JP2003515345A - Ｕｄｐ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼ - Google Patents

Ｕｄｐ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼ

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、シアノヒドリン、テルペノイド、フェニル誘導体またはヘキサノール誘導体をグルコースにコンジュゲートさせるＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼをコードしているＤＮＡ分子を提供する。植物において対応する遺伝子のトランスジェニック発現を使用して、対応するグルコシドの生合成に影響を及ぼすことができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、シアノヒドリン、テルペノイド、フェニル誘導体またはヘキサノー
ル誘導体を、グルコースにコンジュゲートさせる、ＵＤＰ−グルコース：アグリ
コン−グリコシルトランスフェラーゼをコードしているＤＮＡ分子を提供する。
植物の対応する遺伝子のトランスジェニック発現を使用して、対応するグルコシ
ドの生合成に影響を及ぼすことができる。
【０００２】 ドゥーリン（dhurrin）の生合成経路がソルガム（Sorghum bicolor）の黄化実
生で研究され、そして２つの膜結合多機能チトクロームＰ４５０に関係すること
が見出された。アミノ酸前駆体Ｌ−チロシンは、（Ｚ）−ｐ−ヒドロキシフェニ
ルアセトアルドキシムを形成する酵素ＣＹＰ７９Ａ１（Ｐ４５０ＴＹＲ）によっ
て、２回ヒドロキシル化され（ＷＯ９５／１６０４１）、それは次に酵素ＣＹＰ
７１Ｅ１（Ｐ４５０ＯＸ）によってシアノヒドリンｐ−ヒドロキシマンデロニト
リルに変換される（ＷＯ９８／４０４７０）。当該酵素のトランスジェニック発
現を使用し、シアン発生グルコシドの生合成経路を修飾し、再構成し、または新
しく確立し、または植物でのグルコシノレート生産を修飾する。
【０００３】 ドゥーリン生合成において、シアノヒドリンｐ−ヒドロキシマンデロニトリル
は、生理学的ｐＨでｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドおよびＣＮ−との平衡を形
成し、そしてＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼ
によってグルコースにコンジュゲートされる。植物は広い範囲の種々の化学構造
をグリコシル化する（glucosylate）高い能力を有するが、植物に存在するグル
コシルトランスフェラーゼの数および基質特異性の範囲は大部分未知である。早
期の研究は、狭いおよび広い基質特異性が見出され得ることを指摘している。不
幸なことに、生物学的活性を同時的に喪失することなく、グルコシルトランスフ
ェラーゼを均質に単離するときに遭遇する困難性は、事態を混乱させている。遭
遇する困難性は、多くのグルコシルトランスフェラーゼが類似の分子量を有し、
不安定で微量で存在することを一部反映している。
【０００４】 推定的な、植物二次代謝グルコシルトランスフェラーゼをコードしている、１
００種を超える種々のｃＤＮＡが、公衆にアクセス可能なデータベースに説明さ
れているが、タンパク質はほんの一部のみ、確認されている。シアン発生植物か
らのシアノヒドリングルコシルトランスフェラーゼの単離の報告はない。本発明
では、トランスジェニック植物で、ＵＤＰ−グルコース：マンデロニトリル−グ
ルコシルトランスフェラーゼおよび酵素ＣＹＰ７９Ａ１およびＣＹＯ７１Ｅ１の
両方の発現は、これらの植物が、アミノ酸チロシンのシアン発生グルコシドドゥ
ーリンへの変換を触媒することを可能とすることを実証する。こうして、植物で
のシアン発生グルコシドの生合成に関係する反応を触媒するタンパク質の組み合
わせた発現は、これらのトランスジェニック植物でのシアン発生グルコシド合成
についての完全な経路を実際に確立する。
【０００５】 遺伝子は、コード配列およびそれに関連する調節配列を意味し、ここでコード
配列はＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ，ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、二本鎖ＲＮ
Ａ、センスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡに転写される。調節配列の例は、プ
ロモーター配列、５’および３’非翻訳配列および終結配列である。さらなるエ
レメント、例えばイントロンもまた存在し得る。
【０００６】 発現は、植物で外因性遺伝子または導入遺伝子の転写および翻訳を一般に意味
する。しかし、タンパク質をコードしない遺伝子、例えばアンチセンス構築物に
ついては、発現という用語は転写のみを意味する。
【０００７】 本発明は以下の解決を提供する： ・シアノヒドリン（マンデロニトリル、ｐ−ヒドロキシマンドニトリル、アセト
ンシアノヒドリンまたは２−ヒドロキシ−２−メチルブチロニトリルのような）
；テルペノイド（ゲラニオール、ネロールまたはβ−シトロネトールのような）
；フェニル誘導体（ｐ−ヒドロキシ安息香酸、安息香酸、ベンジルアルコール、
ｐ−ヒドロキシベンジルアルコール、２−ヒドロキシ−３−メトキシベンジルア
ルコール、バニリン酸またはバニリンのような）またはヘキサノール誘導体（１
−ヘキサノール、トランス−２−ヘキセン−１−オール、シス−３−ヘキセン−
１−オール、３−メチル−３−ヘキセン−１−オールまたは３−メチル−２−ヘ
キセン−１−オールのような）をグルコースにコンジュゲートさせるＵＤＰ−グ
ルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼをコードしているＤＮＡ
分子、およびコードされたタンパク質それ自体；
【０００８】 ・式Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３を有するグルコシルトランスフェラーゼをコードしている
当該ＤＮＡ分子であって、ここで、 ・・Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、アミノ酸残基Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、
Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、
Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓからなる群より
独立的に選択されるアミノ酸残基からなるコンポーネント配列である； ・・Ｒ２は、類似性サーチプログラムのＢＬＡＳＴ２．０セットのコンピュータ
ープログラムｂｌａｓｔｐであってデフォルト値に所望のパラメータセットであ
るものを使用して決定されるような、配列が配列番号１のアラインメントされる
コンポーネント配列に少なくとも５０％同一である、１５０またはそれ以上のア
ミノ酸残基からなる、 当該ＤＮＡ分子
【０００９】 ・Ｒ２が、配列番号１の、１５０−４２５アミノ酸残基、例えばアミノ酸２１な
いし４４５、１６８ないし４４８、または２８１ないし４４８をコードしている
、 当該ＤＮＡ分子； ・Ｒ１およびＲ３が、独立的に０ないし５００アミノ酸残基からなる、 当該ＤＮＡ分子；
【００１０】 ・Ｒ１またはＲ３が、少なくとも３０アミノ酸の長さを有する、そして配列番号
１のアラインメントされるコンポーネント配列に少なくとも６５％同一である、
１または２以上の付加的なコンポーネント配列、例えば配列番号１のアミノ酸２
１ないし５５、１４２ないし１７４、または３０３ないし３４３をコードしてい
る、 当該ＤＮＡ分子； ・配列番号２に定義されるような３００ないし６００アミノ酸残基長のタンパク
質または配列番号１に定義されるタンパク質をコードしている、 当該ＤＮＡ分子；
【００１１】 ・そのようなｃＤＮＡ分子を単離するための方法； ・シアノヒドリン、テルペノイド、フェニル誘導体またはヘキサノール誘導体を
グルコースにコンジュゲートさせる、精製組換えＵＤＰ−グルコース：アグリコ
ン−グルコシルトランスフェラーゼを生産する方法； ・ゲノムに安定的に組みこまれた、当該タンパク質をコードしているＤＮＡまた
は、発現が当該タンパク質の発現を減少させる、センスＲＮＡ、アンチセンスＲ
ＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはリボザイムをコードしているＤＮＡを含む、トランス
ジェニック植物を得る方法、並びに該トランスジェニック植物それ自体。
【００１２】 Arabidopsis thalianaゲノムは、現在のアラビドプシスゲノム配列決定プログ
ラムから演繹されるように、天然産物合成に関係するグルコシルトランスフェラ
ーゼをコードしている近似的に１２０遺伝子を含むと予測される。他の植物はま
た、グルコシルトランスフェラーゼをコードしている多数の遺伝子を含むと予測
される。S. bicolorの多数のグルコシルトランスフェラーゼの存在にもかかわら
ず、１つを除くこれらの予測されたものは、マンデロニトリルおよびｐ−ヒドロ
キシマンデロニトリルに対する高い特異性を発揮しない。これらのグルコシルト
ランスフェラーゼのいくつかのイソフォームの存在により、ソルガムおよび倍数
体形態の進化および分類学上のバックグラウンドを考察することができそうであ
る。ｐ−ヒドロキシマンデロニトリルの不安定性およびカラムクロマトグラフィ
ー中のS.bicolorにおけるｐ−ヒドロキシマンデロニトリルグルコシルトランス
フェラーゼ活性を含む複数ピークの不存在は、特定のグルコシルトランスフェラ
ーゼ（ｓｂＨＭＮＧＴ）がシアン発生グルコシドドゥーリンの生合成に関係する
ことを実証している。
【００１３】 シアン発生グルコシドの生合成は、一般的な経路、すなわちすべての植物で同
じ型の中間体に関係するものに従って進行する。したがって、種々の植物種でこ
れらのプロセスを触媒する酵素は、顕著な類似性を示すことが予測される。この
ことは、アミノ酸のオキシムへの変換に関係する経路の一部についてすでに明確
に実証された。この部分は、試験されたすべての植物で、１または２以上の、Ｃ
ＹＰ７９ファミリーに属するチトクロームＰ４５０酵素によって触媒されること
が実証されている。これらのチトクロームＰ４５０はアミノ酸レベルで４０％よ
り大きい配列同一性を示す。グルコシノレート（glucosinolate）合成における
アミノ酸のオキシムへの当初の変換はまた、ＣＹＰ７９ファミリーに属している
チトクロームＰ４５０酵素によって触媒される。
【００１４】 以前の発見のラインでは、植物においてグルコースのシアノヒドリンへのシア
ン発生グルコシドコンジュゲーションを合成することは、構造的に関連するグル
コシルトランスフェラーゼに関係する保存された生合成経路にしたがうことが予
測される。本発明の目的は、多くのシアノヒドリン、テルペノイド、フェニル誘
導体、およびヘキサノール誘導体（ｐ−ヒドロキシ安息香酸、安息香酸、ベンジ
ルアルコール、ｐ−ヒドロキシ−ベンジルアルコールおよび／またはゲラニオー
ル）？をグルコースにコンジュゲートさせるＵＤＰ−グルコース：アグリコン−
グルコシルトランスフェラーゼをコードしているＤＮＡ分子を提供し、そしてS.
