CN1415017A - 尿苷二磷酸葡萄糖:糖苷配基一葡糖基转移酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了编码将氰醇、萜类化合物、苯基衍生物或者己醇衍生物偶联到葡萄糖的尿苷二磷酸(UDP)葡萄糖：糖苷配基－葡糖基转移酶的DNA分子。相应基因在植物中的转基因表达能用于影响相应的糖苷的生物合成。

Description

尿苷二磷酸葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶
本发明提供了编码将氰醇、萜类化合物、苯基衍生物或者己醇衍生物偶联到葡萄糖的尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶的DNA分子。相应基因在植物中的转基因表达能用于影响所对应的糖苷的生物合成。
在双色高粱(Sorghum bicolor)黄化苗中研究了蜀黍苷的生物合成途径，并发现涉及两种膜结合多功能细胞色素P450。氨基酸前体L-酪氨酸被CYP79A1(P450TYR)酶羟基化两次，形成(Z)-对-羟基苯乙醛肟(WO95/16041)，其随后被CYP71E1(P4500x)酶转化为氰醇对-羟基苯乙醇腈(WO 98/40470)。所述酶的转基因表达用于改变、重建或者新建在植物中生氰糖苷的生物合成途径或者改变芥子油苷的产生。
在蜀黍苷的生物合成中，氰醇对-羟基苯乙醇腈与对-羟基苯甲醛和氰离子在生理pH下形成平衡，并且通过UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶偶联到葡萄糖。植物具有很强的将广泛的不同化学结构葡萄糖基化的能力，但是植物中葡糖基转移酶存在的数目和底物特异性的范围绝大部分都不知道。早期研究表明窄的和宽的底物特异性都能被发现。不幸的是，在分离葡糖基转移酶至均质时不丧失其生物活性中遇到了困难，使前景暗淡。遇到的困难部分反映了：许多葡糖基转移酶分子量相似、不稳定、并且以微量存在。然而超过一百种不同的编码推断的、次级植物代谢葡糖基转移酶的cDNA已描述于公众可进入的数据库，仅仅证实了几种蛋白质。没有从生氰植物中分离氰醇葡糖基转移酶的报道。本发明证实UDP-葡萄糖：苯乙醇腈-葡糖基转移酶和CYP79A1酶及CYP71E1酶在转基因植物中都表达，使这些植物催化氨基酸酪氨酸向生氰的蜀黍苷的转化。因此，催化涉及生氰糖苷在植物中生物合成反应的蛋白质组合表达实际上建立了在该转基因植物中生氰糖苷合成的完整途径。
基因指的是编码序列和相关调控序列，其中编码序列转录为RNA，例如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、双链RNA、有义RNA或者反义RNA。调控序列的例子是启动子序列、5’和3’非翻译序列和终止序列。还存在其它元件例如内含子。
表达通常指的是内源性基因或者转移基因在植物中的转录和翻译。然而，联系到不编码蛋白质的基因例如反义构建体，术语表达仅指转录。
本发明提供了下述解决方案：
●编码将氰醇(例如苯乙醇腈、对-羟基苯乙醇腈、丙酮氰醇或2-羟基-2甲基丁腈)；萜类化合物(例如香叶醇、橙花醇或β-香茅醇)；苯基衍生物(例如对-羟基苯甲酸、苯甲酸、苯甲醇、对-羟基苯甲醇、2-羟基-3甲基氧苯甲醇、香草酸或香兰素)或者己醇衍生物(例如1-己醇、反式-2-己烯-1-醇、顺式-3-己烯-1-醇、3-甲基-3-己烯-1-醇、3-甲基-2-己烯-1-醇)偶联到葡萄糖的UDP-葡萄糖-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶的DNA分子，以及其编码的蛋白质；
●所述编码葡糖基转移酶的DNA分子具有分子式R1-R2-R3，其中
--R1、R2和R3是组成序列，包括独立地选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、和His氨基酸残基的氨基酸残基，并且
--R2包括150或更多氨基酸残基，如使用可选参数设为默认值的计算机程序相似性查询程序BLAST 2.0组中的blastp确定，其序列与SEQID NO：1中比对的组成序列至少50％相同。
●所述DNA分子，其中R2编码150-425氨基酸残基，例如SEQ IDNO：1中21-445、168-448、或者281-448的氨基酸；
●所述DNA分子，其中R1和R3独立地包括0-500氨基酸残基；
●所述DNA分子，其中R1或者R3编码一种或多种其它的组成序列，所述序列长度至少为30个氨基酸并且与SEQ ID NO：1中比对的组成序列(例如SEQ ID NO：1中21-55、142-174、或者303-343的氨基酸)至少65％一致，；
●所述DNA分子，其编码如SEQ ID NO：2所定义的300-600氨基酸残基长的蛋白质，或者是SEQ ID NO：1所定义的蛋白质；
●分离该cDNA分子的一种方法；
●产生纯化的重组UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶的方法，其中所述酶将氰醇、萜类化合物、苯基或生物者己醇衍生物偶联到葡萄糖；
●一种获得转基因植物的方法以及转基因植物自身，其包括已稳定整合进其基因组的编码该蛋白的DNA，或者编码有义RNA、反义RNA、双链RNA或核酶的DNA，其表达降低所述蛋白的表达。
从当前拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组测序计划状态推断，预期拟南芥基因组含有大约120个编码涉及天然产物合成的编码葡糖基转移酶的基因。还预期其它植物也含有许多编码葡糖基转移酶的基因。尽管双色高粱中存在许多葡糖基转移酶，除一个外都对苯乙醇腈和对-羟基苯乙醇腈没有高特异性。该葡糖基转移酶几种同工型的存在有可能考虑到高粱和多倍体形式的进化和分类学背景。对-羟基苯乙醇腈的不稳定以及在柱层析中缺乏含有双色高粱中的对-羟基苯乙醇腈葡糖基转移酶活性的多个峰表明，在生氰糖苷蜀黍氰苷的生物合成中涉及一种特异的葡糖基转移酶(sbHMNGT)。
按照通常途径，亦即进行生氰糖苷的生物合成涉及所有植物中同一类型中间体。因此，预期不同种属植物中催化这些过程的酶表现显著的相似性。这一点已在涉及氨基酸转化为肟的部分途径中清楚证明。已证实在所有检验的植物中该部分被一个或多个属于CYP79家族的细胞色素P450酶催化。这些细胞色素P450在氨基酸水平上显示大于40％的序列相同性。芥子油苷合成中氨基酸起始转化为肟也被属于CYP79家族的细胞色素P450酶催化。与以前的这些发现相符，预期植物中合成偶联葡萄糖到氰醇的生氰糖苷遵循保守的涉及结构相关葡糖基转移酶的生化途径。本发明的目的是提供编码UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶的DNA分子，所述酶将许多氰醇、萜类化合物、苯基衍生物和己醇衍生物(对-羟基苯甲酸、苯甲酸、苯甲醇、对-羟基苯甲醇和香叶醇)偶联到葡萄糖，并基于双色高粱UDP-葡萄糖：羟基苯乙醇腈-O-葡糖基转移酶的氨基酸序列和其对应基因序列确定其在生氰植物中一般结构。因此本发明提供编码UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶的DNA分子，所述酶将氰醇(例如苯乙醇腈、对-羟基苯乙醇腈、丙酮氰醇或2-羟基-2甲基丁腈)、萜类化合物(例如香叶醇、橙花醇或β-香茅醇)、苯基衍生物(例如对羟基苯甲酸、苯甲酸、苯甲醇、对-羟基苯甲醇、2-羟基-3甲氧基苯甲醇、香草酸或香兰素)或者己醇衍生物(例如1-己醇、反式-2-己烯-1-醇、顺式-3-己烯-1-醇、3-甲基-3-己烯-1-醇、3-甲基-2-己烯-1-醇)偶联到葡萄糖，其分子式为R1-R2-R3，其中
--R1、R2和R3是组成序列，包括独立地选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Me、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His氨基酸残基的氨基酸残基，和任选地任何活细胞中翻译后修饰产生的其它氨基酸残基，并且
