^-，和[(M-H)-60]^-等碎片离子，不出现苷元离子。因此，在m/z 449[M-H]^-处出现的准分子离子和在m/z 329 [(M-H)-120]^-处的碎片离子表明化合物P1为2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷。对于用1M HCl 终止的反应，以2-羟基柚皮素作为底物会产生两个主峰(P2和P3)(图3中e)。准分子离子m/z 431[M-H]^-和碎片离子m/z 311[(M-H)-120]^-表明化合物P2和P3是异构体(芹菜素C-葡萄糖苷)。通过与商业标准品的共洗脱，将化合物P2和P3分别确认为牡荆苷和异牡荆苷。当使用2-羟基圣草酚作为底物时，获得了类似的结果。当加入甲醇终止反应时，在产物中检测到2-羟基圣草酚C-葡萄糖苷(P4)(图3中d)。用1M HCl终止反应时，得到了荭草苷(P5)和异荭草苷(P6)(图3中f)。这些结果清楚地表明，UGT708N1 可以催化2-羟基黄烷酮C-葡糖苷的形成，但是不能催化产物脱水形成黄酮C-葡萄糖苷。

同时，我们还检测到UGT708N2对2-羟基黄烷酮C-葡萄糖苷(由UGT708N1催化2- 羟基黄烷酮生成，2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷和2-羟基圣草酚C-葡萄糖苷均为2-羟基黄烷酮C-葡萄糖苷)的CGT活性。对于以甲醇终止的酶活反应，当将2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷和UDP-阿拉伯糖用作底物时，检测到产物峰(P7)(图3中g)。准分子离子m/z 581 [M-H]^-和碎片离子m/z 521[(M-H)-60]^-表明化合物P7为2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷-C-阿拉伯糖苷。对于用1M HCl终止的酶活反应，使用2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷和UDP-阿拉伯糖作为底物时，产生了两个峰(P8和P9)(图3中i)。相同的准分子离子m/z 563[M-H]^-和碎片离子m/z 473[(M-H)-90]^-表明化合物P8和P9是异构体(芹菜素C-葡萄糖苷-C-阿拉伯糖苷)。通过与商业标准品共洗脱，化合物P8和P9被确认为异夏福塔苷和夏福塔苷。当将2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷和UDP-木糖用作底物时，观察到相似的结果。加入甲醇终止反应后，检测到2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷-C-木糖苷(P10)。加入HCl终止反应后，检测到维采宁-1(P11)和维采宁-3(P12)(图3中m)。有趣的是，当使用2-羟基圣草酚C-葡萄糖苷和UDP-阿拉伯糖/UDP-木糖作为底物时，没有检测到新的产物生成(图3 中h、图3中j，图3中l和图3中n)。这些结果表明UGT708N2可以在体外将2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷催化为2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷-C-阿拉伯糖苷或2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷-C-木糖苷。

我们使用相应的受体和供体底物确定了重组蛋白UGT708N1和UGT708N2的最适pH和最佳反应温度。为了测定最适pH，使用了pH为5.5-8.5的缓冲液B。为了弄清楚温度对酶活性的影响，选择的温度范围为25-60℃。设置反映时间为5-120分钟以阐明产物随时间的变化。为了获得动力学参数，在最佳pH和温度下，用25-400μM受体底物和1mM 供体底物进行酶活反应。通过添加受体底物启动反应，并孵育5-10min。加入50μL 1M HCl 终止反应。所有上述酶活反应重复测定三次。使用Hyper 32软件Michaelis-Menten方程来计算K_m值。在pH5.5-8.5范围内，pH对UGT708N1的酶活性影响不大，最佳反应pH为 7.5(图4中a)。重组蛋白UGT708N2的酶活性在pH为6.0时达到峰值，然后逐渐降低 (图4中d)。UGT708N1在30℃时表现出最大活性，当温度达到60℃时，酶活性急剧下降(图4中b)；而UGT708N2则在37℃时表现出最大活性，当温度达到50℃时，酶活性下降到最大活性一半以下(图4中e)。在最适温度和最佳pH条件下，对UGT708N1 和UGT708N2酶活反应产物随时间的变化进行了监测(图4中c和f)。对于UGT708N1 和UGT708N2，酶活产物在5-15分钟内随时间线性增加。此后，UGT708N1的反应速率持续降低，并且在60分钟后反应几乎停止(图4中c)。但是，UGT708N2的反应速率在15-120分钟内仅略有下降(图4中f)。这些结果为测定动力学参数提供了重要参考。

