JP2004511224A - 緑色植物中でのパラヒドロキシ安息香酸の高レベル生産 - Google Patents

Abstract

本発明は、ユニークな発現カセットを用いた緑色植物中でのｐＨＢＡの高レベル生産に関する。このカセットは高等植物中でタンパク質発現を促進できる、適したプロモーターに作動可能に結合したコリスメートピルベートリアーゼ（ＣＰＬ）コード配列を含む。さらにこのＣＰＬカセットは葉緑体トランジットペプチド、その天然の開裂部位、およびＣＰＬのＮ−末端に融合するトランジットペプチドドナータンパク質の小部分をコードする配列を含む。葉緑体標的配列はこの外来タンパク質を葉緑体コンパートメントへと向かわせ、この細胞器官内への取り込みを助ける。開裂部位はトランジットペプチドに対してユニークなもので、カセットによりコードされたキメラタンパク質のこの部位での開裂により、成熟ＣＰＬ酵素とトランジットペプチドドナーの小部分とを含み、完全な酵素活性を有する新規のポリペプチドが遊離する。

Description

【０００１】
本発明は、２０００年６月２日に出願した米国仮出願第６０／２０９，８５４号の恩恵を請求する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は植物遺伝子の発現および分子生物学ならびに微生物学分野に関する。さらに詳しくは、特定の葉緑体標的配列へと作動可能に結合されているコリスメートピルベートリアーゼコード遺伝子を含有するユニークな発現カセットを発現させることに基づいて、緑色植物中でｐ−ヒドロキシ安息香酸（ｐＨＢＡ）を生産する方法を提示するものである。
【０００３】
（発明の背景）
ｐ−ヒドロキシ安息香酸（ｐＨＢＡ）は液晶ポリマー（ＬＣＰ）であるＺｅｎｉｔｅ（商標）の主たるモノマー成分（６５重量パーセント弱）である。ＬＣＰは高い強度／剛性、低溶融粘度、優れた環境耐性、高温での物性維持、そして低ガス透過性など、従来の樹脂とくらべて優れた性質を有する。しかし、現在のｐＨＢＡ合成方法（Ｋｏｌｂｅ−Ｓｃｈｍｉｔｔ反応（Ｋｏｌｂｅ　ａｎｄ　Ｌａｕｔｅｍａｎｎ、Ａｎｎ．１１３：１２５（１８６９））は極めて高コストのため、液晶モノマーを得る低コストのルートが見つかれば自動車や電気業界をはじめとし、その他の産業においても多数の新規用途が見出されることであろう。生物による生産はｐＨＢＡをより安価に生産する一つの可能性を提示するものである。
【０００４】
ｐＨＢＡは微生物系で生産されている。例えば日本国特許第０６０７８７８０号は安息香酸をｐＨＢＡへと酸化する微生物（好ましくはアスペルギルス属）の存在下で安息香酸を培養することによってｐＨＢＡを生産する方法を教示している。さらに、ｐ−クレゾールをｐＨＢＡへと変換する能力を有するエンテロバクター属の株が土壌から分離されている（日本国特許第０５３２８９８１号）。また日本国特許第０５３３６９８０号と日本国特許第０５３３６９７９号はｐ−クレゾールからｐＨＢＡを産生する能力を有するシュードモナス‐プチダ株の分離を開示している。同様に共同で所有しているＷＯ９８５６９２０号ではパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素（ｐＨＢＨ）を発現する能力を欠いた、シュードモナス‐メンドシナの突然変異体を用いてトルエンからｐＨＢＡを生産する方法が教示されている。最後に米国特許第６０３０８１９号は、コリスメートピルベートリアーゼ（ＣＰＬ）遺伝子を発現する遺伝子操作された大腸菌中でのｐＨＢＡの生産方法を教示している。
【０００５】
これらの成功にも関わらず、商業的に有用な量のｐＨＢＡを微生物プラットフォームで生産する能力は有毒な出発物質と限られたバイオマスの使用によって妨げられている。これらの問題を解決するｐＨＢＡ生産方法が必要とされている。
【０００６】
はからずもｐＨＢＡはほとんどすべての植物、動物および微生物中で天然に産出しているのであるが、その量は極めて少量である。多くの細菌中でｐＨＢＡの生成は、フェニルアラニン、チロシン、ｐ−アミノ安息香酸、およびユビキノンを初めとする多数の芳香族化合物の合成において重要な分岐点中間体である、コリスメート経由で行われている。大腸菌においてコリスメート自身は５つの異なる酵素反応を経て５つの異なる生成物を生じるが、ｐＨＢＡの合成を最終的に行う酵素がＣＰＬと呼ばれる、コリスメートピルベートリアーゼである。後者は大腸菌ｕｂｉＣ遺伝子の生成物であり、これは二つの異なるグループにより独立してクローン化された（Ｓｉｅｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ３０７：３４７−３５０（１９９２）；Ｎｉｃｈｌｏｌｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１７４：５３０９−５３１６（１９９２））。この酵素は１９キロダルトンの単量体タンパク質で、補助因子やエネルギー要求量などは知られていない。その唯一の基質から、Ｃ_３エノールピルビル側鎖を除去することにより、ＣＰＬはコリスメート１モルから１モルのピルベートと１モルのｐＨＢＡへの直接変換を触媒する。組み換えＣＰＬは大腸菌において過度に発現され、精製により均一にされ、その一部は生化学的また動態的に特性付けが行われている（Ｓｉｅｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１４０：８９７−９０４；Ｎｉｃｈｌｏｌｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１７４：５３０９−５３１６（１９９２））。さらにＣＰＬ酵素反応については詳細なメカニズムが提言されている（Ｗａｌｓｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｈｅｍ　Ｒｅｖ．９０：１１０５−１１２９）。
【０００７】
植物ではｐＨＢＡはニンジンの組織（Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌａｎｔａ、１８８、５９４、（１９９２））ならびに種々の草類および作物（Ｌｙｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．，３６、８１３、（１９８８）、およびポピュラーな木々（Ｔｅｒａｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１４、１９９１、（１９７２）；さらに多数のその他の植物の組織（Ｂｉｌｌｅｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｏｅｓｔｅｒｒ．Ｃｈｅｎｕ．，６７、４０１、（１９６６）中で見い出されている。植物にはｐＨＢＡを合成するのに必要なすべての酵素機構が含有されているため、植物がこのモノマーを製造するのに有用なプラットフォームとなりうることが示唆される。例えば、植物プラットフォームは回復可能な資源であり、石油化学的あるいは微生物的方法のいずれよりも物質およびエネルギー消費が遥かに少なくなるであろう。同様に、植物プラットフォームはモノマーの生産にとって微生物系よりもはるかに多量に入手できるバイオマスを意味する。最後にｐＨＢＡが植物中に天然に存在することからこの化合物の過剰生産の結果としての宿主に対する有害性が問題とならないであろうことが示唆される。だが、ｐＨＢＡ生産手段として植物を使用するこれらの明らかな利点にも関わらず、同モノマーの高レベル生産はこれまでわかっていなかった。
【０００８】
乗り越えなくてはならない一つの壁は、植物組織中のコリスメートの生体内運命にある。実際高等植物はＣＰＬと機能的に同義である酵素を持たないため、コリスメートからのｐＨＢＡの生産は微生物においてよりもはるかにより複雑なのである。例えば、Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ　ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎにおいてｐＨＢＡにいたる生合成経路は１０個以下の連続した反応からなり（Ｌｏｓｃｈｅｒ　ａｎｄ　Ｈｅｉｄｅ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６：２７１−２７９（１９９２））、おそらくすべて異なる酵素が触媒していると考えられている。さらにこれらの反応を触媒する酵素のほとんどは今だ同定されておらず、その遺伝子もまだクローン化されていない。他の植物種におけるｐＨＢＡの合成に関しては入手可能な情報はさらに少ない。問題をさらに複雑にしているのは、これら植物中でｐＨＢＡ生産に関与しているということが知られている酵素が異なる細胞コンパートメントに位置し、調節も異なる二つの異なる経路にわたっているということである。したがってコリスメートは、葉緑体およびその他のプラスチド類に主に限定されているシキメート経路の中間体であるが（Ｓｉｅｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８１１−８１９（１９９６））　Ｓｏｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９（１１）：１２４０−１２４４（１９９８））、一方フェニルアラニンより下流のすべての中間体は細胞質ゾルと小胞体の両方で行われるフェニルプロパノイド経路に属しているのである。
【０００９】
通常植物がｐＨＢＡをどのように合成しているのかについて、またこのプロセスに関与している酵素については理解できていないものの、野生型の植物よりも有意に高いレベルでｐＨＢＡを蓄積する形質転換植物体については記載されている。例えばＫａｚｕｆｕｍｉ　Ｙａｚａｋｉ（Ｂａｉｏｓａｉｅｎｓｕ　ｔｏ　Ｉｎｄａｓｕｔｏｒｉ（１９９８）、５６（９）、６２１−６２２）は虫抵抗性を与えるに十分な量でｐＨＢＡを産生するためにＣＰＬコード遺伝子をタバコに導入することについて述べている。同様に、Ｓｉｅｂｅｒｔら（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８１１−８１９（１９９６））は構成的に発現させた葉緑体標的バージョンの大腸菌ＣＰＬ（「ＴＰ−ＵｂｉＣ」と呼ぶ）で形質転換したタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）がｐＨＢＡのレベルを野生型植物の少なくとも１０００倍の大きさに引き上げたことを示した（ＷＯ９６／００７８８、ＤＥ４４２３０２２として特許付与されている）。興味深いことに、この遺伝子修飾したタバコ植物には遊離ｐＨＢＡはごくわずかにしか含まれていなかった。その代わり、実質的にすべてのこの化合物（９８％弱）が二つのグルコース付加体、フェノールグルコシドとエステルグルコシド、に転換され、これらは約３：１で存在していた（Ｓｉｅｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８１１−８１９（１９９６）；Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　３８（７）：８４４−８５０（１９９７））。これらのグルコース付加体はともに単一のグルコース残基がｐＨＢＡのヒドロキシルまたはカルボキシル基と共有結合で結合している１−β−Ｄ−グルコシドであった。この研究で明らかにされた最良の遺伝子導入植物では、葉の組織を分析したところ全ｐＨＢＡグルコシド含量が乾燥重量の０．５２％弱であった。結合したグルコース残基分の補正を行うと、実際に遺伝子導入タバコ植物で生産されたｐＨＢＡの量はこの値の約半分に過ぎなかった。
【００１０】
さらに近年の研究では同じ人工融合タンパク質が構成的プロモーター（Ｓｏｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９（１１）：１２４０−１２４４（１９９８））と誘導可能なプロモーター（Ｓｏｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ１７：８９１−８９６（１９９８））の両方を用いて形質転換したタバコ細胞培養物中で発現されている。ｐＨＢＡグルコシドの蓄積は全植物体での当初の研究よりもやや高いものの、どちらの場合でもそのレベルは乾燥重量の０．７％を超えなかった。対照的にＬｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ　ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎの毛状根培養物のＴＰ−ＵｂｉＣを調べると、形質転換していない対照培養物中の固有レベルを補正した後のｐＨＢＡグルコシド含量は乾燥重量の０．８％にも達した。
【００１１】
これらの研究により高等植物中のｐＨＢＡのレベルを引き上げるために遺伝子工学を使用できることが示されたものの、上述のＴＰ−ＵｂｉＣ人工融合タンパク質は商業的に有用な量でこの化合物を生成することが不可能である。このような努力には栽培学的に適した植物のｐＨＢＡ含量を、先の報告の１０から２０倍に引き上げることが必要となるであろう。したがってこのようなレベルを達成するには、現在のシステムにおいて一つまたはそれ以上の修正が必要である。ＣＰＬの基質であるコリスメートがプラスチド中で合成されるため、改良の可能性のある領域として一つには問題の細胞コンパートメント中でより高レベルの酵素活性を得るために、より優れた葉緑体標的配列の設計を行うことがあげられるかもしれない。実際、ＣＰＬ酵素活性とｐＨＢＡグルコシドの蓄積との間には正の相関があることが上記の研究のうちいくつかで明らかになってる（Ｓｉｅｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８１１−８１９（１９９６）；　Ｓｏｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９　（１１）：１２４０−１２４４（１９９８）；Ｓｏｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ１７：８９１−８９６（１９９８））。さらに、これらの研究のどれにおいても系がＴＰ−ＵｂｉＣ人工融合タンパク質を用いたＣＰＬ酵素活性で飽和されていたことを示唆する証拠はない。
【００１２】
ほとんどの天然に産生する葉緑体タンパク質は、核コードされており、トランジットペプチドと呼ばれる開裂可能なＮ末端ポリペプチド延長部を有するかなり大きな分子量の前駆体として合成されていることが周知である。このトランジットペプチドが葉緑体中への転位に必要な情報のすべてを含有していることもまた一般に認められていることである。タンパク質輸入の機構的な詳細はまだはっきり解明されていないが、いくつかの重要な事実が明らかになっている；（ａ）前駆体の取り込みは翻訳後に起こり（Ｃｈｕａ　ａｎｄ　Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．７５：６１１０−６１１４（１９７８）；Ｈｉｇｈｆｉｅｌｄ　ａｎｄ　Ｅｌｌｉｓ、Ｎａｔｕｒｅ２７１：４２０−４２４（１９７８））、そしてこれは葉緑体エンベロープ膜中に存在するタンパク質様受容体により媒介される（Ｃｌｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３６９１−３６９６（１９８５）））；（ｂ）ＡＴＰ−加水分解は転流の唯一の推進力である（Ｇｒｏｓｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２８５：６２５−６２８（１９８０）；Ｃｌｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３６９１−３６９６（１９８５））；（ｃ）トランジットペプチドの異種タンパク質への融合は、いつもではないが、時には生体内でも（Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒｏｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１３：３５８−３６２（１９８５））；Ｓｃｈｒｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．４：２５−３２（１９８５））また生体外でも（Ｗａｓｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０５：４４６−４５３（１９８６））葉緑体内への摂取を誘発するのに十分である；そして最後に（ｄ）葉緑体輸入に続き、トランジットペプチドは前駆体タンパク質からタンパク質分解により除去され「成熟した」ポリペプチドが生じる。何千ものトランジットペプチドの完全な配列が現在知られているものの、最良の標的化と植物の葉緑体コンパートメント中での異種タンパク質の発現を達成するためにこれらの配列を操作するのは依然として試行錯誤の段階である。しかし、トランジットペプチドを異種タンパク質に単に結合するだけでは葉緑体により効率的に摂取され、正しい処理が行われるのを必ずしも保証するとは言えないということは明らかである。同じ標的配列を異なるタンパク質に融合したとしても、その結果は全く予測不能であり（Ｌｕｂｂｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１：１２２３−１２３０（１９８９））、異なるパッセンジャータンパク質が異なる効率で移送される。この理由は明らかではないが、葉緑体摂取とトランジットペプチドの除去とが対になっており、ある種の人工融合タンパク質は処理されないかまたは処理効率が悪いということが示唆されている。例えば、ルビスコ小サブユニット前駆体の天然開裂部位の近くにおける極めて微少な変化でさえも異常処理を引き起こすことがあり（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｅｌｌｉｓ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４２：３４２−３４６（１９８４）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｅｌｌｉｓ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２：６７−７３（１９８５））葉緑体摂取を減少させた（Ｗａｓｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６１７−６１９（１９８８））ことが示されている。