--R2包括150，优选250或更多的氨基酸残基，其序列至少50％，优选至少55％或者甚至更优选至少70％与SEQ ID NO：1中比对的组成序列相同。
活细胞中翻译后修饰产生的典型的氨基酸残基是Aad、bAad、bAla、Abu、4Abu、Acp、Ahe、Aib、bAib、Apm、Dbu、Des、Dpm、Dpr、EtGly、EtAsn、Hyl、aHyl、3Hyp、4Hyp、Ide、alle、MeGly、Melle、Melys、MeVal、Nva、Nle和Orn。
典型地，R2包括150-450氨基酸残基，优选长度为150-280氨基酸残基。R2特定的实施方案体现于SEQ ID NO：1中的21-445、168-448或者281-448氨基酸。
R1和R3独立地包括0-500，优选0-350氨基酸残基，并且可包括一个或更多其它组成序列，所述序列长度至少为30个氨基酸并且至少65％，但是优选至少70％与SEQ ID NO：1比对的组成序列相同。这样的所述其它组成序列的例子体现于SEQ ID NO：1中21-55，142-174或303-343的氨基酸。该DNA分子编码的葡糖基转移酶通常包括300-600氨基酸残基，如SEQ ID NO：1所描述并且如SEQ ID NO：2所编码的双色高粱酶大小为492个氨基酸残基。
通常存在两种序列对位排列的方法。由Needleman和Wunsch和由Sellers提出的动态程序算法排列两个序列的全长，提供序列的全局排列。另一方面Smith-Waterman算法产生局部排列。局部对位排列比对序列中基于记分矩阵和空位罚分选择的两序列中最相似的区域。这使得数据库查询集中于序列中最高度保守的区域。它也得以鉴定序列中的相似区域。使用Smith-Waterman算法排列的程序例如BLAST(基本局部相似性比对搜索工具，Basic Local Alignment Search Tool)和FASTA程序为加速比对给排列其它限制。
在本发明内容中，使用获自Genetic Computer Group，Madison，WI的PILEUP程序方便地进行全局序列对位排列。
使用BLAST(一组相似性查询程序，设计为用于搜索所有可获得的序列数据库，无论查询的是蛋白质或DNA)方便地进行局部对位排列。该查询工具中BLAST 2.0版本(Gapped BLAST)可在互联网(目前http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上公开得到。它使用启发式算法，查询与全局排列相对的局部排列，并且因此能检测仅共享分离区域的序列之间关系。BLAST查询中分配的记分值有明确的统计学解释。在本发明领域特别有用的是允许在局部序列对位排列中引入空位(gap)的blastp程序和PSI-BLAST程序，两程序比较查询的氨基酸序列与蛋白质序列数据库，而且blastp的变化程序允许仅对两序列局部排列。优选可选参数设为默认值时进行所述程序。
而且，使用BLAST的序列对位排列能考虑到一个氨基酸代替为另一个是否能保存保持该蛋白质结构和功能必需的物化特性，或者更可能破坏基本结构和功能特征。该序列相似性以与相同氨基酸百分比相比较的阳性氨基酸的百分比来定量，并且有助于将该蛋白在界限清楚情况下归类到正确的蛋白家族。
对sbHMNGT底物特异性的定量和定性分析显示强烈偏向双色高粱中存在的氰醇。因此，体内氰醇葡糖基转移酶显示强烈偏向有限数目的氰醇、萜类化合物、苯基衍生物和己醇衍生物。然而，考虑到新的次级代谢物生物合成和异源生物物质代谢的进化，催化生物合成途径末尾反应的酶常常比那些催化前面反应的底物特异性更广，产生更大的可变性。途径(CYP79A1)中第一个酶是酪氨酸专有的，以及CYP71E1和sbHMNGT也接受苯丙氨酸衍生肟和氰醇均分别说明了这一点。腈基团的存在对sbHMNGT底物识别也不是必需的，sbHMNGT对葡萄糖基化苯甲醇、苯甲酸、和香草酸、香草醛和2-羟基3-甲氧基苯甲醇、香叶醇、橙花醇和β-香茅醇的能力表明此点。结果表明，sbHMGT接受与苯乙醇腈或对-羟基苯乙醇腈结构类似的底物。该组底物复合物还包括GreenNote Flavours，例如己-1-醇、反式-2-己烯-1-醇和顺式-3-己烯-1-醇和其它酪氨酸或苯丙氨酸相关芳香族化合物，例如苯乙酸、苯乙醇、和苯基乙酸乙酯(Krings et al Appl Microbiol Biotechnol 49：1-8，1998)。观察到苯甲醇、苯甲酸和香叶醇糖基化的速率比在氰醇中观察到的那些要低。然而，它们仍较高。到目前为止，没有分离或克隆单萜类化合物葡糖基转移酶或者己醇(或己醇衍生物)葡糖基转移酶的报道，尽管这些酶类在确定加工过的食物和蔬菜的味和香上有明显的重要性。
在糖基化过程中，通常通过酶促加入糖基团给予不稳定复合物(糖苷配基)更低的化学反应性和更高的水溶性。典型地，这使植物储存更多这些葡糖苷形式的糖苷。植物合成的许多次级代谢物是葡萄糖基化的。例如已鉴定仅黄酮类化合物葡糖苷就超过1500种。糖基化通常发生在化合物生物合成后期或者是最后一步，否则在细胞环境中不稳定，并且能提供惰性的和可转运的前体形式的化合物库，所述化合物可通过葡萄糖苷酶的水解获得其活性形式。通过导入葡糖基转移酶，自由糖苷配基例如萜类化合物和Green Note Flavours转变成相应葡糖苷用于水果、蔬菜和其它植物中保留香、味和色成分。在食物制备或者消耗中通过特异的或非特异的β-糖苷酶的作用能释放糖苷配基。通过定向进化或基因工程的方法(例如基因改组或者突变)获得对个案所需的香味、口味或颜色化合物的催化特征的进一步优化。
例如在葡萄酒中，由于发现葡萄酒的香、味、和颜色成分来源于大部分以葡糖苷存在的葡萄化合物，许多次级代谢物的葡萄糖基化近来成为重要研究努力的焦点。该类靶点化合物中有萜类，例如发现呈游离的和糖苷形式的香叶醇。考虑到在本发明中，通过调控葡糖基转移酶的活性能调节香和味之前体糖苷库，并且通过酸或酶介导的水解能从储存的葡萄糖苷库中释放香和味。因此，在葡萄、浆果和其它水果、蔬菜、和植物中，导入特定葡糖基转移酶(例如克隆的sbHMGT)或者通过反义技术降低其表达，得以直接改变次级代谢产物成分。这允许调节植物游离的和结合的重要的香味库，以设计有明确的、感官特征的水果、啤酒和其它植物衍生物。
例如葡糖基转移酶偶联糖苷配基到葡萄糖的的能力可在包括下述步骤的试验中确定：
a)包括14C-UDP-葡萄糖、糖苷配基和UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶的反应混合物在30℃孵育2分钟-2小时间
b)终止反应，并且
c)对产生的葡糖苷进行化学鉴定和定量。
典型地，反应混合物体积为5-2000μl，但是优选20μl，包括10-200mM Tris HCl(pH7.9)、1-5μM 14C-UDP-葡萄糖(大约11.0GBq mmol-1)、0-300μM UDP-葡萄糖、0-20mM糖苷配基、25mM γ-葡糖酸内酯、0-2μg/μl BSA和0-10ng/μl UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶。如适当，可包括除γ-葡糖酸内酯外的β-葡糖苷酶抑制剂和除BSA外的蛋白质稳定剂。终止反应的一种可能是酸化反应混合物，例如加入1/10体积的10％乙酸。
可使用多种方法包括NMR光谱、薄层色谱分析(TLC分析)、高压液相色谱分析(HPLC分析)或气液色谱(GLC分析)与葡糖苷的质谱分析恰当组合，做到反应混合物中形成的葡萄糖苷进行化学鉴定和定量。
用于NMR光谱分析的反应混合物通常总体积0.5-1ml，孵育2小时，并且包括0-10mM糖苷配基，例如2mM对-羟基苯乙醇腈或者6.5mM香叶醇、3mM UDP-葡萄糖、2.5μg重组sbHMNGT和0.5mg BSA。例如在NMR分析前用乙酸乙酯抽提葡糖苷并冻干。
为TLC分析，反应混合物加于Silica Gel 60 F524板(Merck)，干燥并用溶剂例如乙酸乙酯∶丙酮∶二氯甲烷∶甲醇∶H2O(40∶30∶12∶10∶8v/v)洗脱。平板室温干燥1小时并在磷成像仪(phosphorImager)扫描前，曝光于储存的磷成像仪平板。基于放射性标记的UDP-葡萄糖的放射性比活性，定量所形成的葡萄糖苷的量。