bicolor ＵＤＰ−グルコース：ヒドロキシマンデロニトリル−Ｏ−グルコシル
トランスフェラーゼのアミノ酸配列およびその対応する遺伝子配列に基づいてシ
アン発生植物におけるそれらの一般的構造を定義することである。
【００１５】 こうして本発明は、ＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフ
ェラーゼであって、シアノヒドリン（マンデロニトリル、ｐ−ヒドロキシマンデ
ロニトリル、アセトンシアノヒロリンまたは２−ヒドロキシ−２−メチルブチロ
ニトリルのような）；テルペノイド（ゲラニオール、ネロールまたはβシトロネ
ロールのような）；フェニル誘導体（ｐ−ヒドロキシ安息香酸、安息香酸、ベン
ジルアルコール、ｐ−ヒドロキシ−ベンジルアルコール、２−ヒドロキシ−３−
メトキシベンジルアルコール、バニリン酸またはバニリンのような）またはヘキ
サノール誘導体（１−ヘキサノール、トランス−２−ヘキセン−１−オール、シ
ス−３−ヘキセン−１−オール、３−メチル−３−ヘキセン−１−オール、３−
メチル−３−ヘキセン−１−オールまたは３−メチル−２−ヘキセン−１−オー
ルのような）をグルコースにコンジュゲートさせ、式Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３を有する
ものをコードしているＤＮＡ分子を提供し、ここで、
【００１６】 ・・Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、アミノ酸残基Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、
Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、
Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓおよび所望により他
のアミノ酸残基であって生存細胞内で翻訳後修飾から生じることのできるものか
らなる群より独立的に選択されるアミノ酸残基からなるコンポーネント配列であ
り、そして ・・Ｒ２は、配列が配列番号１のアラインメントされるコンポーネント配列に少
なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、またはなおより好ましくは少な
くとも７０％同一である、１５０、好ましくは２５０またはそれ以上のアミノ酸
残基からなる。
【００１７】 生存細胞内で翻訳後修飾から生じることのできる典型的なアミノ酸残基は、Ａ
ａｄ、ｂＡａｄ、ｂＡｌａ、Ａｂｕ、４Ａｂｕ、Ａｃｐ、Ａｈｅ、Ａｉｂ、ｂＡ
ｉｂ、Ａｐｍ、Ｄｂｕ、Ｄｅｓ、Ｄｐｍ、Ｄｐｒ、ＥｔＧｌｙ、ＥｔＡｓｎ、Ｈ
ｙｌ、ａＨｙｌ、３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ、Ｉｄｅ、ａｌｌｅ、ＭｅＧｌｙ、Ｍｅｌ
ｌｅ、ＭｅＬｙｓ、ＭｅＶａｌ、Ｎｖａ、ＮｌｅおよびＯｒｎである。
【００１８】 典型的には、Ｒ２は１５０ないし４２５アミノ酸残基からなり、１５０ないし
２８０アミノ酸残基の長さが好ましい。Ｒ２の特定の態様は、配列番号１のアミ
ノ酸２１ないし４４５、１６８ないし４４８または２８１ないし４４８によって
表される。 Ｒ１およびＲ３は、独立的に０ないし５００、好ましくは０ないし３５０アミ
ノ酸残基からなり、そして少なくとも３０アミノ酸の長さを有する１または２以
上の付加的なコンポーネント配列を含み得、そして配列番号１のアラインメント
されるコンポーネント配列に少なくとも６５％、しかし好ましくは少なくとも７
０％同一である。そのような付加的なコンポーネント配列の例は、配列番号１の
アミノ酸２１ないし５５、１４２ないし１７４または３０３ないし３４３によっ
て表される。当該ＤＮＡ分子によってコードされるグルコシルトランスフェラー
ゼは、一般に３００ないし６００アミノ酸残基からなり、S. bicolor酵素は配列
番号１に示されるように４９２アミノ酸残基のサイズを有し、そして配列番号２
によってコードされる。
【００１９】 配列アライメントに対する２つのアプローチが一般に存在する。Needlemanお
よびWunschによっておよびSellersによって提唱されたダイナミックプログラミ
ングアルゴリズムは、２種の配列の完全長をアラインメントし、配列の全体の（
global）アラインメントを提供する。他方、Smith-Watermanアルゴリズムは局所
的(local)アラインメントを得る。マトリックスのスコアリングおよびギャップ
ペナルティーの選択を与えた場合には、局所的アラインメントは、最も類似する
配列内の領域の対をアラインメントする。これは、最も高度に保存された配列の
領域上に焦点をおくデータベースサーチをもたらす。それはまた同定すべき配列
内の類似するドメインをもたらす。Smith-Watermanアルゴリズム、例えばＢＬＡ
ＳＴ（ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール）およびＦＡＳ
ＴＡを使用するアラインメントをスピードアップするために、アラインメントに
さらなる限定を設ける。
【００２０】 本発明の範囲内で、全般配列アラインメントをGenetic Computer Group, Madi
son, WIから利用可能であるプログラムＰＩＬＥＵＰの使用を使用して簡便に実
施する。 局所的アラインメントをＢＬＡＳＴ、すなわちクエリーがタンパク質であるか
ＤＮＡであるかにかかわらず利用可能な配列データベースのすべてを探索するよ
うに設計された類似性サーチプログラムのセットを簡便に使用して実施する。こ
のサーチツールのバージョンＢＬＡＳＴ２．０（ギャップ性ＢＬＡＳＴ）は、イ
ンターネット上で公衆に利用可能とされた（現在のhttp://www/ncbi.nlm.nih.go
v/BLAST/）。それは全体のアラインメントに対するような局所を探す帰納的アル
ゴリズムを使用し、したがって、単離領域のみを共有する配列中の関連性を検出
することができる。ＢＬＡＳＴサーチに割り当てられるスコアーは、よく定義さ
れた統計的解釈を有する。局所的配列アラインメントにおけるギャップの導入の
あるｂｌａｓｔプログラムおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴは、本発明の範囲内で特に
有用であり、両方のプログラムは、タンパク質配列データベースに対するアミノ
酸クエリー配列を比較し、並びにｂｌａｓｔ変形プログラムは２種の配列のみの
局所的アラインメントをもたらす。当該プログラムは、好ましくはデフォルト値
に対する所望のパラメーターセットで稼動される。
【００２１】 さらに、ＢＬＡＳＴを使用する配列アラインメントは、あるアミノ酸の別のも
のによる置換が、タンパク質の構造および機能を維持するために必要な物理学的
および化学的特性を保存しているようであるか、または本質的構造および機能的
性質をより破壊しそうかどうかを考慮に入れることができる。そのような配列類
似性は、同一のアミノ酸のパーセンテージに比較して、「ポジティブ」アミノ酸
のパーセンテージの観点から定量化し、そしてボーダーラインのケースにおける
正確なタンパク質ファミリーへのタンパク質の割り当てを援助することができる
。
【００２２】 ｓｂＨＭＮＧＴの定量的および定性的基質特異性の調査は、S. bicolorに存在
するシアノヒドリンについて強い優先性を示した。こうして、インビボのシアノ
ヒドリングルコシルトランスフェラーゼは、限定的な数のシアノヒドリン、テル
ペノイド、フェニル誘導体およびヘキサノール誘導体について強い優先性を示す
。それにもかかわらず生合成経路の末端の反応を触媒する酵素は、しばしば先行
する反応を触媒するものよりもより広い基質特異性を有し、新規二次代謝物生合
成および生体異物異化の進歩に関してより大きい融通性がある。これは、該経路
の第１の酵素（ＣＹＰ７９Ａ１）がもっぱらチロシンについてのものである一方
、ＣＹＰ７１Ｅ１およびｓｂＨＭＮＧＴがまた、それぞれオキシムおよびシアノ
ヒドリンを誘導するフェニルアラニンを受け入れるという発見によって示される
。ニトリル基の存在はまた、ｓｂＨＭＮＧＴによる基質認識に必ずしも要求され
ず、これはｓｂＨＭＮＧＴのグルコシレートベンジルアルコール、安息香酸、バ
ニリン酸、バニリンおよび２−ヒドロキシ−３−メトキシベンジルアルコール、
ゲラニオール、ネロールおよびβシトロネロールへの能力によって示される。こ
の結果は、ｓｂＨＭＮＧＴが、マンデロニトリルまたはｐ−ヒドロキシ−マンデ
ロニトリルに構造的に類似する基質を受け入れることを示している。
【００２３】 基質化合物のこの群はまた、青臭みフレーバー(Green Note Flavour)、例えば
ヘキサン−１−オール、トランス−２−ヘキセン−１−オールおよびシス−３−