【００１３】
この分野では、トランジットペプチドと開裂部位のみならず、トランジットペプチドドナーの成熟Ｎ−末端を少量葉緑体標的配列に加えることにより、ある程度の改良がなされている。実際このアプローチはもう一つの微生物タンパク質、すなわちネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ−ＩＩ）に対しては生体内および生体外の両方で効果をあげている（（Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒｏｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１３：３５８−３６２（１９８５）；Ｓｃｈｒｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．４：２５−３２（１９８５）；Ｗａｓｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０５：４４６−４５３（１９８６）；Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＰ０１８９７０７；Ｕ．Ｓ．５、７２８、９２５；Ｕ．Ｓ．５、７１７、０８４）。したがって、ルビスコ小サブユニット前駆体のトランジットペプチドとＮＰＴ−ＩＩのＮ−末端へ融合する成熟ルビスコの最初の２２残基とからなるキメラタンパク質はトランジットペプチドと開裂部位のみを含有した同様の構成物より遥かに葉緑体による摂取が良い。しかしこの戦略は絶対確実なものではなく、このパッセンジャータンパク質にとは切っても切れない関係にある高度の予測不能性を伴っている。このことはＣＰＬを葉緑体へ向けようと試みている文献中に容易に見て取ることができる。例えばＳｏｍｍｅｒら（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９（１１）：１２４０−１２４４（１９９８））はトランジットペプチドにそのＮ−末端で融合するＣＰＬ遺伝子生成物とルビスコ小サブユニットの最初の２１アミノ酸残基を含有する類似の人工融合タンパク質（例えば「ＴＰ２１ＵｂｉＣ」）について述べている。この修飾が葉緑体摂取と処理の向上をもたらすものと予想されたが、当初の構成物、ＴＰ−ＵｂｉＣ、を含有していた細胞の方がＣＰＬ酵素活性とｐＨＢＡグルコシドの両方においてより高いレベルを示した。したがってＷａｓｍａｎｎら（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０５：４４６−４５３（１９８６））の教示を適用しても別のタンパク質では逆効果であった。
【００１４】
したがって解決すべき問題は、微生物タンパク質ＣＰＬにより触媒される化学反応を利用した、商業的に有用なレベルでｐＨＢＡを植物中で生産する方法を提供することである。これは上に記載したさまざまな厄介な問題に加えて、文献によれば大腸菌ではある種のＮ−末端修飾により酵素活性が大きく減少することがあることがわかっている（Ｓｉｅｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８１１−８１９（１９９６）ため、とりわけ野心的な目標である。その結果、効率良く葉緑体中へ輸入されるのみならず、タンパク質分解により、未修飾ＣＰＬまたは酵素活性を妨げないＮ−末端延長部を有するＣＰＬ変異株のいずれかを生むような人工融合タンパク質を同定することが重要となる。この問題に対する解決策は当該分野では知られていない。本出願人はこの問題を葉緑体中で十分に高レベルのＣＰｌ酵素活性を発現することができ、商業的に有用なレベルのｐＨＢＡを蓄積することのできる新規人工融合タンパク質を生成することによって解決した。
【００１５】
（発明の概要）
本発明は、緑色植物中でｐＨＢＡを生産する方法であって、
ａ）コリスメートの内在性供給源を有し、および下記の構造を有するコリスメートピルベートリアーゼ発現カセットを含む緑色植物を提供する工程
Ｐ−Ｔ−Ｃ−Ｄ−ＣＰＬ
（式中、
Ｐはコリスメートピルベートリアーゼ遺伝子の発現をドライブするのに適するプロモーターであり、
Ｔはルビスコ葉緑体トランジットペプチドをコードする核酸分子であり、
Ｃはルビスコ葉緑体トランジットペプチド開裂部位をコードする核酸分子であり、
Ｄはルビスコ葉緑体トランジットペプチドドナーポリペプチドのＮ−末端部の約４個から約２０個の連続アミノ酸をコードする核酸分子であり、および
ＣＰＬは成熟コリスメートピルベートリアーゼタンパク質をコードする核酸分子であり、
ここでＰ、Ｔ、Ｃ、ＤおよびＣＰＬはそれぞれ、該カセットの発現によって、成熟コリスメートピルベートリアーゼタンパク質のＮ−末端に融合する葉緑体標的配列を含むキメラタンパク質の翻訳が生じるように、作動可能に結合する。）、
ｂ）前記キメラタンパク質が発現し、葉緑体に転流して、コリスメートがパラヒドロキシ安息香酸グルコシドとパラヒドロキシ安息香酸誘導体へと変換するような条件のもとで前記植物を栽培する工程、
ｃ）パラヒドロキシ安息香酸とパラヒドロキシ安息香酸誘導体を前記植物から回収する工程、ならびに
ｄ）前記パラヒドロキシ安息香酸グルコシドとパラヒドロキシ安息香酸誘導体を処理して遊離パラヒドロキシ安息香酸にする工程
を含む方法を提供する。
【００１６】
特に詳しくは、本発明の方法は植物バイオマスの乾燥重量の２％を超える濃度、好ましくは１０％を超える濃度でパラヒドロキシ安息香酸グルコシドを植物中で生産する。
【００１７】
さらに本発明は、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するコリスメートピルベートリアーゼ酵素をコードする核酸分子に作動可能に結合する、配列番号１５に示すアミノ酸配列を有するリブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット由来葉緑体標的配列をコードする核酸分子を有するキメラ遺伝子を含む、コリスメートピルベートリアーゼ発現カセットを提供する。
【００１８】
本発明は本出願の一部である、下記の詳細な説明と添付の配列説明により、さらに完全に理解されるであろう。
【００１９】
本出願人は３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またアミノ酸配列開示を有する特許出願書類の要件−配列規則」）に適合し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）ならびにＥＰＯとＰＣＴの配列リスト要件（ルール５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）およびセクション２０８と実施細則の付属Ｃ）に準拠した１６の配列を提供した。ヌクレオチドとアミノ酸配列データに使用した記号と形式は３７Ｃ．Ｆ．Ｒ§１．８２２に記載のものに従っている。
【００２０】
配列番号１はＧｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｍ９６２６８を有する大腸菌ＣＰＬを大腸菌発現ベクター、ｐＥＴ−２４ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入するのに有用な５’プライマーである。
【００２１】
配列番号２はＧｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｍ９６２６８を有する大腸菌ＣＰＬを大腸菌発現ベクター、ｐＥＴ−２４ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入するのに有用な３’−プライマーである。
【００２２】
配列番号３は大腸菌発現ベクター、ｐＥＴ−２４ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）中のＧｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｍ９６２６８を有する大腸菌ＣＰＬのＯＲＦのヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号４は大腸菌発現ベクター、ｐＥＴ−２４ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）中のＧｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｍ９６２６８を有する大腸菌ＣＰＬのＯＲＦの一次アミノ酸配列である。
【００２４】
配列番号５は大腸菌中でＴＰ−ＣＰＬを発現するためのトマトルビスコ小サブユニット前駆体の葉緑体標的配列の増幅に有用な５’プライマーである。
【００２５】
配列番号６は大腸菌中でＴＰ−ＣＰＬを発現するためのトマトルビスコ小サブユニット前駆体の葉緑体標的配列の増幅に有用な３’プライマーである。
【００２６】
配列番号７は大腸菌発現ベクター、ｐＥＴ−２４ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）中の葉緑体標的ＣＰＬ融合タンパク質（ＴＰ−ＣＰＬ）のＯＲＦのヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号８は大腸菌発現ベクター、ｐＥＴ−２４ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）中の葉緑体標的ＣＰＬ融合タンパク質（ＴＰ−ＣＰＬ）のＯＲＦの一次アミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号９はＴＰ−ＣＰＬの予測された葉緑体開裂生成物（ΔＴＰ−ＣＰＬ）の増幅と大腸菌発現ベクター、ｐＥＴ−２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）中へのその挿入に有用な５’プライマーである。
【００２９】
配列番号１０はＴＰ−ＣＰＬの予測された葉緑体開裂生成物（ΔＴＰ−ＣＰＬ）の増幅と大腸菌発現ベクター、ｐＥＴ−２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）中へのその挿入に有用な３’プライマーである。
【００３０】
配列番号１１はインビトロ転写／翻訳ベクター、ｐＣＩＴＥ４ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）への挿入のためにＴＰ−ＣＰＬを一次アミノ酸配列を変更せずに増幅、修飾するのに有用な５’プライマーである。
【００３１】
配列番号１２はインビトロ転写／翻訳ベクター、ｐＣＩＴＥ４ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）への挿入のためにＴＰ−ＣＰＬを一次アミノ酸配列を変更せずに増幅、修飾するのに有用な３’プライマーである。
【００３２】
配列番号１３はプラスミドｐＭＨ４０をテンプレートとして使用して３’ＮＯＳターミネーター配列の切り詰められたバージョンを増幅するのに有用な５’プライマーである。
【００３３】
配列番号１４はプラスミドｐＭＨ４０をテンプレートとして使用して３’ＮＯＳターミネーター配列の切り詰められたバージョンを増幅するのに有用な３’プライマーである。
【００３４】
配列番号１５はトマトリブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット由来の葉緑体標的配列である。
【００３５】
配列番号１６は処理された葉緑体標的化ＣＰＬ融合タンパク質（ＴＰ−ＣＰＬ）である。
【００３６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、緑色植物中において商業的に有用なレベルで、パラヒドロキシ安息香酸（ｐＨＢＡ）を高レベルの生産のための方法を提供する。ｐＨＢＡは自動車、電気および他の産業で用いられている液晶ポリマーにおいてモノマーとして有用である。
【００３７】
本方法は、１モルのコリスメートからの１モルのピルベートと１モルのｐＨＢＡへの直接変換を触媒する酵素であるコリスメートピルベートリアーゼ（ＣＰＬ）を修飾したバージョンをコードする遺伝子の効率の良い発現に基づくものである。ＣＰＬ変異株は植物中でタンパク質の発現をドライブする能力のある、適したプロモーターに作動可能に結合されたＣＰＬコード配列を含む、発現カセットの形で緑色植物へと導入される。さらに、この発現カセットはＣＰＬコード配列のすぐ上流に隣接する位置に、葉緑体トランジットペプチド、その天然開裂部位、およびトランジットペプチドドナーポリペプチドの小部分をコードするＤＮＡ断片を含有している。このトランジットペプチドは発現カセットによりコードされているキメラタンパク質を葉緑体に対して向かわせ、ＣＰＬの基質でありｐＨＢＡへと転換されるコリスメートの合成を行っているこの細胞器官内へ摂取させるように作用する。開裂部位はもとのトランジットペプチドドナーにユニークなもので、このカセットによりコードされた人工タンパク質のこの部位での開裂によりトランジットペプチドドナーの小部分をそのＮ−末端に含有する成熟ＣＰＬ酵素を含む新規のポリペプチドが遊離する。
【００３８】
この開示において、多数の用語と略語が用いられている。下記の定義を提供する。
【００３９】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記する。
【００４０】
「コリスメートピルベートリアーゼ」はＣＰＬと略記し、これはコリスメートからのピルベートおよびｐＨＢＡへの変換を触媒する酵素をコードする遺伝子を指す。
【００４１】
「パラヒドロキシ安息香酸」または「Ｐ−ヒドロキシ安息香酸」はｐＨＢＡと略記する。
【００４２】
「Ｐ−ヒドロキシ安息香酸グルコシド」または「ｐＨＢＡグルコシド」はｐＨＢＡとグルコース分子を含む付加体を指す。
【００４３】
「ｐＨＢＡ誘導体」はｐＨＢＡの付加体であって、ＣＰＬ酵素の触媒活性の結果として植物中に生成されるものを指す。
【００４４】
「トランジットペプチド」または「葉緑体トランジットペプチド」は「ＴＰ」と略記され、葉緑体前駆体タンパク質のＮ−末端部分を指し、葉緑体前駆体タンパク質を葉緑体へと誘導し、そののち葉緑体処理プロテアーゼによって分割されるものを指す。
【００４５】
「葉緑体標的配列」とは葉緑体への転流のために異種タンパク質のＮ−末端に結合しているポリペプチド延長部を指す。天然に産出する葉緑体前駆体タンパク質の場合、最適摂取とタンパク質分解処理は部分的には「成熟」葉緑体タンパク質に依存しているかもしれないが、このトランジットペプチドが葉緑体標的配列であると考えられている。
【００４６】
「トランジットペプチドドナー配列」とは葉緑体前駆体タンパク質の「成熟」部分から派生する葉緑体標的配列の部分を指す。トランジットペプチドドナー配列は、常にトランジットペプチド開裂部位のすぐ下流の隣接する位置にあるが、この部位でトランジットペプチドは成熟葉緑体タンパク質から分離される。
【００４７】
「葉緑体処理プロテアーゼ」とはトランジットペプチドと成熟葉緑体タンパク質間の開裂部位を分割することのできるプロテアーゼ酵素を指す。
【００４８】
「トランジットペプチド開裂部位」とは葉緑体処理プロテアーゼが作用する葉緑体標的配列中の２つのアミノ酸間の部位を指す。
【００４９】
ここで用いる「分離された核酸断片」とは一本鎖または二本鎖の、合成された、非天然のまたは改造されたヌクレオチド塩基を含有していてもよい、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指す。ＤＮＡのポリマーの形で分離された核酸部分は一つ以上のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡからなっていてもよい。
【００５０】
「遺伝子」とは特定のタンパク質を発現する核酸断片を指すが、コード配列に先立つ調節配列（５’非コード配列）とコード配列後の調節配列（３’非コード配列）も含有する。「天然遺伝子」とは自身の調節配列と共に天然に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは天然には一緒に見られない調節配列とコード配列とを含有する天然遺伝子ではない遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は異なるソースから得られる調節配列とコード配列を含むもの、または同じソースから得られる調節配列とコード配列ではあるが天然に見られるものとは異なる配置であるものである。「内在的遺伝子」とは生体のゲノム中で天然の位置にある天然遺伝子をさす。「外来性遺伝子」とは宿主生物中に通常は見られず、遺伝子移入により宿主生物中に導入されたものを指す。外来性遺伝子には天然遺伝子を本来の生体ではない生体中に挿入したもの、またはキメラ遺伝子が含まれる。「導入遺伝子」とは形質転換操作によってゲノムに導入された遺伝子である。
【００５１】
「合成遺伝子」は当業者に知られた手順によって化学的に合成されたオリゴヌクレオチド形成ブロックから組み立てることができる。これらの形成ブロックは連結とアニーリングにより遺伝子セグメントを形成し、これらが酵素により組み立てられて完全な遺伝子を構築する。「化学的に合成された」とは、ＤＮＡの配列に関連し、成分ヌクレオチドが生体外で組み立てられたことを意味する。ＤＮＡの手作業による化学的合成はすでにしっかりと確立された手順を用いて行うことができ、または多数の市販の装置の一つを用いて自動化された化学合成を行うこともできる。したがって、宿主細胞のコドンバイアスを反映するようにヌクレオチド配列の最適化に基づいた最適遺伝子発現のために遺伝子を調整することができる。当業者には、コドンの使用が宿主に好まれるコドンに偏っていれば遺伝子発現の成功確率が高まることがおわかりになるであろう。好ましいコドンの判断は配列情報の入手可能な宿主細胞から得られる遺伝子の調査に基づいて行われる。
【００５２】
「コード配列」とは特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適した調節配列」とはコード配列の上流（５’非コード配列）、その中、または下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の翻訳、転写、ＲＮＡプロセシングや安定性に影響をおよぼす配列である。調節配列にはプロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造が含まれる。