液闪计数( LSC分析)也可确定放射性活性。在某些情况下形成的葡糖苷来自非常疏水的糖苷配基，即苯乙醇腈，葡萄糖苷可被抽提到乙酸乙酯相，因此与未掺入的14C-UDP-葡萄糖中分离。向每250μl乙酸乙酯抽提物中加入2ml液闪混合液并且用液闪计数器分析。在柱分离中，使用作为糖苷配基底物的苯乙醇腈和所形成的葡糖苷的乙酸乙酯抽提物，能鉴定那些含有sbHMNGT活性的组分。
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的知识可用于加速编码将氰醇、萜类化合物、苯基衍生物或者己醇衍生物偶联到葡萄糖的尿苷二磷酸：糖苷配基-葡糖基转移酶的DNA分子的分离和产生，该方法包括
a)从表达UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶的植物组织制备cDNA文库，
b)使用基于SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1设计的至少一种寡核苷酸从cDNA文库扩增UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶的部分cDNA，
c)在巢式PCR反应中，任选地使用基于SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：1设计的一种或多种寡核苷酸从cDNA文库扩增UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶的部分cDNA，
d)使用步骤(b)或者(c)中获得的DNA作为探针，以筛选从表达UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶的植物组织制备的DNA文库，并且
e)鉴定和纯化载体DNA，其中包含编码蛋白质的开放阅读框，所述蛋白质特征在于至少150个氨基酸残基长的氨基酸组成序列，其与SEQID NO：2比对的组成序列有50％或更多的序列相同性，
f)任选地进一步加工纯化的DNA以实现，例如在微生物(如大肠杆菌(E.coli)或巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)中异源表达蛋白质，继之分离葡糖基转移酶，确定其底物特异性和抗体产生。
在步骤(b)和(c)中，用于扩增的第二种寡核苷酸优选为与用以制备cDNA文库的载体DNA内一个区域互补的寡核苷酸。然而，也能用基于SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：1序列所设计的第二种寡核苷酸。分离cDNA该方法的实施方案描述于实施例4。编码UDP-葡萄糖：糖苷配基葡糖基转移酶的cDNA克隆或该克隆的片段也可单独用于DNA芯片，或与编码属于CYP79或CYP71E1蛋白家族的蛋白的cDNA克隆(或克隆的片段)一起用于DNA芯片。这提供了监测植物中生物或非生物因子所引起生氰糖苷合成的诱导或抑制的简单方法。
本发明进一步的实施方案是将氰醇偶联到葡萄糖的UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶，例如偶联对-羟基苯乙醇腈到葡萄糖的双色高粱酶。
使用包括染料色谱和使用UDP-葡萄糖洗脱的方法可获得纯化的重组UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶。一种适当的染料色谱的柱材料是Reactive Yellow 3，其优选地交联到琼脂糖珠。使用2mM UDP-葡萄糖能实现方便地洗脱该蛋白。
本发明还提供了核酸化合物，包括编码本发明的新蛋白质的开放阅读框。该化合物特征在于分子式为RA-RB-RC，其中
--RA-RB和RC构成了组成序列，包括独立地选自G、A、T和C核苷酸残基或者G、A、U和C核苷酸残基组的核苷酸残基；
--RA和RC独立地包括0-1500，优选0-1050个核苷酸残基；
--RB包括450-1260，并且优选450-840核苷酸残基；并且
--RB组成序列与SEQ ID NO：2比对的组成序列至少65％相同。
组成序列RB的特定例子体现于SEQ ID NO：2中的61-1335，502-1344，或841-1344核苷酸。
在本发明的一个优选实施方案中，组成序列RA或RC至少一个包括一种或多种其它组成序列，所述序列长度至少150个核苷酸残基并且与SEQ ID NO：2中的比对组成序列至少60％相同。这样的其它组成序列的特定例子体现于SEQ ID NO：2中61-165、427-522或者907-1029的核苷酸。
通过CYP79A1、CYP71E1和sbHMNGT的表达，蜀黍苷合成途径能被导入非生氰植物。来源于同一植物种属即高粱中的这三个基因产物作为大分子复合物组装，产生途径中的中间体的更强的通道，并且释放到植物中的游离的中间体更少。
编码本发明葡糖基转移酶的DNA分子作为转移基因表达对改变植物中生氰糖苷的生物合成特别有用。当编码UDP-葡萄糖：氰醇葡糖基转移酶的基因与编码属于CYP79家族(催化氨基酸转化为相应N-羟基氨基酸和由该N-羟基氨基酸衍生肟或者细胞色素P450单氧化酶)和CYP71家族(催化醛肟转化为腈和该腈转化为相应氰醇)的细胞色素P450酶的基因一起表达时，不生氰的野生型植物转化为生氰植物。恰当选择启动子以提供基因的组成型的、可诱导的或组织特异性表达，提供了获得患有所需疾病和食草反应的转基因生氰植物的方法。同样地，利用相同基因使用反义、双链RNA(dsRNA)或者核酶技术可以改变或者降低生氰植物中生氰糖苷的含量。生氰糖苷属于植保素组。在生氰植物中，阻断或降低UDP-葡萄糖：氰醇葡糖基转移酶的活性预期可导致如同通常生氰糖苷在受损或感染的植物细胞中降解产生的同一产物的产生和积累。因此使用反义或者核酶技术，能够得到在组织中产生生氰糖苷降解产物的植物，其中在野生型植物的该组织中产生生氰糖苷会导致植物对病原体和食草的抗性改变。因此，另一方面，本发明提供了转基因植物，包括已稳定整合进其基因组的编码UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶的DNA，所述酶将氰醇、萜类化合物、苯基衍生物、或者己醇衍生物偶联到葡萄糖，或者编码有义RNA、反义RNA、双链RNA或核酶的DNA，其表达降低了偶联对-羟基苯乙醇腈到葡萄糖的UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶的表达。该植物能用如下方法产生该植物，包括：
(a)将DNA导入能再生为完整植物植物细胞或者组织，所述DNA包括在该植物中可表达的编码UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖转移酶的基因，所述酶将氰醇、萜类化合物、苯基衍生物或者己醇衍生物偶联到葡萄糖，或者所述DNA编码有义RNA、反义RNA或核酶，其表达降低了偶联氰醇到葡萄糖的UDP-葡萄糖：糖苷配基葡糖转移酶的表达；并且
(b)选择转基因植物
实施例
实施例1 UDP-葡萄糖：对-羟基苯乙醇腈葡糖基转移酶实验
通常20μl反应混合物包括
100mM Tris-HCL(pH7.9)，
1-5μM 14C-UDP-葡萄糖(11.0GBq·mmol-1，Amersham
LIFE SCIENCE)，
0-300μM UDP-葡萄糖，
0-20mM对-羟基苯乙醇腈(溶于水，新鲜制备)，
25mM γ-葡糖酸内酯
0-1mg BSA和
0.5-10μl蛋白制备物
将其在30℃孵育2分钟到2小时，之后加入1/10反应体积10％乙酸终止反应。相同实验条件用于确定苯乙醇腈、苯甲酸、苯甲醇、香叶醇和许多其它糖苷配基的葡萄糖基化。
为确定重组sbHMNGT的底物特异性，30℃持续孵育20分钟，并且上面的通用方案经改变以包括
1.25mM糖苷配基(溶解于乙醇，除了溶解于乙二醇单醚的黄酮类化合物)，
1.25μM 14C-UDP-葡萄糖，
