CN1444656A

CN1444656A - 在绿色植物中高水平地生产对羟基苯甲酸

Info

Publication number: CN1444656A
Application number: CN01813598.6A
Authority: CN
Inventors: K·梅耶; D·E·范迪克; P·V·维塔宁
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2000-06-02
Filing date: 2001-05-22
Publication date: 2003-09-24
Anticipated expiration: 2021-05-22
Also published as: AU2001264847B2; JP2004511224A; US7361811B2; US20020002715A1; US6683231B2; CA2411541A1; AU6484701A; WO2001094607A2; US20040143867A1; EP1287149A2; WO2001094607A3; CN100392086C

Abstract

本发明涉及用独特的表达盒在绿色植物中高水平地生产pHBA。所述表达盒包含一个与能够在高等植物中驱动蛋白表达的合适启动子有效连接的分支酸丙酮酸裂合酶(CPL)编码序列。另外，所述CPL盒包含编码叶绿体转运肽、其天然切割位点和与CPL的N末端融合的所述转运肽供体蛋白一小部分的序列。所述叶绿体靶向序列使外源蛋白靶向叶绿体区室，有助于其被摄入到该细胞器中。所述切割位点对于所述转运肽是唯一的，在该位点切割所述盒编码的嵌合蛋白释放出一种新型多肽，所述新型多肽具有全酶活性，包含成熟CPL酶和所述转运肽供体的一小部分。

Description

在绿色植物中高水平地生产对羟基苯甲酸

本申请要求于2000年6月2日申请的美国临时申请第60/209,854号的权益。

发明领域

本发明涉及植物基因表达以及分子生物学和微生物学领域。更具体地讲，提供一种依赖于独特表达盒表达、用于在绿色植物中生产对羟基苯甲酸(pHBA)的方法，所述独特表达盒包含与特定叶绿体靶向序列有效连接的编码分支酸丙酮酸裂合酶的基因。

发明背景

对羟基苯甲酸(pHBA)是一种液晶高分子(LCP)-Zenite^TM的主要单体成分(～65％(重量))。LCP具有优于常规树脂的特性，例如高强度/坚硬、低熔点粘度、优良的环境抗性、较高温度下特性的保持以及低透气性。然而，目前用于合成pHBA的合成方法(Kolbe-Schmitt反应(Kolbe和Lautemann，Ann.113：125(1869))的成本过高，合成LCP单体的便宜途径将开发将其用于汽车工业、电子工业和其它工业的许多新应用。生物学生产提供了一种生产pHBA的不太昂贵途径的潜力。

已经在微生物系统中生产了pHBA。例如，JP 06078780公开了通过在将苯甲酸氧化为pHBA的微生物(最好是曲霉属(Aspergillus))存在下培养苯甲酸来制备pHBA。另外，已经从土壤中分离出能够将对甲酚转化为pHBA的肠杆菌属(Enterobacter)菌株(JP 05328981)。此外JP05336980和JP 05336979公开了能够从对甲酚生产pHBA的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的分离株。同样，共同拥有的WO 9856920公开了采用不能表达对羟基苯甲酸羟化酶(pHBH)的门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)突变体从甲苯生产pHBA的方法。最后，U.S.6030819公开了在表达分支酸丙酮酸裂合酶(CPL)基因的基因工程大肠杆菌(E.coli)中生产pHBA。

尽管取得了这些成功，但在微生物平台上生产商业上有用量的pHBA的能力却由于应用毒性原料和有限的生物量而受到阻碍。需要解决这些问题的用于pHBA生产的方法。

巧合的是，pHBA天然存在于几乎所有植物、动物和微生物中，尽管是微量的。在许多细菌中，pHBA的产生通过分支酸途径产生，分支酸是包括苯丙氨酸、酪氨酸、对氨基苯甲酸和泛醌在内的许多芳族化合物合成的重要分支点中间体。在大肠杆菌中，分支酸本身经历5个不同的酶促反应，产生5种不同的产物，最终负责pHBA合成的酶是分支酸丙酮酸裂合酶，称为CPL。后者是大肠杆菌ubiC基因的产物，该基因由两个不同的研究小组独立地克隆(Siebert等，FEBS Lett307：347-350(1992)；Nichlols等，J.Bacteriol 174：5309-5316(1992))。该酶是一种19kDa单体蛋白，不需要已知的辅因子或能量。CPL通过消除其唯一底物的C₃烯醇丙酮酰基侧链，催化1mol分支酸直接转化为1mol丙酮酸和1mol pHBA。已经在大肠杆菌中过量表达了重组CPL，将其纯化至均质，并且在生物化学和动力学上得到部分表征(Siebert等，Microbiology 104：897-904；Nichlols等，J.Bacteriol 174：5309-5316(1992))。另外，也提出了关于CPL酶促反应的详细机制(Walsh等，ChemRev.90：1105-1129)。

在植物中，已经在胡萝卜组织中(Schnitzler等，Planta，188，594，(1992))、在许多牧草和作物中(Lydon等，J.Agric.Food.Chem.，36，813，(1988))、在杨树的木质素中(Terashima等，Phytochemistry，14，1991，(1972)；和在许多其它植物组织中(Billek等，Oesterr.Chem.，67，401，(1966))发现了pHBA。植物具有合成pHBA的全部必需酶机器的事实提示，它们可能是用于生产这种单体的有用平台。例如，作为可再生的资源，植物平台需要的能耗和材料消耗可能比石化方法或微生物方法低得多。同样，植物平台代表了一种比微生物系统大得多的可得到的单体生产生物量。最后，在植物中天然存在pHBA提示，由于过量生产该化合物的宿主毒性可能不成问题。然而，尽管用植物作为生产pHBA的工具有明显的益处，但所述单体的高水平生产仍不明朗。

需要克服的一个困难在于植物组织中分支酸的代谢命运。事实上，从分支酸产生pHBA在高等植物中要比微生物复杂得多，因为前者缺乏与CPL功能等同的酶。例如，在紫草(Lithospermun erythrorhizon)中产生pHBA的生物合成途径据认为是由多达10个连续反应组成(Loscher和Heide，Plant Physiol.106：271-279(1992))，推定全都由不同的酶催化。此外，催化这些反应的大多数酶尚未鉴定出，也没有克隆出其基因。甚至可得到的关于pHBA在其它植物种中如何合成的信息甚少。对于更为复杂的问题，已知参与植物pHBA产生的那些酶跨越两个不同的途径，它们受到差别调节并且位于不同细胞区室中。因此，分支酸是主要限于叶绿体和其它类型质体的莽草酸途径的中间体(Siebert等，Plant Physiol.112：811-819(1996))；Sommer等，Plant CellPhysiol.39(11)：1240-1244(1998))，而苯丙氨酸下游的所有中间体属于在胞质和内质网中发生的类苯丙酸(phenylpropanoid)途径。

尽管对于植物正常情况下如何合成pHBA和参与该过程的酶缺乏了解，但比野生型植物积累显著更高水平的pHBA的转基因植物已有描述。例如，Kazufumi Yazaki，(Baiosaiensu to Indasutori(1998)，56(9)，621-622)论述了将CPL编码基因导入烟草中，以生产其量足以赋予抗虫性的pHBA。同样，Siebert等，(Plant Physiol.112：811-819(1996))已经证明，用组成型表达叶绿体靶向形式的大肠杆菌CPL(称为“TP-UbiC)转化的烟草植株(Nicotiana tabacum)的pHBA水平升高，比野生型植株高至少3个数量级(WO 96/00788，以DE 4423022授权)。有趣的是，遗传修饰的烟草植株仅含微量的游离pHBA。而实际上所有的所述化合物(～98％)被转化为两种葡萄糖缀合物-一种酚型葡糖苷和一种酯型葡糖苷，其存在比率约为3∶1(Siebert等，Plant Physiol.112：811-819(1996)；Li等，Plant Cell Physiol.38(7)：844-850(1997))。这两种葡萄糖缀合物是1-β-D-葡糖苷，具有一个与pHBA的羟基或羧基共价连接的单个葡萄糖残基。当分析叶组织时，在该项研究中鉴定的最佳转基因植物的总pHBA葡糖苷含量约为0.52％(干重)。根据相关葡萄糖残基校正，在转基因烟草植物中产生的实际pHBA量仅约为该数值的一半。

在最近的研究中，用组成型启动子(Sommer等，Plant Cell Physiol.39(11)：1240-1244(1998))和诱导型启动子(Sommer等，Plant Cell Reports17：891-896(1998))在转化烟草细胞培养物中表达了同一人工融合蛋白。尽管pHBA葡糖苷的积累比用全株的原始研究略高，在两种情况下该水平都不超过0.7％(干重)。相反，当在紫草的发根培养物中检查TP-UbiC时(Sommer等，Plant Molecular Biology 39：683-693(1999))，在根据未转化对照培养物的内源水平进行校正后，pHBA葡糖苷的含量达到高至0.8％(干重)的水平。

尽管这些研究证明了应用基因工程提高高等植物中pHBA水平的可行性，但上述TP-UbiC人工融合蛋白不能产生商业上有用量的所述化合物。这种努力将需要将农学上合适的植物的pHBA含量提高至先前报道的10-20倍的水平。因此，需要对目前的系统作出一种或多种修饰，以达到这些水平。由于CPL的底物分支酸在质体中合成，因此一个可供改进的潜在方面可能在于设计更好的叶绿体靶向序列，以达到在感兴趣的细胞区室中更高水平的酶活性。实际上，在上述几项研究中，在CPL酶活性和pHBA葡糖苷积累之间显然有正相关(Siebert等，Plant Physiol.112：811-819(1996)；Sommer等，Plant Cell Physiol.39(11)：1240-1244(1998)；Sommer等，Plant Cell Reports 17：891-896(1998))。此外，在这些研究中，没有任何证据指示应用TP-UbiC人工融合蛋白，将使所述系统的CPL酶活性饱和。

众所周知，大多数天然存在的叶绿体蛋白是核编码的，作为较大分子量的前体合成，具有一个称为转运肽的可切割的N末端多肽延伸。人们也普遍认为，转运肽含有转运到叶绿体所必需的所有信息。尽管蛋白输入的机制细节仍有待阐明，但已经出现几个重要的事实：(a)前体摄入在翻译后发生(Chua和Schmidt，Proc Natl.Acad.Sci.75：6110-6114(1978)；Highfield和Ellis，Nature 271：420-424(1978))，并且由叶绿体被膜中存在的蛋白性受体介导(Cline等，J.Biol.Chem.260：369132696(1985))；(b)ATP水解是转运的唯一驱动力(Grossman等，Nature 285：625-628(1980)；Cline等，J.Biol.Chem.260：3691-3696(1985))；(c)转运肽与外源蛋白的融合有时(但不总是)在体内(Van denBroeck等，Nature 313：358-362(1985))；Schreier等，EMBO J.4：25-32(1985))和体外(Wasmann等，Mol.Gen.Genet.205：446-453(1986))都足以触发被摄入到叶绿体中；最后，(d)在叶绿体输入后，转运肽被蛋白水解而从前体蛋白除去，从而产生“成熟”多肽。尽管现在已知数千种转运肽的完整序列，操作这些序列以达到外源蛋白的最佳靶向并且在植物叶绿体区室中表达，仍是反复试验的主题。然而，已经很好确立了，简单地将转运肽与外源蛋白连接不一定保证被叶绿体有效摄入或正确加工。甚至当将同一靶向序列与不同蛋白融合时，结果完全是不可预测的(Lubben等，The Plant Cell 1：1223-1230(1989))，不同过客蛋白的转运效率不同。其原因尚不清楚，然而已有提示，叶绿体摄入和的转运肽的去除以某种方式偶联，并且某些人工融合蛋白或者不被加工，或者加工效率低。例如，已经表明，在Rubisco小亚基前体的天然切割位点附近甚至非常精细的改变也可以导致加工异常(Robinson和Ellis，Eur.J.Biochem.142：342-346(1984)；Robinson和Ellis，Eur.J.Biochem.152：67-73(1985))和叶绿体摄入减少(Wasmann等，J.Biol.Chem.263：617-619(1988))。

通过在叶绿体靶向序列中不仅包括所述转运肽和易裂的键，而且还包括所述转运肽供体成熟N末端的一小部分，可以在该方面达到某种程度的改进。实际上，这种方法对于另一种细菌蛋白即新霉素磷酸转移酶II(NPT-II)在体内和体外都已经起作用(Van den Broeck等，Nature 313：358-362(1985)；Schreier等，EMBO J.4：25-32(1985)；Wasmann等，Mol.Gen.Genet.205：446-453(1986)；Herrera-Estrella等，EP 0189707；U.S.5,728,925；U.S.5,717,084)。因此，由Rubisco小亚基前体的转运肽加上与NPT-II N末端融合的成熟Rubisco的前22个残基组成的嵌合蛋白被叶绿体的摄入比仅含所述转运肽和易裂键的相似构建体好得多。然而，这种策略并不十分简单，并且仍与同过客蛋白的连接不可解脱的高度不可预测性相关。这在尝试将CPL靶向叶绿体的文献中最容易见到。例如，Sommer等，Plant Cell Physiol.39(11)：1240-1244(1998)描述了一种类似的人工融合蛋白，所述融合蛋白包含在其N末端与转运肽和Rubisco小亚基的前21个氨基酸残基融合的CPL基因产物(例如“TP21UbiC”)。虽然预期这种修饰将改进叶绿体的摄入和加工，但含有原始构建体TP-UbiC的细胞的CPL酶活性和pHBA葡糖苷的水平都高得多。因此，Wasmann等公开内容(Mol.Gen Genet.205：446-453(1986))的应用对一种不同的蛋白具有有害效应。