【００５３】
「プロモーター」とはコード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節することのできるヌクレオチド配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列に対し３’の位置にある。プロモーター配列は近位とより遠位の上流にある要素からなっており、後者はしばしばエンハンサーと呼ばれる。したがって「エンハンサー」とはプロモーター活性を刺激することができるヌクレオチド配列であり、プロモーター内生の要素であってよく、あるいはプロモーターの組織特異性やレベルを強化するために挿入された異種の要素であってもよい。プロモーターは天然遺伝子からその全体を得たものであってもよく、または天然に産出する異なるプロモーターから得られた異なる要素からなっていてもよく、あるいは合成ヌクレオチドセグメントからなるものであってもよい。当業者には異なるプロモーターは異なる組織または細胞系において、または発達の異なる段階で、または異なる環境的条件に応答して、遺伝子の発現を誘導できることが理解できるであろう。ほとんどの時期において、ほとんどの細胞系の中で核酸断片を発現させるプロモーターを通常「構成的プロモーター」と呼ぶ。植物細胞中で様々な型の新規のプロモーターが常に発見されている；多数の例をＯｋａｍｕｒｏとＧｏｌｄｂｅｒｇの編纂による（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ　１５：１−８２に見ることができる。さらにほとんどの場合において、調節配列の厳密な境界が完全に定義されてないので、異なる長さの核酸断片が全く同一のプロモーター活性を有することもあることを認識することが必要である。
【００５４】
「３’非コード配列」とは、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響をおよぼしうる調節信号をコードするその他の配列を含有する。このポリアデニル化信号は通常ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸鎖付加に影響を与えることによって特徴付けられる。
【００５５】
「作動可能に結合されている」という用語は単一の核酸断片上で核酸配列が、一方の機能が他方によって影響を受けるように会合していることを指す。例えばプロモーターがコード配列の発現に影響をおよぼすことができるとき（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節を受けているとき）、プロモーターは作動可能にコード配列に結合している。コード配列はセンスあるいはアンチセンスのオリエンテーションにおいて調節配列に作動可能に結合させることができる。
【００５６】
「発現」という用語はここでは本発明の核酸断片から得られたセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はｍＲＮＡのポリペプチド内ヘの翻訳を指すこともできる。
【００５７】
「成熟した」タンパク質とは、翻訳後、プロセッシングが行われたポリペプチドを指す。すなわち初期の翻訳生成物中に存在するプレ−およびプロペプチドが除かれたものである。「前駆体」タンパク質とはｍＲＮＡの初期の翻訳生成物を指し、すなわちプレ−およびプロペプチドがまだ存在している。プレ−およびプロペプチドは細胞内局在化シグナルであってもよいが、これに限定されるわけではない。
【００５８】
「形質転換」とは核酸断片を宿主生体のゲノム内へ移入し、その結果遺伝的に安定な遺伝形質が得られることを指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生体は「遺伝子導入」、「組み換え」または「形質転換」生物と呼ばれる。
【００５９】
「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」という用語はしばしば遺伝子を有する染色体外遺伝要素であって、細胞の中心的物質代謝の一部ではなく、通常環状の二重らせんＤＮＡ分子の形で存在するものを指す。このような要素は自律複製する配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、直線状または環状のあるいは、一本鎖、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、どのような供給源から得たものであってもよく、適切な３’非翻訳配列にそって、選択された遺伝子生成物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞中へ導入することのできる、多数のヌクレオチド配列が一つのユニークな構成体にまとめられ、あるいは再び結合されたものである。「形質転換カセット」とは異種遺伝子を含有し、異種遺伝子に加えてある特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」とは異種遺伝子を含有し、異種遺伝子に加えて、異種宿主中でこの遺伝子の強化発現を行わせる要素を有する特定のベクターを指す。
【００６０】
ここで用いた標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は当該分野では良く知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．，による記載がＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）（以降「Ｍａｎｉａｔｉｓ」と呼ぶ）にあり；またＳｉｌｈａｖｙ　Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ、Ｍ．　Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ、Ｌ．Ｗ．による記載が、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　Ｇｅｎｅ　Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｌｄ　Ｐｒｅｓｓ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ（１９８４）にあり；さらにＡｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．らによる記載がＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　（Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）出版）にある。
【００６１】
ＣＰＬ発現カセット
本発明は完全な活性を持ち、修飾されたバージョンのコリスメートピルベートリアーゼ（ＣＰＬ）の発現およびこのポリペプチドを宿主植物の葉緑体へと向かわせるのに有用な発現カセットを提供する。通常この発現カセットは（１）５’と３’調節配列の転写調節下にあるクローン化したＣＰＬ遺伝子と（２）優性選択マーカーとを含有するであろう。本発明の発現カセットはまたプロモーター調節領域（例えば誘導可能なまたは構成的な、環境的にあるいは発達的に調節された、または細胞、あるいは組織特異性／選択的発現を行わせるもの）、転写開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセッシングシグナル、転写終了部位、および／またはポリアデニル化シグナルを含有してもよい。好ましい実施態様において、本発明のカセットはさらにトランジットペプチドをコードする配列ならびに宿主植物細胞葉緑体プロセッシングプロテアーゼの作用を受ける、トランジットペプチド開裂部位を含む、トランジットペプチドドナーの一部をコードする配列と、トランジットペプチドをコードする配列をも含有する。本カセットはまたＣＰＬ発現を促進するため、一つ以上のイントロンを含有してもよい。
【００６２】
ＣＰＬ遺伝子はコリスメート１モルをピルベート１モルとｐＨＢＡ１モルに変換する酵素をコードする。もっともよく特徴付けがなされているＣＰＬ遺伝子は大腸菌から分離されたＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号Ｍ９６２６８のものである。
【００６３】
本ＣＰＬ遺伝子を駆動するのに有用なプロモーターは数多く、当該分野でよく知られている。プロモーターとしては、植物中で作用し、かつ一般にＣＰＬ発現カセットが存在する植物宿主から得られるものが適している。ＣＰＬ遺伝子の発現を誘導することのできるプロモーターとターミネータの組み合わせであればいかなる組み合わせも本カセットで使用することができる。いくつかの適したプロモーターとターミネータの組み合わせとしては、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）およびカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）遺伝子があげられる。使用することのできる効率のよい植物プロモーターの一つの型は高レベル植物プロモーターである。本発明の遺伝子配列と作動可能に結合させたこのようなプロモーターは本遺伝子生成物の発現を促進することができるはずである。本発明で使用することのできる、高レベル植物プロモーターには例えばダイズ由来のリブロース−１、５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓ）のプロモーター（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ａｐｐ．Ｇｅｎ．，１：４８３−４９８　１９８２））、およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターがある。これらの二つのプロモーターは植物細胞中で光誘導されることがわかっている（例えばＧｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ、ａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、　Ａ．Ｃａｓｈｍｏｒｅ、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８３）、ｐａｇｅｓ２９−３８；Ｃｏｒｕｚｚｉ、Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５８：１３９９（１９８３）、およびＤｕｎｓｍｕｉｒ、Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２：２８５（１９８３）参照のこと）。
【００６４】
ポリペプチド発現が求められる本発明の場合、一般にＣＰＬコード領域の３’−末端にポリアデニル化領域を含有することが望ましい。ポリアデニル化領域はさまざまな植物遺伝子あるいはＴ−ＤＮＡから得ることができる。添付する３’末端配列は例えばノパリンシンターゼあるいはオクトピンシンターゼ遺伝子から得ることができ、あるいは別法として別の植物遺伝子から、または好ましさの度合いは下がるがその他の真核生物の遺伝子から得ることもできる。
【００６５】
５’非翻訳領域、または部分コード配列のコード配列にイントロン配列を添付し、細胞質ゾル中に蓄積する成熟メッセージの量を増加させることができる。スプライス可能なイントロンを植物および動物発現構成体の転写ユニット中に含有させることにより、ｍＲＮＡとタンパク質レベルでの遺伝子発現が１０００倍にまで引き上げられることが示されている。Ｂｕｃｈｍａｎ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．８：４３９５−４４０５（１９８８）；Ｃａｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．１：１１８３−１２００（１９８７）。このような遺伝子発現のイントロンによる増大は転写ユニットの５’末端の近くに置かれた時に通常最大となる。トウモロコシイントロンＡｄｈｌ−Ｓイントロン１、２、および６、Ｂｒｏｎｚｅ−１イントロンが当該分野で知られている。一般にはＴｈｅ　Ｍａｉｚｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｃｈａｐｔｅｒ１１６、Ｆｒｅｅｉｎｇ　ａｎｄ　Ｗａｌｂｏｔ、Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照のこと。
【００６６】
好ましい実施態様においてＣＰＬタンパク質を葉緑体およびその他のプラスチドへと導くことは有用であろう。典型的にはこれは発現されたタンパク質をプラスチド向かわせ、その細胞器官中への転流を促進する、葉緑体トランジットペプチドの導入によって実施される。多数の葉緑体トランジットペプチドが知られており、本発明の発現カセット中で作動可能である。例をあげるとこれに限るわけではないがＰｉｓｕｍ（Ｅｓｕｔｏｒｅｒａ　ｅｔ　ａｌ．，ＪＰ１９８６２２４９９０；Ｅ００９７７）、ニンジン（Ｌｕｏ　ｅｔ　ａｌ、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，３３（４）、７０９−７２２（１９９７；Ｚ３３３８３）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ（Ｂｏｗｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　ＥＰ０３５９６１７；Ａ０９０２９）、Ｏｒｙｚａ（ｄｅ　Ｐａｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５（３）、３９９−４０６（１９９０）；Ｘ５１９１１、およびＨｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＰ０１８９７０７；Ｕ．　Ｓ．５、７２８、９２５；Ｕ．Ｓ．５、７１７、０８４（Ａ１０３９６およびＡ１０３９８）に記載されているような合成配列などがある。本発明においては、いずれの植物から分離されたものでもよいが、リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ（ルビスコ）小サブユニット前駆体タンパク質の葉緑体トランジットペプチドが好ましい。このルビスコ小サブユニットは様々な植物から得たものが十分に特徴付けされており、これらのトランジットペプチドはいずれも本発明での使用に適しているであろう。例えばＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ（Ｑｕａｔｒａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，ＡＷ５９９７３８）；Ｌｏｔｕｓ（Ｐｏｕｌｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，ＡＷ４２８７６０）；Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ（Ｊ．Ｓ．Ｓｈｉｎ、ＡＩ５６３２４０）；Ｎｉｃｏｔｉａｎａ（Ａｐｐｌｅｂｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｈｅｒｅｄｉｔｙ（１９９７）、７９（６）、５５７−５６３）；アルファルファ（Ｋｈｏｕｄｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９９７）、１９７（１／２）、３４３−３５１）；ジャガイモおよびトマト（Ｆｒｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９９３）、１３７（２）、２７１−４）；小麦（Ｇａｌｉｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９１）、８１（１）、９８−１０４）；および米（Ｘｉｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．，Ｓｅｒ．Ｂ（Ｅｎｇｌ．Ｅｄ．）　（１９８７）、３０（７）、７０６−１９）を参照のこと。例えばトランジットペプチドはこれに限るわけではないが、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オートムギ、モロコシ、コメ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、テンサイ、サトウキビ、キャノーラ、キビ、マメ、エンドウマメ、ライムギ、アマ、および飼草などの植物から分離したルビスコ小サブユニットから得ることができる。本発明での使用に好ましいのはトマトルビスコ小サブユニット前駆体タンパク質である。
【００６７】
葉緑体標的配列は所望のタンパク質を葉緑体へと向かわせるのみならずその細胞内器官中への転流を促進する。これには成熟したポリペプチドまたはタンパク質からの葉緑体にもともと存在する葉緑体プロセシングプロテアーゼによる適切なトランジットペプチド開裂部位でのトランジットペプチドの開裂が伴なう。したがって、本発明の葉緑体標的配列は、葉緑体中に含有される活性成熟ポリペプチドへとプレタンパク質が正しくプロセシングされるための適切な開裂部位を含有する。本発明において好ましいのは、天然に存在するＣｙｓとＭｅｔ残基の間にこのトランジットペプチドを成熟ポリペプチドから分離する開裂部位を有する、トマトルビスコ小サブユニット前駆体タンパク質の葉緑体標的配列である。
【００６８】