ヘキセン−１−オールおよび他のチロシンまたはフェニルアラニン関連性芳香化
合物、例えば、フェニル酢酸、フェニルエチルアルコール、およびフェニルエチ
ルアセテート等を含む（Krings et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:1-8,
1998）。ベンジルアルコール、安息香酸およびゲラニオールのグルコシル化に
ついて観察される速度は、シアノヒドリンについてのものよりは低い。しかし、
これらはなお高い。現在まで、加工食品および野菜の食味および芳香を定義する
ことにおけるこれらの酵素クラスの明かな重要性にもかかわらず、モノテルペノ
イドグルコシルトランスフェラーゼの、ヘキサノールまたはヘキサノール誘導性
化合物についてのグルコシルトランスフェラーゼの単離またはクローニングにつ
いて報告はない。
【００２４】 グルコシル化のプロセスにおいて、不安定化合物（アグリコン）は一般により
化学的に反応性でなく、糖基の酵素的付加によってより水溶性にさせる。このこ
とは、植物が、グリコシドの形態で多量のこれらのアグリコンを貯蔵することを
典型的には可能とする。植物によって合成される多くの二次代謝物は、グリコシ
ル化される。例えば、１５００超のグリコシドのフラボノイドのみが特性把握さ
れている。グリコシル化は、化合物の生合成の晩期または遅い段階で一般起こり
、さもなくば細胞内環境で不安定であり、そして不活性および輸送可能な化合物
の前駆体形態のプールを提供することができ、これらはグルコシダーゼ酵素によ
る加水分解によって活性形態で得ることができる。
【００２５】 遊離アグリコン、例えば、テルペノイドおよび青臭みフレーバーの、グルコシ
ルトランスフェラーゼの導入による対応するグルコシドへの変換を使用し、果実
、野菜および他の植物の芳香、フレーバーおよび色素構成成分を保存することが
できる。アグリコンを、食品製造または消費中に特異的または非特異的ｂ−グル
コシダーゼの作用によって開放することができる。さらに個々の所望の芳香、フ
レーバーまたは色素構成成分への触媒特性の最適化は、直接的な評価または遺伝
子工学的方法、例えば遺伝子シャッフリングまたは突然変異によって達成され得
る。
【００２６】 例えば、ブドウ樹において多くの二次代謝物のグルコシル化は、近年、ワイン
の多くの芳香、フレーバーおよび色素構成成分が大部分グルコシドとして存在す
るブドウ化合物に由来するという発見から生じている、顕著な調査努力の焦点と
なっている。テルペン、例えば遊離およびグルコシル化形態の両方で見出される
ゲラニオールが、そのような標的化合物に含まれる。本発明の観点では、芳香お
よびフレーバー前駆体のグルコシドプールは、グルコシルトランスフェラーゼ活
性の操作によって調節されることができ、そして芳香およびフレーバーは、酸ま
たは酵素介在性加水分解を介してグルコシドの貯蔵されたプールから開放される
ことができる。こうして、ブドウ液果および他の果実、野菜および植物では、特
定のグルコシルトランスフェラーゼの導入、例えばクローン化ｓｂＨＭＧＴまた
はアンチセンス技術によるこれらの発現の減少によって、二次代謝物組成物の所
望の修飾が可能となる。これにより、植物の重要な遊離および結合性フレーバー
プールの調節が可能となり、果実、ワインおよびその他の植物に由来する産物で
あって定義された官能特性を有するものをもたらす。
【００２７】 グルコシルトランスフェラーゼの、アグリコンをグルコースにコンジュゲート
させる能力は、以下のステップを含む検定で決定することができる： ａ）３０℃で２分ないし２時間、１４Ｃ−ＵＤＰ−グルコース、アグリコンおよ
びＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼを含む反応
混合物をインキュベーションするステップ； ｂ）反応を終結させるステップ、および ｃ）生産されたグルコシドを化学的に同定し、そして定量するステップ。
【００２８】 反応混合物は典型的には、５ないし２０００μｌ、好ましくは２０μｌの体積
を有し、そして１０−２００ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．９）；１−５μＭ １４ Ｃ−ＵＤＰ−グルコース（約１１．０ＧＢｑｍｍｏｌ−１）；０−３００μ
Ｍ ＵＤＰ−グルコース；０−２０ｍＭ アグリコン；２５ｍＭ γ−グルコノ
ラクトン；０−２μｇ／μｌ ＢＳＡおよび０−１０ｎｇ／μｌ ＵＤＰ−グル
コース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼを含む。γグルコノラクト
ン以外のβ−グルコシダーゼインヒビターおよびＢＳＡ以外のタンパク質スタビ
ライザーは、適当な場合に含まれ得る。反応を終結させるための１つの可能性は
、例えば１／１０体積の１０％酢酸を添加することによって反応混合物を酸性化
することである。
【００２９】 反応混合物中に形成されたグルコシドの化学的同定および定量は、グルコシド
の質量分析と妥当に組み合わせた、ＮＭＲ分光法、ＴＬＣ分析、ＨＰＬＣ分析ま
たはＧＬＣ分析を含む種々の方法論を使用して達成し得る。 ＮＭＲ分光法による分析のための反応混合物は、通常は０．５−１ｍｌの総体
積を有し、２時間インキュベーションし、そして０−１０ｍＭのアグリコン、例
えば、２ｍＭのｐ−ヒドロキシ−マンデロニトリルまたは６．５ｍＭのゲラニオ
ール、３ｍＭのＵＤＰ−グルコース、２．５μgの組換えｓｂＨＭＮＧＴ、およ
び０．５ｍｇのＢＳＡを含む。グルコシドを、例えば酢酸エチルで抽出しそして
凍結乾燥し、次いでＮＭＲ分析する。
【００３０】 ＴＬＣ分析のために反応混合物をシリカゲル６０Ｆ２５４プレート（Ｍｅｒｃ
ｋ）に適用し、乾燥し、そして溶媒、例えば酢酸エチル：アセトン：ジクロロメ
タン：メタノール：Ｈ２Ｏ（４０：３０：１２：１０：８、ｖ／ｖ）の溶媒にお
いて溶出させる。プレートを室温で１時間乾燥し、そして貯蔵ホスホルイメージ
ングプレートに曝露し、次いでホスホルイメージャーでスキャンニングをする。
放射標識ＵＤＰ−グルコースの特異的放射活性に基づき、形成されたグルコシド
の量を定量する。
【００３１】 放射活性はまた、液体シンチレーションカウンチングによって決定し得る（Ｌ
ＳＣ分析）。ある種の場合、形成されたグルコシドが極めて疎水性のアグリコン
、例えばマンデロニトリルに由来する場合、グルコシドを酢酸エチル相に抽出す
ることができ、それによって未取り込み１４Ｃ−ＵＤＰ−グルコースから分離す
ることができる。２ｍｌのシンチレーションカクテルを２５０μｌのそれぞれの
酢酸エチル抽出液に添加し、そして液体シンチレーションカウンターを使用して
分析する。カラム分画の間に、ｓｂＨＭＮＧＴ活性を有するこれらのフラクショ
ンを、アグリコン基質としてマンデロニトリルおよび形成されたグルコシドの酢
酸エチル抽出液を使用して同定することができる。
【００３２】 配列番号１および配列番号２の知識を使用して、シアノヒドリン、テルペノイ
ド、フェニル誘導体またはヘキサノール誘導体をグルコースへコンジュゲートさ
せるＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼをコード
するＤＮＡ分子の単離および生産を促進することができる。
【００３３】 該方法は以下のステップを含む： （ａ）ＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼを発現
している植物組織からｃＤＮＡライブラリーを調製するステップ、 （ｂ）配列番号２または配列番号１に基づいて設計した、少なくとも１つのオリ
ゴヌクレオチドを使用して、ｃＤＮＡライブラリーからＵＤＰ−グルコース：ア
グリコン−グルコシルトランスフェラーゼｃＤＮＡの一部を増幅するステップ、
（ｃ）配列番号２または配列番号１に基づいて設計した、１または２以上のオリ
ゴヌクレオチドを所望により使用して、ネスティッドＰＣＲ反応において、ｃＤ
ＮＡライブラリーからＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフ
ェラーゼｃＤＮＡの一部を増幅するステップ、
【００３４】 （ｄ）ステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）で得たＤＮＡをプローブとして使用
して、ＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼを発現
している植物組織から調製したＤＮＡライブラリーをスクリーニングするステッ
プ、および （ｅ）アラインメントされる配列番号２のコンポーネント配列に５０％またはそ
れ以上の配列同一性を有する、少なくとも１５０アミノ酸残基長のアミノ酸コン
ポーネント配列によって特徴付けられるタンパク質をコードしているオープンリ