因此，有待解决的问题是提供一种利用细菌蛋白CPL催化的化学反应在植物中以商业有用水平生产pHBA的方法。这是一个特别不凡的目标，因为在上述所有复杂情况之上，从所述文献中显然可以看出大肠杆菌CPL的某些N末端修饰可能导致酶活性的相当大的损失(Siebert等，Plant Physiol.112：811-819(1996))。因此，不仅必需鉴定被有效输入到叶绿体中的人工融合蛋白，而且所述融合蛋白也被蛋白酶加工产生未经修饰的CPL或者具有不干扰酶活性的N末端延伸的CPL变异体。现有技术未指出这一问题的解决方法。申请人通过构建一种使得能够在叶绿体中足够高水平地表达CPL酶活性以积累商业有用水平的pHBA的新型人工融合蛋白，解决了所述的问题。

发明概述

本发明提供一种在绿色植物中生产pHBA的方法，所述方法包括：

a)提供一种绿色植物，所述绿色植物具有内源分支酸源并且含有具有以下结构的分支酸丙酮酸裂合酶表达盒：

P-T-C-D-CPL

其中：

P为适合于驱动分支酸丙酮酸裂合酶基因表达的启动子；

T为编码核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)叶绿体转运肽的核酸分子；

C为编码Rubisco叶绿体转运肽切割位点的核酸分子；

D为编码Rubisco叶绿体转运肽供体多肽N末端部分的约4-20个连续氨基酸的核酸分子；和

CPL为编码成熟分支酸丙酮酸裂合酶蛋白的核酸分子；其中P、T、C、D和CPL中的每个有效连接，使得所述盒的表达导致一种嵌合蛋白的翻译，所述嵌合蛋白包含与成熟分支酸丙酮酸裂合酶蛋白N末端融合的叶绿体靶向序列；

b)培育所述植物，其培育条件使得所述嵌合蛋白可被表达并且被转运至叶绿体，以供将分支酸转化为对羟基苯甲酸葡糖苷和对羟基苯甲酸衍生物；

c)从所述植物中回收对羟基苯甲酸和对羟基苯甲酸衍生物；和

d)将所述对羟基苯甲酸葡糖苷和对羟基苯甲酸衍生物加工为游离对羟基苯甲酸。

具体地说，本发明方法在植物中产生浓度高于2％所述植物生物量干重、优选浓度高于10％的对羟基苯甲酸葡糖苷。

另外，本发明提供一种分支酸丙酮酸裂合酶表达盒，所述表达盒包含一种嵌合基因，所述嵌合基因所具有的核酸分子编码核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基衍生的叶绿体靶向序列，所述叶绿体靶向序列具有SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列，所述叶绿体靶向序列有效连接于编码具有SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的分支酸丙酮酸裂合酶的核酸分子。

附图、序列描述的简述

图1显示了两种不同叶绿体靶向形式的CPL的一级氨基酸序列比对。这两种形式都是人工融合蛋白。第3行中的形式对应于先前研究中所用的TP-UbiC(Siebert等，Plant Physiol.112：811-819(1996)Sommer等，Plant Cell Physiol.39(11)：1240-1244(1998)；Sommer等，Plant Cell Reports 17：891-896(1998)；Sommer等，Plant MolecularBiology 39：683-693(1999))，而第2行中的形式对应于在本项研究中开发的TP-CPL。大肠杆菌(E.coli)CPL(第4行)和rbcS2的番茄Rubisco小亚基前体(第1行)也包括在该比对中。对应于“成熟”Rubisco小亚基的氨基酸残基以粗体显示。Rubisco小亚基前体的N末端叶绿体转运肽以纯文本形式显示。大肠杆菌CPL的一级氨基酸序列以斜体显示。箭头指示高度保守的Cys-Met接点(Mazur等，Nuc Acids Res.13：2373-2386(1985)；Berry-Lowe等，J.Mol.and Appl.Gen.1，483-498(1982))，其中转运肽切割正常发生，产生成熟Rubisco小亚基。

图2显示了中间质粒“TP-CPL-pML63”和相关限制位点的示意图(环形图)。

图3显示了二元载体植物表达构建体“TP-CPL-pZBL1”的示意图(环形图)，该表达构建体在导入农杆菌后用于转化烟草和拟南芥。

图4显示了与野生型植株相比，从表达TP-CPL转基因烟草植株(转化体#5)制备的叶片组织提取物的代表性HPLC谱图。

图5显示了15株表达TP-CPL的不同转基因烟草植株的总pHBA-葡糖苷含量。对将原代转化体转移到土壤后5周获得的新鲜叶片材料进行该分析。

图6显示了在表达TP-CPL的转基因烟草植株中总pHBA葡糖苷的年龄依赖性积累。对从各个发育阶段的原代转化体获得的叶片组织进行该分析。总pHBA葡糖苷以干重百分比表示。

图7显示了野生型烟草植株(第9泳道)和表达TP-CPL的转基因烟草植株(第1-7泳道)的蛋白质印迹。对从5周龄原代转化体获得的叶片组织进行该分析。第8泳道含有20ng纯化重组ΔTP-CPL(例如TP-CPL的预测叶绿体切割产物)。在SDS-PAGE后，将蛋白质转移至硝化纤维素上，用抗CPL抗血清的1∶200稀释液探测。

根据以下详细的描述和构成本申请一部分的所附序列的描述，可以更加全面地理解本发明。

申请人提供了16个序列，这些序列符合37C.F.R.1.821-1.825(“Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequencesand/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”)，并且符合World Intellectual Property Organization(WIPO)Standard ST.25(1998)和EPO和PCT的序列表要求(Rules 5.2和49.5(a-bis)，以及Section 208和Annex C of the Administrative Instructions)。用于核苷酸序列和氨基酸序列数据的符号和格式符合37C.F.R.§1.822的规则。

SEQ ID NO：1为可用于将Genbank登记号为M96268的大肠杆菌CPL导入大肠杆菌表达载体pET-24a(+)(Novagen)中的5’引物。

SEQ ID NO：2为可用于将Genbank登记号为M96268的大肠杆菌CPL导入大肠杆菌表达载体pET-24a(+)(Novagen)中的3’引物。

SEQ ID NO：3为大肠杆菌表达载体pET-24a(+)(Novagen)中Genbank登记号为M96268的大肠杆菌CPL的ORF的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4为大肠杆菌表达载体pET-24a(+)(Novagen)中Genbank登记号为M96268的大肠杆菌CPL的ORF的一级氨基酸序列。

SEQ ID NO：5为可用于扩增番茄Rubisco小亚基前体的叶绿体靶向序列以供在大肠杆菌中表达TP-CPL的5’引物。

SEQ ID NO：6为可用于扩增番茄Rubisco小亚基前体的叶绿体靶向序列以供在大肠杆菌中表达TP-CPL的3’引物。

SEQ ID NO：7为大肠杆菌表达载体pET-24a(+)(Novagen)中所述叶绿体靶向CPL融合蛋白(TP-CPL)的ORF的核苷酸序列。

SEQ ID NO：8为大肠杆菌表达载体pET-24a(+)(Novagen)中所述叶绿体靶向CPL融合蛋白(TP-CPL)的ORF的一级氨基酸序列。

SEQ ID NO：9为可用于扩增TP-CPL的预测叶绿体切割产物(ΔTP-CPL)并且将其插入大肠杆菌表达载体pET-24d(+)(Novagen)中的5’引物。

SEQ ID NO：10为可用于扩增TP-CPL的预测叶绿体切割产物(ΔTP-CPL)并且将其插入大肠杆菌表达载体pET-24d(+)(Novagen)中的3’引物。

SEQ ID NO：11为可用于扩增并修饰TP-CPL而不改变其一级氨基酸序列以供插入体外转录/翻译载体pCITE4a(+)(Novagen)中的5’引物。

SEQ ID NO：12为可用于扩增并修饰TP-CPL而不改变其一级氨基酸序列以供插入体外转录/翻译载体pCITEAa(+)(Novagen)中的3’引物。

SEQ ID NO：13为可用于用质粒pMH40作为模板扩增3’NOS终止序列的截短形式的5’引物。

SEQ ID NO：14为可用于用质粒pMH40作为模板扩增3’NOS终止序列的截短形式的3’引物。

SEQ ID NO：15为来源于番茄核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基的叶绿体靶向序列。

SEQ ID NO：16为经加工的叶绿体靶向CPL融合蛋白(TP-CPL)。

发明详述

本发明提供以商业上有用的水平在绿色植物中高水平地生产对羟基苯甲酸(pHBA)的方法。pHBA可用作应用于汽车工业、电子工业和其它工业的液晶高分子中的单体。

所述方法依赖于编码修饰形式的酶分支酸丙酮酸裂合酶(CPL)的基因的有效表达，所述酶催化1mol分支酸直接转化为1mol丙酮酸和1mol pHBA。将所述CPL变异体以表达盒形式导入绿色植物中，所述表达盒包含与能够在植物中驱动蛋白质表达的合适启动子有效连接的所述CPL编码序列。另外，所述表达盒含有一个DNA片段，该片段正好位于CPL编码序列上游并与其相邻，编码叶绿体转运肽、其天然切割位点和所述转运肽供体多肽的一小部分。所述转运肽的作用是将所述表达盒所编码的嵌合蛋白靶向叶绿体，并且使其能够被摄取到负责分支酸合成的该细胞器中，分支酸为CPL的底物，被转化为pHBA。所述切割位点是该原始转运肽供体所特有的，由该盒编码的人工蛋白在该位点的切割，释放出在其N末端包含所述转运肽供体的一小部分的成熟CPL酶的新型多肽。

在本说明书中，使用大量的术语和缩写。提供以下定义。

“聚合酶链式反应”缩写为PCR。

“分支酸丙酮酸裂合酶”缩写为CPL，是指编码催化分支酸转化为丙酮酸和pHBA的酶的基因。

“对羟基苯甲酸(Para-hydroxybenzoic acid)”或“对羟基苯甲酸(P-hydroxybenzoic acid)”缩写为pHBA。

术语“对羟基苯甲酸葡糖苷”或“pHBA葡糖苷”是指包含pHBA和葡萄糖分子的缀合物。

术语“pHBA衍生物”是指由于所述CPL酶的催化活性可以在植物中形成的pHBA的任何缀合物。

术语“转运肽”或“叶绿体转运肽”将缩写为“TP”，是指将叶绿体前体蛋白导向叶绿体中并且随后被叶绿体加工蛋白酶切除的叶绿体前体蛋白的N末端部分。

术语“叶绿体靶向序列”是指连接于外源蛋白质N末端以便被转运到叶绿体中的任何多肽延伸。就天然存在的叶绿体前体蛋白而论，转运肽被认为是叶绿体靶向序列，尽管最佳摄取和蛋白酶加工可能部分依赖于“成熟”叶绿体蛋白的部分。

术语“转运肽供体序列”是指来源于所述叶绿体前体蛋白“成熟”部分的叶绿体靶向序列的部分。转运肽供体序列总是位于转运肽切割位点的下游并且紧邻将转运肽与成熟叶绿体蛋白分开的转运肽切割位点。

术语“叶绿体加工蛋白酶”是指能够切割转运肽和成熟叶绿体蛋白之间易裂键的蛋白酶。

术语“转运肽切割位点”是指叶绿体靶向序列中叶绿体加工蛋白酶所作用的两个氨基酸之间的位点。

正如本文所用的，“分离的核酸片段”是单链或双链的RNA或DNA的聚合物，任选地含有合成、非天然或经改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离核酸片段可以由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段组成。

“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括所述编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调节序列。“天然基因”是指在自然界中发现的具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”是指为非天然基因、包含在自然界中不是一起存在的调节序列和编码序列的任何基因。因此，嵌合基因可以包含来源于不同来源的调节序列和编码序列、或来源于同一来源但以不同于自然界中所发现的方式排布的的调节序列和编码序列。“内源基因”是指在生物的基因组中处于其自然位置的天然基因。“外源”基因是指在宿主生物中不是正常存在的、而是通过基因转移被导入该宿主生物的基因。外源基因可以包含插入到非天然生物中的天然基因、或嵌合基因。“转基因”是通过转化法已经被导入到基因组中的基因。