機能的ＣＰＬ発現カセットを用いてＣＰＬの発現と葉緑体中でのｐＨＢＡグルコシドの生産に適した植物宿主を形質転換する。事実上ＣＰＬ遺伝子の発現をサポートすることのできる植物宿主であればいずれも適しているが、収穫の容易さとバイオマスの大きさから、作物植物が好ましい。適した植物宿主の例をあげるとこれに限るわけではないが、単子葉および双子葉植物のいずれでもよく、ダイズ、ナタネ、（Ｂｚａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ａｎｎｕｓ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、トウモロコシ、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｓｐ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ）、燕麦（Ａｖｅｎａ　ｓａｔｉｖａ、Ｌ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｂｉｃｏｌｏｒ）、コメ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、テンサイ、サトウキビ、キャノーラ、キビ、マメ、エンドウマメ、ライムギ、アマ、および飼草などがあげられる。
【００６９】
植物細胞宿主に構成体を導入するための様々な技法が利用可能であり当業者に知られている。これらの技法にはＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓやＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを形質転換剤として用いたＤＮＡ形質転換、エレクトロポレーション、粒子加速法などがある［例えばＥＰ２９５９５９およびＥＰ１３８３４１を参照のこと］。一つの適した方法ではＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐｐのＴｉとＲｉプラスミドのバイナリー型のベクターが使用されている。Ｔｉ誘導ベクターはダイズ、ワタ、ナタネ、タバコおよびコメなどの単子葉植物および双子葉植物を初めとする広範囲に渡る高等植物の形質転換を行う［Ｐａｃｃｉｏｔｔｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：２４１；Ｂｙｒｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８７）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ、Ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ８：３；Ｓｕｋｈａｐｉｎｄａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８７）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：２０９−２１６；Ｌｏｒｚ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１７８；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１８３；Ｐａｒｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ．（１９９５）、３８（４）、３６５−７１；Ｈｉｅｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｊ．（１９９４）、６：２７１−２８２］。Ｔ−ＤＮＡを植物細胞の形質転換へ使用することは大々的に研究されており、多くの記載がある［ＥＰ　１２０５１６；Ｈｏｅｋｅｍａ、Ｉｎ：　Ｔｈｅ　Ｂｉｎａｒｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｏｆｆｓｅｔ−ｄｒｕｋｋｅｒｉｊ　Ｋａｎｔｅｒｓ　Ｂ．Ｖ．；Ａｌｂｌａｓｓｅｒｄａｍ（１９８５）、Ｃｈａｐｔｅｒ　Ｖ、Ｋｎａｕｆ、ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｈｏｓｔ　Ｒａｎｇｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ−Ｐｌａｎｔ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ、Ｐｕｈｌｅｒ、　Ａ．ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８３、ｐ．　２４５；およびＡｎ、ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．（１９８５）４：２７７−２８４］。植物体に導入するために、本発明のキメラ遺伝子は実施例に記載するようにバイナリーベクター内に挿入することができる。
【００７０】
その他の形質転換法も当業者は使用することができる。例えば異種ＤＮＡ構成体の直接摂取［ＥＰ　２９５９５９参照］、エレクトロポレーション法［Ｆｒｏｍｍ　ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１９：７９１参照］　あるいは核酸構成体で被覆した金属粒子を用いた高速弾動衝撃法［Ｋｌｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０、そして米国特許第４、９４５、０５０号参照］。ひとたび形質転換が行われれば、当業者は細胞の再生を行うことができる。特に適しているのは、外来の遺伝子を商業的に重要な作物内に転換する、最近発表された方法である、例えば菜種［Ｄｅ　Ｂｌｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８９）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：６９４−７０１参照］、ヒマワリ［Ｅｖｅｒｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８７）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：１２０１］、ダイズ［ＭｃＣａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９２３；Ｈｉｎｃｈｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９１５；Ｃｈｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８９）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　９１：１２１２−１２１８；　Ｃｈｒｉｓｔｏｕ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８６：７５００−７５０４；ＥＰ　３０１７４９］米［Ｈｉｅｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｊ．（１９９４）、６：２７１−２８２］、そしてトウモロコシ［Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　２：６０３−６１８；Ｆｒｏｍｍ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：８３３８３９］などがある。
【００７１】
形質転換植物細胞はその後適当な選択培地に置かれ形質転換細胞の選択を行い、この細胞をついでカルスへと育てる。カルスからシュートが、シュートから発根媒体中で栽培することにより幼植物が形成される。さまざまな構成体は通常植物細胞中での選択のためマーカーと結合される。このマーカーは殺生物剤（特にカナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコール、除草剤などの抗生物質）に対して抵抗性のあるものが好都合である。この特定のマーカーを使用することにより、導入ＤＮＡを持たない細胞と比較して形質転換された細胞を選択することができる。本発明の転写カセットをはじめとするＤＮＡ構成体の成分は、宿主の生来の（内在性）および外来の（外来性）配列から調製することができる。「外来」とはこの構成体を導入する野生型の宿主にはこの配列が含まれていないことを指す。異種の構成体には、転写開始領域を取り出すべき、この遺伝子には生来備わっていない少なくとも一つの領域が含有される。遺伝子導入細胞および植物中での導入遺伝子の存在を確認するには、当業者に知られた技法を用いてサザーンブロット分析を行うことができる。
【００７２】
ＣＰＬの葉緑体への転流とそれに続くプロセシング
本発明はＣＰＬ遺伝子生成物を葉緑体中に商業的に有用な量のｐＨＢＡを生じるに十分な酵素活性をもって転流を行わせるための葉緑体標的配列の新規の操作法に基づくものである。本出願人らは本発明の基幹となる様相がトランジットペプチドのみならず天然に存在する葉緑体開裂部位およびトランジットペプチドドナーの成熟Ｎ−末端の小部分をも含有させることにあることを見い出した。その原理はコリスメートのｐＨＢＡへの変換が高率で行われるように、葉緑体摂取と外来タンパク質のプロセシングを向上することにある。しかし、細胞内器官への摂取に続き、トランジットペプチドはタンパク質分解により葉緑体プロセシング酵素によって除去され、Ｎ−末端に小さいポリペプチド延長部を有するＣＰＬ変異体を生じる。予期しなかったことに、これらの追加のアミノ酸残基はＣＰＬ酵素活性を妨げず、形質転換植物は先に報告されたものよりも有意に多量のｐＨＢＡ誘導体を蓄積する本キメラタンパク質を発現する。ｐＨＢＡの産生に関してはこのタイプの特異性に対する必要は当該分野においてまだ認められていなかった。
【００７３】
ＣＰＬを生植物体の葉緑体中で発現させる試みとして唯一報告されている例はＳｉｅｂｅｒｔらのＰｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８１１８１９（１９９６）である。しかし本キメラタンパク質（例えばＴＰ−ＣＰＬ）とＳｉｅｂｅｒｔら（上記）が述べる大腸菌ＣＰＬ（例えばＴＰ−ＵｂｉＣ）の葉緑体標的化バージョンとの間には多くの重要な相違が存在する。例えば、本キメラには、トランジットペプチドを効率よく除去するためのしっかりと定義された開裂部位を有する、葉緑体標的配列が含まれる。さらにこの特定の部位でトランジットペプチドを除去することにより成熟ＣＰＬポリペプチドのＮ−末端領域に５つの追加アミノ酸の付加がおこる。これと対照的にＳｉｅｂｅｒｔら（上記）が述べるＴＰ−ＵｂｉＣにはきちんと定義された開裂部位がなく、さらに推定的トランジットペプチド開裂部位と大腸菌ＣＰＬのイニシエータメチオニン残基との間に挿入された９個のアミノ酸伸長部分が含まれている。これらの相違点はさらに図１で説明する。
【００７４】
図１はそのトランジットペプチド完備したトマトルビスコ小サブユニット前駆体（１行目）、ＴＰ−ＣＰＬ（２行目）、ＴＰ−ＵｂｉＣ（３行目）および大腸菌ＣＰＬ（１行目）のアミノ酸配列を示す。本キメラタンパク質（２行目）はトマトルビスコ小サブユニット前駆体の葉緑体トランジットペプチド（緑残基）と「成熟」ルビスコの最初の４つのアミノ酸残基が大腸菌ＣＰＬのイニシエータＭｅｔ残基に結合しているものからなっている。したがって、ＴＰ−ＣＰＬは全トランジットペプチドのみならず通常トランジットペプチドの除去が行われる高度に保存された開裂部位（例えば矢印で示す、ＣｙｓとＭｅｔ残基の間）も含有する。葉緑体中でＴＰ−ＣＰＬがやはりこの部位で開裂すると考えると、得られるタンパク質は５個のアミノ酸残基をＮ末端に有するＣＰＬ変異体となろう。本出願人は予測されたＴＰ−ＣＰＬの葉緑体開裂生成物を大腸菌中で発現させ、それを精製して均一にし、さらにこれが酵素活性的に完全に機能性を有していることを示した。本出願人はまた「成熟」ポリペプチドを本キメラタンパク質を発現する形質転換タバコ植物から精製し、そのＮ−末端をエドマン分解法に付すことによって、タンパク質分解処理がＣｙｓ−Ｍｅｔ結合で生じることを示した。
【００７５】
これと対照的に、図１の３行目に示すように、ＴＰ−ＵｂｉＣ（Ｓｉｅｂｅｒｔら、上記）はトランジットペプチド除去がルビスコ小サブユニット前駆体、または成熟ルビスコポリペプチドに属するアミノ酸残基のどれかで通常生じる開裂部位を含有しない（Ｍａｚｕｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１３：２３７３−２３８６（１９８５）；Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．ａｎｄ　Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１、４８３−４９８（１９８２））。実際ほとんどの植物種において高度に保存されている開裂部位の一部を形成しているこのＭｅｔ残基は、葉緑体プロセシング酵素によって認識されるかもしれないが認識されないかもしれないＡｌａ残基により置換されている。さらにＴＰ−ＵｂｉＣは９個のアミノ酸残基（黒字で示す）の伸長部分を含有し、これは推定開裂部位のＣｙｓ残基と大腸菌ＣＰｌのイニシエータＭｅｔ残基間に並置されている（図１）。これらの追加のアミノ酸はＴＰ−Ｕｂｉｃ人工融合タンパク質（Ｓｉｅｂｅｒｔら、上記）の構築中にクローン化アーティファクトとして導入されたもので、それらが葉緑体輸入および／またはタンパク質分解処理に対して及ぼす恐れのある悪影響については探究されていなかった。いずれにせよ、トランジットペプチドの開裂が示唆通りＣｙｓ−Ａｌａ結合でおこるのであったとしても、得られた「成熟」タンパク質には９個の余分なアミノ酸残基がそのＮ−末端に含有され、それがＣＰＬ酵素活性に対し悪影響を及ぼす恐れがある（参照、表Ｉ、（Ｓｉｅｂｅｒｔら（上記）の２行目および４行目）。
【００７６】
（実施例）
本発明をさらに下記の実施例により詳しく述べる。これらの実施例は本発明の好ましい実施態様を示すものであるが、説明のためだけに提示するものである。上記の解説およびこれらの実施例から当業者は本発明の本質的な特徴を確かめることができ、その範囲と精神から逸脱することなく、本発明にさまざまな変更と修正を行い種々の用途ならびに条件へと本発明を適合させることができるであろう。
【００７７】
（一般的方法）
本実施例中で用いた標準的な組換えＤＮＡおよび分子的クローニング技法は当該分野においてよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ、　Ｅ．　Ｆ．ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、（１９８９）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ、Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　Ｇｅｎｅ　Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４）さらにＡｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃ．　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　（１９８７）発行）に記載されている。
【００７８】
微生物の培養物の維持と増殖のための材料および方法は当該分野でよく知られている。下記の実施例で使用するのに適した技法はＭａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ　Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ　Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ　Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ　Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ　Ｒ．Ｋｒｉｅｇ　ａｎｄ　Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ　Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、ｅｄｓ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ（１９９４））またはＴｈｏｍａｓ　Ｄ．Ｂｒｏｃｋ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓｉｎａｕｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ（１９８９）に記載のようなものである。微生物細胞の増殖および維持に使用したすべての試薬、制限酵素および材料は、特に明記しない限りＡｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。
【００７９】
遺伝子配列の操作はＧｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ　Ｉｎｃ．（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ　（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から入手可能な一式のプログラムを用いて行った。ＧＣＧプログラム「Ｐｉｌｅｕｐ」を用いた場合はギャップクリエーションデフォルト値には１２を、ギャップイクステンションデフォルト値には４を用いた。ＣＧＣ「Ｇａｐ」または「Ｂｅｓｔｆｉｔ」プログラムを用いた場合、デフォルトギャップクリエーションペナルティーには５０、デフォルトギャップエクステンションペナルティーには３を使用した。いずれの場合にもＧＣＧプログラムパラメータ用のプロンプトの指示がない場合、これらおよびその他のＧＣＧプログラムではデフォルト値を使用した。
【００８０】
略語の意味は下記の通りである。「ｈ」は時間、「ｍｉｎ」は分、「ｓｅｃ」は秒、「ｄ」は日、「ｍＬ」はミリリットル、「Ｌ」はリットルを示す。
【００８１】
（実施例１）
大腸菌ＣＰＬのＰＣＲ−クローニング
ゲノムＤＮＡからの大腸菌ｕｂｉＣ遺伝子を増幅するために二つのＰＣＲプライマーを使用したが、後に高コピー数プラスミドへと連結するために、ユニークな制限部位をその隣接領域に添付した。この遺伝子が、以後ＣＰＬと呼ぶ、コリスメートピルベートリアーゼをコードする。この目的のために用いたプライマーは大腸菌ｕｂｉＣ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号Ｍ９６２６８）の公表されているＤＮＡ配列に基づく、下記のヌクレオチドからなっていた。