对重组蛋白UGT708N1(表2)和UGT708N2(表3)的底物特异性进行检测。选取的受体底物包括2-羟基黄烷酮、2-羟基黄烷酮C-葡萄糖苷、黄烷酮、黄酮、黄酮C-葡萄糖苷和黄酮醇，供体底物则包括UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-阿拉伯糖、UDP-木糖。之前有研究报道了以黄酮为底物的黄酮C-葡萄糖苷的生物合成途径。在本研究中，在UDP- 葡萄糖的存在下，没有检测到CGT对芹菜素或木犀草素有催化活性。两种酶均表现出严格的底物特异性。重组UGT708N1只能使用2-羟基黄烷酮和UDP-葡萄糖作为底物，而重组UGT708N2则只能利用2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷和UDP-阿拉伯糖/UDP-木糖作为底物。UGT708N1对2-羟基柚皮素和2-羟基圣草酚的K_m值分别为4.9μM和6.3μM，与先前报道的其他CGT的K_m值相当，例如，OsCGT对2-羟基柚皮素的K_m值为2.5μM，FeCGTa 对2-羟基柚皮素的K_m值为4.4μM，FeCGTb对2-羟基柚皮素的K_m值为3.7μM。UGT708N2 对2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷的K_m值分别为50.8μM(使用UDP-阿拉伯糖作为糖供体) 和42.3μM(使用UDP-木糖作为糖供体)，低于FcCGT对2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷(112.5 μM，使用UDP-葡萄糖作为糖供体)。

表2纯化重组蛋白UGT708N1对类黄酮的CGT活性和相应的动力学参数

表3纯化重组蛋白UGT708N2对类黄酮的CGT活性和相应的动力学参数

5、NnCGTs在烟叶中的瞬时表达及其酶活性

将UGT708N1和UGT708N2的全长编码序列分别构建到pSN1301载体(记载过pSN1301载体的非专利文献是：Zhou,J.,Li,F.,Wang,J.L.,Ma,Y.,Chong,K.and Xu,Y.Y.(2009)Basic helix-loop-helix transcription factor from wild rice(OrbHLH2)improves tolerance to salt-and osmotic stress in Arabidopsis.Journal of PlantPhysiology,166, 1296-1306.)上，并由CaMV 35S启动子驱动，通过测序验证重组质粒的准确性。将重组质粒转化到根癌农杆菌(GV3101)(购自北京博迈德公司)中，然后通过注射感染烟草叶片。具体方法为：将含有重组质粒的1mL根癌农杆菌加入含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的50mL液体LB培养基中。立即将菌液在28℃和200rpm下孵育24小时，收集细胞并用50mL缓冲液C(10mM 2-N-吗啉代乙烷磺酸(MES)，10mM MgCl₂、 100μM乙酰丁香酮，pH5.2)重悬，悬浮液OD₆₀₀介于0.6到1.0之间。通过注射进行烟草(Brigneti,G.,Voinnet,O.,Li,W.X.,Ji,L.H.,Ding,S.W.,and Baulcombe,D.C.(1998). Retracted:Viralpathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing inNicotiana benthamiana.The EMBO journal,17(22),6739-6746.)叶片的转染，将植物在黑暗中培养48 小时，然后收集被感染的叶片并获得无细胞提取物。

获得烟草叶片无细胞提取物的方法如下：在液氮中用研钵将冷冻鲜样研磨成粉末，称取约1g粉末，加入至4mL提取Buffer中(50mM Tris-HCl，1mM二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)，5％(w/v)聚乙烯聚吡咯烷酮((polyvinylpolypyrrolidone，PVPP)， pH 8.0)，在冰浴上用超声破碎仪破碎2min，12,000×g 4℃离心15min，收集上清，超滤分子筛Amicon Ultra-15 Ultra 10K浓缩。浓缩液使用北京华兴博创生物技术中心提供的预装脱盐柱进行脱盐处理，按如下步骤进行操作：