“合成基因”可以从寡核苷酸构件装配，所述构件可以用本领域技术人员已知的方法化学合成。将这些构建连接并退火形成基因区段，然后将其酶促装配以构建完整的基因。涉及DNA序列的“化学合成”意指将在体外装配所述组分核苷酸。DNA的人工化学合成可以用很好建立的方法来完成，或者可以用大量市售机器中的一种进行自动化化学合成。因此，可以基于核苷酸序列的优化以反映宿主细胞密码子偏好来定制所述基因，以供进行最佳基因表达。技术人员会认识到，如果使密码子选择偏向于宿主所偏好的密码子，则有可能达到成功的基因表达。优选密码子的确定可以基于可获得序列信息、得自宿主细胞的基因的调查。

“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调节序列”是指位于编码序列上游(5’非编码序列)、其中或下游(3’非编码序列)并且影响所连接的编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应物结合部位和茎-环结构。

“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的核苷酸序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3’。启动子序列由近端和更远端上游元件组成，后一元件通常被称为增强子。因此，“增强子”是可以刺激启动子活性的核苷酸序列，可能是所述启动子的固有元件或是为增加启动子的水平或组织特异性而插入的异源元件。启动子可以全部得自天然基因，或者由来源于自然界中存在的不同启动子的不同元件组成，或者甚至可以包含合成核苷酸区段。本领域技术人员知道，不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中表达，或者在不同发育阶段或者对不同环境条件作出反应而表达。使核酸片段在大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。时常发现可用于植物细胞的各种类型的新启动子，大量的例子可以在Okamuro和Goldberg编辑物(1989)Biochemistry of Plants15：1-82中找到。人们可进一步认识到，由于在大多数情况下，调节序列的实际边界尚未完全确定，所以不同长度的核酸片段可能具有同样的启动子活性。

“3’非编码序列”是指位于编码序列下游的DNA序列，包括聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。聚腺苷酸化信号通常根据影响在mRNA前体的3’末端添加聚腺苷酸序列段来鉴定。

术语“有效连接”是指单一核酸片段上致使一个序列的功能受另一序列影响的核酸序列的连接。例如，当启动子能够影响编码序列表达时，启动子与编码序列有效连接(即所述编码序列处于所述启动子的转录控制之下)。可以将编码序列以有义方向或反义方向与调节序列有效连接。

术语“表达”如本文所用的，是指来源于本发明核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达也可以是指mRNA翻译为多肽。

“成熟”蛋白是指翻译后加工的多肽；即已经从中除去了存在于初级翻译产物的任何前肽或原肽的多肽。“前体”蛋白是指mRNA的初级翻译产物，即仍存在前肽和原肽。前肽和原肽可以但不限于胞内定位信号。

“转化”是指将核酸片段转移到宿主生物的基因组中，导致遗传稳定的遗传。含有所述转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”生物或“重组”生物或“转化”生物。

术语“质粒”、“载体”和“盒”是指染色体外元件，它常常携带不是所述细胞中心代谢的部分，通常为环状双链DNA分子的形式。这类元件可以是得自任何来源的自主复制型序列、基因组整合型序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环状的单链或双链DNA或RNA，其中许多核苷酸序列已经连接或重组为单一构建体，能够将启动子片段和所选基因产物的DNA序列以及合适的3’非翻译序列导入细胞中。“转化盒”是指含有外源基因并且具有除所述外源基因以外的有利于转化特定宿主细胞的特定载体。“表达盒”是指含有外源基因并且具有除所述外源基因以外的允许外源宿主中该基因表达增强的元件的特定载体。

此处所用的标准重组DNA技术和分子克隆技术是本领域众所周知的，并且描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)(在下文称为“Maniatis”)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1984)；和Ausubel，F.M.等， Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版(1987)。CPL表达盒

本发明提供一种表达盒，所述表达盒可用于表达具有完全活性的修饰形式的分支酸丙酮酸裂合酶(CPL)并且将该多肽靶向宿主植物的叶绿体。通常，所述表达盒将包含(1)处于5’和3’调节序列转录控制下的克隆化CPL基因和(2)一个显性选择标记。本发明的表达盒也可以含有一个启动子调节区(例如赋予诱导型或组成型、环境或发育调节型、或者细胞或组织特异性/选择性表达的启动子调节区)、一个转录起始位点、一个核糖体结合位点、一个RNA加工信号、一个转录终止位点和/或一个聚腺苷酸化信号。在一个优选实施方案中，本发明的盒将另外含有编码转运肽的序列以及编码所述转运肽供体一部分的序列，所述转运肽供体的一部分含有一个适合于被宿主植物细胞叶绿体加工蛋白酶加工的转运肽切割位点。本发明的盒任选地也可以包含一个或多个内含子，以有利于CPL表达。

所述CPL基因编码将1mol分支酸转化为1mol丙酮酸和1molpHBA的酶。最充分表征的CPL基因已经从大肠杆菌中分离出来，其GenBank登记号为M96268。

可用于驱动本发明CPL基因的启动子很多，并且是本领域众所周知的。合适的启动子将是在植物中起作用的那些启动子，一般来源于带有所述CPL表达盒的植物宿主。能够诱导所述CPL基因表达的任何启动子和任何终止子的任何组合都可以用于本发明的盒中。启动子和终止子的一些合适的例子包括得自胭脂碱合酶(nos)、章鱼碱合酶(ocs)和花椰菜花叶病毒(CaMV)基因的启动子和终止子。可以使用的一种类型的有效植物启动子是一种高水平植物启动子。与本发明的遗传序列有效连接的这类启动子，应该能够启动本发明基因产物的表达。可以在本发明中使用的高水平植物启动子包括例如得自大豆的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基(ss)的启动子(Berry-Lowe等，J.Molecular and App.Gen.，1：483-498 1982))、和叶绿素a/b结合蛋白的启动子。已知这两种启动子在植物细胞中是光诱导型的(参见例如 Genetic Engineering of Plants，and Agricultural Perspective，A.Cashmore，Plenum，New York(1983)，第29-38页；Coruzzi，G.等，The Journal of Biological Chemistry，258：1399(1983)，和Dunsmuir，P.等，Journal of Molecular and AppliedGenetics，2：285(1983))。

在本发明中，当需要多肽表达时，一般理想的是在CPL编码区的3’末端包括一个聚腺苷酸化区。所述聚腺苷酸化区可以来源于多种植物基因或来源于T-DNA。待加入的3’末端序列可以来源于例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或者来源于另一植物基因，或不太优选来源于任何其它真核基因。

可以将内含子序列加至所述部分编码序列的5’非翻译区或编码序列，以增加在细胞溶胶中积累的成熟信息的量。在植物和动物表达构建体的转录单位中包括可剪接内含子，已经表明在mRNA水平和蛋白质水平上都增加基因表达，至多增加1000倍。Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.8：4395-4405(1988)；Callis等，Genes Dev.1：1183-1200(1987)。基因表达的这类内含子增强在置于转录单位5’末端附近时通常最大。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6以及Bronze-1内含子的应用是本领域已知的。一般参见The Maize Handbook，Chapter 116，Freeling和Walbot编著，Springer，New York(1994)。

在一个优选实施方案中，将所述CPL蛋白导向叶绿体和其它质体会是有用的。通常，通过引入使已表达蛋白靶向质体并且也有助于其转运到该细胞器中的叶绿体转运肽，可实现这一点。许多叶绿体转运肽是已知的，并且可以用于本发明的表达盒中，包括但不限于来源于以下的叶绿体转运肽：豌豆属(Pisum)(Esutorera等，JP 1986224990；E00977)、胡萝卜(Luo等，Plant Mol.Biol.，33(4)，709-722(1997；Z33383)、烟草属(Nicotiana)(Bowler等，EP 0359617；A09029)、稻属(Oryza)(de Pater等，Plant Mol.Biol.，15(3)，399-406(1990)；X51911)、以及诸如在Herrera-Estrella等，EP 0189707；U.S.5,728,925；U.S.5,717,084(A10396和A10398)中提供的合成序列。在本发明中，优选从任何植物中分离的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)小亚基前体蛋白的叶绿体转运肽。得自各种各样植物的Rubisco小亚基已被很好地表征，得自其中任一种的转运肽将适合于供本发明中使用。参见例如立碗藓属(Physcomitrella)(Quatrano等，AW599738)；百脉根属(Lotus)(Poulsen等，AW428760)；西瓜属(Citrullus)(J.S.Shin，AI563240)；烟草属(Appleby等，Heredity(1997)，79(6)，557-563)；苜蓿(Khoudi等，Gene(1997)，197(1/2)，343-351)；马铃薯和番茄(Fritz等，Gene(1993)，137(2)，271-4)；小麦(Galili等，Theor.Appl.Genet.(1991)，81(1)，98-104)；和水稻(Xie等，Sci.Sin.，Ser.B(Engl.Ed.)(1987)，30(7)，706-19)。例如，转运肽可以来源于从植物中分离的Rubisco小亚基，所述植物包括但不限于大豆、油菜、向日葵、棉花、玉米、烟草、苜蓿、小麦、大麦、燕麦、高粱、水稻、拟南芥属(Arabidopsis)、甜菜、甘蔗、canola、小米、菜豆、豌豆、黑麦、亚麻和禾本科牧草。优选用于本发明的是番茄Rubisco小亚基前体蛋白。

叶绿体靶向序列不仅将所需蛋白靶向叶绿体，而且也有助于将其转运到所述细胞器中。这伴随着由所述叶绿体天然的叶绿体加工蛋白酶在合适的转运肽切割位点上从成熟多肽或蛋白切除所述转运肽。因此，本发明的叶绿体靶向序列包含一个合适的切割位点，以供正确加工前蛋白为叶绿体中含有的活性成熟多肽。在本发明中优选番茄Rubisco小亚基前体蛋白的叶绿体靶向序列，该序列在天然存在的Cys和Met残基之间具有一个切割位点，将转运肽与成熟多肽隔开。

用功能性CPL表达盒转化合适的植物宿主，以便在叶绿体中表达CPL并产生pHBA葡糖苷。实际上，能够支持所述CPL基因表达的任何植物宿主都将是合适的，然而优选各种作物，因为它们易于收获并且生物量大。合适的植物宿主将包括但不限于单子叶植物和双子叶植物，例如大豆、油菜(欧洲油菜(Brassica napus)、芸苔(B.campestris))、向日葵(Helianthus annus)、棉花(Gossypium hirsutum)、玉米、烟草(Nicotiana tabacum)、苜蓿(Medicago sativa)、小麦(Triticum sp)、大麦(Hordeum vulgare)、燕麦(Avena sativa，L)、高粱(Sorghum bicolor)、水稻(Oryza sativa)、拟南芥属、甜菜、甘蔗、canola、小米、菜豆、豌豆、黑麦、亚麻和禾本科牧草。

将构建体导入植物细胞宿主中的各种各样的技术是可用的，并且是本领域技术人员已知的。这些技术包括用DNA例如根癌农杆菌(A.tumefaciens)或发根农杆菌(A.rhizogenes)作为转化因子转化、电穿孔、粒子加速等。[参见例如EP 295959和EP 138341]。一种合适的方法涉及应用农杆菌(Agrobacterium spp)的Ti质粒和Ri质粒的二元型载体。Ti衍生载体转化各种各样的高等植物，包括单子叶植物和双子叶植物，例如大豆、棉花、油菜、烟草和水稻[Pacciotti等(1985)Bio/Technology3：241；Byrne等，(1987)Plant Cell，Tissue and Organ Culture 8：3；Sukhapinda等，(1987)Plant Mol.Biol.8：209-216；Lorz等，(1985)Mol.Gen Genet.199：178；Portrykus(1985)Mol.Gen.Genet.199：183；Park等，J.Plant Biol.(1995)，38(4)，365-71；Hiei等，Plant J.(1994)，6：271-282]。用T-DNA转化植物细胞已经接受了广泛的研究，并且有大量的描述[EP 120516；Hoekema，载于 The Binary Plant Vector System，Offset-drukkerij Kanters B.V.；Alblasserdam(1985)，Chapter V，Knauf等，Genetic Analysis of Host Range Expression by Agrobacterium载于Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction，Puhler，A.编著，Springer-Verlag，New York，1983，p.245；和An等，EMBO J.(1985)4：277-284]。为了导入植物中，可以如实施例中所述，将本发明的嵌合基因插入到二元载体中。

其它转化法是本领域技术人员可利用的，例如直接摄取外源DNA构建体[参见EP 295959]、电穿孔技术[参见Fromm等(1986)Nature(London)319：791]或用包被所述核酸构建体的金属微粒高速弹道轰击[参见Kline等(1987)Nature(London)327：70，和参见美国专利第4,945,050号]。一旦转化后，本领域技术人员可以让细胞再生。尤其适用的是最近介绍的将外源基因转化到商业上重要的作物中的方法，所述作物例如油菜[参见De Block等，(1989)Plant Physiol.91：694-701]、向日葵[Everett等，(1987)Bio/Technology 5：1201]、大豆[McCabe等，(1988)Bio/Technology 6：923；Hinchee等，(1988)Bio/Technology 6：915；Chee等，(1989)Plant Physiol.91：1212-1218；Christou等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA 86：7500-7504；EP 301749]、水稻[Hiei等，Plant J.(1994)，6：271-282]和玉米[Gordon-Kamm等，(1990)Plant Cell 2：603-618；Fromm等，(1990)Biotechnology 8：833-839]。