プライマー１−（配列番号１）
５’−ＣＴＡ　ＣＴＣ　ＡＴＴ　Ｔｃａ　ｔａｔ　ｇＴＣ　ＡＣＡ　ＣＣＣ　ＣＧＣ　ＧＴＴ　ＡＡ−３’
プライマー２−（配列番号２）
５’−ＣＡＴ　ＣＴＴ　ＡＣＴ　ａｇａ　ｔｃｔ　ＴＴＡ　ＧＴＡ　ＣＡＡ　ＣＧＧ　ＴＧＡ　ＣＧＣ　Ｃ−３’
【００８２】
下線を付した塩基はターゲット遺伝子とハイブリッドを形成し、一方小文字はＰＣＲプライマーの末端に添付した制限部位（ＮｄｅＩまたはＢｇｌＩＩ）を示す。
【００８３】
大腸菌ｕｂｉＣ遺伝子の増幅はプライマー１および２と大腸菌株Ｗ３１１０（Ｃａｍｐｂｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：２２７６２２８４（１９７８））からのゲノムＤＮＡを用いて行った。プライマー１は遺伝子の始めの部分でハイブリッドを形成し、ＮｄｅＩ部位をタンパク質の開始コドンに導入する、一方プライマー２は他端でハイブリッドを形成し、終止コドンのすぐ後にＢｇ１ＩＩ部位を設ける。１００μｌのＰＣＲ反応液には１００ｎｇ弱のゲノムＤＮＡと両プライマーを最終濃度が０．５μＭとなるように含有させた。他の反応成分は製造者のプロトコルに従い、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）により提供された。増幅はＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ　４８０（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）中でそれぞれ９４℃で１分、５５℃で１分、さらに７２℃で１分のサイクルを２２回おこなった。最後のサイクルの後、７２℃で７分の延長期間を設けた。
【００８４】
ＰＣＲ生成物をＮｄｅＩとＢｇｌＩＩで切断し、得られた断片をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化した大腸菌発現ベクター、ｐＥＴ−２４ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に連結した。この連結反応混合物を用いて大腸菌ＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテント細胞（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）の形質転換をＢＴＸ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｒ　１００（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ．）を用いて製造者のプロトコルに従い行ない、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上で生成物を選択した。プライマー１、プライマー２、および各再懸濁コロニーをテンプレート源として用いたＰＣＲ反応により、ＣＰＬの挿入されたプラスミドを含有した形質転換細胞を同定した。これ以降この技法は単に「コロニーＰＣＲ」と呼ぶ。プラスミドＤＮＡを正しいサイズのＰＣＲ生成物を生じた代表的コロニーから分離し、ＣＰＬに相当する全挿入部分の全配列を調べてＰＣＲのエラーをチェックした。エラーは一つも見つからなかった。今後の操作のために選択したプラスミドを以降「ｐＥＴ２４ａ−ＣＰＬ」と呼ぶ。ｐＥＴ２４ａ大腸菌発現構成体中のＣＰＬのＯＲＦヌクレオチド配列およびその予測された１次アミノ酸配列を配列番号３および配列番号４にそれぞれ示す。コード領域はＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号Ｍ９６２６８で示されるＯＲＦと全く同一であることに注意して頂きたい。
【００８５】
（実施例２）
組み換え大腸菌ＣＰＬの過発現、精製および特徴付け
酵素の特徴付けおよび抗体製造のために十分な量のＣＰＬを製造するため、ｐＥＴ２４ａ−ＣＰＬを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中に導入した。これはＢＴＸ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｒ　１００（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ．）を製造者のプロトコルに従って用いたエレクトロポレーションにより行った。カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上で生成物を選択し、その後の操作のために一つのコロニーを選択した。組み換えタンパク質の製造のために、プラスミド所有株を上記の培地を用いて液体培地により３０℃で増殖し、０．１５ｍＭのＩＰＴＧを用いて０．８弱のＡ６００ｎｍで細胞を誘導した。同じ増殖条件のもとで４．５時間誘導を行った後、細胞を遠心分離により集め、その後の使用のために−８０℃で保存した。続く工程は０から４℃で行った。
【００８６】
約３倍量の０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）、５ｍＭのＭｇＳＯ４、１ｍＭのジチオスレイトール、０．０３ｍｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼＩ、０．５ｍＭのフェニルメチルスルホニルフッ化物に凍結細胞ペレットを再度懸濁し２０，０００ｐｓｉでフレンチプレス細胞破砕機に２回かけた。デブリを遠心分離（４３，００００ｘ　ｇ、１時間）で除き、３０ｍｇ弱のタンパク質を１ｍＬ中に含有する無細胞抽出物にグリセロール（５％）を補いその後の使用のために−８０℃で保存した。タンパク質濃度をＢＳＡを標準液としたＬｏｗｒｙ　ｅｔ　ａｌ．（Ｌｏｗｒｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．１９３：２６５−２７５（１９５１））の方法により求めた。無細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果、上記の増殖条件の下で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で組み換えタンパク質は全可溶性タンパク質の１５％を上回るレベルでよく発現していたことが分かった。しかしフレンチプレス細胞破砕機抽出液の可溶画分には組み換えタンパク質の約２５％しか回収されなかった。この材料は下記に示す精製に用いた。
【００８７】
精製の最初には陰イオン交換クロマトグラフィーを必要とした。組み換えＣＰＬを含有する大腸菌の無細胞抽出液の一定量（１．０ｍＬ）を手早く室温に戻し、脱イオン水で１：１に希釈し、０．２μｍのＡｃｒｏｄｉｓｃフィルター（Ｇｅｌｍａｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４１９２）でろ過した。全サンプルをＭｏｎｏＱ　ＨＲ５／５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ）に付しこれを２５℃で流量１ｍｌ／ｍｉｎのバッファーＱ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ５０ｍＭ、ｐＨ７．７、亜硫酸ナトリウム１０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ）を用いて展開させた。これらの条件のもとでは組み換えＣＰＬは陰イオン交換樹脂に吸着せず、カラムから最初の数分間で均一濃度で溶出する。カラム流出物を一本の管に集め、５％（ｗ／ｖ）のグリセロールを補い、最終体積が４５０μＬとなるまでＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（Ａｍｉｃｏｎ　Ｉｎｃ．）中４℃で濃縮した。この簡単な手順の後の組み換えタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｕ．，Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０−６８５（１９７０））とクーマシーブルー染色により調べたところ〜９０％の純度を示した。次の工程では、２０μＬの濃縮サンプルを０．３ＭのＮａＣｌを含有するバッファーＱであらかじめ平衡化した７．５ｘ６００ｍｍのＴＳＫ　Ｇ３０００ＳＷゲルろ過カラム（ＴＯＳＯＨ　Ｃｏｒｐ．）に付した。このカラムを流量１．０ｍＬ／ｍｉｎ（２５℃）で展開すると、高度に精製された組換えＣＰＬが１９．７−２１分の間に溶出した。残りの半量のサンプルを全く同じ方法で処理している間、この精製組換ＣＰＬを氷上に保った。この二つのゲルろ過カラムからのピーク画分をプールし、グリセロール（５％）を補って、タンパク質の濃度が１２ｍｇ／ｍＬ弱となるよう濃縮した後、その後の使用に備えて８０℃で保存した。精製したタンパク質の収量は３．７ｍｇ弱で無細胞抽出液中に含まれる全タンパク質量の約１２％に相当する。目視により過負荷クーマシー染色ゲルを目視したところ、組換えタンパク質の最終調製物は９８％を超える純度を有することがわかった。
【００８８】
精製組み換えＣＰＬをエドマン分解に付したところ、このタンパク質のイニシエータＭｅｔ残基が大腸菌中で除去されていることがわかった。このマイナーな翻訳後修飾の他にも、組換えＣＰＬの始めの１３個のアミノ酸が配列番号４に示すタンパク質の２から１４の残基（例えば真正大腸菌タンパク質のＯＲＦ）と全く同一であった。精製した組換えＣＰＬのプロモーター分子量はエレクトロスプレーイオン化質量分析により求めたところ１８６４４．６ダルトンであった。この値はイニシエータＭｅｔ残基が含有されていないとしたＤＮＡ配列から予測される分子量（１８６４５．４９ダルトン）と極めてよく一致している。これらの観察に基づき、イニシエータＭｅｔ残基が野生型の大腸菌タンパク質からも切断により失われているという結論を導くことが妥当である。なぜなら後者のヌクレオチド配列は組換えＣＰＬと全く同一であるからである。
【００８９】
精製された組換えタンパク質の酵素活性を評価するために、連続的な分光分析の技法を開発した。このアッセイはコリスメートのｐＨＢＡへの変換により、後者の芳香環が形成される結果、２４６ｎｍにおける吸光度が増加するということに基づくものである。初期の生成物形成速度を２５℃で９０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．２ＭのＮａＣｌ、１００μＭのコリスミ酸バリウム（Ｓｉｇｍａ）、および量を様々に変えた精製組み換えＣＰＬを入れた石英キュベット中で測定した。反応は酵素により開始させた。生成物の形成は２４６ｎｍでの吸光度の変化から１１，２２０Ｍ−１のｐＨＢＡの吸光係数を用いて計算した。後者は全く同一の条件のもとでｐＨＢＡの濃度を５μＭから１００μＭへと変化させて求めた。光の吸収はｐＨＢＡ濃度に正比例していた。上記のアッセイに基づいた、精製組み換えＣＰＬの２５℃での代謝回転数は３６ｍｉｎ−１弱であった。同一の組換えタンパク質を拡大規模で精製して得たさらに二つの調製物からは、同条件の下でやや高い代謝回転数（例えば４１ｍｉｎ−１と４２ｍｉｎ−１）が得られた。文献中でこの酵素に関して得られる唯一の値は４９ｍｉｎ−１である（Ｎｉｃｈｏｌｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：５３０９５３１６（１９９２））が、このアッセイは３７℃で行われていた。ＣＰＬ酵素反応のＱ１０（温度係数）が少なくとも２で特徴付けられていると考えると、これらの観察から、上に記載した精製組換えタンパク質は完全に活性であることがわかる。
【００９０】
（実施例３）
葉緑体に標的化したバージョンのＣＰＬ：ＴＰ−ＣＰＬの構築
ＣＰＬの生理的基質であるコリスメートはフェニルアラニンおよびチロシンといったアミノ酸を始めとする数多くの芳香族化合物合成の分岐点となる重要な中間体である。植物中でコリスメートは葉緑体およびその他の型のプラスチド中に局在するシキミ酸経路中で形成される（Ｓｉｅｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８１１−８１９（１９９６））。したがって外来タンパク質をコリスメート生産部位である葉緑体へと効率的に向かわせるＮ−末端葉緑体標的配列を有するＣＰＬを提供することが極めて重要である。これはＣＰＬのイニシエータＭｅｔ残基に融合するトマトルビスコ小サブユニット前駆体タンパク質から得られた葉緑体標的配列からなるキメラタンパク質を構築することによって行われる。得られる融合タンパク質は以降「ＴＰ−ＣＰＬ」と呼ぶ。ルビスコ小サブユニットのトランジットペプチドと「成熟」ルビスコの始めの４個のアミノ酸残基に対応するＤＮＡ断片を作るにはＰＣＲを用いた。増幅のための標的はプラスミドｐＴＳＳ１−９１−（＃２）−ＩＢＩ（Ｓｉｅｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８１１−８１９（１９９６））であり、これはｒｂｃＳ２用トマトルビスコ小サブユニット前駆体の全長ｃＤＮＡクローンを含有している（Ｓｕｇｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ．２０９：２４７−２５６（１９８７）；Ｓｉｅｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８１１８１９（１９９６））。下記のプライマーをこの反応において使用した。
プライマー３
５’−ＣＴＡ　ＣＴＣ　ＡＣＴ　ＴＡＧ　ＡＴＣ　Ｔｃｃ　ａｔｇ　ｇＣＴ　ＴＣＣ　ＴＣＴ　ＧＴＣ　ＡＴＴ　ＴＣＴ−３’（配列番号５）
プライマー４
５’−ＣＡＴ　ＣＴＴ　ＡＣＴ　ｃａｔ　ａｔｇ　ＣＣＡ　ＣＡＣ　ＣＴＧ　ＣＡＴ　ＧＣＡ　ＧＣ−３’　　　（配列番号６）
【００９１】
プライマー３の下線部分はルビスコ小サブユニット前駆体の始めの２１個のヌクレオチドとハイブリッドを形成し、ＮｃｏＩ部位（小文字部分）を葉緑体標的配列の始めのイニシエータＭｅｔ残基に導入する。示してあるようにこのプライマーはまたＢｇ１ＩＩ部位（太字部分）をＮｃｏＩ部位のすぐ上流の５’端に含有している。プライマー４は葉緑体標的配列のもう一方の端でルビスコ小サブユニット前駆体のＯＲＦの１６７−１８４のヌクレオチドとハイブリッドを形成する。ユニークなＮｄｅＩ部位がこのプライマー中に設計されており（小文字部分）、葉緑体標的配列を含有するＰＣＲ断片をｐＥＴ−２４ａ発現構成体中のＣＰｌの開始コドンに位置しているＮｄｅＩ部位へ添付できるようになっている。１００μｌのＰＣＲ反応物には７５ｎｇ弱のｐＴＳＳ１−９１−（＃２）−ＩＢＩとそれぞれ最終濃度が０．９μＭ弱であるプライマー３および４が含まれていた。増幅はＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ　４８０（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）中で９４℃で１分、５５℃で１分さらに７２℃で１分のサイクルを２５回くり返し、最後のサイクルの後は７２℃で７分の延長時間を設けた。ＰＣＲ生成物はＢｇｌＩＩとＮｄｅＩで消化し、Ｔ７プロモーターを含むベクター配列のみを含有する小ＤＮＡ断片（１０６ｂｐ）を除去するために同じ制限酵素で開裂したｐＥＴ２４ａＣＰＬに連結した。この連結反応混合物を、エレクトロポレーションを用いて大腸菌ＤＨ１０Ｂヘと導入し生成物はカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上で選択した。挿入した葉緑体標的配列を有するプラスミドを含む形質転換物をプライマー２と３を用いたコロニーＰＣＲにより同定した。正しい大きさのＰＣＲ生成物を生じている代表的なプラスミドを今後の操作のために選択した。このプラスミドを以降「ｐＥＴ２４ａ−ＴＰ−ＣＰＬ」と呼ぶ。ＰＣＲエラーがなかったことを確認するために、増幅した葉緑体標的配列に相当するプラスミドの領域をカスタム設計したプライマーを用いて完全に配列決定した。ＴＰ−ＣＰＬのＯＲＦのヌクレオチド配列とその予測された一次アミノ酸配列をそれぞれ配列番号７および配列番号８に示す。
【００９２】
（実施例４）
予測されたＴＰ−ＣＰＬの葉緑体開裂生成物は完全活性を有する
予測されたＴＰ−ＣＰＬの葉緑体開裂生成物のアミノ酸配列に相当するＤＮＡ断片（例えばＭＱＶＷＨ−ＣＰＬ）をプラスミド挿入物ｐｅｔ２４ａ−ＴＰ−ＣＰＬをテンプレートとしてＰＣＲを用いて生成した。下記のプライマーをこの反応において使用した。
プライマー５
５’−ＣＴＡ　ＣＴＣ　ＡＴＴ　Ｔｇａ　ａｇａ　ｃＴＧ　ＣＡＴ　ＧＣＡ　ＧＧＴ　ＧＴＧ　ＧＣＡ　Ｔ−３’　　　（配列番号９）：
プライマー６
５’−ＣＡＴ　ＣＴＴ　ＡＣＴ　ｇｔｃ　ｇａｃ　ＴＴＴ　ＡＧＴ　ＡＣＡ　ＡＣＧ　ＧＴＧ　ＡＣＧ　Ｃ−３’　　　（配列番号１０）
【００９３】
プライマー５の下線部分はＴＰ−ＣＰＬ遺伝子挿入部分の５’端に結合し、ユニークなＢＢＳＩ部位（小文字部分）を予測葉緑体開裂生成物（以降「ΔＴＰ−ＣＰＬ」と呼ぶ）の開始Ｍｅｔ残基のすぐ上流に導入する。プライマー６は遺伝子挿入物の他端でハイブリッドを形成し、ユニークなＳａＩＩ部位（小文字部分）を終止コドンのすぐ向こう側に設ける。ＰＣＲ生成物をＢＢＳＩ（ＮｃｏＩ適合性の「粘着性末端」を残す）とＳａ１Ｉで切断し、得られた断片をＮｃｏＩとＳａ１Ｉで消化した大腸菌発現ベクター、ｐＥＴ−２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に連結した。この連結反応混合物をＢＴＸ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｒ　１００（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ．）を製造者のプロトコルにしたがって使用して大腸菌ＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテント細胞（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を形質転換した。生成物はカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上で選択した。ΔＴＰ−ＣＰＬ挿入部を有するプラスミドを含有する形質転換物を適当なプライマーを使用してコロニーＰＣＲにより同定した。正しい大きさのＰＣＲ生成物を生じた代表的なプラスミド（例えばｐＥＴ２４ａ−ΔＴＰ−ＣＰＬ）をコロニーから分離し、ΔＴＰ−ＣＰＬに対応する挿入部をＰＣＲエラーがなかったことを確認するために完全に配列決定した。