12.5μM UDP-葡萄糖，
100ng重组sbHMNGT，和
4μg BSA。
重组sbHMNG活性的定量测定在30℃进行4分钟孵育。进行分析以确定底物特异性除，了反应混合物包括如下：
1、5或10mM糖苷配基，
5μM 14C-UDP-葡萄糖，
0.2mM UDP-葡萄糖，
200ng重组sbHMNGT，和
24μg BSA。NMR光谱分析用的反应混合物孵育2小时，总体积0.5-1ml，包括
2mM对-羟基苯乙醇腈或6.5mM香叶醇，
3mM UDP-葡萄糖，
2.5μg重组sbHMNGT，和
0.5mg BSA。
用乙酸乙酯抽提葡糖苷并在NMR分析前快速真空冻干。
为 TLC分析，反应混合物加到Silica Gel 60 F524板(Merck)上，干燥并在含有乙酸乙酯∶丙酮∶二氯甲烷∶甲醇∶H2O(40∶30∶12∶10∶8v/v)的溶剂中洗脱。平板室温干燥1小时并在Storm 860Phosphorlmager(Molecular Dynamics)扫描前暴露于储存的磷成像平板(Molecular Dynamics)。
为液闪计数(LSC)分析，用400μl乙酸乙酯抽提反应混合物以从未掺入的14C-UDP-葡萄糖中分离葡糖苷。每250μl乙酸乙酯抽提物加入2mlEcoscint A(国立诊断，新泽西，美国)并且使用Win Spectral 1414(Wallac)液闪计数器分析。用苯乙醇腈作为底物以检测液相色谱产生的测试组分。实施例2 UDP-葡萄糖：对-羟基苯乙醇腈-葡糖基转移酶的纯化
除非特别指出，所有步骤在4℃进行。尽管sbHMNGT的内源性底物是对-羟基苯乙醇腈，苯乙醇腈用作纯化过程中sbHMNGT活性试验的底物，因为它是同样好的底物。而且，在苯基环对位上缺乏羟基排除了对-葡萄糖基氧基苯乙醇腈合成的可能，在用LSC试验中其与蜀黍苷不可区分。
1千克双色高粱种室温下水中浸泡过夜，并且随后按照描述黑暗中30℃生长两天(Halkier et al，Plant Physiol.90：1552-1559，1989)。收获发芽的苗并使用研体和研杵在2倍体积的预冷抽提缓冲液(250mM蔗糖；100mM Tris HCl(pH7.5)；50mM NaCl；2mM EDTA；5％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮；200μM苯甲基磺酰氟；6mM DTT)来抽提。抽提物先经尼龙筛过滤，20,000g离心20分钟。上清组分经差别硫酸铵(35-70％)分级沉淀1小时，并在20,000g离心20分钟。使用绘画刷重悬沉淀于缓冲液A(20mM Tris HCl(pH7.5)；5mM DTT)并用缓冲液A平衡的100ml Sephadex G25(Pharmacia)或Biogel P-6(Bio-Rad)柱(20ml/min流速)除盐。尽管这些纯化步骤不导致sbHMNGT的比活显著提高，但有效去除了低分子量溶质(包括生氰前体)。收集第一个紫外吸收峰并加样到缓冲液B(缓冲液A+50mM NaCl)平衡过的20ml Q-sepharose(Pharmacia)柱(60-80ml/hr流速)。柱子用缓冲液B洗脱直到基线稳定，并且用缓冲液A(总共800ml)以50-400mM NaCl线性梯度洗脱蛋白。收集10ml组分，并取3-5ul通过LSC检测苯乙醇腈-葡糖基转移酶活性。所有结合到Q-sepharose的活性sbHMNGT在150-200mM NaCl间洗脱，并纯化了约7倍。合并的活性组分在缓冲液B中稀释5倍，并用Amicon YM30或者YM10膜在于-80℃储存前浓缩20倍。
染料色谱纯化的其余步骤在室温或者4℃进行。合并的浓缩离子交换组分的1/4(5ml中含有约10-15mg蛋白质)加到缓冲液B(10-15ml/hr)平衡的含有交联到4％琼脂糖珠上的(Lot 63H9502；Sigma)ReactiveYellow 3柱子(1cm×10cm)。柱子用缓冲液B洗直到基线稳定。用10ml含有2mM UDP-葡萄糖的缓冲液B洗脱蛋白质。合并含有基本纯的sbHMNGT的活性组分并储存于-80℃(加或不加1mg/ml牛血清白蛋白(BSA))。
结果：考虑到总的sbHMNGT活性、蛋白质浓度和抽提体积，开始的实验表明，2天的发芽期是最佳的。与用研体和研杵抽提相比，使用Waring混合器导致活性少于50％。sbHMNGT活性在-80℃冻存大体上不受影响并且加入甘油也没作用。缓冲溶液中加入升高浓度的DTT(5mM，与2mM相比较)在4℃储存2天后活性高10倍。主要在粗制备物中发现DTT的显著效果，而部分纯化的离子交换制备物对还原剂的浓度较不敏感。
在迷你型柱上测试几个假亲和柱包括Cibachron blue 3G，ReactiveGreen 19，Reactive Yellow 3和与4％的琼脂糖珠交联的UDP-葡萄糖醛酸(glucoronic acid)。在不同盐浓度下使用NaCl和UDP-葡萄糖试验洗脱。鉴定Reactive Yellow 3是优选的柱材料。活性SbHMNGT在50mM NaCl下结合到Reactive Yellow 3的并在用稍高NaCl浓度洗后能洗脱，在洗脱物中无任何可检测的紫外吸收。显示sbHMNGT活性与SDS-PAGE中50-55kDa左右迁移的多肽相关，尽管存在几种杂质(数据未显示)。用2mM UDP-葡萄糖代替NaCl洗脱产生表观上均一的相似迁移多肽的洗脱。当重复该方案时发现为获得同等纯度，与总蛋白相关的低的柱高是关键。假设由SDS-PAGE可见的所有多肽是有活性的(并且因此所有失活的蛋白已丢失)并且补偿了冷底物稀释(UDP-葡萄糖)，sbHMNGT代表大约0.25％的总蛋白，被纯化了420倍，而得率是22％。实施例3 肽产生和测序
大约5μg sbHMNGT用于N-末端测序，使用蛋白测序仪(型号G1000A，Hewlett-Packard)。为消化肽，大约100μg sbHMNGT用三氯乙酸沉淀并且重悬于50μl的50mM Tris HCl(pH8.0)，5mM DTT和6.4mM尿素。制备物在60℃孵育50分钟，冷却到室温，并用三倍体积的30mM Tris(pH7.7)和1.25mM EDTA稀释。Endo Lys-C(Promega)以1∶25比率(w/w)加入并且让反应混合物在37℃孵育24小时。用Vydac 208TP52 C8柱(250mm×21mm)和Beckman System GoldHPLC设备反向HPLC纯化肽。肽以0.2ml/min流速在缓冲液C(0.1％三氯乙酸)中上样，并且用缓冲液C中0-80％的乙腈线性梯度洗脱。手工收集组分并且按照以上描述测序。
实施例4-克隆
PCR扩增：使用2单位Taq DNA聚合酶(Pharmacia)，4μl 10×TaqDNA聚合酶缓冲液，5％(v/v)二甲基亚砜，1μl dNTPs(10mM)，80皮摩尔每种引物C2EF(5’-TTYGTIWSICAYTGYGGITGGAA-3’，SEQID NO：3)和T7(5’-AATACGACTCACTATAG-3’，SEQ ID NO：4)和大约10ng质粒DNA模板在总体积40μl中进行第一轮PCR扩增反应。从由1-2cm高的双色高粱黄化苗(Bak et al，Plant Mol.Biol.36：393-405，1998)制备的单方向pcDNA II(Invitrogen)质粒文库制备质粒DNA模板。热循环参数为95℃，5分钟，3×(95℃5秒，42℃30秒，72℃30秒)，32×(95℃5秒，50℃30秒，72℃30秒)，最后72℃5分钟。
按照以上描述进行第二轮PCR扩增，除了使用引物C2DF(5’-GARGCIACIGCIGCIGGICARCC-3’，SEQ IDE NO：5)和T7，和1μl第一轮反应物作为DNA模板。热循环参数为95℃，5分钟，32×(95℃5秒，55℃30秒，72℃30秒)，最后72℃5分钟。PCR反应混合物用1.5％琼脂糖凝胶进行凝胶电泳，切割大约600bp条带并用Qiaex II凝胶抽提试剂盒(Qiagen)清洗。再连接干净的PCR产物到pGEM-T载体并按照厂家(Promega)建议用于转化大肠杆菌JM109。核酸序列测定揭示在PCR克隆15#44的翻译产物中存在两个以前获得的肽序列。