然后将转基因植物细胞置于合适的选择培养基中，以选择转基因细胞，然后让其生长为愈伤组织。从愈伤组织生长出芽，通过在发根培养基中生长，从所述芽产生小植株。各种构建体通常与一种标记连接，以供在植物细胞中进行选择。方便的是，所述标记可以是杀生物剂(特别是抗生素，例如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素、氯霉素、除草剂等)抗性。所用的特定标记将允许与缺乏被导入的DNA的细胞相比选择出转化细胞。包括本发明转录盒的DNA构建体的组分可以从对宿主为天然(内源)或外来(外源)的序列中制备。所谓“外源”意指在所述构建体所导入的野生型宿主中不存在的序列。异源构建体将含有至少一个对于所述转录起始区所来源的基因为非天然的区域。为了确证转基因细胞和植株中存在所述转基因，可以用本领域技术人员已知的方法进行DNA印迹分析。CPL转运到叶绿体中并且随后加工

本发明依赖于对叶绿体靶向序列的新操作，以实现将所述CPL基因产物转运到具有足够酶活性的叶绿体中，以产生商业上有用量的pHBA。申请人已经发现，本发明的一个重要方面是不仅包括转运肽，而且包括一个天然存在的叶绿体切割位点和所述转运肽供体的成熟N末端的一小部分。合理的是改进叶绿体摄取并加工所述外源蛋白，以获得分支酸转化为pHBA的更高的转化率。然而，在被摄入到所述细胞器中之后，转运肽被叶绿体加工酶蛋白酶解除去，产生在其N末端连接有一个小的多肽延伸的CPL变异体。出乎意料的是，这些额外的氨基酸残基并不干扰CPL酶活性，表达本发明嵌合蛋白的转化植株积累显著高于先前报道的量的pHBA衍生物。关于pHBA的生产，在本领域中尚未认识到该类型专一性的需要。

已报道的尝试在活植株的叶绿体中表达CPL的唯一例子叙述于Siebert等，Plant Physial.112：811-819(1996)。然而，在本发明嵌合蛋白(例如TP-CPL)和Siebert等(参见上文)中叙述的叶绿体靶向形式的大肠杆菌CPL(例如TP-UbiC)之间有许多重要的差异。例如，本发明的嵌合物包括一个叶绿体靶向序列，该序列具有一个很好确定的切割位点，以供有效去除所述转运肽。另外，在这一特定位点除去转运肽，导致在成熟CPL多肽N末端区添加5个额外的氨基酸。相反，在Siebert等(参见上文)中叙述的TP-UbiC缺乏很好确定的切割位点，另外含有一段在大肠杆菌CPL的推定的转运肽切割位点和起始子甲硫氨酸残基之间插入的9个氨基酸的序列段。这些差异在图1中进一步阐述。

图1显示了具有其转运肽的完整番茄Rubisco小亚基前体(第1行)、TP-CPL(第2行)、TP-UbiC(第3行)和大肠杆菌CPL(第1行)的氨基酸序列比对。本发明的嵌合蛋白(第2行)由与大肠杆菌CPL的起始子Met残基融合的番茄Rubisco小亚基前体(绿色残基)的叶绿体转运肽加上“成熟”Rubisco的前4个氨基酸残基组成。因此，TP-CPL不仅含有完整的转运肽，而且还含有高度保守的正常发生转运肽去除(例如在箭头所示的Cys和Met残基之间)的切割位点。假定在叶绿体中，TP-CPL也在该位置切割，则所得的蛋白质将是在其N末端具有5个额外氨基酸残基的CPL变异体。申请人已经在大肠杆菌中表达了预测的TP-CPL的叶绿体切割产物，将其纯化至同质，并且表明它在酶活性方面具有完全的功能。申请人也通过从表达本发明嵌合蛋白的转基因烟草植株中纯化“成熟”多肽，并且对其N末端进行Edman降解，证明了蛋白酶加工的确在Cys-Met接点处发生。

相反，如图1的第3行所示，TP-UbiC(Siebert等，参见上文)不含正常发生从Rubisco小亚基前体去除转运肽的切割位点或者属于成熟Rubisco多肽的任何氨基酸残基(Mazur等，Nuc Acids Res.13：2373-2386(1985)；Berry-Lowe等，J.Mol.and Appl.Gen.1，483-498(1982))。实际上，构成在大多数植物种中高度保守的易裂键部分的Met残基已经被Ala残基取代，所述Met残基可能被叶绿体加工酶识别或可能不识别。另外，Tp-UbiC含有一段在大肠杆菌CPL的推定切割位点的Cys残基和起始子Met残基之间并列的9个额外的氨基酸残基的序列段(以黑体字母显示)(图1)。这些额外氨基酸作为TP-UbiC人工融合蛋白的构建过程中的克隆人工产物被引入(Siebert等，参见上文)，未研究它们对叶绿体输入和/或蛋白酶加工的潜在有害影响。无论如何，即使正如所提示的，所述转运肽的切割发生Cys-Ala接点，所得的“成熟”蛋白也将在其N末端含有9个额外的氨基酸残基，它们可能对CPL酶活性有有害作用(参见Siebert等(参见上文)的表I，第2行和第4行)。

实施例

在以下实施例中进一步明确本发明。应该理解，这些实施例尽管指出了本发明的优选实施方案，但仅仅作为说明给出。根据以上的论述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种变化和修改，使其适合于各种用途和条件。通用方法

在实施例中使用的标准重组DNA技术和分子克隆技术是本领域众所周知的，并且描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor LaboratoryPress：Cold Spring Harbor，(1989)(Maniatis)和T.J.Silhavy，M.L.Bennan和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)和Ausubel，F.M.等，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版(1987)。

适用于细菌培养物的维持和生长的材料和方法是本领域众所周知的。适用于以下实施例中的技术可以在以下文献中找到：Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips编著)，American Society for Microbiology，Washington，DC(1994))或者Thomas D.Brock， Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，Second Edition，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989)。用于细菌细胞生长和维持的所有试剂、限制性酶和材料都得自Aldrich Chemica1s(Milwaukee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)，除非另有说明。

遗传序列的操作采用可得自the Genetics Computer Group Inc.的程序组(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)完成。在使用GCG程序“Pileup”时，所使用的空位产生(gap creation)缺省值为12，空位延伸(gap extension)缺省值为4。在使用CGC“Gap”或“Bestfit”程序时，所使用的缺省空位产生罚分为50，而缺省空位延伸罚分为3。当在这些GCG程序或任何其它GCG程序中没有GCG程序参数提示符时，使用缺省值。

缩写的含义如下：“h”意指小时，“min”意指分钟，“sec”意指秒，“d”意指天，“ml”意指毫升，“L”意指升。

实施例1

大肠杆菌CPL的PCR克隆

用两种PCR引物从基因组DNA扩增大肠杆菌ubiC基因，同时将单一限制位点加至其侧翼区，以便随后连接到高拷贝数质粒中。该基因编码分支酸丙酮酸裂合酶，该酶在下文称为CPL。用于此目的的引物基于已发表的大肠杆菌ubic基因的DNA序列(GenBank登记号M96268)，由以下核苷酸组成：引物1-(SEQ ID NO：1)：

5′-CTA CTC ATT Tca tat gTC ACA CCC CGC GTT AA-3′引物2-(SEQ ID NO：2)：

5′-CAT CTT ACT aga tct TTA GTA CAA CGG TGA CGC C-3′下划线的碱基与靶基因杂交，而小写字母指示加入至所述PCR引物末端的限制位点(NdeI或BglII)。

大肠杆菌ubic基因的扩增采用引物1和2以及得自大肠杆菌菌株W3110(Campbell等，Proc.Natl.Acad.Sci.75：2276-2284(1978))的基因组DNA来完成。引物1杂交于该基因的开始之处，并且在所述蛋白质的起始密码子处引入一个NdeI位点，而引物2杂交于相反的末端，在紧接终止密码子之后提供一个BglII位点。100μl PCR反应物含有约100ng基因组DNA，两种引物的终浓度为0.5μM。其它反应成分由GeneAmp PCR试剂盒(GeneAmp PCR Reagent Kit)(Perkin Elmer)提供，按照生产商的方案。扩增在DNA热循环仪480(Perkin Elmer)中进行22个循环，每个循环包括94℃1分钟、55℃1分钟和72℃1分钟。在最后的循环之后，在72℃延伸7分钟。

PCR产物用NdeI和BglII切割，将所得片段连接到已经用NdeI和BamHI消化的大肠杆菌表达载体pET-24a(+)(Novagen)中。使用BTX Transfector 100(Biotechnologies and Experimental Research Inc.)，按照生产商的方案，用连接反应混合物转化大肠杆菌DH10B电感受态细胞(GibcoBRL)；在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基对生长物进行选择。含有具有CPL插入片段的质粒的转化子通过使用引物1和2和各个重悬浮菌落作为模板源的PCR反应来鉴定；因此，该技术简称为“菌落PCR”。从产生正确大小的PCR产物的代表性菌落分离出质粒DNA，对对应于所述CPL的完整插入片段进行全测序，以检查PCR的错误；没有发现错误。在下文将经选择以供进一步操作的质粒被称为“pET24a-CPL”。pET24a大肠杆菌表达构建体中CPL的ORF的核苷酸序列及其预测的一级氨基酸序列分别描述于SEQ ID NO：3和SEQID NO：4。注意到所述编码区与GenBank登记号M96268中给出的ORF相同。

实施例2

重组大肠杆菌CPL的过量表达、纯化和表征

为了产生足量的CPL以供酶表征和抗体产生，将pET24a-CPL导入大肠杆菌BL21(DE3)中。这一步通过用BTX Transfector 100(Biotechnologies and Experimental Research Inc.)，按照生产商的方案进行电穿孔来完成。生长物在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基上进行选择，选择出一个菌落以供进一步操作。为了产生重组蛋白，让含所述质粒的菌株在上述培养基的液体培养物中于30℃生长，在A600nm约为0.8时，用0.15mM IPTG诱导细胞。在同样的生长条件下进行4.5小时诱导期之后，通过离心收获细胞，将其贮存于-80℃待用。后续步骤在0-4℃下进行。

将冷冻的细胞沉淀重悬于约3倍体积的0.1M Tris-HCl(pH7.7)、5mM MgSO₄、1mM二硫苏糖醇、0.03mg/ml DNA酶I、0.5mM苯基甲磺酰氟中，并且在20,000psi下通过弗氏压碎器两次。通过离心(43,0000xg，1h)除去碎片，向含有约30mg蛋白质/mL的无细胞提取物中补充甘油(5％)，贮存于-80℃下待用。采用Lowry等的方法(Lowry等，J.Biol Chem.193：265-275(1951))，用BSA作为标准，测定蛋白质浓度。无细胞提取物的SDS-PAGE分析显示，所述重组蛋白在所述生长条件下在大肠杆菌BL21(DE3)中表达良好，表达水平超过总可溶性蛋白的15％。然而，在弗氏压碎器压碎的提取物的可溶性部分中仅回收约25％的所述重组蛋白，使用该材料如下所述进行纯化。

纯化的第一步需要阴离子交换色谱。将一等份(1.0mL)含有重组CPL的大肠杆菌无细胞提取物快速解冻至室温，用去离子水以1∶1稀释，然后通过0.2μm Acrodisc滤器(Gelman Sciences，Cat.No.4192)过滤。将所有样品上样至Mono Q HR 5/5柱(Pharmacia Biotech Inc)，于25℃用缓冲液Q(50mM Tris-HCI，pH7.7，10mM亚硫酸钠，1mMEDTA)、以1ml/min的流速展开。在这些条件下，重组CPL不吸附于所述阴离子交换树脂上，在展开的前几分钟期间从所述柱子上被等度洗脱下来。在一个试管中收集柱流通液，补充5％(w/v)甘油，于4℃在Centricon-10(Amicon Inc.)中浓缩至450μl的终体积。在该简单操作之后，根据SDS-PAGE(Laemmli U.，Nature 227：680-685(1970))和考马斯蓝染色判断，所述重组蛋白的纯度约为90％。在下一步中，将200μl浓缩样品上样至用含0.3M NaCl的缓冲液Q预先平衡的7.5×600mmTSK G3000SW凝胶过滤柱(TOSOH Corp.)。该柱以1.0mL/min(25℃)的流速展开，在19.7-21min之间高度纯化的重组CPL被洗脱。将后者保持在冰上，而将剩余的一半样品以同样方式加工。将两个凝胶过滤柱的峰流分合并，补充甘油(5％)，浓缩至约12mg蛋白/mL，贮存于-80℃待用。纯化蛋白的产量约为3.7mg，相当于所述无细胞提取物中存在的总蛋白的约12％。过载考马斯染色凝胶的目测表明最终的重组蛋白制剂的纯度超过98％。