【００９４】
精製および反応速度分析のための組換えタンパク質を発現するために、ｐＥＴ２４ａ−ΔＴＰ−ＣＰＬを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の中にエレクトロポレーションを用いて導入した。形質転換細胞をカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地で培養し、代表的コロニーをさらなる操作のために選択した。３００　ｍｌの培養物を上記の培地中３０℃で培養し、ＩＰＴＧを０．８弱のＡ６００ｎｍで最終濃度が０．１５ｍＭとなるよう加えた。同じ条件のもとで４．５時間の誘導期を設けたのち、細胞を遠心分離により集め、−８０℃で保存した。その後の工程は特に明記しない限り０から４℃で行った。
【００９５】
０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）、５ｍＭのＭｇＳＯ４、１ｍＭのジチオスレイトール、０．０３ｍｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼＩ、０．５ｍＭのフェニルメチルスルホニルフッ化物を含有する２．５ｍｌの溶液に凍結細胞ペレットを再度懸濁し、２０，０００ｐｓｉでフレンチプレス細胞破砕機に２回かけた。無細胞抽出液を遠心分離（４３，００００ｘ　ｇ、２５分）にかけ、上清（４．５ｍｌ）を注意深く取り除き、５％のグリセロールを加えその後の使用のために−８０℃で保存した。ΔＴＰ−ＣＰＬ用精製プロトコルは未修飾の組換え大腸菌ＣＰＬ用に記載したものと本質的に同一のものであった。手短かに言えば、上記の全サンプルを解凍し最終体積が２．５ｍＬとなるまでＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０（Ａｍｉｃｏｎ　Ｉｎｃ．）を用いて濃縮した。サンプルを製造者のプロトコルに従い、バッファーＱであらかじめ平衡化したＰＤ−１０ゲルろ過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ）を用いてバッファーＱに交換した。Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０中で体積を２ｍｌに減少させ、全サンプルをＭｏｎｏＱ　ＨＲ１０／１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ）に入れ流量４ｍｌ／ｍｉｎ（２５℃）のバッファーＱを用いて展開した。２分から３分の間に溶出した物質を集め、グリセロールを最終濃度が５％（ｗ／ｖ）となるように加えた。サンプルをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（Ａｍｉｃｏｎ　Ｉｎｃ．）中で２００μｌになるまで濃縮し、７．５ｘ６００ｍｍのＴＳＫ　Ｇ３０００ＳＷゲルろ過カラム（ＴＯＳＯＨ　Ｃｏｒｐ．）に付した。このカラムは０．３ＭのＮａＣｌ（２５℃）を含有するバッファーＱで流量１．０ｍｌ／ｍｉｎ（２５℃）で展開させたもので、組換えΔＴＰ−ＣＰＬは２０．７分から２２分の間に溶出した。精製組換えタンパク質を含有する画分は５％のグリセロールを補って、タンパク質の濃度が１ｍｌあたり０．７ｍｇ弱となるよう濃縮した後、その後の使用に備えて８０℃で保存した。
【００９６】
精製された組換えΔＴＰ−ＣＰＬの酵素活性を２５℃で実施例２に記載の分光分析アッセイを用いて求めた。これらの条件において代謝回転数は４０．７ｍｉｎ１であった。この値はＮ−末端延長部を持たない精製組み換え大腸菌ＣＰＬから得たもの（例えば３６から４２ｍｉｎ−１）と実質的に同一であった。この観察からはっきりとΔＴＰ−ＣＰＬのＮ−末端に融合する５つの追加のアミノ酸残基が酵素活性を犠牲にしていないことがわかる。さらにＴＰ−ＣＰＬの予測葉緑体開裂生成物がおそらく完全に活性をもつものであることが示唆される。
【００９７】
（実施例５）
インビトロのタンパク質輸入：ＴＰ−ＣＰＬが分離葉緑体中に輸入される
ＴＰ−ＣＰＬを高等植物中に導入する前に、葉緑体により摂取されうることを示すことが重要である。これはこの人工融合タンパク質の放射性バージョンを合成し、それを古典的な葉緑体タンパク質輸入実験に付すことによって行った。第一の工程は輸送実験のために［３５Ｓ］メチオニンを用いてタンパク質に放射性ラベルを付すために用いることのできるＤＮＡ構成体を形成することであった。これを行うため、ＴＰ−ＣＰＬをコードする配列をインビトロ転写／翻訳ベクター、ｐＣＩＴＥ４ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＭｓｃＩとＢｇ１ＩＩ部位へと挿入するために、プライマー７と８、およびプラスミド中の挿入部分、ｐｅｔ２４Ａ−ＴＰ−ＣＰＬ、をＰＣＲ増幅のテンプレートとして用いてＴＰ−ＣＰＬコード配列の修飾を行った。
プライマー７
５’−ＣＴＡ　ＣＴＣ　ＡＴＴ　ｔｇｇ　ｃｃａ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＴＣＡ　ＴＴＴ　ＣＴＴ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　Ｃ−３’　　　（配列番号１１）
プライマー８
５’−ＣＡＴ　ＣＴＴ　ＡＣＴ　ａｇａ　ｔｃｔ　ＴＴＡ　ＧＴＡ　ＣＡＡ　ＣＧＧ　ＴＧＡ　Ｃ−３’　　　（配列番号１２）
【００９８】
プライマー７はＴＰ−ＣＰＬの開始コドン（下線部分）のすぐ後でヌクレオチドの伸長部分とハイブリッドを形成し、ユニークなＭｓｃＩ部位（小文字で示す）をイニシエータＭｅｔ残基の位置に導入する。プライマー８は遺伝子挿入物の他端に結合し、ユニークなＢｇ１ＩＩ部位を終止コドンのすぐ向こう側に導入する。どちらのプライマーもこの人工融合タンパク質にアミノ酸変化を導入しない。得られたＰＣＲ断片をＭｓｃＩとＢｇ１ＩＩで消化し、ＭｓｃＩとＢａｍＨＩで切断したｐＣＩＴＥ４ａ（＋）に連結した。Ｂｇ１ＩＩとＢａｍＨＩは適合性のある「粘着性末端」を形成する。この連結反応混合物を大腸菌ＤＨ１０Ｂにエレクトロポレーションを用いて導入し、形質転換細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上で培養した。正しい挿入部を有するプラスミド（適切なプライマーを用いてコロニーＰＣＲにより同定した）を有する代表的なコロニーを今後の操作の為に選択した。プラスミドＤＮＡを完全に配列決定したところＰＣＲエラーがなかったことが確認された。
【００９９】
ついで上述のプラスミド構成体を［３５Ｓ］メチオニンと「Ｓｉｎｇｌｅ　Ｔｕｂｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　２、Ｔ７」キット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を製造者のプロトコルに従って用いてインビトロ転写／翻訳に付した。反応は６０ｍＭの未標識メチオニン含有２Ｘインポートバッファー（Ｖｉｉｔａｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５０００−１５００７（１９８８））で終端させた。葉緑体をエンドウ（Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ）の１４日苗から単離し、放射標識したＴＰ−ＣＰＬを用いてインビトロ輸入アッセイ（Ｖｉｉｔａｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５０００１５００７（１９８８））に付した。プロテアーゼ後処理を用いて結合ポリペプチドと輸入ポリペプチドとを識別した（Ｃｌｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３６９１−３６９６（１９８５））。無損傷のプラスチドをパーコールクッションをもちいて遠心分離することにより再精製し、２Ｘゲルサンプルバッファ１５０μｌ中に再度懸濁し、先に記載されているように（Ｖｉｉｔａｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５０００−１５００７（１９８８））ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／フルオログラフィーにて分析した。
【０１００】
ＴＰ−ＣＰＬのインビトロ転写／翻訳から２５ｋＤａ弱（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０−６８５（１９７０））中泳動に基づく）の、そのＤＮＡ配列から予測される値（２５１８８Ｄａ）と一致する見かけ分子量を有する放射活性ポリペプチドが合成された。ＡＴＰの存在下では、このポリペプチドは葉緑体により取り込まれ処理されて大きさが小さくなったが、これはクーマシー染色された精製組換えΔＴＰ−ＣＰＬ（例えばＴＰ−ＣＰＬの予測された葉緑体開裂生成物）と共泳動するように見えた。古典的プロテアーゼ保護実験により輸入アッセイ後無損傷葉緑体と共に回収された放射性ポリペプチドが実際に内部移行していたことが明らかになった。
【０１０１】
対照的に葉緑体がタンパク質輸入を支持する条件（例えば暗所でＡＴＰの不在下）のもとで培養されると、ＴＰ−ＣＰＬの摂取とプロセシングは観察されなかった。非活性化条件のもとで、無損傷のプラスチドと共に回収された放射性バンドは唯一全長融合タンパク質、ＴＰ−ＣＰＬのものだけであった。さらに、後者に対応する放射性バンドはプロテアーゼによる処理の後、完全に消失し、これが輸入されたものではなく外部葉緑体膜に単に結合していたに過ぎないことが示された。これらの両結果から、ＴＰ−ＣＰＬのＮ−末端に付着した葉緑体標的配列は人工融合タンパク質を葉緑体へと向かわせることができ、その細胞器官内への取り込みの後、タンパク質分解処理が予測された方法で行われることが明らかに示されている。
【０１０２】
（実施例６）
タバコおよびシロイヌナズナ形質転換に用いる発現プラスミドの構築
ＴＰ−ＣＰＬが葉緑体により効率的に摂取され（実施例５）、高ＣＰＬ活性を有する新規のタンパク質へと分割される（実施例４）ことが明らかになったので、これを植物体へと導入することにした。タバコおよびシロイヌナズナ中で構成的発現を行うのに用いることのできる構成体を形成するために、全長ＴＰ−ＣＰＬ融合タンパク質に対応するＤＮＡ断片を修正バージョンのプラスミドｐＭＬ６３内にサブクローンした。プラスミドｐＭＬ６３は下記の遺伝要素を含有するｐＭＬ４０から得たものであった。すなわち、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ｃａｂリーダー配列、ｕｉｄＡコード領域、およびＮＯＳポリアデニル化信号配列である。簡単に言えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは転写開始部位の先に８塩基対が延長されている１．３ｋｂのＤＮＡ断片である（Ｏｄｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３０３：８１０−８１２）。その３’端に作動可能に結合しているのがｃａｂリーダー配列であって、これは６０ｂｐの非翻訳二重鎖ＤＮＡ部分であり、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子２２Ｌ（Ｈａｒｐｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１２：１８２１９０）から得られた。このｃａｂリーダーの３’端に結合しているのがｕｉｄＡ遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ．６：３９０１）で、これはタンパク質β−グルクロニダーゼ（例えば「ＧＵＳ」）をコードする。最後にＧＵＳ遺伝子の３’端に結合しているのがノパリンシンターゼ（例えば「ＮＯＳ」）遺伝子からのポリアデニル化信号配列を含有する８００ｂｐのＤＮＡ断片である（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１−５６４）。これらのＤＮＡ断片は合わせて３５Ｓ−ＧＵＳキメラ遺伝子を形成し、標準クローン化技法によってベクターｐＧＥＭ９Ｚｆ（−）（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ　ＷＩ）に挿入されプラスミドｐＭＨ４０を生じる。
【０１０３】
プラスミドｐＭＬ６３は基本的にはｐＭＨ４０と同じであるが３’ＮＯＳターミネーター配列が切り詰められたバージョンであって、下記の方法で生成された。まずｐＭＨ４０をＳａ１Ｉで消化し、得られた４．０３ｋｂと２．９ｋｂの二つのＤＮＡ断片を再連結して３５Ｓプロモーター／ｃａｂ２２リーダー／ＧＵＳ遺伝子／３’ＮＯＳターミネータカセットを逆順に有するプラスミドを得た。得られた構成体をついでＡｓｐ７１８ＩとＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、３’ＮＯＳターミネーター配列を有する７７０ｂｐ断片を取り外した。後者は捨て、ｐＭＨ４０をテンプレートとし、プライマー９と１０を使用したＰＣＲにより精製したより短いバージョンと置き換えた。
プライマー９
５’−ＣＣＣ　ＧＧＧ　ＧＧＴ　ＡＣＣ　ＴＡＡ　ＡＧＡ　ＡＧＧ　ＡＧＴ　ＧＣＧ　ＴＣＧ　ＡＡＧ−３’　　　（配列番号１３）
プライマー１０
５’−ＧＡＴ　ＡＴＣ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＧＴＣ　ＧＡＣ　ＡＴＣ　ＧＡＴ　ＣＴＡ　ＧＴＡ　　　ＡＣＡ　ＴＡＧ　ＡＴＧ　Ａ　　３’　　　（配列番号１４）
【０１０４】
ＰＣＲ生成物をＨｉｎｄＩＩＩとＡｓｐ１８Ｉにより消化し、公表された配列（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ（１９８２）　１：５６１５７４）のヌクレオチド１２７７（ＴＡＡ終止コドン）から始まりヌクレオチド１５５６で終わる２７９ｂｐの３’ＮＯＳターミネーター配列を含有する２９８ｂｐの断片を得た。このＰＣＲ断片をｐＭＬ３に連結しプラスミドｐＭＬ６３を得た。
【０１０５】
上に示すように、ｐＭＬ６３には３５Ｓプロモーターと切り詰められたバージョンの３’ＮＯＳターミネータの制御下にＧＵＳｌコード領域が含有される。したがってこれには植物中でＧＵＳの構成的発現に必要なすべての転写情報が含有されている。ＴＰ−ＣＰＬの類似の構成体を形成するために、プラスミドｐＭＬ６３をＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで消化した。この操作はＧＵＳ遺伝子挿入部分のみを切り離し、隣接調節配列とベクターの残りは無傷で残す。プラスミド、ｐｅｔ２４ａ−ＴＰ−ＣＰＬをＴＰ−ＣＰＬ融合タンパク質の全コード領域を遊離するＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで処理した。全コード領域に対応する小ＤＮＡ断片（６９３ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動により精製し、ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩによりｐＭＬ６３を切断することによって得た大ベクター断片（４．６３ｂｐ）を用いて標準連結反応に付した。連結反応混合物をエレクトロポレーションを用いて大腸菌ＤＨ１０Ｂへと導入し、生成物をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上で選択した。挿入ＴＰ−ＣＰＬコード配列を有するプラスミドを含有する形質転換物をプライマー２とプライマー３を用いたコロニーＰＣＲで同定した。正しい大きさのＰＣＲ生成物を生じた代表的なプラスミドを今後の操作のために選択した。最終構成体、以後「ＴＰ−ＣＰＬ−ｐＭＬ６３」とよぶ、を図で表したものを図２に示す。
【０１０６】
アグロバクテリウム媒介タバコリーフディスク形質転換用に用いたバイナリーベクターはＡＴＣＣに１９９７年６月２４日に預託され、受け入れ番号２０９１２８を有する、プラスミドｐＺＢＬ１であった。ＰＺＢＬ１にはｐＢＲ３２２からの複製起原、ｎｐｔＩカナマイシン耐性細菌遺伝子、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａプラスミドｐＶＳ１の複製および安定領域（Ｉｔｏｈ　ｅｔ　ａｌ、　１９８４）、ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｅｌｚｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８５が記載しているＴＤＮＡ境界（ここで右の境界断片の一部であるＯＣＳエンハンサー（ＯＣＳプロモーターの３２０から１１６に渡る（（Ｇｒｅｖｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９８３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：４９９−５１１））が除去されている）、そしてＮＯＳ／Ｐ−ｎｐｔＩＩ−ＯＣＳ３’遺伝子がカナマイシン耐性植物選択マーカーとして作用するべく含まれている。ＴＰ−ＣＰＬの発現に際し、プラスミドｐＺＢＬ１を外来遺伝子の挿入と植物ゲノムへの安定な取り込みに理想的な位置にある左右の境界間のユニークな部位で切断するＳａｌＩで消化した。挿入なく再連結が行われる可能性を最小にするために、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を製造者の推奨に従って用い、切断ベクターの脱リン酸化を行った。バイナリーベクター中に挿入されるべき断片を得るために、プラスミドＴＰ−ＣＰＬ−ｐＭＬ６３をＳａｌＩで消化した。この処理によりＴＰ−ＣＰＬ融合遺伝子のための全転写ユニット（例えば３５Ｓプロモーター／ｃａｂ２２リーダー／ＴＰ−ＣＰＬ／３’ＮＯＳターミネータ）が２．４ｋｂのＤＮＡ断片として放出される。このＤＮＡ断片はアガロースゲル電気泳動により精製され、上記のようにｐＺＢＬ１から得られた脱リン酸化した１１．０ｋｂの断片を用いて標準連結反応に付す。この連結反応混合物をエレクトロポレーションを用いて大腸菌ＤＨ１０Ｂに導入し、生成物をカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上で選択した。ＴＰ−ＣＰＬ融合遺伝子を含むプラスミドを含有する形質転換物をコロニーＰＣＲによりプライマー２と３により同定し、挿入部分の向きをＫｐｎＩを用いた制限消化分析によって求めた。今後の操作のために選択したプラスミド、以降「ＴＰ−ＣＰＬ−ｐＺＢＬ１」と呼ぶ、中では図３に図示するように、ＴＰ−ＣＰＬの開始コドンがＴ−ＤＮＡの右境界断片と隣接している。下記に記載するように、本発現構成体はｐＨＢＡの過剰生産用にタバコとシロイヌナズナの形質転換を行うのに使用した。