克隆和文库筛选：用PCR克隆15#44作模板用引物441F(5’-GAGGCGACGGCGGCGGGGCAG-3’，SEQ ID NO：6)和442R(5’-CATGTCACTGCTTGCCCCCGACCA-3’，SEQ ID NO：7)按照厂家(Boehringer Mannheim)建议进行PCR，产生一条306bp的地高辛-11-dUTP标记的探针。用1.5％琼脂糖凝胶电泳后使用Qiaex II凝胶抽提试剂盒清洗标记的探针，并用以筛选上述质粒文库的大约50,000个克隆。在5×SSC，0.1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸，0.02％(w/v)SDS和1％封闭剂(Boehringer Mannheim)中65℃杂交过夜。再在0.5×SSC中60℃洗膜3×15分钟。分离到7个杂交克隆和一个全长克隆，选择sbHMNGT做进一步鉴定。实施例5 sbHMNGT与已知的或推断的编码葡糖基转移酶的cDNA之翻译产物之间的相同性和相似性
表1分别总结了sbHMNGT与已知的或者推断的葡糖基转移酶编码氨基酸序列之间的整体相同性和相似性，以及相应N-末端区域(也就是说，切割位点在sbHMNGT的291/292氨基酸残基的共有序列xCLxWL的N末端序列所限定的区域)内的相同性和相似性。
表2分别总结了sbHMNGT区域α(限定为HMNGT中188-229号残基)的氨基酸序列与已知或推断的葡糖基转移酶氨基酸序列的相应序列之间的相似性与相同性。
相似性和相同性的计算基于使用GAP程序(Genetic Computer Group，Madison，WI)对cDNA翻译产物配对比较，其中认为A/G、Y/F、S/r、V/I/L、R/K/H、D/E/N/Q为组成相似的残基。缩写的序列名是stSGT(高粱(Solanum tuberosum)茄啶葡糖基转移酶：GenbankTM录入号U82367)；bnTHGT(芸苔(Brassica napus)硫代羟肟酸(thiohydroximate)-S-葡糖基转移酶：EP-771 878-A1的SEQ IDNO：28)；zmUFGT(玉米黄酮类化合物-葡糖基转移酶：Genbank TM录入号X13502)；vvUFGT(葡萄(Vitis vinifera)花青素-葡糖基转移酶：GenbankTM录入号AF000371)；psGT(Pisum sativum UDP-葡萄糖：葡糖基转移酶：GenbankTM录入号AF034743)；meGT(木薯(Cassava)UDP-葡萄糖：葡糖基转移酶：GenbankTM录入号X77464)和zmlAAGT(玉米(Maize)吲哚-3-乙酸β-葡糖基转移酶：GenbankTM录入号L34847)。
表1：
        sbHMNGT
        整体％              N末端％
        相同性    相似性    相同性     相似性zmUFGT       36.7      41.5      32.6      37.1vvUFGT       30.0      38.7      23.8      33.3psGT         41.6      51.5      32.9      46.3meGT         31.3      41.6      25.3      36.8zmlAAGT      34.9      41.3      27.8      35.0snSGT        28.9      38.0      23.6      31.0bnTHGT       30.7      38.0      24.7      33.3表2：α区域的一致性(斜体)与相似性(黑体界面)
          S sbHMNGT       psGT          Z mUFGT         V vUFGT        mhGTsbHMNGT          45.2％         26.2％          19.1％         20％psGT          69.1％        
Figure A0081784400212
   ------          ------         ------zmUFGT        35.7％         ------        
Figure A0081784400213
    47.6％         37.5％vvUFGT        35.7％         ------          59.5％        
Figure A0081784400214
   -----mhGT          37.5％         ------          55.0％         -----         
实施例6 异源性表达
用sbHMNGT 1质粒作为模板，用引物EXF1(5’-AATAAAAGCATATGGGAAGCAACGCGGCGCCTCCG-3’，SEQ ID NO：8)和EXR1(5’-TTGGATCCTCACTGCTTGCCCCCGACCA-3’，SEQ ID NO：9)PCR扩增1500bp的全长sbHMNGT插入片段。引物含有限制性内切酶NdeI(EXF1)和BamHI(EXR1)的5′识别位点。PCR反应条件基本按照实施例4描述，除了热循环参数为95℃，3分钟，30×(95℃5秒，53℃30秒，72℃90秒)，最后72℃5分钟。凝胶纯化PCR产物，用NdeI和BamHI消化，再次凝胶纯化，连接到已用限制性内切酶NdeI和BamHI消化并经凝胶纯化过的质粒表达载体pSP19g10L(Barnes，Methods inEnzymology 272：3-14，1996)。按照厂家(Promega)建议将连接反应混合物转化大肠杆菌JM109细胞。选择出成功克隆的细胞后，按照描述(Ford et al，J.Biol.Chem.273：9224-9233，1998)开始表达。简短地说，600μl 37℃过夜培养物加于300ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中。使培养物在150rpm连续振摇下28℃生长5小时，再加入IPTG至终浓度为0.4mM。诱导后，让培养物继续生长过夜，并且2500g离心10分钟收获。沉淀重悬于9ml200mM Tris pH7.9，1mM EDTA，5mM DTT和0.1mg/ml溶菌酶中。加入等体积冷冰水并且让混合物室温孵育10分钟，随后冰上孵育20分钟。加入18μmol苯甲磺酰氟和100单位的DnaseI/ml(Sigma)，将重悬物经-20℃三次冻融循环。苯甲基磺酰氟调整到终浓度为1.5mM，并且将制备物在15,000g离心15分钟。按照上述制备阴性对照，其在质粒载体上不含有插入片段。为纯化重组蛋白质，按照上述裂解两个300ml培养物，并且按天然蛋白进一步纯化。简短地说，粗细胞裂解物经Q-Sepharose层析、除盐并按照实施例2所描述ReactiveYellow 3层析。重组蛋白产量大约1mg/100ml LB培养物。实施例7与除盐后高粱黄化苗粗提物相比较重组sbHMNGT的底物特异性
用14C-UDP-葡萄糖经TLC确定葡糖基转移酶活性。下表1实心框(■)表示在与各自糖苷配基底物孵育后可见放射性标记产物。空心框(□)表示在所用实验条件下没有检测到任何放射性标记产物。括号中数字表示每个糖苷配基带计算标准差的相对VMAX。对-羟基苯乙醇腈的VMAX值是1500摩尔产物/摩尔sbHMNGT/秒。
表3：
  底物                 活性