ーディングフレームを含む、ベクターＤＮＡを同定し、そして精製するステップ
、および （ｆ）所望によりさらに精製ＤＮＡを修飾し、その後のグルコシルトランスフェ
ラーゼの単離、その基質特異性の決定および抗体の生成のために、例えば、Esch
erichia coliまたはPichia pastorisのような微生物でタンパク質の異種性発現
を達成するステップ。
【００３５】 プロセスステップ（ｂ）および（ｃ）において、増幅のために使用する第２の
オリゴヌクレオチドは、好ましくは該ｃＤＮＡライブラリーを調製するために使
用されるベクターＤＮＡ内の領域に相補的なオリゴヌクレオチドである。しかし
、配列番号２または配列番号１の配列に基づいて設計された第２のオリゴヌクレ
オチドもまた使用することができる。ｃＤＮＡの単離のためのこの方法の好まし
い実施態様は、実施例４に記載する。ＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコ
シルトランスフェラーゼをコードしているｃＤＮＡクローンまたはこのクローン
のフラグメントはまた、ＤＮＡチップ単独で、またはこれらのクローンのタンパ
ク質またはフラグメントのＣＹＰ７９またはＣＹＰ７１Ｅ１ファミリーに属して
いるタンパク質をコードしているｃＤＮＡクローンと組み合わせて使用し得る。
これは、生物性および抗生物性ファクターの結果としての植物におけるシアン発
生グルコシドの合成の誘導または抑制を監視する容易な方法を提供する。
【００３６】 本発明のさらなる実施態様は、シアノヒドリンをグルコースにコンジュゲート
させるＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼ、例え
ばｐ−ヒドロキシマンデロニトリルをグルコースにコンジュゲートさせるS. bic
olor酵素である。
【００３７】 精製組換えＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼ
を、染色（dye）クロマトグラフィーおよびＵＤＰ−グルコースによる溶出を含
む方法によって得ることができる。染色クロマトグラフィーのための適当なカラ
ム材料は、好ましくはベッド用アガロースに架橋されたReactive Yellow 3であ
る。タンパク質の溶出を２ｍＭのＵＤＰ−グルコースを使用して簡便には達成す
る。
【００３８】 本発明はまた、本発明に従う新規タンパク質をコードしているオープンリーデ
ィングフレームを含む核酸化合物を提供する。当該化合物は式ＲＡ−ＲＢ−ＲＣ を特徴とし、ここで、 ・・ＲＡ、ＲＢおよびＲＣは、ヌクレオチド残基Ｇ、Ａ、ＴおよびＣからなる群
またはヌクレオチド残基Ｇ、Ａ、ＵおよびＣからなる群より独立的に選択される
ヌクレオチド残基からなるコンポーネント配列を構成し、 ・・ＲＡおよびＲＣは、独立的に０ないし１５００、好ましくは０ないし１０５
０ヌクレオチド残基からなり、 ・・ＲＢは、４５０−１２６０、そして好ましくは４５０−８４０ヌクレオチド
残基からなり、そして ・・コンポーネント配列ＲＢは、配列番号２のアラインメントされるコンポーネ
ント配列に少なくとも６５％同一である。
【００３９】 コンポーネント配列ＲＢの特定の例は、配列番号２のヌクレオチド６１ないし
１３３５、５０２ないし１３４４、または８４１ないし１３４４によって表され
る。
【００４０】 本発明の好ましい実施態様では、コンポーネント配列ＲＡまたはＲＣの少なく
とも１つは、１または２以上の付加的なコンポーネント配列であって、少なくと
も１５０ヌクレオチド残基の長さを有し、そして配列番号２のアラインメントさ
れるコンポーネント配列に少なくとも６０％同一である、コンポーネント配列を
含む。そのような付加的なコンポーネント配列の特定の例は、配列番号２のヌク
レオチド６１ないし１６５、４２７ないし５２２、または９０７ないし１０２９
に表される。
【００４１】 ドゥーリン合成の経路は、ＣＹＰ７９Ａ１、ＣＹＰ７１Ｅ１およびｓｂＨＭＮ
ＧＴの発現によって非シアン発生（acyanogenic）植物に導入することができる
。同じ植物種、すなわちソルガムに由来するこれらの３種の遺伝子産物は、巨大
分子複合体としてアセンブルし、該経路の中間体のより強力なチャンネリングを
もたらし、そしてより少ない遊離の中間体がその植物に開放される。
【００４２】 導入遺伝子として発現される、本発明に従うグリコシルトランスフェラーゼを
コードしているＤＮＡ分子は、植物でのシアン発生グリコシドの生合成を修飾す
るために特に有用である。ＵＤＰ−グルコース：シアノヒドリングルコシルトラ
ンスフェラーゼをコードしている遺伝子が、ＣＹＰ７９ファミリー（アミノ酸の
、対応するＮ−ヒドロキシアミノ酸およびこのＮ−ヒドロキシアミノ酸に由来す
るオキシムへの変換を触媒し、またはチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ
）およびＣＹＰ７１Ｅファミリー（アルドキシムの、ニトリルへの変換および当
該ニトリルの、対応するシアノヒドリンへの変換を触媒する）に属するチトクロ
ームＰ４５０酵素をコードしている遺伝子と結びついて発現されるとき、非シア
ン発生野生型植物をシアン発生植物に変換することができる。遺伝子の構成的、
誘導可能性または組織特異的発現をもたらすプロモーターの妥当な選択は、所望
の病害および食植（herbivor）応答性を有するトランスジェニックシアン発生植
物を得る手段を提供する。
【００４３】 同様に、シアン発生植物におけるシアン発生グルコシドの含量を、同じ遺伝子
を使用するアンチセンス、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはリボザイム技術を
使用して修飾しまたは減少させ得る。シアン発生グルコシドは、ファイトアンテ
ィシピン（phytoanticipins）の群に属する。シアン発生植物では、ＵＤＰ−グ
ルコース：シアノヒドリングルコシルトランスフェラーゼ活性のブロックまたは
減によって、損傷され、または感染された植物細胞でシアン発生グルコシドの分
解によって通常生産されるのと同じ産物の生産および蓄積を生じることが予測さ
れる。こうしてアンチセンスまたはリボザイム技術を使用して、同じ組織でシア
ン発生グルコシドの分解産物を生産する植物を得ることができ、ここでシアン発
生グルコシドは、野生型植物で生産され、病原体および食植に対する抵抗性の変
化した植物を生じる。
【００４４】 こうして、ゲノムに安定的に組みこまれた、シアノヒドリン、テルペノイド、
フェニル誘導体またはヘキサノール誘導体をグルコースにコンジュゲートさせる
ＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼをコードして
いるＤＮＡ、または発現が、ｐ−ヒドロキシマンデロニトリルをグルコースにコ
ンジュゲートさせるＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェ
ラーゼの発現を減少させる、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ
またはリボザイムをコードしているＤＮＡを含む、トランスジェニック植物を提
供することが、本発明のさらなる態様である。
【００４５】 そのような植物を、以下のステップを含む方法によって生産することができる
： （ａ）完全な植物に再生することのできる植物細胞または組織に、シアノヒドリ
ン、テルペノイド、フェニル誘導体またはヘキサノール誘導体をグルコースにコ
ンジュゲートさせるＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェ
ラーゼをコードしている、その植物で発現可能な遺伝子を含むＤＮＡまたは、発
現がシアノヒドリンをグルコースにコンジュゲートさせるＵＤＰ−グルコース：
アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼの発現を減少させる、センスＲＮＡ
、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードしているＤＮＡを導入するステ
ップ、および （ｂ）トランスジェニック植物を選択するステップ。
【００４６】 実施例 実施例１−ＵＤＰ−グルコース：ｐ−ヒドロキシマンデロニトリル−グルコシル
トランスフェラーゼ検定 全般に２０μｌの反応混合物であって、 １００ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．９）、 １−５μＭ １４Ｃ−ＵＤＰ−グルコース（１１．０ＧＢｑｍｍｏｌ−１、Amer
sham LIFE SCIENCE）、 ０−３００ｍＭ ＵＤＰ−グルコース、 ０−２０ｍＭ ｐ−ヒドロキシマンデロニトリル（水に溶解し、新しく調製した