【０１０７】
（実施例７）
遺伝子導入タバコ植物の生成
プラスミドＴＰ−ＣＰＬ−ｐＺＢＬ１を凍結融解形質転換法（Ｈｏｌｓｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６３：１８１−１８７）を用いてアグロバクテリウム‐ツメファシエンス株ＬＢＡ４４０４（Ｈｏｅｋｅｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３０３：１７９−１８０（１９８３）内に導入した。細胞を２８℃でカナマイシン（１０００μｇ／ｍｌ）とリファンピシン（２０μｇ／ｍｌ）を含有するＹＥＰ培地（１リットルあたりトリプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌを５ｇ含有）で平板培養した。バイナリー構成体を有するコロニーを適切なプライマーを用いたＰＣＲにより同定した。
【０１０８】
リーフディスク感染用の鉢植えのタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ．Ｘａｎｔｈｉ）を昼２１℃１４時間、夜１８℃１０時間のサイクル、およそ８０％の相対湿度、冷白蛍光灯と白熱灯の混合照明により栽培室の中で育てた。アグロバクテリウム媒介、リーフディスク形質転換を、下記の変更を除き本質的にＤｅ　Ｂｌａｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：２７７−２９２）の記載通りに行った。直径８ｍｍのリーフディスクを殺菌した紙穿孔機を用いて４から６週の植物体の全葉から調製した。リーフディスクはＴＰ−ＣＰＬ−ｐＺＢＬ１を有するアグロバクテリウムのＭｕｒａｓｈｉｇｅ　Ｍｉｎａｍａｌ　Ｏｒｇａｎｉｃｓ　Ｍｅｄｉｕｍ中でＯＤ６００がほぼＺとなるよう再懸濁した濃縮溶液に３０分間浸して接種した。接種したリーフディスクを１リットル中に３０ｇのショ糖、１ｍｇの６−ベンジルアアミノプリン（ＢＡＰ）、０．１ｍｇのナフタレン酢酸、８ｇの寒天、およびＧｉｂｃｏＢＲＬ（ｃａｔ．＃２３１１８−０２９）から入手したＭｕｒａｓｈｉｇｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｏｒｇａｎｉｃｓ　Ｍｅｄｉｕｍを１パックを含有する培地上に直接置いた。３日間２８℃で光りの下で培養した後、形質転換したタバコ細胞の生成物を選択し、残留するアグロバクテリウムを除去するためにリーフディスクを同じ組成でカナマイシン（３００μｇ／ｍｌ）とセフォタキシム（５００μｇ／ｍｌ）を含有する新しい培地へと移した。リーフディスクは上記の増殖条件の下で３週間培養し、ついで根の誘導のために最適なシュートの大きさが得られるまで３週間ごとに新しい培地に移した。シュートは１リットル中にＭｕｒａｓｈｉｇｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｏｒｇａｎｉｃｓ　Ｍｅｄｉｕｍを１パック、寒天８ｇ、ショ糖１０ｇを含有する培地に発根させた。約４週間後、植物を土壌へ移し上記の条件の下生育室の中で栽培し成熟させた。
【０１０９】
（実施例８）
ｐＨＢＡグルコシド標準物質の化学合成
ｐＨＢＡエステルグルコシドを合成するために、１Ｌのベンゼン中で１１０ｍｍｏｌの４−ヒドロキシ安息香酸と５５ｍｍｏｌのビス（トリブチルスズ）オキサイドとを混合した。混合物を適切な共沸混合物容器を用いて、窒素雰囲気の下で１６時間加熱環流した。減圧下でベンゼンを除去し、ほとんどが４−ヒドロキシ安息香酸トリブチルスズエステルからなる透明な油を得た（Ｏｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ３６：２６４１−２６４８）。次に２５ｍｍｏｌのアセトブロモ−ａ−Ｄ−グルコースを１，２Ｌの１、２−ジクロロエタンに溶かしたものを２５ｍｍｏｌの４−ヒドロキシ安息香酸トリブチルスズエステル中間体に加え、これに１２．５ｍｍｏｌのテトラブチルアンモニウムブロマイドを加えた。混合物を窒素雰囲気で３時間加熱環流し、反応の進行を硫酸で炭化することによる検出を用いてＴＬＣによりモニターした。溶媒を減圧下で除去し、アセチル保護ｐＨＢＡエステルグルコシドを酢酸エチルとヘキサンの１：１混合物を用いた溶出により、シリカゲル上で精製した。その後１０％のメタノール水溶液中で１当量の炭酸カリウムを用いてアセチル保護基を３時間選択的に鹸化した。溶媒を減圧下で除去し、ｐＨＢＡエステルグルコシドをメタノールできれいにすりつぶした。メタノールをろ過により除去したところ得られた白色粉体は融点が２０９から２１０℃であった。ｐＨＢＡエステルグルコシドの化学構造を^１ＨＮＭＲを用いて確認した。
【０１１０】
ｐＨＢＡアシルグルコシドの合成用に１６．４ｍｍｏｌの４−ヒドロキシ安息香酸メチルと１４．６ｍｍｏｌのアセトブロモ−ａ−Ｄ−グルコースを７．０ｍｌの無水ピリジン中に溶解し、これに２３．３ｍｍｏｌの９９．９９％酸化銀を加えた。窒素雰囲気の下、室温で３時間反応物を攪拌した。不溶性の銀塩をろ過して取り出し、ピリジンで洗浄した。ろ液と洗浄液は集めて減圧下に濃縮し、氷水中に注いだ。暗褐色の固体を回収し、水ですすぎ、１：１のクロロホルムと塩化メチレン混合液に溶解し、ついで炭酸ナトリウムを乾燥剤として用いて乾燥した。この溶液をセライトでろ過し、溶媒を減圧下に除去した。このヒドロキシ結合安息香酸メチル、アセチル保護グリコシド（Ｄｕｒｋｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，（１９７９）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　７７：２５２−２５４）をシリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製した。カラムは酢酸エチルとヘキサンの１：２混合物で溶出した。精製化合物を４０ｍｌのメタノールに溶解し、ナトリウムメトキシド１．５ｍｍｏｌを加えた。４．５時間後、溶液が黄色に変色したので、溶媒を減圧下に除去し、得られた残渣を２５ｍｌの水に溶解した。溶液を５ｍｌ弱に濃縮し、結晶化させてヒドロキシ結合安息香酸メチルグリコシドを得た。結晶を回収し、高真空下で乾燥した。メチルエステル基を選択的に鹸化するために、２．５ｍｍｏｌのヒドロキシ結合安息香酸メチルグリコシドを２５ｍｌの水に溶解し、２．５ｍｌの１ＭのＮａＯＨを加えた。室温で一晩攪拌した後、溶液を中和し、５ｍｌ弱に濃縮して結晶化させ所望のｐＨＢＡアシルグリコシドを得た。この化合物の融点は１０８から１１０℃であり、化学構造は１ＨＮＭＲで確認した。
【０１１１】
（実施例９）
ｐＨＢＡグルコシドの分析用タバコリーフサンプルの調製
健康な葉（中央葉脈沿いの長さがおよそ１５ｃｍであるもの）をタバコ植物の茎の上部三分の一のところから選びとった。葉の先端から三分の一の部分から組織（生重量１００ｍｇ）を鋏で手早く切り取り、セラミックビーズを入れたＢｉｏｐｕｌｖｅｒｉｚｅｒ　Ｈ　Ｔｕｂｅ（ｃａｔ．ｎｏ．６５７０−２０１または６５４０−４０１、セラミックビーズと共にＢＩＯ　１０１（Ｊｏｓｈｕａ　Ｗａｙ、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）から入手）の中に入れた。１ｍｌのメタノールを加えて、このチューブに蓋をし、５ｍ／ｓの速度でＳａｖａｎｔ　ＦａｓｔＰｒｅｐ　ＦＰ１２０組織破砕機を４０秒間運転し、機械的攪拌を行った。次にチューブをロータリーシェーカーに置き、４００ｒｐｍで１時間、室温で激しく攪拌した。抽出物は通常の卓上遠心機による遠心（１０，０００ｘｇ、１０分）で清澄化し、二つのｐＨＢＡグルコシドを含有する上清を注意深く空のチューブへと取り出した。残りの不溶なリーフ物質は０．５ｍｌのメタノールを用い室温で３０分上記の条件下でロータリーシェーカーを用いて再抽出した。この第二の抽出から得た上清を第一のものと合わせ、サンプルをその後の処理のために−２０℃で保存した。リーフ物質の各サンプルに加えたメタノールの量と抽出・遠心分離後に回収した最終体積とを分析秤とメタノールの密度を用いて質量を体積に変換することによって決定した。
【０１１２】
ＨＰＬＣ分析用のサンプルは下記のように処理した。特に明記しない限り、すべての工程は室温において行った。メタノール抽出物の一定量を遠心機チューブに移し、上記のようにして正確な体積を求めた。溶媒をヒートセットをオンにしたＳｐｅｅｄ−Ｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）中、真空下で除去し、サンプルを完全に乾燥させた。乾燥残渣を１００μｌの０．２ＮＨＣｌに溶解し０．７ｍＬの水で飽和したジエチルエーテルを加えた。激しい渦巻き攪拌と遠心分離を行った後、エーテル層を注意深く除去して捨て、サンプルを上記に記載のようにエーテルを用いて再抽出した。残りの水層（５０μｌ）を０．２２ｕｍセルロースアセテートフィルター（Ｃｏｓｔａｒ　ＥＺ−ｓｐｉｎ）でろ過し、９０％バッファーＡ（０．１％ギ酸水溶液）と１０％バッファーＢ（メタノール）を１ｍｌ／ｍｉｎで用いて予め平衡化したＶｙｄａｃ２１８ＴＰ５４　ＰＲＯＴＥＩＮ　ＡＮＤ　ＰＥＰＴＩＤＥ　Ｃ１８カラムに注入した。サンプルの注入後、２０分かけてバッファーＢの最終濃度が５０％となるようにこのカラムを線形勾配で展開した。流速は１ｍｌ／ｍｉｎであった。フェノールとエステルのｐＨＢＡグルコシドの溶出を２５４ｎｍで分光光度法的にモニターした。図４にＴＰ−ＣＰＬ発現タバコ植物（形質転換体＃５）と野生型植物の代表的なＨＰＬＣチャートを示す。
【０１１３】
真正なｐＨＢＡグルコシド標準物質（上記参照）を用いてＨＰＬＣの保持時間の較正を行い、両化合物の吸光係数を、使用ＨＰＬＣ条件のもとで正確に求めた。ピーク領域をＨ／Ｐ　Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ添付のソフトウエアを用いて積分し、既知量の適切な標準物質から得た値を用いて注入ごとのｐＨＢＡグルコシドの量をマイクログラムで求めた。注入したオリジナルのメタノール抽出物の割合と希釈分とを加味した上で、分析したリーフサンプルからの全収量を反映するように数字を訂正した。これを分析した植物組織の乾燥重量の個々の測定値と合わせて（例えば同じ日に同じ植物から得たものなど）、ｐＨＢＡ−グルコシドを乾燥重量パーセントとして表した。
【０１１４】
（実施例１０）
自己交配Ｆ１世代におけるカナマイシン耐性の分離
自己交配によって得た初代タバコ形質転換体＃３４からの種を、０．１％のＳＤＳを含有する１０％の漂白溶液［Ｃｌｏｒｏｘ（商標）、５．２５％のＮａ（ＯＣｌ）_２を含有］に室温で３０分浸漬し、ゆるやかに攪拌して表面を殺菌した。抗生物質の選択を行わなかった時の２００個の種の発芽度数は９７．５％であった。対照的にカナマイシン（３００μｇ／ｍｌ）を含有した発芽培地上で培養した５００個の種のうちおよそ２０％が劣勢の表現型（例えばカナマイシン感受性の種のカナマイシン耐性種の割合が１：４であった）を示した。形質転換体＃３４の分離比が単一遺伝子優性形質の理論比である１：３に極めて近い（たとえば複座イベントの特徴である１：１６という割合とは異なる）ため、選択可能なマーカーとＴＰ−ＣＰＬ遺伝子発現構成体が単座でゲノムに安定的に取り込まれたのだという結論を得ることができるだろう。
【０１１５】
（実施例１１）
タバコリーフ抽出物中のＣＰＬ酵素活性の定量
野生型と遺伝子導入タバコ植物からのリーフ組織抽出物を調製し、わずかな修正を加えた他は先の記載のように分析して（（Ｓｉｅｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８１１−８１９（１９９６））ＣＰＬ酵素活性を求めた。リーフサンプル（湿重量２ｇ）を氷で冷した乳ばち中、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１％のβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオライドおよび７５ｍｇ／ｍｌのポリビニルポリピロリドンを含有する溶液２．６ｍｌにより均質化した。特に明記しない限り以降の工程はすべて０から４℃で行った。低速で遠心分離にかけ、不溶な物質を除いたあと、サンプルをＰＤ−１０ゲルろ過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ）を製造者の推奨通りに用いて、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、および２００ｍＭのＮａＣｌを含有するバッファーへと交換した。タンパク質濃度をＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質アッセイを用いて求めた。
【０１１６】
ＣＰＬ酵素アッセイを下記のように行った。基本となる反応混合物（最終体積５００μｌ）は５０ｍＭのＴｒｉｓ　ｐＨ８．０（３７℃）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣｌ、および１５０μＭの精製コリスミ酸バリウム（Ｓｉｅｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４０：８９７−９０４　（１９９４））を含有していた。５分間３７℃で培養した後、５０μｇのタンパク質を含むタバコリーフ抽出物により反応を開始した。３７℃で２分反応させた後０．３ｍｌの０．７５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）で反応を終了させ、反応中に製造されたｐＨＢＡの量を求めた。生成物の回収をモニターするために各チューブには９，５００ｄｐｍの［^１４Ｃ］で標識したｐＨＢＡ（５５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を内部標準として加えた。混合物をＨ_２Ｏ飽和酢酸エチル１ｍｌで抽出し、有機層を回収して乾燥した。ｐＨＢＡの量を実施例９に記載のものと全く同じカラムと条件を用いて逆層ＨＰＬＣにより定量した。ｐＨＢＡに対応するピークを回収し、液体シンチレーション計数により放射活性量を求めた。下記に報告するＣＰＬ酵素活性値はタンパク質１ｍｇあたりのｐｋａｔｓで表してあり、内部標準と自然分解を通じてコリスメートから製造された（Ｓｉｅｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８１１−８１９（１９９６））少量のｐＨＢＡについては修正済みである。
【０１１７】
（実施例１２）
遺伝子導入タバコ植物発現ＴＰ−ＣＰＬの分析
上に記載したように、ＴＰ−ＣＰＬをアグロバクテリウム媒介、リーフディスク形質転換を用いてタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）に導入し、そのｐＨＢＡグルコシド蓄積に与える影響を定量した。この人工融合タンパク質がこれまでに植物中のｐＨＢＡレベルを引き上げるのに用いられてきた他の大腸菌ＣＰＬの葉緑体標的化バージョン（Ｓｉｅｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８１１−８１９（１９９６）；Ｓｏｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ１７：８９１−８９６（１９９８））より実際に優れているということが図５に示すデータから明らかである。この分析は異なる形質転換イベントより生じた１５のタバコ植物（初代形質転換体）から得た葉の組織に対して行った。サンプルは植物が土壌に移されてから５週間後に採取されたことに注目して頂きたい。予測通り、初代の形質転換体は全乾燥重量に基づき、０から２．３％にわたるさまざまなｐＨＢＡグルコシドレベルを示した。このような変動は通常あらゆる植物形質転換実験において観察されるもので、おそらくいわゆる「位置」効果（例えば形質遺伝子がゲノムの異なる位置に安定に導入される）から生じる遺伝子発現レベルの差を反映しているのであろう。同様の現象が本研究においても生じたということは、精製組み換え大腸菌ＣＰＬに対する抗血清を用いたタバコ形質転換体のウェスタンブロット分析でも支持されている。例えば植物の大半（例えば１４／１５）が免疫学的に検出可能なレベルの外来タンパク質を有していたが、発現のレベルにはかなりの開きがあった。しかし一般的に言えば、ウェスタン信号の強度とｐＨＢＡグルコシドの蓄積の間には正の相関がありこれまでに観察されていること（Ｓｉｅｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８１１−８１９（１９９６））；Ｓｏｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９（１１）：１２４０−１２４４（１９９８）；Ｓｏｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１７：８９１−８９６（１９９８））と一致した。
【０１１８】
乾燥重量に基づく５週のタバコ植物の平均ｐＨＢＡグルコシド含量は、１．１２％（＋／−０．１８６％）であり、ここで（）の中の数字は平均の標準誤差である。さらに重要なのは、初代形質転換体のうち３体（＃１３、＃１９および＃３７）のみにおいてｐＨＢＡグルコシドのレベルがＴＰ−ＵｂｉＣ人工融合タンパク質での同様の研究（Ｓｉｅｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８１１−８１９（１９９６））で得られた最高レベルである、０．５２％を下回ったことである。さらに本研究における３つの最良の植物（＃８、＃３４、および＃３９）は少なくとも乾燥重量の２％になるｐＨＢＡグルコシド含量を有していた。