1.将50mL离心管盖旋开，拧去层析柱的下盖，将离心管盖重新盖好；

2.取下层析柱的上盖，用镊子取出凝胶上的滤片；

3.将需要置换的缓冲液2mL加入层析柱中，配平后2000rpm离心5min，弃去离心管中的液体；

4.重复步骤3五次，更换新的50mL离心管；

5.加入0.5mL蛋白浓缩液，使溶液完全进入树脂中；

6.配平后2000rpm离心5min，收集管底的液体，为除盐后的蛋白溶液；

7.清洗层析柱：在层析柱中加入2mL 20％乙醇，配平后2000rpm离心5min，重复 3次；

8.拧开离心管盖，将层析柱下盖拧上，将离心管盖拧上，在层析柱中加满20％乙醇，将滤片加到凝胶上，用玻棒压平，盖上层析柱上盖，2－8℃保存备用。

随后，检测无细胞提取物对2-羟基黄烷酮的催化活性，检测方法同上(结果如图5所示)。空载体pSN1301作为对照。图5中a和图5中b分别是2-羟基柚皮素和2-羟基圣草酚标准品。以2-羟基柚皮素和2-羟基圣草酚为底物，加入经UGT708N1转化的无细胞叶片提取物后，使用1M HCl终止酶活反应后，检测到了黄酮C-葡萄糖苷(图5中e 和图5中f)。通过与商业标准品的共同洗脱，化合物P2，P3，P5和P6分别被鉴定为牡荆苷、异牡荆苷、荭草苷和异荭草苷。以2-羟基柚皮素为底物，加入经UGT708N1转化的无细胞叶提取物和经UGT708N2转化的无细胞叶片提取物后，用1M HCl终止反应，检测到黄酮双-C-糖苷的产生(图5中g和图5中i)。通过与商业标准品的共同洗脱，化合物P8，P9，P11和P12被鉴定为异夏福塔苷，夏福塔苷，维采宁-1和维采宁-3。以2- 羟基圣草酚为底物，加入经UGT708N1转化的无细胞叶提取物和经UGT708N2转化的无细胞叶片提取物后，用1M HCl终止反应，未检测到黄酮双-C-糖苷的产生(图5中h和图5中j)。在添加空载体转化的无细胞叶片提取物，使用1M HCl终止反应后，未检测到任何黄酮C-糖苷产物(图5中c和图5中d)。这些结果证明了UGT708N1和UGT708N2 在植物体内的功能。

6、NnCGTs在植物器官和组织中的表达

为了表征NnCGTs的时空特异性表达，从不同的植物器官和组织中提取了总RNA。进行定量逆转录qRT-PCR以分析NnCGTs转录水平。

定量RT-PCR分析方法如下：

利用RT-PCR对莲子心、种仁、种皮、叶片、叶柄、花被片和莲房中的NnCGTs进行表达量的分析。使用与上述相同的方法提取总RNA并合成第一链cDNA。使用以下引物对扩增UGT708N1的片段：正向引物(5'-GCCACAACATGGGGATCAGA-3')和反向引物 (5'-ACCAACTTCAACAGCCCTCC-3')，扩增UGT708N2的片段：正向引物(5'-GCTTCCA-CCACCCCTTGTAG-3')和反向引物(5'-CCTGCCCATCACCTTACCAC-3')。10μL反应体系包含5.0μL

Premix Ex Taq^TMII(TaKaRa)，2.0μL双蒸水，2.0μL cDNA模板，0.5μL正向引物和0.5μL反向引物。使用Bio-Rad CFX384实时系统进行PCR。使用β-actin(正向引物5'-GATGCCCTGATGAAGATCC-3'和反向引物5'-CCACTCAGCACA- ATGTTTCC-3')作为内参基因。对于每个样品，进行了三个生物学重复和三个技术重复，以确保定量RT-PCR结果的准确性和可靠性。结果如图6中a和图6中b所示，UGT708N1 和UGT708N2在莲子心中具有相对较高的表达量，但在其他组织器官中也能检测到 UGT708N1和UGT708N2的表达。前期研究发现，黄酮C-糖苷在莲子心中特异积累，其他器官和组织中检测不到(Li,S.S.,Wu,J.,Chen,L.G.,Du,H.,Xu,Y.J.,Wang,L.J.,Zhang, H.J.,Zheng,X.C.,and Wang,L.S.(2014).Biogenesis ofC-glycosyl flavones and profiling of flavonoid glycosides in lotus(Nelumbonucifera).PLoS One,9(10),e108860.)，推测这可能是由于在其他器官和组织中缺少UGT708N1和UGT708N2的前体导致。