让纯化重组CPL经过Edman降解，表明所述蛋白的起始子Met残基在大肠杆菌中被除去。然而，除了这一微小的翻译后修饰之外，重组CPL的前13个氨基酸与SEQ ID NO：4中所示蛋白(例如真实大肠杆菌蛋白的ORF)的残基2-14相同。通过电喷雾电离质谱术测定，纯化重组CPL的原聚体分子量为18644.6道尔顿。这一数值与根据不包括起始子Met残基时的所述DNA序列预测的分子量(18645.49道尔顿)非常吻合。根据这些观测结果，合理地推断：起始子Met残基也从天然大肠杆菌蛋白中被切除，因为后者的核苷酸序列与重组CPL相同。

开发一种连续分光光度测定，以评价所述纯化重组蛋白的催化活性。该测定基于伴随分支酸转化为pHBA、由于后者的芳环形成引起的246 nm的吸光度的增加。于25℃下在含有90mM Tris-HCl(pH7.6)、0.2M NaCl、100μM分支酸钡(Sigma)和各种量的纯化重组CPL的石英比色杯中，测量初始产物生成速率；用酶引发反应。用pHBA于246nm下11,220M^-1的消光系数，根据吸光度的变化计算产物的生成。在范围为5μM-100μM的浓度的pHBA下，在相同的条件下测量吸光度；吸光度与pHBA的浓度成正比。基于上述测定，纯化重组CPL于25℃的转换数约为36min^-1。以大得多的规模纯化的同一重组蛋白的两种其它制剂，在同样的条件下得到略高的转换数(例如41min^-1和42min^-1)。在文献中可得到的有关该酶的唯一数值是49min^-1(Nichols等，J.Bacteriol.174：5309-5316(1992))，但所述测定于37℃进行。假定所述CPL酶反应的特征是Q10(温度系数)至少为2，那么这些观测结果表明，上述的纯化重组蛋白具有完全的活性。

实施例3

CPL叶绿体靶向形式：TP-CPL的构建

分支酸为CPL的生理底物，是包括氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸在内的多种芳族化合物合成的一种重要的分支点中间体。在植物中，分支酸在位于叶绿体和其它类型质体中的莽草酸途径中生成(Siebert等，Plant Physiol.112：811-819(1996))。因此，必需提供具有N末端叶绿体靶向序列的CPL，所述叶绿体靶向序列能够将外源蛋白有效导向叶绿体，即分支酸产生的部位。通过构建由与CPL的起始子Met残基融合的来源于番茄Rubisco小亚基前体蛋白的叶绿体靶向序列组成的嵌合蛋白，完成这一步；所得的融合蛋白在下文被称为“TP-CPL”。为了产生对应于Rubisco小亚基转运肽和“成熟”Rubisco的前4个氨基酸残基的DNA片段，使用PCR。扩增的靶是质粒pTSS1-91-(#2)-IBI(Siebert等，Plant Physiol.112：811-819(1996))，它含有rbcS2的番茄Rubisco小亚基前体的全长cDNA克隆(Sugita等，Mol Gen Genet.209：247-256(1987)；Siebert等，Plant Physiol.112：811-819(1996))。该反应使用以下引物：引物35′-CTA CTC ACT TAG ATC Tcc atg gCT TCC TCT GTC ATT TCT- 3′′(SEQ ID NO：5)引物45′-CAT CTT ACT cat at g CCA CAC CTG CAT GCA GC-3′(SEQ ID NO：6)

引物3的下划线部分杂交于Rubisco小亚基前体的前21个核苷酸，并且在所述叶绿体靶向序列起始处的起始子Met残基之处引入一个NcoI位点(小写字母)。如所示的，该引物在其5’端也含有一个BglII位点(粗体字母)，紧接NcoI位点的上游。引物4在所述叶绿体靶向序列的另一端杂交于Rubisco小亚基前体的ORF的核苷酸167-184。将一个单一NdeI位点工程改造到该引物中(小写字母)，以允许含有所述叶绿体靶向序列的PCR片段连接至位于pET-24a表达构建体中CPL起始密码子之处的NdeI位点。100μl的PCR反应物含有约75ngpTSS1-91-(#2)-IBI以及终浓度约为0.9μM的引物3和4。扩增在DNA热循环仪480(Perkin Elmer)中进行25个循环，每个循环包括94℃1分钟、55℃1分钟和72℃1分钟；在最后的循环之后进行72℃7分钟的延伸期。所述PCR产物用BglII和NdeI消化，连接到已经用相同限制性酶切割以除去小DNA片段(106bp)、仅含载体序列包括T7启动子的pET24a-CPL中。用电穿孔将连接反应混合物导入大肠杆菌DH10B中，生长物在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基上选择。用引物2和3，通过菌落PCR，鉴定带有含插入的叶绿体靶向序列的质粒的转化子。选择出产生正确大小的PCR产物的一个代表性质粒以供进一步操作；该质粒在下文称为“pET24a-TP-CPL”。为了证实没有PCR错误，用定制的引物，对对应于所扩增叶绿体靶向序列的质粒区域进行全测序。TP-CPL的ORF的核苷酸序列及其预测的一级氨基酸序列分别描述于SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。

实施例4

TP-CPL的预测叶绿体切割产物具有完全的活性

用质粒pet24a-TP-CPL中的插入片段作为模板，通过PCR产生对应于TP-CPL的预测叶绿体切割产物的氨基酸序列(例如MQVWH-CPL)的DNA片段。该反应使用以下引物：引物55′CTA CTC ATT Tga aga cTG CAT GCA GGT GTG GCA T-3′(SEQ ID NO：9)：引物65′-CAT CTT ACT gtc gac TTT AGT ACA ACG GTG ACG C-3′(SEQ ID NO：10)

引物5的下划线部分结合于TP-CPL基因插入片段的5’端，并且恰好在所述预测叶绿体切割产物(在下文称为“ΔTP-CPL”)起始子Met残基上游引入一个单一BBSI位点(小写字母)。引物6杂交于所述基因插入片段的相反端，在紧接终止密码子之后提供一个单一SalI位点(小写字母)。所述PCR产物用BBSI(它留下NcoI匹配的“粘性末端”)和SalI切割，将所得的片段连接到用NcoI和SalI消化的大肠杆菌表达载体pET-24d(+)(Novagen)中。采用BTX Transfector 100(Biotechnologies and Experimental Research Inc.)，按照生产商的方案，用连接反应混合物转化大肠杆菌DH10B电感受态细胞(GibcoBRL)中；生长物在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基中进行选择。用适当的引物，通过菌落PCR鉴定含有具有ΔTP-CPL插入片段的质粒的转化子。从产生正确大小的PCR产物的菌落中分离出一个代表性质粒(例如pET24a-ΔTP-CPL)，对对应于ΔTP-CPL的插入片段进行全测序，以证实没有PCR错误。

为了表达所述重组蛋白以供纯化和动力学分析，采用电穿孔将pET24a-ΔTP-CPL导入到大肠杆菌BL21(DE3)中。将转化细胞平板接种于含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基上，选择一个代表性菌落以供进一步操作。让300ml培养物在上述培养基中于30℃生长。在A600nm约为0.8时，加入IPTG至终浓度为0.15mM。在同样条件下诱导4.5小时后，通过离心收获细胞，将其贮存于-80℃。后续步骤在0-4℃下进行，除非另有说明。

将冷冻的细胞沉淀重悬于2.5ml含有0.1M Tris-HCl(pH7.7)、5mM MgSO₄、1mM二硫苏糖醇、0.03mg/ml DNA酶I、0.5mM苯基甲磺酰氟的溶液中，使其通过20,000psi下的弗氏压碎器两次。对无细胞提取物进行离心(43,000xg，25min)，小心取出上清液(4.5ml)，补充5％甘油并贮存于-80℃待用。用于ΔTP-CPL的纯化方案与上述用于未经修饰的重组大肠杆菌CPL的方案基本相同。简而言之，将上述全部样品解冻，用Centriprep-10(Amicon Inc)将其浓缩至2.5ml的终体积。然后用以缓冲液Q预先平衡的PD-10凝胶过滤柱(Pharmacia BiotechInc)，按照生产商的方案，将样品交换到缓冲液Q中。在Centriprep-10中，将体积缩小至2ml，将全部样品上样至Mono Q HR 10/10柱(Pharmacia Biotech Inc)，用缓冲液Q以4ml/min(25℃)展开。收集在2-3分钟之间洗脱的物质，加入甘油至终浓度为5％(v/v)。在Centricon-10(Amicon Inc)中将样品浓缩至200μl，上样至7.5×600mmTSK G3000SW凝胶过滤柱(TOSOH Corp.)。该柱用含有0.3M NaCl的缓冲液Q(25℃)以1ml/min展开，重组ΔTP-CPL在20.7-22min之间被洗脱。给含有所述纯化重组蛋白的流分补充5％甘油，浓缩至约0.7mg蛋白/ml，储存于-80℃待用。

用实施例2中描述的分光光度测定，于25℃测定纯化的重组ΔTP-CPL的酶活性。在这些条件下，转换数为40.7min^-1。该数值实际上与用无N末端延伸的纯化重组大肠杆菌CPL获得的数值相同(例如36-42min^-1)。这一观测结果清楚地表明，融合于ΔTP-CPL N末端的5个额外的氨基酸残基并不损害酶活性，还提示TP-CPL的预测叶绿体切割产物可能具有完全的活性。

实施例5

体外蛋白质输入：将TP-CPL输入到分离的叶绿体中

在将TP-CPL导入到高等植物之前，重要的是表明它可能被叶绿体摄入。通过合成放射性形式的人工融合蛋白，并进行典型的叶绿体蛋白质输入试验，进行这一步。第一步是产生可以用来用[³⁵S]甲硫氨酸放射性标记所述蛋白的DNA构建体，以供转运实验用。为此，修饰编码TP-CPL的序列，以供用引物7和8，用质粒pet24A-TP-CPL中的插入片段作为PCR扩增的模板，插入到体外转录/翻译载体pCITE4a(+)(Novagen)的MscI和BglII位点中。引物75′-CTA CTC ATT tgg cca G CT CTG TCA TTT CTT CAG CAG C-3′(SEQ ID NO：11)引物85′-CAT CTT ACT a ga tct TTA GTA CAA CGG TGA C-3′(SEQ ID NO：12)

引物7杂交于恰好在TP-CPL起始密码子之后的核苷酸序列段(下划线区域)，并且在起始子Met残基之处加入一个单一MscI位点(以小写字母表示)。引物8结合于该基因插入片段的另一端，紧接终止密码子之后引入一个单一BglII位点。任一种引物都没有在所述人工融合蛋白中引入任何氨基酸改变。所得的PCR片段用MscI和BglII消化，连接于用MscI和BamHI切割的pCITE4a(+)中；BglII和BamHI产生匹配的“粘性末端”。采用电穿孔将连接反应混合物导入大肠杆菌DH10B中，将转化细胞平板接种在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上。选择带有具正确插入片段的质粒的一个代表性菌落(通过菌落PCR鉴定，采用合适的引物)，以供进一步操作。对质粒DNA进行全测序，以证实没有PCR错误。

接着，用[35S]甲硫氨酸和“Single Tube Protein System 2，T7”试剂盒(Novagen)，按照销售商的方案，对上述质粒构建体进行体外转录/翻译。用含有60mM未标记甲硫氨酸的2X输入缓冲液(Viitanen等，J.Biol.Chem.263：15000-15007(1988))终止反应。从14日龄的豌豆幼苗(Pisum sativum)分离叶绿体，用放射性标记的TP-CPL进行体外输入测定(Viitanen等，J.Biol.Chem.263：15000-15007(1988))。用蛋白酶后处理来鉴别结合多肽和输入多肽(Cline等，J.Biol.Chem.260：3691-3696(1985))。然后通过Percoll垫离心，重纯化完整的质体，将其重悬于150μl2X凝胶样品缓冲液中，如先前描述的方法(Viitanen等，J.Biol.Chem.263：15000-15007(1988))通过SDS-PAGE/荧光自显影分析。

TP-CPL的体外转录/翻译导致合成表观分子量约25kDa(基于SDS-PAGE的迁移率(Laemmli，U.K.，Nature 227：680-685(1970))的放射性多肽，所述分子量与根据其DNA序列预测的数值(25188Da)一致。在存在ATP时，该多肽被叶绿体摄入并加工成较小的大小，它看来与考马斯染色纯化的重组ΔTP-CPL(例如TP-CPL的预测叶绿体切割产物)共迁移。经典的蛋白酶保护实验确立，在输入测定后用完整的叶绿体回收的所述放射性多肽事实上已经被内化。