）、 ２５ｍＭ γ−グルコノラクトン、 ０−１ｍｇ ＢＳＡおよび ０．５−１０μｌ タンパク質調製物 を含む混合物を２分ないし２時間、３０℃でインキュベーションする。その後、
反応を反応体積の１／１０の１０％酢酸の添加によって終結させる。同じ検定条
件を使用し、マンデロニトリル、安息香酸、ベンジルアルコール、ゲラニオール
および多くのその他のアグリコンのグルコシル化を決定する。
【００４７】 組換えｓｂＨＭＮＧＴの基質特異性を決定するために、インキュベーションを
２０分３０℃で継続し、そして前記の全般的プロトコルを、 １．２５ｍＭ アグリコン（エチレングリコールモノエーテルに溶解されるフラ
ボノイドを除く他、エタノールに溶解する）、 １．２５μＭ １４Ｃ−ＵＤＰ−グルコース、 １２．５μＭ ＵＤＰ−グルコース、 １００ｍｇ 組換えｓｂＨＭＮＧＴ、および ４μｇ ＢＳＡ を含ませるように適合させる。
【００４８】 組換えｓｂＨＭＮＧＴの活性の定量的決定を、３０℃で４分間のインキュベー
ションを使用して実施する。反応混合物が以下のものからなることを除く他、基
質特異性の決定と同様に分析を実施する： １，５または１０ｍＭ アグリコン、 ５μＭ １４Ｃ−ＵＤＰ−グルコース、 ０．２ｍＭ ＵＤＰ−グルコース、 ２００ｎｇ 組換えｓｂＨＭＮＧＴ、および ２４μｇ ＢＳＡ。
【００４９】 ＮＭＲ分光法による分析のための反応混合物を、２時間インキュベーションし
、それは０．５−１ｍｌの総体積であって以下のものを含む： ２ｍＭ ｐ−ヒドロキシメンデロニトリルまたは６．５ｍＭ ゲラニオール、 ３ｍＭ ＵＤＰ−グルコース、 ２．５μｇ 組換えｓｂＨＭＮＧＴ、および ０．５ｍｇ ＢＳＡ。 グルコシドを酢酸エチルで抽出し、スピーディーバキューム（speedy-vac）を
使用して凍結乾燥し、次いでＮＭＲ分析する。
【００５０】 ＴＬＣ分析のために、反応混合物にシリカゲル６０Ｆ２５４プレート（Merck
）を適用し、乾燥させ、そして酢酸エチル：アセトン：ジクロロメタン：メタノ
ール：Ｈ２Ｏ（４０：３０：１２：１０：８、ｖ／ｖ）を含む溶媒において溶出
させる。プレートを１時間室温で乾燥し、そして貯蔵ホスホルイメージングプレ
ート（Molecular Dynamics）にさらし、次いでStorm 860ホスホルイメージャー
（Molecular Dynamics）においてスキャニングする。
【００５１】 液体シンチレーションカウンチング（ＬＳＣ）による分析のために、反応混合
物を４００μｌの酢酸エチルで抽出し、未取りこみ１４Ｃ−ＵＤＰ−グルコース
からグルコシドを分離する。２ｍｌのEcoscint A(National Diagnostics, New J
ersey USA)を２５０μｌのそれぞれの酢酸エチルエキストラクトに添加し、そし
てWin Spectral 1414(Wallac)液体シンチレーションカウンターを使用して分析
する。マンデロニトリルを基質として使用し、液体クロマトグラフィーによって
生成フラクションを検定する。
【００５２】 実施例２−ＵＤＰグルコース：ｐ−ヒドロキシマンデロニトリル−グルコシルト
ランスフェラーゼの精製 特に指摘した場合の他、すべてのステップは４℃で実施する。ｓｂＨＭＮＧＴ
の内因性基質はｐ−ヒドロキシマンデロニトリルであるけれども、マンデロニト
リルを、精製を通じてｓｂＨＭＮＧＴ活性の検定のための基質として使用し、こ
れはそれは同じように良好な基質であるからである。さらにベンゼン環のパラ位
のヒドロキシル基の不存在は、ＬＳＣ検定を使用してはドゥーリンから区別でき
ない、ｐ−グルコシルオキシマンデロニトリル合成の可能性を排除する。
【００５３】 １ｋｇのS. bicolorの種子を水に終夜室温で浸漬し、次に（Halkier et al, P
lant Physiol. 90: 1552-1559, 1989）に記載されているように２日間３０℃で
暗黒で成長させる。実生苗条を収集しそして乳棒および乳鉢を使用して２体積の
氷温抽出バッファー（２５０ｍＭ スクロース；１００ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）；５０ｍＭ ＮａＣｌ；２ｍＭ ＥＤＴＡ；５％（ｗ／ｖ）のポリビ
ニルポリピロリドン；２００μＭ フェニルメチルスルフォニルフルオリド；６
ｍＭ ＤＴＴ；）で抽出する。抽出物をナイロンメッシュを通して濾過し、次い
で２０００００Ｘｇで２０分間遠心分離する。上清フラクションを分別用硫酸ア
ンモニウム分別（３５−７０％）に１時間の沈降で付し、２００００Ｘｇで２０
分間遠心分離する。
【００５４】 固形物をバッファーＡ（２０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）；５ｍＭ Ｄ
ＴＴ）にペイントブラシを使用して再懸濁し、そしてバッファーＡで平衡させた
、１００ｍｌ Sephadex G-25(Pharmacia)またはBiogel P-6(Bio-Rad)カラム（
２０ｍｌ／分の流速）を使用して脱塩する。これらの精製ステップはｓｂＨＭＮ
ＧＴの特異的活性の測定可能な増加を生じない一方、低分子量の溶質（シアン化
物前駆体を含む）を効率的に除去する。第１のＵＶ吸収ピークを収集し、そして
バッファーＢ（バッファーＡ＋５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡させた２０ｍｌ Ｑ
−セファロース（Pharmacia）カラム（６０−８０ｍｌ／時間の流速）に適用す
る。該カラムをベースラインが安定化するまでバッファーＢで洗浄し、そしてタ
ンパク質をバッファーＡ（総体積８００ｍｌ）中の５０ないし４００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌの線形勾配で溶出させる。１０ｍｌのフラクションを収集しそして３−５μ
ｌをＬＳＣによってマンデロニトリルグルコシルトランスフェラーゼ活性につい
て検定する。Ｑ−セファロースに結合したすべてのｓｂＨＭＮＧＴ活性を、１５
０−２００ｍＭ ＮａＣｌの間で溶出させ、〜７倍の精製である。合わせた活性
フラクションをバッファーＢで５倍に希釈し、そしてAmicon YM30またはYM10膜
を使用して２０倍に濃縮し、次いで−８０℃で貯蔵する。
【００５５】 染色クロマトグラフィー精製の残りのステップを、室温または４℃で実施する
。合わせた濃縮イオン交換フラクション（５ｍｌ中の〜１０−１５ｍｇタンパク
質）の４分の１を、バッファーＢで平衡させた（１０−１５ｍｌ／時間）４％ベ
ッド用アガロース（ロット63H9502; Sigma）上に架橋したReactive Yellow 3を
含むカラム（１ｃｍＸ１０ｃｍ）に適用する。カラムをベースラインが安定化す
るまでバッファーＢで洗浄する。タンパク質をバッファーＢ中の１０ｍｌの２ｍ
Ｍ ＵＤＰ−グルコースで溶出させる。本質的に純粋なｓｂＨＭＮＧＴを含む活
性フラクションをプールし、そして１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを添加し、または添加
せず−８０℃で貯蔵する。
【００５６】 結果：当初の実験は、２日間の発芽期間が、総ｓｂＨＭＮＧＴ活性、タンパク質
濃度および抽出体積の観点から最適であることを指摘した。ワーリングブレンダ
ーを使用すると、乳鉢および乳棒の使用による抽出と比較して、５０％より低い
活性という結果であった。ｓｂＨＭＮＧＴ活性は−８０℃での凍結によって大き
くは影響を受けず、そしてグリセロールの添加は影響がなかった。バッファー溶
液中の高濃度の（２ｍＭと比較して５ｍＭ）ＤＴＴを添加すると、４℃２日間の
貯蔵後に１０培大きい活性という結果であった。この顕著なＤＴＴの影響は、粗
調製物にまず見出され、一方、一部精製されたイオン交換調製物は、還元剤の濃
度に対してより応答性でない。
【００５７】 いくつかの偽アフィニティー（pseudoaffinity）試薬を、Cibachron blue 3G
、Reactive Green 19、Reactive Yellow 3およびＵＤＰ−グルクロン酸であって
４％ベッド用アガロースに架橋されたものを含むミニカラムフォーマットで試験
した。種々の塩濃度でのＮａＣｌおよびＵＤＰ−グルコースを使用する溶出によ
る試行によって、Reactive Yellow 3が優れたカラム材料であることを認めた。
ｓｂＨＭＮＧＴ活性は、Reactive Yellow 3に５０ｍＭ ＮａＣｌで結合し、そ
してＮａＣｌ濃度のわずかな増加で洗浄後に溶出させ得、溶出液中に何らの測定
可能なＵＶ吸収がなかった。ｓｂＨＭＮＧＴ活性はいずれかの塩濃度で結合し、
そしてＮａＣｌ濃度のわずかな増加で洗浄後に溶出させることができ、溶出液中
に何らの測定可能なＵＶ吸収がなかった。幾つかの不純物が存在するが、ｓｂＨ