实施例2、用于工程菌生产类黄酮C-糖苷

1.工程菌液的制备

将含有UGT708N2的pET28a(+)载体转入大肠杆菌Rosetta 2(DE3)中。将含有重组质粒的1mL大肠杆菌添加至100mL含有100μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，立即将菌液置于37℃和200rpm下孵育，至OD600为0.5～0.7。加入终浓度为0.3mM的异丙基1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，置于22℃和150rpm条件下诱导重组蛋白表达。孵育24小时后，4000×g离心10min，收集菌体，用含2％木糖(或阿拉伯糖)的M9基本培养基(Green MR,Sambrook J(2012)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th Ed. Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)重悬菌体，使菌体溶液的吸光值OD600介于3.0～6.0之间，该菌液作为工程菌液用于生物转化。

2.产物生成及分离纯化

将底物(2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷)用DMSO进行溶解，配制成浓度为200mM的母液，随后加入上述工程菌液中，使其终浓度为200μM。将工程菌液置于30℃和150rpm 条件下孵育12h，每隔2h向菌液中添加浓度为200μM的底物。随后，12000×g离心 20min，收集上清，目标产物位于上清液中。将上清液进Sep-Pak Plus C18色谱柱(Waters, Milford,MA,USA)，利用甲醇洗脱以除去上清液中残余的木糖(或阿拉伯糖)。将洗脱液用适量1M HCl稀释后进ODS色谱柱(Wako-gel 50C18,15mm i.d.×120mm；Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)，先用20％甲醇水进行平衡和纯化，随后利用20-60％甲醇水进行线性梯度洗脱。最后，将洗脱液进行浓缩和结晶获得纯化的类黄酮C-糖苷产物。