相反，当将叶绿体在确实支持蛋白质输入的条件(例如在黑暗中，无ATP)下孵育时，没有观察到TP-CPL的摄入和加工。在无能量供给的条件下，用完整的质体回收的唯一放射性条带是全长的融合蛋白TP-CPL。此外，对应于后者的放射性条带在用蛋白酶处理后完全消失，证明它并未被输入，而是仅仅结合于叶绿体外膜。综合而言，这些结果清楚地证明，连接于TP-CPL N末端的所述叶绿体靶向序列能够将所述人工融合蛋白导向叶绿体，并且在摄入到细胞器之后，以预期的方式发生蛋白酶加工。

实施例6

用于烟草和拟南芥转化的表达质粒的构建

在确立TP-CPL被叶绿体有效摄入(实施例5)并且被切割为具有高CPL活性的新蛋白(实施例4)之后，决定将其导入植物中。为了产生可以用于在烟草和拟南芥中组成型表达的构建体，将对应于全长TP-CPL融合蛋白的DNA片段亚克隆到修饰形式的质粒pML63中。后者衍生于pML40，含有以下遗传元件：一个CaMV 35S启动子、一个cab前导序列、uidA编码区和NOS聚腺苷酸化信号序列。简而言之，CaMV35S启动子是一段在转录起始位点之后延伸8个碱基对的1.3kb DNA片段(Odell等，(1985)Nature 303：810-812)。在其3’端有效连接cab前导序列，这是从叶绿素a/b结合蛋白基因22L获得的60bp非翻译双链DNA片段(Harpster等(1988)Mol.Gen.Genet.212：182-190)。在cab前导序列的3’端融合编码蛋白β-葡糖醛酸糖苷酶(例如“GUS”)的uidA基因(Jefferson等(1987)EMBO J 6：3901)。最后，在GUS基因的3’端连接一个含有得自胭脂碱合酶(例如“NOS”)基因(Depicker等(1982)J.Mol.Appl.Genet.1：561-564)的聚腺苷酸化信号序列的800bp DNA片段。这些DNA片段结合在一起包含35S-GUS嵌合基因，通过标准克隆技术将其插入到载体pGEM9Zf(-)(Promega；Madison WI)中，得到质粒pMH40。

质粒pML63与pMH40基本相同，但具有截短形式的3’NOS终止序列，用以下方式产生。首先，pMH40用SalI消化，将两种所得的4.03kb和2.9kb的DNA片段重新连接，得到具有反向取向的所述35S启动子/cab22前导序列/GUS基因/3’NOS终止盒的质粒。然后，所得的构建体用Asp718I和HindIII消化，释放含有3’NOS终止序列的770bp片段。弃去后者，用采用pMH40作为模板并且用引物9和10通过PCR产生的较短的形式取代。引物9：5′-CCC GGG GGT ACC TAA AGA AGG AGT GCG TCG AAG-3′(SEQ ID NO：13)：引物10：5′-GAT ATC AAG CTT TCT AGA GTC GAC ATC GAT CTA GTA ACA TAG ATG A 3′(SEQ ID NO：14)：

所述PCR产物用HindIII和Asp718I消化，产生含有279bp 3’NOS终止序列、始于已发表序列(Depicker等，J.Mol Appl Genet(1982)1：561-574)的核苷酸1277(TAA终止密码子)且终止于核苷酸1556的298 bp片段。将该PCR片段连接到pML3中，产生质粒pML63。

如上所述，pML63含有所述35S启动子控制下的GUS编码区和截短形式的3’NOS终止子。因此，它含有在植物中组成型表达GUS所必需的全部转录信息。为了产生TP-CPL的类似构建体，用NcoI和EcoRI消化质粒pML63。这种操作仅释放GUS基因插入片段，留下调节侧翼序列和完整载体的其余部分。质粒pet24a-TP-CPL也用NcoI和EcoRI处理，这释放出TP-CPL融合蛋白的完整编码区。通过琼脂糖凝胶电泳纯化对应于后者的小DNA片段(693bp)，并将其与通过用NcoI和EcoRI切割pML63获得的大载体片段(4.63bp)进行标准连接反应。采用电穿孔将连接反应混合物导入大肠杆菌DH10B中，生长物在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上进行选择。用引物2和3，通过菌落PCR鉴定带有含所插入TP-CPL编码序列的质粒的转化子。选择产生正确大小的PCR产物的一个代表性质粒，以供进一步操作。在下文称为“TP-CPL-pML63”的最终构建体的示意图示于图2中。

用于农杆菌介导的烟草叶盘片转化的二元载体是质粒pZBL1，该质粒于1997年6月24日保藏于ATCC，保藏号为209128。pZBL1含有：得自pBR322的复制起点；细菌nptI卡那霉素抗性基因；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)质粒pVS1(Itoh等，1984)的复制区和稳定区；van den Elzen等，1985描述的T-DNA边界(border)，其中作为右边界片段一部分的OCS增强子(从OCS启动子的-320延伸至-116)(Greve等，1983，J.Mol.Appl.Genet.1：499-511)被除去；和一个作为卡那霉素抗性植物选择标记的NOS/P-nptII-OCS 3’基因。为了表达TP-CPL，质粒pZBL1用SalI消化，SalI在右边界和左边界之间的单一位点切割，该位置为插入外源基因且稳定整合到植物基因组中的理想位置。为了将无插入片段的重连接的可能性降至最低，经切割的载体用牛小肠碱性磷酸酶(GibcoBRL)按照生产商的建议去磷酸化。为了获得可能插入到所述二元载体的片段，质粒TP-CPL-pML63也用SalI消化。这一处理释放出作为2.4kb DNA片段的TP-CPL融合基因的完整转录单位(例如35S启动子/cab22前导序列/TP-CPL/3’NOS终止子)。后者通过琼脂糖凝胶电泳纯化，并与如上所述从pZBL1获得的去磷酸化11.0kb片段进行标准连接反应。采用电穿孔将所述连接反应混合物导入大肠杆菌DH10B中，生长物在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基上进行选择。用引物2和3，通过菌落PCR鉴定带有含TP-CPL融合基因的质粒的转化子，通过用KpnI进行限制性酶消化分析确定所述插入片段的取向。在选择以供进一步操作、在下文称为“TP-CPL-pZBL1”的质粒中，TP-CPL的起始密码子与T-DNA的右边界片段相邻，如图3图示。如下所述，这种表达构建体用于转化烟草和拟南芥，以进行pHBA的过量生产。

实施例7

转基因烟草植株的产生

采用冻融转化法(Holsters等，Mol.Gen.Genet.163：181-187)，将质粒TP-CPL-pZBL1导入根癌农杆菌菌株LBA4404(Hoekema等，Nature303：179-180(1983))中。将细胞于28℃平板接种于也含有卡那霉素(1000μg/ml)和利福平(20μg/ml)的YEP培养基(每升10g胰蛋白胨、10g酵母膏和5g NaCl)上，用合适的引物，通过PCR鉴定带有所述二元构建体的菌落。

用于叶盘片侵染的盆栽烟草植株(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)在生长室中生长，维持14hr 21℃光照、10hr 18℃黑暗周期，相对湿度大约为80％，用混合冷白荧光和白炽灯。农杆菌介导的叶盘片转化基本上按照De Blaere等，Meth.Enzymol.153：277-292所述的方法进行，进入以下的修改。用无菌纸钻孔器和4-6周龄的植株，从完整的叶片准备直径8mm的叶盘片。通过将叶盘片在带有TP-CPL-pZBL1、在Murashige Minamal Organics培养基中重悬至OD600为～Z的农杆菌浓缩溶液中浸没30分钟进行接种。将接种的叶盘片直接置于含有(每升)30g蔗糖、1mg 6-苄氨基嘌呤(BAP)、0.1mg萘乙酸、8g琼脂和得自GibcoBRL的1个包装的Murashige′s Minimal Organics培养基(cat.#23118-029)的培养基上。在光照下于28℃培养3天后，将叶盘片转移至也含有卡那霉素(300μg/ml)和头孢噻肟(500μg/ml)的相同组成的新鲜培养基上，以便根据转化烟草细胞的生长进行选择，并且消除残留的农杆菌。叶盘片在上述生长条件下培育3周，然后以3周的间隔转移至组成相同的新鲜培养基上，直至获得可供根诱导用的最适芽的大小。芽在含有(每升)1个包装的Murashige′s Minimal Organics培养基、8g琼脂和10g蔗糖的培养基上生根。约4周后，将植株转移到土壤中，让其在生长室中在上述条件下生长至成熟。

实施例8

pHBA葡糖苷标准的化学合成

为了合成pHBA酯葡糖苷，将110mmol 4-羟基苯甲酸与含55mmol氧化双(三丁基锡)的1L苯混合。在氮气环境下，用共沸装置将混合物原位加热至回流达16小时。减压除去苯，得到主要为4-羟基苯甲酸三丁基锡酯的澄清的油状物(Ogawa等，(1982)Tetrahedron 36：2641-2648)。下一步，将含25mmol乙酰溴-a-D-葡萄糖的1.2L1，2-二氯乙烷加入至25mmol 4-羟基苯甲酸三丁基锡酯中间体，然后加入12.5mmol溴化四丁基铵。在氮气环境下加热混合物至回流达3小时，通过TLC，通过用硫酸炭化进行检测，监测反应进程。减压除去溶剂，在硅胶上，用乙酸乙酯和己烷的1∶1混合物洗脱，纯化乙酰保护的pHBA酯葡糖苷。然后，乙酰保护基用10％甲醇水溶液中的1当量碳酸钾选择性皂化3小时。减压除去溶剂，用甲醇干净地研磨pHBA酯葡糖苷。过滤除去后者，所得的白色粉末表现出熔点为209-210℃。通过¹HNMR证实所述pHBA酯葡糖苷的化学结构。

为了合成pHBA酰基葡糖苷，将16.4mmol 4-羟基苯甲酸甲酯和14.6mmol乙酰溴-a-D-葡萄糖溶于7.0ml无水吡啶中，然后加入23.3mmol 99.99％氧化银。在氮气环境下于室温搅拌反应物3小时。经过滤收集不溶性银盐，用吡啶洗涤，将合并的滤液和洗涤液减压浓缩，注入冰冷水的混合物中。收集暗褐色固体，用水冲洗，溶于氯仿和二氯甲烷的1∶1混合物中，随后用碳酸钠作为干燥剂干燥。让溶液通过celite过滤，减压除去溶剂。然后用硅胶色谱纯化羟基连接的苯甲酸甲酯乙酰保护的葡糖苷(Durkee等，(1979)Carbohydrate Research 77：252-254)；柱子用乙酸乙酯和己烷的1∶2混合物洗脱。将纯化的化合物溶于40ml甲醇中，加入1.5mmol甲醇钠。4.5小时后，溶液变为黄色，减压除去溶剂；将所得的残余物溶于25ml水中。将溶液浓缩至约5ml，让其结晶，得到所述羟基连接的苯甲酸甲酯葡糖苷；收集晶体，然后在高真空下干燥。为了选择性地皂化所述甲酯基团，将2.5mmol羟基连接的苯甲酸甲酯葡糖苷溶于25ml水中，加入2.5ml 1M NaOH。于室温搅拌过夜后，中和溶液，将其浓缩至约5ml，让其结晶，得到所需的pHBA酰基葡糖苷。发现该化合物的熔点为108-110℃，通过¹HNMR证实其化学结构。

实施例9

制备供pHBA葡糖苷分析用的烟叶样品

从烟草植株茎顶部三分之一的部分选择沿中脉测量约15cm的健康叶片。用剪刀快速剪取叶片远端1/3部分的组织(100mg鲜重)，置于含有陶瓷珠的Biopulverizer H管(cat.no.6570-201或6540-401)中，后两者都得自BIO 101(Joshua Way，Vista，CA)。在加入1ml甲醇后，给管加盖，用以5m/s速度操作的Savant FastPrep FP120组织破碎装置机械搅拌40秒。接着，将试管置于旋转振荡器上，于室温以400rpm剧烈搅拌1小时。用常规台式微量离心机离心(10,000xg，10min)，使提取物澄清，小心取出含有两种pHBA葡糖苷的上清液，转移到空管中。采用旋转振荡器和上述条件，周0.5ml甲醇于室温重提取剩余的不溶性叶片材料30分钟。将第二次提取产生的上清液与第一次提取的上清液合并，将样品储存于-20℃以供随后的加工。用分析天平和甲醇的密度将质量转换为体积，通过重量分析测量加入到每种叶片材料样品中的甲醇体积以及在提取和离心后回收的终体积。

如下进一步加工所述样品以供HPLC分析。除非另有说明，所有的步骤均在室温下进行。将一等份甲醇提取物转移至微量离心管，如上所述测量其实际体积。在Speed-Vac(Savant Instruments)中开始加热，真空除去溶剂，使所述样品完全干燥。将干燥残余物溶于100μl0.2N HCl中，加入0.7mL水饱和的乙醚。在剧烈涡旋混合和离心之后，小心取出乙醚相并将其弃去，样品用乙醚如上所述重新提取。然后，将一等份的剩余水相(50μl)通过0.22um醋酸纤维素滤膜(Costar EZ-spin)过滤，注射到用90％缓冲液A(0.1％甲酸水溶液)和10％缓冲液B(甲醇)以1ml/min预平衡的Vydac 218TP54 PROTEIN AND PEPTIDEC18柱中。在注射样品后，柱子立即用在20min期间产生的至终浓度为50％缓冲液B的线性梯度展开。流速为1ml/min。用分光光度计于254nm监测酚型和酯型pHBA葡糖苷的洗脱。图4显示了一株表达TP-CPL的烟草植株(转化体#5)和一株野生型植株的代表性HPLC谱图。