ＭＮＧＴ活性はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって５０−５５ｋＤａ周辺に移動するポリ
ペプチドと相関がある（データ示さず）。
【００５８】 ＮａＣｌのかわりに２ｍＭ ＵＤＰ−グルコースでの溶出により、明かに均質
である、同様に移動しているポリペプチドの溶出を生じた。該プロトコールを反
復するとき、総タンパク質に対して低いカラムの高さが、同程度の純度を得るた
めに重要であることが見出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化されたすべ
てのポリペプチドが活性であった（したがってすべての不活性なタンパク質が失
われた）と仮定し、そしてコールド基質ドゥーリン（ＵＤＰ−グルコース）を補
償すれば、ｓｂＨＭＮＧＴは総タンパク質のおよそ０．２５％を表し、そして２
２％の収率で４２０倍に精製された。
【００５９】 実施例３−ペプチド生成およびシーケンシング およそ５μｇのｓｂＨＭＮＧＴを、タンパク質シーケンサー（モデルＧ１００
０Ａ、Hewlett-Packard）を使用してＮ−末端シーケンシングに付する。ペプチ
ド消化のために、およそ１００μｇのｓｂＨＭＮＧＴをトリクロロ酢酸で沈殿さ
せ、そして５０μｌの５０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＤＴＴ
および６．４ｍＭ 尿素中に再懸濁する。調製物を６０℃で５０分間インキュー
ベーションし、室温まで冷却し、そして３体積の３０ｍＭ トリス（ｐＨ７．７
）および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡで希釈する。Ｅｎｄｏ Ｌｙｓ−Ｃ（Promega
）を１：２５の比率（ｗ／ｗ）で添加し、そして反応混合物を２４時間３７℃で
インキュベーションした。ペプチドを、Vydac 208TP52 C8カラム（２５０ｍｍＸ
２１ｍｍ）およびBeckman System Gold HPLC装置を使用して逆相ＨＰＬＣによっ
て精製する。ペプチドをバッファーＣ（０．１％ トリフルオロ酢酸）中０．２
ｍｌ／分流速で適用し、そしてバッファーＣ中０から８０％ アセトニトリルの
線形勾配で溶出させる。フラクションを手で収集し、そして前記の様にシーケン
シングする。
【００６０】 実施例４−クローニング ＰＣＲ増幅：第１ラウンドＰＣＲ増幅反応を、２単位のＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼ（Pharmacia）、４μｌの１０ｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼバッファー、５％
（ｖ／ｖ） ジメチルスルフォキシド、１μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、８０ｐ
モルのそれぞれのプライマーであるＣ２ＥＦ（５’−TTYGTNWSNCAYTGYGGNTGGAA
−３’、配列番号３）およびＴ７（５’−AATACGACTCACTATAG−３’、配列番号
４）および約１０ｎｇのプラスミドＤＮＡテンプレートであって４０μｌの総体
積中のものを使用して実施する。プラスミドＤＮＡテンプレートを、１−２ｃｍ
の高レベル黄化S. bicolor実生から作成したユニディレクショナルｐｃＤＮＡＩ
Ｉ（Invitrogen）プラスミドライブラリーから調製する（Bak et al, Plant Mol
. Biol. 36: 393-405, 1998）。熱サイクルパラメーターは、９５℃５分間、３
ｘ（９５℃５秒間、４２℃３０秒間、７２℃３０秒間）、３２ｘ（９５℃５秒間
、５０℃３０秒間、７２℃３０秒間）および最後に７２℃５分間である。
【００６１】 第２ラウンドＰＣＲ増幅を前記の様に実施し、ただし、プライマーＣ２ＤＦ（
５’−GARGCNACNGCNGCNGGNCARCC−３’、配列番号５）およびＴ７、およびＤＮ
Ａテンプレートとしての１μｌの第１ラウンド反応物を使用する。熱サイクルパ
ラメーターは、９５℃５分間、３２ｘ（９５℃５秒間、５５℃３０秒間、７２℃
３０秒間）および最後に７２℃５分間である。ＰＣＲ反応混合物を１．５％アガ
ロースゲルを使用するゲル電気泳動に付し、そしておよそ６００ｂｐのバンドを
切除し、そしてQiaex IIゲル抽出キット(Qiagen)を使用して清浄化する。清浄化
したＰＣＲ産物を次いで、製造者（Promega）の指示に従ってｐＧＥＭ−Ｔベク
ターにライゲートし、そして使用してE. coli JM109株に形質転換する。核酸シ
ーケンシングにより、ＰＣＲクローン１５＃４４の翻訳産物に２種の予め得られ
たペプチド配列の存在が明かとなる。
【００６２】 クローニングおよびライブラリースクリーニング：ＰＣＲクローン１５＃４４を
、ＰＣＲによって３０６ｂｐジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ標識したプローブ
を生成させるためのテンプレートとして使用し、ここで、プライマー４４１Ｆ（
５’―GAGGCGACGGCGGCGGGGCAG―３’、配列番号６）および４４２Ｒ（５’―CAT
GTCACTGCTTGCCCCCGACCA―３’、配列番号７）を製造者の指示（Boehringer Mann
heim）に従って使用する。標識したプローブを、１．５％アガロースゲルでゲル
電気泳動後、Qiaex IIゲル抽出キットを使用して清浄化し、そして使用し、前記
のプラスミドライブラリーのおよそ５００００コロニーをスクリーニングする。
ハイブリダイゼーションを、５ｘＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサ
ルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳおよび１％ブロッキング試薬（Boehring
er Mannheim）中で６５℃で終夜実施する。次いで膜を、６０℃３ｘ１５分間、
０．５ｘＳＳＣ中で洗浄する。７種のハイブリダイズしているクローンを単離し
そして１種の全長クローンであるｓｂＨＭＮＧＴ１をさらなる特性把握のために
選択する。
【００６３】 実施例５−ｓｂＨＭＮＧＴおよび既知または推定グルコシルトランスフェラーゼ
コードｃＤＮＡの翻訳産物の間の同一性および類似性 表１は、ｓｂＨＭＮＧＴおよび既知または推定グルコシルトランスフェラーゼ
アミノ酸配列の間の全体の同一性、それぞれ類似性、並びに対応するＮ−末端領
域、すなわちコンセンサス配列ｘＣＬｘＷＬのＮ−末端の配列として定義される
領域であってｓｂＨＭＮＧＴのアミノ酸残基２９１／２９２のスプリットポイン
トを有するものにおける同一性、それぞれ類似性を要約する。
【００６４】 表２は、ＨＭＮＧＴ中の残基１８８−２２９として定義される、ｓｂＨＭＮＧ
Ｔ領域αのアミノ酸配列、および既知または推定グルコシルトランスフェラーゼ
アミノ酸配列中の対応する配列の間の類似性、それぞれ同一性を要約する。
【００６５】 類似性および同一性の算出は、ＧＡＰプログラム（Genetic Computer Group,
Madison, WI）を使用するｃＤＮＡ翻訳産物の対状の比較に基づき、ここで、Ａ
／Ｇ、Ｙ／Ｆ、Ｓ／Ｔ、Ｖ／Ｉ／Ｌ、Ｒ／Ｋ／Ｈ、およびＤ／Ｅ／Ｎ／Ｑは類似
残基を構成すると考えられる。省略形である配列名は、ｓｔＳＧＴ（Solanum tu
berosumソラニジングルコシルトランスフェラーゼ：GenBnak（登録商標）アクセ
ッションナンバーＵ８２３６７）；ｂｎＴＨＧＴ（Brassica napusチオヒドロキ
シメート−Ｓ−グルコシルトランスフェラーゼ：ＥＰ−７７１８７８−Ａ１の配
列番号２８）、ｚｍＵＦＧＴ（トウモロコシフラボノイド−グルコシルトランス
フェラーゼ：GenBank(登録商標)アクセッションナンバーＸ１３５０２）、ｖｖ
ＵＦＧＴ（Vitis viniferaアントシアニジン−グルコシルトランスフェラーゼ：
GenBank（登録商標）アクセッションナンバーＡＦ０００３７１）、ｐｓＧＴ（P
isum sativumＵＤＰ−グルコースグルコシルトランスフェラーゼ：GenBank(登録
商標)アクセッションナンバーＡＦ０３４７４３）、ｍｅＧＴ（キャッサバＵＤ
Ｐ−グルコースグルコシルトランスフェラーゼ：GenBank(登録商標)アクセッシ
ョンナンバーＸ７７４６４）、およびｚｍｌＡＡＧＴ（トウモロコシインドール
−３−アセテートベータ−グルコシルトランスフェラーゼ：GenBank(登録商標)
アクセッションナンバーＬ３４８４７）である。
【００６６】 表１：
【表１】
【００６７】 表２：α領域同一性（イタリック）および類似性（太字書体）
【表２】
【００６８】 実施例６−異種性発現 プライマーＥＸＦ１（５’―AATAAAAGCATATGGGAAGCAACGCGCCGCCTCCG―３’、