上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院植物研究所

<120> 用莲类黄酮C-糖基转移酶UGT708N2合成类黄酮C-糖苷的方法

<130> SPI19260

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1419

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT708N1

<400> 1

atggaaatgt catcttccag cgatctccag atactgcctc ctcatgtggc cctcctccca 60

agctctggga tgggtcacct ggtacctttc gtccgccttg ccgctgccct tgcccgccgc 120

aactgcctag tcaccttcat caccacccac ccaactgtgt ctctctccga atcacgactt 180

gtttctcgtc tgctctccgc ctttcctcac gtcactcccc tagagtttca tctcctcccc 240

ttggatcatt ccaccgccaa ctccaaggac cctttcttcc tccaattcga agccattcgc 300

cgatctgctc acctcctctc tcccctcctc tcttcctgtt ctgatccgcc tctctctgct 360

cttatcacag acgtaagctt agcctctgca ttcatctcca tcacggacga gcttcgtctc 420

cctaactaca ttctcttcac atcatctgcc tggatgctat cactctgcct caacttcccc 480

acctttgtcg tcaacactag tactaatctc agtggcggat ccgctacggc tagtgatgac 540

attgaaattc ccggggttcc acccgtaccc aagtcatggc ttccaccact gcttctggat 600

ctgagtaatc tcttcacgac ccaattcatg gccaacggcc aagaactcat aaaatcaaac 660

ggaattttga tcaatacatt cggcaatgca gagcaggcga cagtggcagc gcttaacgaa 720

ggtaaagtgg tgaatgggtt acccccagtg accaagatcg gccctttggc accatgcgag 780

ttcgagaagg gttcatcggt ggaatggctt gatggacaac cagctgggtc agtgctgtat 840

gttagcttcg ggagtaggac ggccatgtcg agagaacaaa ttagagagct gggcgatggg 900

ctagtgagga gcgggtgcag gtttctgtgg gtggtgaagg acaagaaagt agacagggag 960

gatgaggagg agttgggtgg gattgtgggt caggagctca tggaaaggat gaaggataat 1020

gggttggtag tgaagaattg ggttgaccaa ggggtggtac tagctcaccc ggctgtcggt 1080

gggttcctga gtcactgtgg gtggaactcg gtgactgagg ctgcatggaa cggtgtgccg 1140

gttttggcat ggccacaaca tggggatcag agcattaatg cccaagtgat ggagaagagt 1200

ggaataggaa tgtgggttaa gagctggggt tggggaagga cagaggtggt gaagggggaa 1260

gagatagggc agaagattgg ggaaatgatg gggaatgacc gtctgaaagc ccaagcggcg 1320

aatattagag aggaatctag gagggctgtt gaagttggtg gaggttctta caaggagttg 1380

gagggaataa ttgagaagtg gaagattagc agaatctaa 1419

<210> 2

<211> 472

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT708N1

<400> 2

Met Glu Met Ser Ser Ser Ser Asp Leu Gln Ile Leu Pro Pro His Val

1 5 10 15

Ala Leu Leu Pro Ser Ser Gly Met Gly His Leu Val Pro Phe Val Arg

20 25 30

Leu Ala Ala Ala Leu Ala Arg Arg Asn Cys Leu Val Thr Phe Ile Thr

35 40 45

Thr His Pro Thr Val Ser Leu Ser Glu Ser Arg Leu Val Ser Arg Leu

50 55 60

Leu Ser Ala Phe Pro His Val Thr Pro Leu Glu Phe His Leu Leu Pro

65 70 75 80

Leu Asp His Ser Thr Ala Asn Ser Lys Asp Pro Phe Phe Leu Gln Phe

85 90 95

Glu Ala Ile Arg Arg Ser Ala His Leu Leu Ser Pro Leu Leu Ser Ser

100 105 110

Cys Ser Asp Pro Pro Leu Ser Ala Leu Ile Thr Asp Val Ser Leu Ala

115 120 125

Ser Ala Phe Ile Ser Ile Thr Asp Glu Leu Arg Leu Pro Asn Tyr Ile

130 135 140

Leu Phe Thr Ser Ser Ala Trp Met Leu Ser Leu Cys Leu Asn Phe Pro

145 150 155 160

Thr Phe Val Val Asn Thr Ser Thr Asn Leu Ser Gly Gly Ser Ala Thr

165 170 175

Ala Ser Asp Asp Ile Glu Ile Pro Gly Val Pro Pro Val Pro Lys Ser

180 185 190

Trp Leu Pro Pro Leu Leu Leu Asp Leu Ser Asn Leu Phe Thr Thr Gln

195 200 205

Phe Met Ala Asn Gly Gln Glu Leu Ile Lys Ser Asn Gly Ile Leu Ile

210 215 220

Asn Thr Phe Gly Asn Ala Glu Gln Ala Thr Val Ala Ala Leu Asn Glu

225 230 235 240

Gly Lys Val Val Asn Gly Leu Pro Pro Val Thr Lys Ile Gly Pro Leu

245 250 255

Ala Pro Cys Glu Phe Glu Lys Gly Ser Ser Val Glu Trp Leu Asp Gly