  氰醇                 高粱粗提物  重组sbHMNGT1)苯乙醇腈                 ■          ■(77.8±8.6％)2)对-羟基苯乙醇腈          ■          ■(100±7.2％)3)丙酮氰醇                 □          □苯基衍生物4)氢醌                     ■          □5)苯甲醇                   ■          ■(13.1±2.1％)6)对-羟基苯甲醇            ■          ■7)苯甲酸                   ■          ■(4.2±0.8％)8)对-羟基苯甲酸            ■          □9)对-羟基苯甲醛            ■          □10)龙胆酸                  □          □11)咖啡酸                  ■          □12)2-羟基肉桂酸            ■          □13)白藜芦醇(芪)            ■          □14)水杨酸                        ■    □15)对-羟基扁桃酸                 ■    □16)香草酸                        ■    ■17)香兰素                        ■    ■18)2-羟基-3-甲基-苯甲醇          ■    ■黄酮类化合物19)五羟黄酮(黄酮醇)              ■    □20)花青素(花色素)                ■    □21)鹰嘴豆芽素A(异黄酮)           ■    □22)柑橘素(黄烷酮)                ■    □23)芹菜配基(黄酮)                ■    □己醇衍生物24)1-己醇                        ■    ■25)反式-2-己烯-1-醇              ■    ■26)顺式-3-己烯-1-醇              ■    ■27)3-甲基-1-己烯-1-醇            ■    ■28)3-甲基-2-己烯-1-醇            ■    ■其它29)吲哚乙酸(植物激素)            ■    □30)香叶醇(类单萜)                ■    ■(11.0±0.5％)31)番茄碱(生物碱)                ■    □32)橙花醇                        ■    ■33)对香茅醇                      ■    ■
                            序列表
                            序列表<110>LUMINIS PTY，LIMITED
 Royal Veterinary & Agricltural University<120>UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶<130>S-31227A<140><141><160>9<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>492<212>PRT<213>双色高梁(Sorghum bicolor)<400>1Met Gly Ser Asn Ala Pro Pro Pro Pro Thr Pro His Val Val Leu Val1               5                  10                  15Pro Phe Pro Gly Gln Gly His Val Ala Pro Leu Met Gln Leu Ala Arg
         20                  25                  30Leu Leu His Ala Arg Gly Ala Arg Val Thr Phe Val Tyr Thr Gln Tyr
     35                  40                  45Asn Tyr Arg Arg Leu Leu Arg Ala Lys Gly Glu Ala Ala Val Arg Pro
 50                  55                  60Pro Ala Thr Ser Ser Ala Arg Phe Arg Ile Glu Val Ile Asp Asp Gly65                  70                  75                  80Leu Ser Leu Ser Val Pro Gln Asn Asp Val Gly Gly Leu Val Asp Ser
             85                  90                  95Leu Arg Lys Asn Cys Leu His Pro Phe Arg Ala Leu Leu Arg Arg Leu
        100                 105                 110Gly Gln Glu Val Glu Gly Gln Asp Ala Pro Pro Val Thr Cys Val Val
    115                 120                 125Gly Asp Val Val Met Thr Phe Ala Ala Ala Ala Ala Arg Glu Ala Gly
130                 135                 140Ile Pro Glu Val Gln Phe Phe Thr Ala Ser Ala Cys Gly Leu Leu Gly145                 150                 155                 160Tyr Leu His Tyr Gly Glu Leu Val Glu Arg Gly Leu Val Pro Phe Arg
            165                 170                 175Asp Ala Ser Leu Leu Ala Asp Asp Asp Tyr Leu Asp Thr Pro Leu Glu
        180                 185                 190Trp Val Pro Gly Met Ser His Met Arg Leu Arg Asp Met Pro Thr Phe
    195                 200                 205Cys Arg Thr Thr Asp Pro Asp Asp Val Met Val Ser Ala Thr Leu Gln
210                 215                 220Gln Met Glu Ser Ala Ala Gly Ser Lys Ala Leu Ile Leu Asn Thr Leu225                 230                 235                 240Tyr Glu Leu Glu Lys Asp Val Val Asp Ala Leu Ala Ala Phe Phe Pro
            245                 250                 255Pro Ile Tyr Thr Val Gly Pro Leu Ala Glu Val Ile Ala Ser Ser Asp
        260                 265                 270Ser Ala Ser Ala Gly Leu Ala Ala Met Asp Ile Ser Ile Trp Gln Glu
    275                 280                 285Asp Thr Arg Cys Leu Ser Trp Leu Asp Gly Lys Pro Ala Gly Ser Val