配列番号８）およびＥＸＲ１（５’―TTGGATCCTCACTGCTTGCCCCCGACCA―３’、配
列番号９）を使用して１５００ｂｐ全長ｓｂＨＭＮＧＴインサートをＰＣＲによ
って増幅し、ここでｓｂＨＭＮＧＴ１プラスミドをテンプレートとして使用する
。該プライマーは、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ（ＥＸＦ１）およびＢａｍ
ＨＩ（ＥＸＲ１）のための５’認識部位を含む。ＰＣＲ反応条件は本質的に実施
例４に記載の通りであり、ただし、熱サイクルパラメータは、９５℃３分間、３
０ｘ（９５℃５秒間、５３℃３０秒間、ｍ７２℃９０秒間）および最後に７２℃
５分間である。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｄｅｌおよびＢａｍＨＩで消化し、
再びゲル精製し、そしてプラスミド発現ベクターｐＳＰ１９ｇ１０Ｌ（Barners,
Methods in Enzymology 272: 3-14, 1996）にライゲートし、これをまた制限酵
素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製した。ライゲーション反応混合
物を次いで製造者（Promega）の指示にしたがってE. coliJM109細胞に形質転換
するのに使用する。首尾よくクローン化した細胞の選択の後に、発現を（Ford e
t al, J. Biol Chem. 273: 9224-9233, 1988)に記載のようにイニシエートする
。簡単には、６００μｌの３７℃の終夜の培養物を、１００μｇ／ｌアンシピリ
ンを含む３００ｍｌのluria broth（ＬＢ）に添加する。培養物を１５０ｒｐｍ
の連続振とう下で５時間２８℃で増殖させ、それからＩＰＴＧを０．４ｍＭの最
終濃度まで添加する。
【００６９】 誘導後に、培養物を終夜継続して増殖させ、そして２５００ｘｇ１０分間の遠
心分離によって収集する。固形物を９ｍｌの２００ｍＭトリスｐＨ７．９、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴおよび０．１ｍｇ／ｍｌリゾチームに再懸濁する
。等体積の氷温冷水を添加し、そして混合物を室温で１０分間インキュベートし
、次いで氷上で２０分間インキュベートする。１８μモルのフェニルメチルスル
ホニルフルオリドおよびＤＮアーゼ１００単位／ｍｌ（Sigma）を添加後、懸濁
液を３回の−２０℃の凍結および融解サイクルに付す。フェニルメチルスルホニ
ルフルオリドを１．５ｍＭ 最終濃度に調節し、そして調製物を１５０００ｘｇ
１５分間遠心分離する。プラスミドベクターにインサートを含まない、ネガティ
ブコントロールを前記の様に調製する。組換えタンパク質の精製のために、２種
の３００ｍｌ培養物を前記の様に溶解し、そしてさらにネイティブタンパク質に
関して精製する。簡単には、実施例２に記載のように、粗細胞ライセートをＱ−
セファロースクロマトグラフィー、脱塩、そしてReactive Yellow 3クロマトグ
ラフィーに付す。組換えタンパク質の収率はおよそ１ｍｇ／１００ｍｌ ＬＢ培
養物である。
【００７０】 実施例７−脱塩した黄化ソルガム実生粗抽出物と比較した組換えｓｂＨＭＮＧＴ
の基質特異性 グルコシルトランスフェラーゼ活性を、１４Ｃ−ＵＤＰ−グルコースを使用す
るＴＬＣによって決定した。以下の表１の黒い四角（■）は、放射標識した産物
がそれぞれのアグリコン基質とのインキュベーション後に可視化されたことを指
摘している。白い四角（□）は、標識産物が使用した実験条件下で検出されなか
ったことを指摘している。括弧中の図は、それぞれのアグリコンについて、算出
した標準偏差をともなう相対的Ｖｍａｘを指摘する。ｐ−ヒドロキシマンデロニ
トリルについてのＶｍａｘ値は、１５００ｍｏｌの産物／ｓｂＤＭＮＧＴのｍｏ
ｌ／秒であった。
【００７１】 表３： 基質 活性 シアノヒドリン 粗ソルガム抽出物 組換えｓｂＨＭＮＧＴ １）マンデロニトリル ■ ■(77.8±8.6%) ２）ｐ−ヒドロキシマンデロニトリル ■ ■(100±7.2%) ３）アセトンシアノヒドリン □ □ ベンジル誘導体 ４）ヒドロキノン ■ □ ５）ベンジルアルコール ■ ■(13.1±2.1%) ６）ｐ−ヒト゛ロキシヘ゛ンシ゛ルアルコール ■ ■ ７）安息香酸 ■ ■(4.2%±0.8%) ８）ｐ−ヒドロキシ安息香酸 ■ □ ９）ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド ■ □ １０）ゲンチシン酸 □ □ １１）コーヒー酸 ■ □ １２）２−ヒドロキシケイ皮酸 ■ □ １３）レスベラトール(スチルベン) ■ □ １４）サリチル酸 ■ □ １５）ｐ−ヒドロキシマンデル酸 ■ □ １６）バニリン酸 ■ ■ １７）バニリン ■ ■ １８）2-ヒト゛ロキシ-3-メトキシヘ゛ンシ゛ルアルコール ■ ■
【００７２】 表３の続き 基質 活性 シアノヒドリン 粗ソルガム抽出物 組換えｓｂＨＭＮＧＴ フラボノイド １９）ケルセチン（フラボノール） ■ □ ２０）シアニジン（アントシアニジン） ■ □ ２１）バイオチャニンＡ(イソフラホ゛ン) ■ □ ２２）ナリンゲニン（フラボネート） ■ □ ２３）アピゲニン（フラボン） ■ □ ヘキサノール誘導体 ２４）１−ヘキサノール ■ ■ ２５）トランス-2-ヘキセン-1-オール ■ ■ ２６）シス-3-ヘキセン-1-オール ■ ■ ２７）3-メチル-3-ヘキセン-1-オール ■ ■ ２８）3-メチル-2-ヘキセン-1-オール ■ ■ その他 ２９）イント゛ール酢酸（植物ホルモン） ■ □ ３０）ケ゛ラニオール（モノテルヘ゜ノイト゛） ■ ■(11.0±0.5%)) ３１）トマチシ゛ン(アルカロイト゛) ■ □ ３２）ネロール ■ ■ ３３）ｐ−シトロネロール ■ ■
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 ロイヤル・ヴェテリネリー・アンド・アグ リカルチュラル・ユニヴァーシティ Ｒｏｙａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ａｎ ｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅ ｒｓｉｔｙ デンマーク、デーコー−1871フレデリクス ベアウ・セ・コペンハーゲン、トールヴァ ルセンスヴァイ40番 (72)発明者 ペーター・ヘイ オーストラリア5068サウス・オーストラリ ア州リーブルック、ザ・パークウェイ14番 (72)発明者 ビルゲル・リンドベアウ・メーラー デンマーク、デーコー−2700ブレンシェ イ、コンクステズヴェイ５番 (72)発明者 パトリック・レイモンド・ジョーンズ 千葉県佐倉市表町４−５−16 シーエスコ ーポ・ナンバー201 ユミ・オオタニ方 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 4B024 AA03 AA08 BA10 BA79 CA04 CA09 CA20 DA02 DA06 EA04 GA11 GA27 HA03 HA13 HA14 4B050 CC01 CC03 DD13 FF03E FF04E FF09E FF11E FF12E LL03 LL05 4B065 AA26X AA88X AA88Y AB01 AC14 BA02 BD01 BD14 BD15 BD16 BD17 CA29 CA46 CA53

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 シアノヒドリン、テルペノイド、フェニル誘導体またはヘキ
    サノール誘導体をグルコースにコンジュゲートさせるＵＤＰ−グルコース：アグ
    リコン−グルコシルトランスフェラーゼをコードしているＤＮＡ分子。
  2. 【請求項２】 マンデロニトリル、ｐ−ヒドロキシマンドニトリル、アセト
    ンシアノヒドリンまたは２−ヒドロキシ−２−メチルブチロニトリル；ゲラニオ
    ール、ネロールまたはβ−シトロネロール；ｐ−ヒドロキシ安息香酸、安息香酸
    、ベンジルアルコール、ｐ−ヒドロキシ−ベンジルアルコール、２−ヒドロキシ
    −３−メトキシベンジルアルコール、バニリン酸またはバニリン；１−ヘキサノ
    ール、トランス−２−ヘキセン−１−オール、シス−３−ヘキセン−１−オール
    、３−メチル−３−ヘキセン−１−オールまたは３−メチル−２−ヘキセン−１
    −オールをグルコースにコンジュゲートさせるＵＤＰ−グルコース：アグリコン
    −グルコシルトランスフェラーゼをコードしている、請求項１に記載のＤＮＡ分
    子。
  3. 【請求項３】 式Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３を有するＵＤＰ−グルコース：アグリコ