260 265 270

Gln Pro Ala Gly Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Arg Thr Ala

275 280 285

Met Ser Arg Glu Gln Ile Arg Glu Leu Gly Asp Gly Leu Val Arg Ser

290 295 300

Gly Cys Arg Phe Leu Trp Val Val Lys Asp Lys Lys Val Asp Arg Glu

305 310 315 320

Asp Glu Glu Glu Leu Gly Gly Ile Val Gly Gln Glu Leu Met Glu Arg

325 330 335

Met Lys Asp Asn Gly Leu Val Val Lys Asn Trp Val Asp Gln Gly Val

340 345 350

Val Leu Ala His Pro Ala Val Gly Gly Phe Leu Ser His Cys Gly Trp

355 360 365

Asn Ser Val Thr Glu Ala Ala Trp Asn Gly Val Pro Val Leu Ala Trp

370 375 380

Pro Gln His Gly Asp Gln Ser Ile Asn Ala Gln Val Met Glu Lys Ser

385 390 395 400

Gly Ile Gly Met Trp Val Lys Ser Trp Gly Trp Gly Arg Thr Glu Val

405 410 415

Val Lys Gly Glu Glu Ile Gly Gln Lys Ile Gly Glu Met Met Gly Asn

420 425 430

Asp Arg Leu Lys Ala Gln Ala Ala Asn Ile Arg Glu Glu Ser Arg Arg

435 440 445

Ala Val Glu Val Gly Gly Gly Ser Tyr Lys Glu Leu Glu Gly Ile Ile

450 455 460

Glu Lys Trp Lys Ile Ser Arg Ile

465 470

<210> 3

<211> 1380

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT708N2

<400> 3

atgtcagata ccaacactct ccacgtagct atcctcccta gctcagggat gggtcacctt 60

gtccctgccg tccgccttgc tgcttctctt gccgctcgca actgtcgaat caccttcatc 120

accacccacc caaccgtctc ccttgccgag tcacgcctcg tctctcgcct cgtctccttc 180

ttccctaatg tcactcgaca agagtttcat ctccttccct tggaccgctc aactgccaac 240

tcaaatgacc ctttctgcct ccagtttgag accatccgcc gctccgctca cctcctctct 300

ccaatcctct cttcctgttc tccgcctctc tctgctcttg tcacagaccc gagcttagtc 360

tcagcggtca tccctatcac ggaaaagctt cgccttgcta attacaacct cttcatagca 420

agtccaaaga tgttgtcact cttaatctac ttccctacca tcgctaatac tgacctcagc 480

accacttcct ctaaaactac cgattatatc gaaattcctg gtattccacc cctacccaag 540

tcatggcttc caccacccct tgtagatcct agtagcctct tcaggaccca gttcatagcc 600

aatggtcaag agatagtaaa atccgatgga attctggtca atgcattcga cagcctagac 660

aaggcaaccg tggcagcgct taacggtggt aaggtgatgg gcaggttgcc gccggtgatc 720

acggtcgggc cgtttgtacc attggaattc gagaagggct caccagtgga atggctcgac 780

aggcaaccgg tagggtcagt ggtgtatgtt tgctttggga ataggacagc tgcgtctaga 840

gaacaaatta gagagctggg tgatgggctt gagcggagtg ggtgcaggtt tctgtgggtg 900

gtgaaggaaa agaaagtgga cagagaggat gaggaggagg tgggtgagat tgtgggtcat 960

gggttcctgg agagagtgaa ggagaagggg ttagtggtga agagttgggt ggagcaaggg 1020

gaggtgctag ctcacccggc tgtgggtttg tttctcagtc actgtgggtg gaactcaatc 1080

actgaggctg cattgtacgg tgtgcccatt ttgggatggc cacaaggtgg ggatcagaag 1140

ataaatggag aggtaattcc aaagagtggg ttagggatat gggttgagac ttggggttgg 1200

gaagagatag tgaaggggga agagataggg gacaaaatta gggagatgat gggagatgag 1260

aagctgaaag tccaagcagc ccgtattggg gaagaggcta ggaagtctgt tggagttggt 1320

ggaagttctt acaaaggatt ggagggattg gttgagaaga tgagaaaggg aagagcttga 1380

<210> 4

<211> 459

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT708N2

<400> 4

Met Ser Asp Thr Asn Thr Leu His Val Ala Ile Leu Pro Ser Ser Gly

1 5 10 15

Met Gly His Leu Val Pro Ala Val Arg Leu Ala Ala Ser Leu Ala Ala

20 25 30

Arg Asn Cys Arg Ile Thr Phe Ile Thr Thr His Pro Thr Val Ser Leu

35 40 45

Ala Glu Ser Arg Leu Val Ser Arg Leu Val Ser Phe Phe Pro Asn Val

50 55 60

Thr Arg Gln Glu Phe His Leu Leu Pro Leu Asp Arg Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Ser Asn Asp Pro Phe Cys Leu Gln Phe Glu Thr Ile Arg Arg Ser Ala