290                 295                 300Val Tyr Val Asn Phe Gly Ser Met Ala Val Met Thr Ala Ala Gln Ala305                 310                 315                 320Arg Glu Phe Ala Leu Gly Leu Ala Ser Cys Gly Ser Pro Phe Leu Trp
            325                 330                 335Val Lys Arg pro Asp Val Val Glu Gly Glu Glu Val Leu Leu Pro Glu
        340                 345                 350Ala Leu Leu Asp Glu Val Ala Arg Gly Arg Gly Leu Val Val Pro Trp
    355                 360                 365Cys Pro Gln Ala Ala Val Leu Lys His Ala Ala Val Gly Leu Phe Val
370                 375                 380Ser His Cys Gly Trp Asn Ser Leu Leu Glu Ala Thr Ala Ala Gly Gln385                 390                 395                 400Pro Val Leu Ala Trp Pro Cys His Gly Glu Gln Thr Thr Asn Cys Arg
            405                 410                 415Gln Leu Cys Glu Val Trp Gly Asn Gly Ala Gln Leu Pro Arg Glu Val
        420                 425                 430Glu Ser Gly Ala Val Ala Arg Leu Val Arg Glu Met Met Val Gly Asp
    435                 440                 445Leu Gly Lys Glu Lys Arg Ala Lys Ala Ala Glu Trp Lys Ala Ala Ala
450                 455                 460Glu Ala Ala Ala Arg Lys Gly Gly Ala Ser Trp Arg Asn Val Glu Arg465                 470                 475                   480Val Val Asn Asp Leu Leu Leu Val Gly Gly Lys Gln
            485                 490<210>2<211>1479<212>DNA<213>双色高梁<400>2atgggcagca acgcgccgcc tccgccgacg cctcacgtgg tgctggtccc gttcccgggg 60cagggccacg tcgcgccgct gatgcagctg gcgcgcctcc tccacgcccg gggcgcgcgc 120gtcaccttcg tctacaccca gtacaactac cgccgcctcc tgcgcgccaa gggcgaggcc 180gccgtcaggc cccccgccac ctcctccgcg aggttccgca tcgaggtcat cgacgacggc 240ctctccctct ccgtgccgca gaacgacgtc ggggggctcg tcgactccct gcgcaaaaac 300tgcctccacc cgttccgcgc cctgctgcgc cgcctggggc aggaggtgga ggggcaagac 360gcgccgcccg tcacctgcgt cgtcggcgac gtcgtcatga ccttcgccgc cgcagctgcc 420agggaggccg gcatccccga ggtgcagttc ttcacggcct cagcatgcgg actcttgggc 480tacttgcact acggcgagct cgtcgaacga ggcctcgtcc ctttcagaga cgccagcctc 540ctcgccgacg acgattacct ggacacgccg ctggagtggg tgcccgggat gagccacatg 600cggctcaggg acatgccgac gttctgccgc accacggacc ccgacgacgt catggtgtcc 660gccacgctcc agcagatgga gagcgccgcc ggctccaagg ccctcatcct caacaccctg 720tacgagctcg agaaggacgt ggtggacgcg ctcgccgcct tcttcccgcc gatctacacc 780gtggggccgc tcgccgaggt catcgcgtcc tccgactccg cctccgccgg cctcgccgcc 840atggacatca gcatctggca ggaggacacg cggtgcctgt cgtggctcga cgggaagccg 900gccggctccg tggtgtacgt caacttcggc agcatggccg tcatgacggc cgcgcaggcg 960cgggagttcg cgctgggcct ggcaagctgc ggctccccgt tcctgtgggt gaagcgcccc 1020gacgtggtgg aaggcgagga ggtgctgctg ccggaggccc tgctggacga ggtggctcgc 1080ggcaggggcc tcgtggtgcc atggtgcccg caggcagcag tgctcaagca cgccgccgtg 1140ggactgttcg tctcgcactg cggatggaac tccctgctgg aggcgacggc ggcggggcag 1200ccggtgctcg cctggccctg ccacggggaa cagaccacca actgcaggca gctgtgcgag 1260gtctggggca acggcgcgca gctgcccaga gaagtggaga gcggcgcggt ggcccgtctg 1320gtgagggaga tgatggtcgg ggacctgggc aaggagaagc gggcgaaggc ggcggagtgg 1380aaggcggcgg cggaggccgc ggccaggaaa ggcggcgcgt cgtggcgtaa tgttgaacgc 1440gtggtgaacg acctgctgct ggtcgggggc aagcagtga                        1479<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物C2EF<220><221>修饰的碱基<222>(6)<223>a<220><221>修饰的碱基<222>(9)<223>a<220><221>修饰的碱基<222>(18)<223>a<400>3ttygtnwsnc aytgyggntg gaa                                             23<210>4<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：T7 