    ン−グルコシルトランスフェラーゼをコードしている請求項１に記載のＤＮＡ分
    子であって、ここで、 ・・Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、アミノ酸残基Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、
    Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、
    Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓからなる群より
    独立的に選択されるアミノ酸残基からなるコンポーネント配列であり、そして ・・Ｒ２は、配列が配列番号１のアラインメントされるコンポーネント配列に少
    なくとも５０％同一である、１５０またはそれ以上のアミノ酸残基からなる、 ＤＮＡ分子。
  4. 【請求項４】 Ｒ２のアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸２１ないし４
    ４５、１６８ないし４４８、または２８１ないし４４８によって表される、請求
    項１に記載のＤＮＡ分子。
  5. 【請求項５】 Ｒ１またはＲ３が、少なくとも３０アミノ酸の長さを有する
    、そして配列番号１のアラインメントされるコンポーネント配列に少なくとも６
    ５％同一である、１または２以上の付加的なコンポーネント配列を含む、請求項
    １に記載のＤＮＡ分子。
  6. 【請求項６】 ３００ないし６００アミノ酸残基長のＵＤＰ−グルコース：
    アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼをコードしている、請求項１に記載
    のＤＮＡ分子。
  7. 【請求項７】 配列番号１のアミノ酸配列を有するＵＤＰ−グルコース：ア
    グリコン−グルコシルトランスフェラーゼをコードしている、請求項１に記載の
    ＤＮＡ分子。
  8. 【請求項８】 配列番号２のヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の
    ＤＮＡ分子。
  9. 【請求項９】 請求項１ないし８のいずれかに記載のＤＮＡ分子によってコ
    ードされるような、シアノヒドリン、テルペノイド、フェニル誘導体またはヘキ
    サノール誘導体をグルコースにコンジュゲートさせるＵＤＰ−グルコース：アグ
    リコン−グルコシルトランスフェラーゼ。
  10. 【請求項１０】 シアノヒドリン、テルペノイド、フェニル誘導体またはヘ
    キサノール誘導体をグルコースへコンジュゲートさせるＵＤＰ−グルコース：ア
    グリコン−グルコシルトランスフェラーゼをコードしているｃＤＮＡ分子を単離
    する方法であって、 （ａ）ＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼを発現
    している植物組織からｃＤＮＡライブラリーを調製するステップ、 （ｂ）配列番号１に基づいて設計した、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを
    使用して、ｃＤＮＡライブラリーからＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコ
    シルトランスフェラーゼｃＤＮＡの一部を増幅するステップ、 （ｃ）配列番号１に基づいて設計した、さらなるオリゴヌクレオチドを所望によ
    り使用して、ネスティッドＰＣＲ反応において、ｃＤＮＡライブラリーからＵＤ
    Ｐ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼｃＤＮＡの一部を
    増幅するステップ、 （ｄ）ステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）で得たＤＮＡをプローブとして使用
    して、ＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼを発現
    している植物組織から調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするステ
    ップ、および （ｅ）アラインメントされる配列番号２のコンポーネント配列または配列番号１
    の一部をコードしている配列に５０％またはそれ以上の配列同一性を有する、少
    なくとも１５０アミノ酸残基長のアミノ酸コンポーネント配列によって特徴付け
    られるタンパク質をコードしているオープンリーディングフレームを含む、ベク
    ターＤＮＡを同定し、そして精製するステップ、および （ｆ）所望により精製ＤＮＡをさらに修飾するステップ、 のステップを含む方法。
  11. 【請求項１１】 シアノヒドリン、テルペノイド、フェニル誘導体またはヘ
    キサノール誘導体をグルコースにコンジュゲートさせる、精製組換えＵＤＰ−グ
    ルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼを生産する方法であって
    、 （ａ）線形塩勾配で溶出させる、Q-Sepharoseクロマトグラフィー、および （ｂ）ＵＤＰ−グルコースで溶出させる、染色(dye)クロマトグラフィー を含む方法。
  12. 【請求項１２】 ゲノムに安定的に組みこまれた、シアノヒドリン、テルペ
    ノイド、フェニル誘導体またはヘキサノール誘導体をグルコースにコンジュゲー
    トさせるＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼをコ
    ードしているＤＮＡまたは、発現がｐ−ヒドロキシマンデロニトリルをグルコー
    スにコンジュゲートさせるＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトラン
    スフェラーゼの発現を減少させる、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖
    ＲＮＡまたはリボザイムをコードしているＤＮＡを含む、トランスジェニック植
    物。
  13. 【請求項１３】 ゲノムに安定的に組みこまれた、アミノ酸の対応するＮ−
    ヒドロキシアミノ酸およびこのＮ−ヒドロキシアミノ酸に由来するオキシムへの
    変換を触媒するチトクロームＰ−４５０モノオキシゲナーゼ、またはアルドキシ
    ムのニトリルへの変換および当該ニトリルの対応するシアノヒドリンへの変換を
    触媒するチトクローム４５０モノオキシゲナーゼをコードしているＤＮＡをさら
    に含む、請求項１２に記載のトランスジェニック植物。
  14. 【請求項１４】 請求項１２に記載のトランスジェニック植物を得る方法で
    あって、 （ａ）完全な植物に再生することのできる植物細胞または組織に、シアノヒドリ
    ン、テルペノイド、フェニル誘導体またはヘキサノール誘導体をグルコースにコ
    ンジュゲートさせるＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェ
    ラーゼをコードしている、当該植物で発現可能な遺伝子を含むＤＮＡを導入する
    ステップ、および （ｂ）トランスジェニック植物を選択するステップ、 を含む方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１２に記載のトランスジェニック植物を得る方法で
    あって、 （ａ）完全な植物に再生することのできる植物細胞または組織に、発現がシアノ
    ヒドリン、テルペノイド、フェニル誘導体またはヘキサノール誘導体をグルコー
    スにコンジュゲートさせるＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトラン
    スフェラーゼの発現を減少させる、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはリ
    ボザイムをコードしているＤＮＡを導入するステップ、および （ｂ）トランスジェニック植物を選択するステップ、 を含む方法。
JP2001542555A 1999-12-01 2000-11-29 Ｕｄｐ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼ Pending JP2003515345A (ja)

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