85 90 95

His Leu Leu Ser Pro Ile Leu Ser Ser Cys Ser Pro Pro Leu Ser Ala

100 105 110

Leu Val Thr Asp Pro Ser Leu Val Ser Ala Val Ile Pro Ile Thr Glu

115 120 125

Lys Leu Arg Leu Ala Asn Tyr Asn Leu Phe Ile Ala Ser Pro Lys Met

130 135 140

Leu Ser Leu Leu Ile Tyr Phe Pro Thr Ile Ala Asn Thr Asp Leu Ser

145 150 155 160

Thr Thr Ser Ser Lys Thr Thr Asp Tyr Ile Glu Ile Pro Gly Ile Pro

165 170 175

Pro Leu Pro Lys Ser Trp Leu Pro Pro Pro Leu Val Asp Pro Ser Ser

180 185 190

Leu Phe Arg Thr Gln Phe Ile Ala Asn Gly Gln Glu Ile Val Lys Ser

195 200 205

Asp Gly Ile Leu Val Asn Ala Phe Asp Ser Leu Asp Lys Ala Thr Val

210 215 220

Ala Ala Leu Asn Gly Gly Lys Val Met Gly Arg Leu Pro Pro Val Ile

225 230 235 240

Thr Val Gly Pro Phe Val Pro Leu Glu Phe Glu Lys Gly Ser Pro Val

245 250 255

Glu Trp Leu Asp Arg Gln Pro Val Gly Ser Val Val Tyr Val Cys Phe

260 265 270

Gly Asn Arg Thr Ala Ala Ser Arg Glu Gln Ile Arg Glu Leu Gly Asp

275 280 285

Gly Leu Glu Arg Ser Gly Cys Arg Phe Leu Trp Val Val Lys Glu Lys

290 295 300

Lys Val Asp Arg Glu Asp Glu Glu Glu Val Gly Glu Ile Val Gly His

305 310 315 320

Gly Phe Leu Glu Arg Val Lys Glu Lys Gly Leu Val Val Lys Ser Trp

325 330 335

Val Glu Gln Gly Glu Val Leu Ala His Pro Ala Val Gly Leu Phe Leu

340 345 350

Ser His Cys Gly Trp Asn Ser Ile Thr Glu Ala Ala Leu Tyr Gly Val

355 360 365

Pro Ile Leu Gly Trp Pro Gln Gly Gly Asp Gln Lys Ile Asn Gly Glu

370 375 380

Val Ile Pro Lys Ser Gly Leu Gly Ile Trp Val Glu Thr Trp Gly Trp

385 390 395 400

Glu Glu Ile Val Lys Gly Glu Glu Ile Gly Asp Lys Ile Arg Glu Met

405 410 415

Met Gly Asp Glu Lys Leu Lys Val Gln Ala Ala Arg Ile Gly Glu Glu

420 425 430

Ala Arg Lys Ser Val Gly Val Gly Gly Ser Ser Tyr Lys Gly Leu Glu

435 440 445

Gly Leu Val Glu Lys Met Arg Lys Gly Arg Ala

450 455

Claims

1.一种制备类黄酮C-糖苷的方法，其特征在于：使用如下所示的蛋白质催化底物合成类黄酮C-糖苷：

所述蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列4所示；

所述蛋白质催化底物2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷和UDP-阿拉伯糖合成2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷-C-阿拉伯糖苷；或

所述蛋白质催化底物2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷和UDP-木糖合成2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷-C-木糖苷。

2.一种制备类黄酮C-糖苷的方法，包括如下步骤：

（1）将含有核苷酸序列如序列表中序列3所示的编码基因的重组载体转入工程菌中，得到含有重组载体的工程菌；将所述含有重组载体的工程菌添加至培养基中进行孵育并诱导重组蛋白表达，收集并重悬菌体，得到工程菌液；

（2）将底物加入所述步骤（1）得到的工程菌液中，进行孵育，收集上清，目标产物位于上清液中；将所述上清液进行酸化处理，随后洗脱、纯化，即得到类黄酮C-糖苷；

所述底物为2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷和UDP-阿拉伯糖，得到的类黄酮C-糖苷为2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷-C-阿拉伯糖苷；或

所述底物为2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷和UDP-木糖，得到的类黄酮C-糖苷为2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷-C-木糖苷。

3.根据权利要求2所述的制备类黄酮C-糖苷的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的所述重组载体是将含有核苷酸序列如序列表中序列3所示的编码基因转入pET28a（+）载体中得到的重组载体；所述工程菌为大肠杆菌Rosetta 2（DE3）。

4.根据权利要求2所述的制备类黄酮C-糖苷的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的孵育是在温度为37°C、转速为200 rpm的条件下进行孵育，至OD₆₀₀为0.5~0.7之间；所述诱导重组蛋白表达是加入终浓度为0.3 mM的异丙基1-硫代-β-D-半乳糖苷，置于22°C和150 rpm条件下诱导重组蛋白表达；所述重悬菌体是用含2%木糖或阿拉伯糖的M9基本培养基重悬菌体使菌体溶液的吸光值OD₆₀₀介于3.0~6.0之间。

5.根据权利要求2所述的制备类黄酮C-糖苷的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的孵育是将工程菌液置于30°C和150 rpm条件下孵育12 h，每隔2 h向菌液中添加浓度为200 μM的底物；所述洗脱是利用20-60%甲醇水进行线性梯度洗脱。