用真正的pHBA葡糖苷标准(参见上文)校正HPLC分离的保留时间，在所用的HPLC条件下准确地测量两种化合物的消光系数。因此，用H/P Chemstation提供的软件，对峰面积进行积分，用已知量的合适标准获得的数值用来定量测定每次注射的pHBA葡糖苷的微克量。在计及注射到柱子上的原始甲醇提取物的稀释度和所占的百分率后，对所述数值进行校正，以反映得自所分析叶片样品的总回收率。将其与所分析植物组织(例如在同一天得自同一植株的，干重)的各个测量结果偶联，使得能够将pHBA-葡糖苷以干重百分比表示。

实施例10

卡那霉素抗性在第一自交子代中的分离

通过自交产生的原代烟草转化体#34的种子通过在也含有0.1％SDS的10％漂白溶液[含5.25％Na(OCl)₂的Clorox^]中于室温温和搅拌下浸渍30分钟进行表面消毒。无抗生素选择的200粒种子的发芽率为97.5％。相反，在接种到也含有卡那霉素(300μg/ml)的发芽培养基上的500粒种子中，约20％表现出隐性表型(例如卡那霉素敏感性种子与卡那霉素抗性种子之比为1∶4)。由于转化体#34的分离比非常接近1∶3的单基因显性性状的理论比值(例如，与双基因座事件特征性的1∶16比值相对比)，所以可以推断，所述选择标记和TP-CPL基因表达构建体稳定整合到基因组的单一基因座中。

实施例11

烟草叶片提取物中CPL酶活性的测量

制备得自野生型和转基因烟草植株的叶片组织提取物，如先前描述的方法(Siebert等，PlantPhysiol.112：811-819(1996))并略加修改，分析其CPL酶活性。叶片样品(2g湿重)在冰冷研钵中用2.6ml含有50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.1％β-巯基乙醇、1mM EDTA、1mM苯基甲磺酰氟和75mg/ml聚乙烯聚吡咯烷酮的溶液中匀浆。除非另有说明，所有的后续步骤均在0-4℃下进行。在低速离心除去不溶性物质后，用PD-10凝胶过滤柱(Pharmacia Biotech Inc)，按照生产商的建议，将样品的缓冲液交换为50mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA和200mMNaCl。用Bio-Rad(Bradford)蛋白质测定测量蛋白质的浓度。

CPL酶测定如下进行。基本反应混合物(终体积500μl)含有50mMTris pH8.0(于37℃)、10mM EDTA、200mM NaCl和150μM纯化分支酸钡(Siebert等Microbiology 140：897-904(1994))。在于37℃孵育5分钟后，用含有50μg蛋白质的烟草叶片提取物引发反应。在于37℃2分钟后，用0.3ml 0.75M乙酸钠(pH4)终止反应，测定在反应中产生的pHBA的量。为了监测产物的回收，每管接受9,500dpm的[14C]-标记的pHBA(55mCi/mmol)作为内标。混合物用1ml H₂O饱和的乙酸乙酯抽提，收集有机相并使其干燥。然后用实施例9中所述的完全相同的柱子和条件，通过反相HPLC定量测定pHBA的量。收集对应于pHBA的峰，通过液体闪烁计数测量放射性的量。以下报道的关于CPL酶活性的数值以每mg蛋白质的pkats表示，并且已经根据所述内标和从分支酸通过自发分解产生的少量pHBA的回收率进行了校正(Siebert等，Plant Physiol.112：811-819(1996))。

实施例12

表达TP-CPL的转基因烟草植株的分析

如上所述，用农杆菌介导的叶盘片转化将TP-CPL导入烟草(Nicotiana tabacum)中，以测定其对pHBA葡糖苷积累的影响。根据图5中所示的数据，显然该人工融合蛋白实际上优于先前已经用来升高植物中pHBA水平的其它叶绿体靶向形式的大肠杆菌CPL(Siebert等，Plant Physiol.112：811-819(1996)；Sommer等，Plant Cell Reports17：891-896(1998))。该分析用得自通过不同的转化事件产生的15株烟草植株(原代转化体)的叶片组织进行。请注意，到仅在植株转移至土壤后5周时取样。正如所预期的，原代转化体表现出各种水平的pHBA葡糖苷，从总干重的0至2.3％不等。这种类型的变异通常在几乎所有的植物转化实验中观察到，推定反映出由于所谓的“位置”效应(例如，所述性状基因在基因组的不同位置稳定整合)和转基因拷贝数引起的不同水平的基因表达。在本项研究中也发生相似的现象得到用针对纯化重组大肠杆菌CPL的抗血清进行的烟草转化体的蛋白质印迹分析的支持。例如，尽管大多数所述植株(例如14/15)具有免疫学可检测水平的所述外源蛋白，但在表达水平上仍有相当大的变异。然而，一般而言，在蛋白质印迹信号强度和pHBA葡糖苷的积累之间有正相关，与先前的观察(Siebert等，Plant Physiol.112：811-819(1996))；Sommer等，Plant Cell Physiol.39(11)：1240-1244(1998)；Sommer等，Plant CellReports 17：891-896(1998))一致。

基于干重，5周龄烟草植株的平均pHBA葡糖苷含量为1.12％(+/-0.186％)，其中括号中的数字为平均值的标准误差。更重要的是，仅在原代转化体中的3株转化体(#13、#19和#37)的pHBA葡糖苷水平低于0.52％，这是在用TP-UbiC人工融合蛋白获得的相似研究中获得的最高水平(Siebert等，Plant Physiol.112：811-819(1996))。此外，在本项研究中的三株最佳植株(#8、#34和#39)的pHBA葡糖苷含量至少为2％干重。

为了检查所需表型的稳定性，在直至种子形成期的延长的时间内监测转基因烟草植株中的3株(#4、#5和#34)。有可能当所述植株继续发育时，所述植株可能不能够维持这类高水平的pHBA葡糖苷。然而，如图6中所示，情况不是这样。当所述植株变老时，其叶片pHBA葡糖苷含量显著增加。例如，在转化体#5中，当在将所述植株转移至土壤中后1周、5周、11周和13周分析时，总pHBA葡糖苷水平为总干重的0.5％、1.6％、7.2％和10％。13周的数值代表比用TP-UbiC获得的结果几乎增加20倍，相当于在相连的葡萄糖分子的质量进行校正后pHBA含量约为4.5％。尽管有这些非常高水平的次级代谢物，但所述转基因烟草植株看来完全正常，在形态上与野生型植株不可区分。

为了跟踪外源基因的命运和下一代中pHBA积累的相关表型，选择转化体#34进行进一步分析。作为13周龄的原代转化体，该植株的pHBA葡糖苷含量为总干重的8％(图6)。如实施例10中所述，当通过自花受粉获得的种子在卡那霉素存在下萌发并检查所述抗生素抗性表型的分离时，观察到1(敏感性)∶4(抗性)的比率。这提示在基因组的单一位置上发生了所述选择标记与TP-CPL的整合，而不是卡那霉素抗性分离比将为1∶15的双基因座事件。理论上，卡那霉素抗性植株由以2∶1的比率存在的两个群体-杂合群体和纯合群体组成。假定没有共抑制，则预期纯合植株的CPL酶活性两倍于杂合植株，也许积累甚至更高水平的pHBA葡糖苷。为了解决这一问题，让卡那霉素抗性幼苗中的5株(在下文称为#34A-34E)生长为成熟植株，，并分析其CPL酶活性和pHBA葡糖苷。在所述植株15周龄时取样，该项研究的结果示于以下表I中。

表I

植株34 CPL酶活性总pHBA-葡糖苷

姊妹株 (pkat/mg蛋白) (干重百分比)

34A 927 4.8

34B 991 5.9

34C 1048 5.0

34D 784 5.0

34E 356 3.2正如所预期的，所有卡那霉素抗性的幼苗也表现出CPL酶活性并且积累pHBA葡糖苷。因此，人工融合蛋白TP-CPL的基因稳定地传递给下一代。尽管所检查的植株数少，但看来是两个不同的群体。子代中的4株(例如#34A-34D)的CPL酶活性非常相似，从每mg蛋白784-1,048pkat不等。注意到该组的平均CPL活性(例如938pkat/mg)比当检查活烟草植株时用TP-UbiC获得的最佳数值(Siebert等，Plant Physiol.112：811-819(1996))高约4.5倍。同样这4株姊妹株也具有相当水平的pHBA葡糖苷。平均值约为5.2％的干重，所述数值非常聚集(例如4.8％-5.9％)。

相反，其中1株植株(例如#34E)的CPL酶活性和pHBA葡糖苷的水平非常低。虽然使得我们推测这株姊妹株为杂合体，而其它4株植株为纯合体，但得出这个结论还是为时太早。首先，根据获得的所述卡那霉素抗性表型的分离模式，预期仅1/3的所述植株为纯合的，而不是所观察到的所述群体的80％。第二，可以想象，具有双倍的多拷贝所述性状基因的纯合状态可能导致共抑制，产生自相矛盾的低水平的CPL酶活性和pHBA葡糖苷。目前正在进行实验，以尝试解决这一问题。无论如何，有趣的是注意到，在第二代植株中pHBA葡糖苷的积累水平与原代转化体的不完全一样。

实施例13

TP-CPL的蛋白酶加工在体内发生在预测的切割住点

如图7所示，表达人工融合蛋白TP-CPL的转基因烟草植株的全叶片提取物仅含有一种与针对纯化重组大肠杆菌CPL的抗血清交叉反应的多肽。此外，通过SDS-PAGE测量，在野生型植株中不存在的所述交叉反应多肽的大小，比导入烟草中的原始融合蛋白小得多。事实上，看来恰好与纯化的重组ΔTP-CPL共迁移，所述纯化的重组ΔTP-CPL为TP-CPL的预测叶绿体切割产物(实施例4)，也是体外叶绿体输入实验后观察到的放射性条带(实施例5)。虽然如此，为了提供从所述人工融合蛋白中所述叶绿体靶向序列的除去在体内的确发生在预测的切割位点的明确证明，从得自烟草转化体#34获得的叶片组织纯化所述蛋白，并且通过Edman降解测定其N末端氨基酸残基。

用研钵和研棒，用含有50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.1％β-巯基乙醇、1mM苯基甲磺酰氟和75mg/ml聚乙烯聚吡咯烷酮的冰冷溶液(研磨缓冲液)将叶片组织(6.9g湿重)匀浆。除非另有说明，所有后续步骤均在0-4℃下进行，将叶片提取物离心30分钟(40,000xg)除去不溶性物质，在所得的上清液中补充固体(NH₄)₂SO₄至终浓度为80％(w/v)。将溶液温和搅拌30分钟，然后以20,000xg离心10分钟，以沉淀大多数蛋白质。弃去上清液，将所得的沉淀重悬于2.0ml无聚乙烯聚吡咯烷酮但补充8％(v/v)甘油的研磨缓冲液中，通过Bio-Rad(Bradford)蛋白质测定测量，蛋白质浓度为14.3mg/ml。

然后，用PD-10凝胶过滤柱(Pharmacia Biotech Inc)，将一等份上述样品(0.5ml)交换为缓冲液Q(实施例2)。在样品完全进入树脂后，柱子用2.2ml缓冲液Q洗涤一次，弃去流出液。在加入另外1.1ml相同缓冲液后，收集在外水体积中洗脱的物质。然后将全部样品上样至于室温用缓冲液Q平衡的MonoQ HR5/5柱。柱子用相同缓冲液以1.0ml/min的流速展开，从样品注射时开始，收集各流分(每个流分1.0ml)。用针对纯化重组大肠杆菌CPL的抗血清，通过蛋白质印迹分析鉴定含有TP-CPL的叶绿体切割产物的流分。实际上所有交叉反应物质都在流分#3和#4中被洗脱出来，如前所述，仅用所述抗血清检测到的种类与纯化的重组ΔTP-CPL共迁移。合并柱流分#3和#4，补充7.5％甘油、0.3M NaCl和0.01％Tween 20(Bio-Rad cat.#170-6531)，用Centricon 10(Amicon)将其浓缩至约200μl的终体积。然后将全部样品上样至于室温用50mM Tris-HCl(pH7.2)、0.3M NaCl和0.01％Tween20预平衡的7.5×600mm TSK G3000SW凝胶过滤柱(TOSOH Corp.)。柱子用同一缓冲液以1.0ml/min(25℃)展开，将在21.5-23min之间洗脱的、含有真正TP-CPL叶绿体切割产物的流分合并在一起，用Microcon 10(Amicon)浓缩至55μl的终体积。经浓缩的物质用样品缓冲液以1∶1稀释，并且通过SDS-PAGE分析，以评价纯化度。尽管在考马斯蓝染色的凝胶中也显然有许多其它条带，但所述TP-CPL叶绿体切割产物是与其它污染物很好分离的一种主要的蛋白种类。对应于该条带的所述多肽N末端分析(在电泳转移至聚偏二氟乙烯膜和6个循环的Edman降解之后)证实在预测的切割位点，例如在图1中所示的Cys-Met接点，发生了所述人工融合蛋白的蛋白酶加工。根据这一观测结果和实施例4中叙述的酶活性数据，可以推断，在表达TP-CPL的烟草植株的叶绿体中负责将分支酸转化为pHBA的多肽是在其N末端连接有5个额外氨基酸残基、具有完全活性的CPL变异体。