primer<400>4aatacgactc actatag                                                    17<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物C2DF<220><221>修饰的碱基<222>(6)<223>a<220><221>修饰的碱基<222>(9)<223>a<220><221>修饰的碱基<222>(12)<223>a<220><221>修饰的碱基<222>(15)<223>a<220><221>修饰的碱基<222>(18)<223>a<400>5gargcnacng cngcnggnca rcc                                 23<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物441F<400>6gaggcgacgg cggcggggca g                                   21<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物442R<400>7catgtcactg cttgcccccg acca                                24<210>8<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物EXF1<400>8aataaaagca tatgggaagc aacgcgccgc ctccg                    35<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>9ttggatcctc actgcttgcc cccgacca                            28

Claims (15)

1.编码将氰醇、萜类化合物、苯基衍生物或者己醇衍生物偶联到葡萄糖的UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶的DNA分子。
2.权利要求1中的DNA分子，其编码将苯乙醇腈、对-羟基苯乙醇腈、丙酮氰醇或2-羟基-2甲基丁腈；香叶醇、橙花醇或β-香茅醇；对-羟基苯甲酸、苯甲酸、苯甲醇、对-羟基苯甲醇、2-羟基-3甲氧基苯甲醇、香草酸或香兰素；1-己醇、  反式-2-己烯-1-醇、顺式-3-己烯-1-醇、3-甲基-3-己烯-1-醇、3-甲基-2-己烯-1-醇偶联到葡萄糖的UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶。
3.权利要求1中的DNA分子，其编码具有分子式为R1-R2-R3的UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶，其中
--R1、R2和R3是组成序列，包括独立地选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、和His氨基酸残基组的氨基酸残基，并且
--R2包括150或更多氨基酸残基，其序列与SEQ ID NO：1中比对的组成序列至少50％相同。
4.权利要求1中的DNA分子，其中R2的氨基酸序列由SEQ ID NO：1中21-445、168-448、或者281-448的氨基酸所示。
5.权利要求1中的DNA分子，其中R1或R3包括一个或多个其它组成序列，所述序列长度至少为30个氨基酸，并且与SEQ ID NO：1中比对的组成序列至少65％相同。
6.权利要求1中的DNA分子，其编码300-600氨基酸残基长度的UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶。
7.权利要求1中的DNA分子，其编码具有SEQ ID NO：1中氨基酸序列的UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶。
8.权利要求1中的DNA分子，其具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列。
9.权利要求1-8之任意一项的DNA分子编码的将氰醇、萜类化合物、苯基衍生物或者己醇衍生物偶联到葡萄糖的UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶。
10.一种分离cDNA分子的方法，所述cDNA分子编码将氰醇、萜类化合物、苯基衍生物或者己醇衍生物偶联到葡萄糖的UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶；包括
a)从表达UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶的植物组织制备cDNA文库，
b)从cDNA文库使用基于SEQ ID NO：1设计的至少一种寡核苷酸扩增UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶的部分cDNA，
c)在巢式PCR反应中，任选地使用基于SEQ ID NO：1设计的另一种寡核苷酸从cDNA文库扩增UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶的部分cDNA，
d)使用步骤(b)或者(c)中获得的DNA作为探针，筛选从表达UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶的植物组织中制备的cDNA文库，并且
e)鉴定和纯化载体DNA，所述载体DNA包含编码蛋白质的开放阅读框，所述蛋白质其特征在于至少150个氨基酸残基长的氨基酸组成序列，且与SEQ ID NO：2中比对的组成序列或编码部分SEQ ID NO：1的序列有50％或更多的序列相同性，并且
f)任选地进一步加工纯化的DNA。
11.一种产生纯化的重组UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶的方法，所述酶将氰醇、萜类化合物、苯基衍生物或者己醇衍生物偶联到葡萄糖，方法包括
a)用线性盐梯度洗脱的Q-Sepharose层析，和
b)用UDP-葡萄糖洗脱的染料层析。
12.一种转基因植物，其包含已稳定整合进其基因组的编码将氰醇、萜类化合物、苯基衍生物、或者己醇衍生物偶联到葡萄糖的UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶的DNA，或者编码有义RNA、反义RNA、双链RNA或核酶的DNA，其表达降低了将对-羟基苯乙醇腈偶联到葡萄糖的UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶的表达。
13.权利要求12中的转基因植物，其还包含稳定整合进其基因组的编码催化氨基酸转化为相应N-羟基氨基酸和由该N-羟基氨基酸衍生的肟之细胞色素P-450单加氧酶的DNA，或者催化醛肟转化为腈和该腈转化为相应氰醇的细胞色素P450单加氧酶的DNA。
14.根据权利要求12获得转基因植物的方法，包括
(a)将如下DNA导入能再生为完整植物的植物细胞或组织，所述DNA包含在植物中可表达的基因，所述基因编码将氰醇、萜类化合物、苯基衍生物或者己醇衍生物偶联到葡萄糖的UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶，并且
(b)选择转基因植物。
15.根据权利要求12获得转基因植物的方法，包括
(a)将如下DNA导入能再生为完整植物的植物细胞或组织，所述DNA编码有义RNA、反义RNA或核酶，其表达降低了将氰醇、萜类化合物、苯基衍生物或者己醇衍生物偶联到葡萄糖的UDP-葡萄糖：糖苷配基葡糖转移酶的表达；并且
(b)选择转基因植物。
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