实施例14

表达TP-CPL的转基因拟南芥植株的产生和分析

将人工融合蛋白TP-CPL导入拟南芥中，测定pHBA葡糖苷水平。采用可利用的方案(Meyer等(1994)Science 264：1452-1455)，通过电穿孔将携带CaMV35S-CPL表达盒(例如TP-CPL-pZBL1)的二元载体转化到携带非致癌型(disarmed)Ti(毒性)质粒pMP90(Koncz，C.和Schell，J.(1986)Mol.Gen.Genet.204：383-396)的根癌农杆菌菌株C58 C1 Rif(也称为菌株GV3101)中。采用已发表的真空深入技术方案(Clough S.J.，Bent A.F.(1998)Plant J.16(6)：735-43)，用携带具有CPL表达构建体的二元载体的MP90菌株转化具有野生型fahl-2(Chapple等，Plant Cell4：1413-1424(1992))，sngl-1(Lorenzen等，Plant Physiology 112：1625-1630(1996))遗传背景的拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型Columbia植株。在无菌条件下，在标准植物生长培养基上，用卡那霉素(50μg/ml)来选择，鉴定转基因幼苗。将卡那霉素抗性幼苗转移至土壤中，并且在土壤/珍珠岩(soil/perlite)混合物中，以12小时光照/12小时黑暗光周期、以100Em^-2s^-1、于18℃(黑暗)和21℃(光照)培育。通过这种方法，产生一个得自独立转化事件的301株原代转化体的群体。在转移至土壤后6周，如下所述用反相HPLC分析转基因拟南芥植株的pHBA葡糖苷。

将新鲜切下的叶片材料在50％MeOH(5μl/mg湿重)中匀浆，所得提取物通过低速离心澄清。然后，将一等份叶片提取物上样至Nova-Pak C18柱(60埃孔径，4μm粒径)，使用含1.5％磷酸的乙腈梯度(6％-48％)。pHBA酚型和酯型葡糖苷通过254nm的UV吸收来检测，用从真正的化学标准获得的消光系数(参见实施例8)来定量。在分析的272株转基因拟南芥植株中，239株(或约88％)含有可检测水平的两种葡萄糖缀合物，并且这些缀合物以大约等量存在。最佳过量生产者的总pHBA葡糖苷含量为10.73％干重，这与采用同一构建体用烟草观察到的最高水平非常相似。整个转基因拟南芥植株群体的平均值为3.35％(+/-0.13％)；括号中的数字为平均值的标准误差。

总之，这些结果清楚地证明，本发明的嵌合蛋白-TP-CPL不仅能够在烟草中产生高水平的pHBA葡糖苷，而且也能够在其它植物种中产生高水平的pHBA葡糖苷。

序列表<110>纳幕尔杜邦公司(E.I.du Pont de Nemours and Company)<120>在绿色植物中高水平地生产对羟基苯甲酸<130>BC1015 PCT<140><141><160>16<170>MICROSOFT OFFICE 97<210>1<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>1ctactcattt catatgtcac accccgcgtt aa 32<210>2<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>2catcttacta gatctttagt acaacggtga cgcc 34<210>3<211>495<212>DNA<213>未知生物<220><223>未知生物的描述：大肠杆菌(E.coli)<400>3atgtcacacc ccgcgttaac gcaactgcgt gcgctgcgct attgtaaaga gatccctgcc 60ctggatccgc aactgctcga ctggctgttg ctggaggatt ccatgacaaa acgttttgaa 120cagcagggaa aaacggtaag cgtgacgatg atccgcgaag ggtttgtcga gcagaatgaa 180atccccgaag aactgccgct gctgccgaaa gagtctcgtt actggttacg tgaaattttg 240ttatgtgccg atggtgaacc gtggcttgcc ggtcgtaccg tcgttcctgt gtcaacgtta 300agcgggccgg agctggcgtt acaaaaattg ggtaaaacgc cgttaggacg ctatctgttc 360acatcatcga cattaacccg ggactttatt gagataggcc gtgatgccgg gctgtggggg 420cgacgttccc gcctgcgatt aagcggtaaa ccgctgttgc taacagaact gtttttaccg 480gcgtcaccgt tgtac 495<210>4<211>165<212>PRT<213>未知生物<220><223>未知生物的描述：大肠杆菌(E.coli)<400>4Met Ser His Pro Ala Leu Thr Gln Leu Arg Ala Leu Arg Tyr Cys Lys1 5 10 15Glu Ile Pro Ala Leu Asp Pro Gln Leu Leu Asp Trp Leu Leu Leu Glu

20 25 30Asp Ser Met Thr Lys Arg Phe Glu Gln Gln Gly Lys Thr Val Ser Val

35 40 45Thr Met Ile Arg Glu Gly Phe Val Glu Gln Asn Glu Ile Pro Glu Glu

50 55 60Leu Pro Leu Leu Pro Lys Glu Ser Arg Tyr Trp Leu Arg Glu Ile Leu65 70 75 80Leu Cys Ala Asp Gly Glu Pro Trp Leu Ala Gly Arg Thr Val Val Pro

85 90 95Val Ser Thr Leu Ser Gly Pro Glu Leu Ala Leu Gln Lys Leu Gly Lys

100 105 110Thr Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Thr Ser Ser Thr Leu Thr Arg Asp

115 120 125Phe Ile Glu Ile Gly Arg Asp Ala Gly Leu Trp Gly Arg Arg Ser Arg

130 135 140Leu Arg Leu Ser Gly Lys Pro Leu Leu Leu Thr Glu Leu Phe Leu Pro145 150 155 160Ala Ser Pro Leu Tyr

165<210>5<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>5ctactcactt agatctccat ggcttcctct gtcatttct 39<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>6catcttactc atatgccaca cctgcatgca gc 32<210>7<211>684<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成CPL<400>7atggcttcct ctgtcatttc ttcagcagct gttgccacac gcagcaatgt tacacaagct 60agcatggttg cacctttcac tggtctcaaa tcttcagcca ctttccctgt tacaaagaag 120caaaaccttg acatcacttc cattgctagc aatggtggaa gagttagctg catgcaggtg 180tggcatatgt cacaccccgc gttaacgcaa ctgcgtgcgc tgcgctattg taaagagatc 240cctgccctgg atccgcaact gctcgactgg ctgttgctgg aggattccat gacaaaacgt 300tttgaacagc agggaaaaac ggtaagcgtg acgatgatcc gcgaagggtt tgtcgagcag 360aatgaaatcc ccgaagaact gccgctgctg ccgaaagagt ctcgttactg gttacgtgaa 420attttgttat gtgccgatgg tgaaccgtgg cttgccggtc gtaccgtcgt tcctgtgtca 480acgttaagcg ggccggagct ggcgttacaa aaattgggta aaacgccgtt aggacgctat 540ctgttcacat catcgacatt aacccgggac tttattgaga taggccgtga tgccgggctg 600tgggggcgac gttcccgcct gcgattaagc ggtaaaccgc tgttgctaac agaactgttt 660ttaccggcgt caccgttgta ctaa 684<210>8<211>227<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成CPL<400>8Met ala Ser Ser Val Ile Ser Ser Ala Ala Val Ala Thr Arg Ser Asn1 5 10 15Val Thr Gln Ala Ser Met Val Ala Pro Phe Thr Gly Leu Lys Ser Ser

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20 25 30Trp Leu Leu Leu Glu Asp Ser Met Thr Lys Arg Phe Glu Gln Gln Gly

35 40 45Lys Thr Val Ser Val Thr Met Ile Arg Glu Gly Phe Val Glu Gln Asn

50 55 60Glu Ile Pro Glu Glu Leu Pro Leu Leu Pro Lys Glu Ser Arg Tyr Trp65 70 75 80Leu Arg Glu Ile Leu Leu Cys Ala Asp Gly Glu Pro Trp Leu Ala Gly

85 90 95Arg Thr Val Val Pro Val Ser Thr Leu Ser Gly Pro Glu Leu Ala Leu

100 105 110Gln Lys Leu Gly Lys Thr Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Thr Ser Ser

115 120 125Thr Leu Thr Arg Asp Phe Ile Glu Ile Gly Arg Asp Ala Gly Leu Trp

130 135 140Gly Arg Arg Ser Arg Leu Arg Leu Ser Gly Lys Pro Leu Leu Leu Thr145 150 155 160Glu Leu Phe Leu Pro Ala Ser Pro Leu Tyr

165 170

Claims

1.一种在绿色植物中生产对羟基苯甲酸的方法，所述方法包括：

P-T-C-D-CPL

其中：

P为适合于驱动分支酸丙酮酸裂合酶基因表达的启动子；

C为编码Rubisco叶绿体转运肽切割位点的核酸分子；

2.一种权利要求1的方法，其中所述Rubisco转运肽来源于选自以下的植物：大豆、油菜、向日葵、棉花、玉米、烟草、苜蓿、小麦、大麦、燕麦、高粱、水稻、拟南芥属(Arabidopsis)、甜菜、甘蔗、canola、小米、菜豆、豌豆、黑麦、亚麻和禾本科牧草。

3.一种权利要求1的方法，其中所述启动子选自：35S启动子、胭脂碱合酶启动子、章鱼碱合酶启动子、花椰菜花叶病毒启动子、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶启动子和叶绿素a/b结合蛋白的启动子。

4.一种权利要求1的方法，其中所述分支酸丙酮酸裂合酶由SEQID NO：3中所示核酸序列编码。

5.一种权利要求1的方法，其中所述包含与所述成熟分支酸丙酮酸裂合酶蛋白的N末端融合的叶绿体靶向序列的嵌合蛋白，具有SEQ ID NO：8中所示的氧基酸序列。

6.一种权利要求5的方法，其中将所述包含与所述成熟分支酸丙酮酸裂合酶蛋白的N末端融合的叶绿体靶向序列的嵌合蛋白，加工为SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列。

7.一种权利要求1的方法，其中所述pHBA葡糖苷按植物生物量的干重计以至少2％的对羟基苯甲酸葡糖苷的浓度产生。

8.一种权利要求1的方法，其中所述对羟基苯甲酸葡糖苷按植物生物量的干重计以至少10％的对羟基苯甲酸葡糖苷的浓度产生。

9.一种权利要求1的方法，其中所述含有分支酸丙酮酸裂合酶表达盒的绿色植物选自：大豆、油菜、向日葵、棉花、玉米、烟草、苜蓿、小麦、大麦、燕麦、高粱、水稻、拟南芥属、甜菜、甘蔗、canola、小米、菜豆、豌豆、黑麦、亚麻和禾本科牧草。

10.一种权利要求1的方法，其中所述对羟基苯甲酸按植物生物量的干重计以高于4.5％pHBA的浓度产生。

11.一种分支酸丙酮酸裂合酶表达盒，所述表达盒包含一种嵌合基因，所述嵌合基因具有与编码具有SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的分支酸丙酮酸裂合酶的核酸分子有效连接的、编码具有SEQ IDNO：15中所示氨基酸序列的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基叶绿体靶向序列的核酸分子。

12.一种权利要求11的分支酸丙酮酸裂合酶表达盒，其中所述嵌合基因编码SEQ ID NO：8中所示的多肽。

13.一种包含权利要求11的CPL表达盒的植物。

14.权利要求13的植物，所述植物选自：大豆、油菜、向日葵、棉花、玉米、烟草、苜蓿、小麦、大麦、燕麦、高粱、水稻、拟南芥属、甜菜、甘蔗、canola、小米、菜豆、豌豆、黑麦、亚麻和禾本科牧草。

15.一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含与具有SEQ ID NO：8中所示氨基酸序列的成熟分支酸丙酮酸裂合酶蛋白N末端融合的叶绿体靶向序列。

16.一种分离的核酸片段，所述核酸片段编码一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含与具有SEQ ID NO：15中所示氨基酸序列的成熟CPL蛋白的N末端融合的叶绿体靶向序列。

17.一种权利要求16的分离核酸片段，所述核酸片段具有SEQ IDNO：7中所示的序列。

18.权利要求15的叶绿体切割产物，所述切割产物具有SEQ IDNO：16中所示的氨基酸序列。

19.一种核酸片段，所述核酸片段编码权利要求18的经加工的蛋白质。