【０１１９】
所望の表現系の安定性を調べるために、３体の遺伝子導入タバコ植物（＃４、＃５、および＃３４）を種子形成の段階まで、長期に渡りモニターした。植物が発育を続けるにつれｐＨＢＡグルコシドのレベルをそのように高く維持することはできない可能性があった。しかし、図６に示すように、そうではなかった。植物が成長するにつれ、その葉のｐＨＢＡグルコシド含量は急激に増加した。例えば土壌に植物を移した後１、５、１１および１３週後の時点での形質転換体＃５の全ｐＨＢＡグルコシドレベルは乾燥重量のそれぞれ０．５％、１．６％、７．２％および１０％であった。１３週の値はＴＰ−ＵｂｉＣで得られた値のほぼ２０倍の増加を表しており、附随したグルコース分子の質量を補正した後、４．５％弱のｐＨＢＡ含量に相当する。これらの極めて高いレベルの２次代謝生成物にもかかわらず、遺伝子導入タバコ植物は完全に正常のようであるし、また形態学的には野生型植物と区別がつかない。
【０１２０】
外来遺伝子とｐＨＢＡ蓄積の関連表現型の次世代へ運命をたどるため、形質転換体＃３４をさらなる分析のために選択した。１３週の初代形質転換体として、この植物のｐＨＢＡグルコシド含量は全乾燥重量の８％（図６）であった。実施例１０に記載のように、自己交配により得た種子をカナマイシンの存在下で発芽させ、抗生物質耐性表現系の分離のために調べたところ、観察された比率は１（感受性）対４（耐性）であった。これは選択可能なマーカーとＴＰ−ＣＰＬの取り込みがゲノム中の単座でおこり、二座イベントではない（その場合カナマイシン耐性の分離比は１：１５となるであろう）ことを示唆している。理論的に、カナマイシン耐性植物は二つの集団、２：１の割合で存在する異型接合体と同型接合体からなる。共抑制がないとすると、同型接合体植物はＣＰＬ酵素活性が異型接合体のものよりも２倍多くなることが予想され、おそらくｐＨＢＡグルコシドの蓄積レベルもより高いことであろう。この問題に当たるため、カナマイシン耐性の幼苗５本（下記では＃３４Ａ−＃３４Ｅとする）を成熟植物まで育成しＣＰＬ酵素活性とｐＨＢＡグルコシドについて分析した。サンプルを採取した時の植物は１５週齢であった。この研究の結果を下記の表Ｉに示す。
【０１２１】
表Ｉ
植物３４　　　　　　　　　ＣＰＬ酵素活性　　　　　全ｐＨＢＡグルコシド
兄弟苗　　　　　　　（ｐｋａｔ／タンパク質ｍｇ）　　量（乾燥重量％）
３４Ａ　　　　　　　　　　　　９２７　　　　　　　　　　４．８
３４Ｂ　　　　　　　　　　　　９９１　　　　　　　　　　５．９
３４Ｃ　　　　　　　　　　　１０４８　　　　　　　　　　５．０
３４Ｄ　　　　　　　　　　　　７８４　　　　　　　　　　５．０
３４Ｅ　　　　　　　　　　　　３５６　　　　　　　　　　３．２
【０１２２】
予測通り、カナマイシン耐性のすべての幼苗はまたＣＰＬ酵素活性と蓄積ｐＨＢＡグルコシドを示した。したがってこの人工融合タンパク用の遺伝子、ＴＰ−ＣＰＬは安定に次世代へと伝えられていたのであった。調べた植物の数は少ないが二つの異なる集団があるように思われた。子孫のうち４つ（例えば＃３４Ａ−３４Ｄ）のＣＰＬ酵素活性は極めて類似しておりタンパク質１ｍｇあたり７８４からから１、０４８ｐｋａｔｓであった。このグループの平均ＣＰＬ活性（例えば９３８ｐｋａｔ／ｍｇ）は生きているタバコ植物を検査した時にＴＰ−ＵｂｉＣで得られたもっともよい値（Ｓｉｅｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８１１−８１９（１９９６））の約４．５倍以上の数字であることに注意して頂きたい。おなじ４つの子孫はｐＨＢＡグルコシドに関しても同等レベルを示した。平均値は乾燥重量の５．２％弱であり、数字は極めて似通ったものであった（例えば４．８％−５．９％）。
【０１２３】
これとは対照的に、植物のうち一本（例えば＃３４Ｅ）はＣＰＬ酵素活性とｐ４グルコシドのレベルが遥かに低かった。この子孫が異型接合体であり、他の４つが同型接合体であるという推測を行いたくなるが、この結論を引き出すのはまだ時期尚早である。第一にカナマイシン耐性表現型に対して得た分離パターンに基づくと植物の三分の一のみが同型接合体であると思われ、観察された８０％ではないのである。第二に２倍の数の形質遺伝子を有する同型接合状態は共抑制へと導かれ、逆説的に低レベルのＣＰｌ酵素活性とｐＨＢＡグルコシドを生じることが考えられる。この問題を解決すべく現在実験を行っているところである。にもかかわらず、ｐＨＢＡグルコシドの第二世代の植物中の蓄積が初代形質転換体におけるほど高くなかったことに注目することは興味深い。
【０１２４】
（実施例１３）
ＴＰ−ＣＰＬのタンパク質分解処理が生体内で予測された開裂部位において生じる
図７に示すように、人工融合タンパク質、ＴＰ−ＣＰＬを発現する遺伝子導入タバコ植物の全葉抽出物は、抗精製組み換え大腸菌ＣＰＬ抗血清と交叉反応するたった一つのポリペプチドのみを含有する。さらにこの野生型植物には存在しない交叉反応性ポリペプチドの大きさは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べるとタバコに導入された元々の融合タンパク質よりもはるかに小さい。実際これはＴＰ−ＣＰＬの予測された葉緑体開裂生成物（実施例４）である精製組み換えΔＴＰ−ＣＰＬと、またインビトロ葉緑体輸入実験（実施例５）の後観察される放射性バンドと厳密に共泳動するように見える。しかし人工融合タンパク質からの葉緑体標的配列の除去は生体内で予測された開裂部位で生じることを異論の余地なく示すために、このタンパク質をタバコ形質転換体＃３４から得た葉の組織から精製し、そのＮ−末端アミノ酸残基をエドマン分解によって決定した。
【０１２５】
葉の組織（湿重量６．９ｇ）を乳ばちと乳棒により５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオライド、そして７５ｍｇ／ｍｌのポリビニルポリピロリドンを含有する氷冷溶液（グラインドバッファー）で均質化した。特に明記しないかぎり以降の工程は０から４℃で行った。葉抽出液を３０分遠心分離（４０，０００ｘｇ）して不溶な物質を除去し、得られた上清に固体（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を補って最終濃度を８０％（ｗ／ｖ）とした。この溶液を３０分緩やかに攪拌し、１０分間２０，０００ｘｇで遠心分離してタンパク質の大半を沈澱させた。上清を捨て、得られたペレットを２．０ｍｌのポリビニルポリピロリドンを含有せず、８％（ｖ／ｖ）のグリセロールを補ったグラインドバッファー中にタンパク質濃度が１ｍｌ中１４．３ｍｇ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質アッセイにより求めた）となるように再懸濁した。
【０１２６】
上記サンプルの一定量（０．５ｍｌ）をＰＤ−１０ゲルろ過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ）を用いてバッファーＱ（実施例２）中に交換した。サンプルが完全に樹脂中に入った後、カラムを２．２ｍｌのバッファーＱで洗浄し溶出液を捨てた。同じバッファーをさらに１．１ｍｌ加えた後、空隙容量中に溶出してくる物質を回収した。全サンプルを室温でバッファーＱで平衡化しておいたＭｏｎｏＱＨＲ５／５に付した。カラムを同バッファーを流量１．０ｍｌ／ｍｉｎで用いて展開し、画分（それぞれ１．０ｍｌ）をサンプル注入時から回収した。ＴＰ−ＣＰＬの葉緑体開裂生成物を含有する画分を抗精製組み換え大腸菌ＣＰＬ抗血清を用いてウェスタンブロット分析により同定した。実質的にすべての交叉反応性物質は画分＃３と＃４に溶出し、前と同様抗血清により検出された唯一の種は精製組み換えΔＴＰ−ＣＰＬと共泳動した。カラム画分＃３と＃４をプールし、７．５％のグリセロール、０．３ＭのＮａＣｌと０．０１％のＴｗｅｅｎ２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　ｃａｔ．＃１７０−６５３１）で補い、最終的に体積が約２００μｌとなるまでＣｅｎｔｒｉｃｏｎ１０（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて濃縮した。全サンプルを予め室温で５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ　（ｐＨ７．２）、０．３ＭのＮａＣｌ、そして０．０１％のＴｗｅｅｎで平衡化しておいた２０７．５ｘ６００ｍｍのＴＳＫ　Ｇ３０００ＳＷゲルろ過カラム（ＴＯＳＯＨ　Ｃｏｒｐ．）に付した。カラムを１．０ｍｌ／ｍｉｎ（２５℃）で、同バッファーにより展開し、真正ＴＰ−ＣＰＬ葉緑体開裂生成物を含有していた、２１．５から２３分の間に溶出した画分をプールし最終的に体積が５５μｌとなるまでＭｉｃｒｏｃｏｎ１０（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて濃縮した。濃縮した物質をサンプルバッファーで１：１に希釈し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し精製度を評価した。多数の他のバンドもクーマシーブルーで染色したゲル中に見られたが、ＴＰ−ＣＰＬ葉緑体開裂生成物が主たるタンパク質であり、他の不純物からよく分離されていた。このバンドに対応するポリペプチドのＮ−末端分析（ポリビニリデンジフルオライド膜への電気泳動移入と、６サイクルのエドマン分解後）を行ったところ、この人工融合タンパク質のタンパク分解処理が予測された開裂部位、すなわち図１に示すＣｙｓ−Ｍｅｔ結合、において生じていたことが確認された。この観察と実施例４に示した酵素活性データから、ＴＰ−ＣＰＬを発現するタバコ植物の葉緑体中でコリスメートのｐＨＢＡへの変換を担当するポリペプチドはそのＮ−末端に５個の追加のアミノ酸残基が結合した完全に活性のあるＣＰＬ変異株であるという結論を導くことができるであろう。
【０１２７】
（実施例１４）
ＴＰ−ＣＰＬ発現遺伝子導入シロイヌナズナ植物の生成と分析
人工融合タンパク質であるＴＰ−ＣＰＬをシロイヌナズナに導入しｐＨＢＡグルコシドレベルを求めた。ＣａＭＶ３５Ｓ−ＣＰＬ発現カセット（例えばＴＰ−ＣＰＬ−ｐＺＢＬ１）を有するバイナリーベクターを武装解除Ｔｉ（ビルレンス）プラスミドｐＭＰ９０（Ｋｏｎｃｚ、Ｃ．　ａｎｄ　Ｓｃｈｅｌｌ、Ｊ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４：３８３−３９６）を有するアグロバクテリウム‐ツメファシエンス株Ｃ５８Ｃ１Ｒｉｆ（ＧＶ３１０１株としても知られている）中に利用可能なプロトコルを用いたエレクトロポレーション（Ｍｅｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４：１４５２−１４５５）　により形質転換した。ＣＰＬ発現構成体を有するバイナリーベクターを有するＭＰ９０株を野生型、ｆａｈ１−２（Ｃｈａｐｐｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　４：１４１３−１４２４（１９９２））、ｓｎｇ１−１（Ｌｏｒｅｎｚｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ１１２：１６２５−１６３０（１９９６））遺伝的背景を有する、生態型コロンビアのシロイヌナズナ植物の形質転換を公開されている真空浸透技法（Ｃｌｏｕｇｈ　Ｓ．Ｊ．，Ｂｅｎｔ　Ａ．　Ｆ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．１６（６）：７３５−４３）を用いて行った。遺伝子導入幼植物体は無菌状態のもと標準植物増殖培地上で選抜用にカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を用いて同定した。カナマイシン耐性幼植物体を土壌に移し、土／パーライト混合物で１２時間明／１２時間暗の光周期、１００Ｅｍ^−２ｓ−^１、１８℃（暗）および２１℃（明）で育成した。この手順を通じ３０１個の初代の形質転換体が独立した形質転換イベントから生成された。土壌に移して６週間後に形質転換したシロイヌナズナ植物体のｐＨＢＡグルコシドを下記に記載するように逆層ＨＰＬＣを用いて分析した。
【０１２８】
切り取った新鮮な葉を５０％のＭｅＯＨ中で均質化（湿重量ｍｇあたり５μｌ）し、得られた抽出物を低速遠心分離によって清澄化した。葉抽出物の一定量を１．５％のリン酸含有アセトニトリルの勾配（６％−４８％）を用いてＮｏｖａ−Ｐａｋ　Ｃ１８Ｌカラム（孔径６０オングストローム、粒径４μｍ）に付した。ｐＨＢＡフェノールおよびエステルグルコシドを２５４ｎｍにおけるＵＶ吸収により検出し、真正化学表純物質（実施例８を参照）から得た吸光係数を用いて定量した。分析した２７２体の遺伝子導入シロイヌナズナ植物体のうち、２３９（すなわちほぼ８８％近く）に検出可能レベルの両グルコース接合体が含まれており、これらはほぼ同量存在した。最も良く過剰生産を行った株の全ｐＨＢＡグルコシド含量は乾燥重量の１０．７３％であり、これは同じ構成体を用いてタバコで行った時に観察された最高レベルに極めて近い値であった。遺伝子導入シロイヌナズナ植物全集団の平均値は３．３５％（＋／−０．１３％）であった。（）に入れた数字は平均の標準誤差である。
【０１２９】
これらの両結果から、本キメラタンパク質、ＴＰ−ＣＰＬ、はタバコのみならずその他の植物種においてもｐＨＢＡグルコシドを高レベルで産生することができることがはっきり示されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１はＣＰＬの二つの異なる葉緑体標的バージョンの一次アミノ酸配列を示す。両方とも人工融合タンパク質である。３行目のものは先の研究（Ｓｉｅｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８１１−８１９（１９９６）Ｓｏｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９（１１）：１２４０−１２４４（１９９８）；Ｓｏｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１７：８９１−８９６（１９９８）Ｓｏｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　３９：６８３−６９３（１９９９））、に用いられたものでＴＰ−ＵｂｉＣに対応し、一方２行目のものは本研究で形成したＴＰ−ＣＰＬに対応する。大腸菌ＣＰＬ（４行目）とｒｂｃＳ２用のトマトルビスコ小サブユニット前駆体（１行目）もまた配列に含められている。「成熟」ルビスコ小サブユニットに対応するアミノ酸残基は太字で示した。ルビスコ小サブユニット前駆体のＮ−末端葉緑体トランジットペプチドはふつうの文字で示してある。大腸菌ＣＰＬの一次アミノ酸配列は斜体で示してある。矢印は高度に保存されているＣｙｓ−Ｍｅｔ接合　（Ｍａｚｕｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１３：２３７３−２３８６　（１９８５）；　Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　ａｎｄ　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎ．　１、　４８３−４９８　（１９８２））を示し、ここでトランジットペプチドは通常開裂し、成熟ルビスコ小サブユニットを生じる。
【図２】
図２は中間体プラスミド「ＴＰ−ＣＰＬ−ｐＭＬ６３」と関連制限部位を図（環状のダイアグラム）で示す。
【図３】
図３はアグロバクテリウムに導入してからタバコとシロイヌナズナの形質転換に用いたバイナリーベクター植物発現構成体「ＴＰ−ＣＰＬ−ｐＺＢＬ１」を図（環状のダイアグラム）で示す。
【図４】
図４はＴＰ−ＣＰＬ（形質転換体＃５）を発現する遺伝子導入タバコ植物から調製した葉の組織の抽出物の代表的なＨＰＬＣのチャートを野生型のものと比較したものである。
【図５】
図５はＴＰ−ＣＰＬを発現した１５の異なる遺伝子導入タバコ植物の全ｐＨＢＡグルコシド含量を示す。この分析は初代の形質転換体を土壌に移してから５週間後に得た新鮮な葉に対して行った。
【図６】
図６はＴＰ−ＣＰＬを発現した形質転換タバコ植物中の全ｐＨＢＡグルコシドの蓄積が植物体の齢に依存することを示す。この分析は異なる成長の段階で初代形質転換体から採取した葉組織に対して行った。全ｐＨＢＡグルコシド量は乾燥重量のパーセントで表した。
【図７】
図７は野生型（レーン９）とＴＰ−ＣＰＬを発現した遺伝子導入タバコ植物（レーン１から７）に対して行ったウェスタンブロットである。この分析は５週齢の初代形質転換体から得た葉組織に対して行った。レーン８は２０ｎｇの精製組み換えΔＴＰ−ＣＰＬ（例えば、予測されたＴＰ−ＣＰＬの葉緑体開裂生成物）を含有している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続き、タンパク質はニトロセルロースへと移し抗ＣＰＬ抗血清で１：２００に希釈したもので検査した。

Claims (19)

1. 緑色植物中でパラヒドロキシ安息香酸を生産する方法であって、
   ａ）コリスメートの内在性供給源を有し、および下記の構造を有するコリスメートピルベートリアーゼ発現カセットを含む緑色植物を提供する工程
   Ｐ−Ｔ−Ｃ−Ｄ−ＣＰＬ
   （式中、
   Ｐはコリスメートピルベートリアーゼ遺伝子の発現をドライブするのに適するプロモーターであり、
   Ｔはルビスコ葉緑体トランジットペプチドをコードする核酸分子であり、
   Ｃはルビスコ葉緑体トランジットペプチド開裂部位をコードする核酸分子であり、
   Ｄはルビスコ葉緑体トランジットペプチドドナーポリペプチドのＮ−末端部の約４個から約２０個の連続アミノ酸をコードする核酸分子であり、および
   ＣＰＬは成熟コリスメートピルベートリアーゼタンパク質をコードする核酸分子であり、
   ここでＰ、Ｔ、Ｃ、ＤおよびＣＰＬはそれぞれ、該カセットの発現によって、成熟コリスメートピルベートリアーゼタンパク質のＮ−末端に融合する葉緑体標的配列を含むキメラタンパク質の翻訳が生じるように、作動可能に結合する。）、
   ｂ）前記キメラタンパク質が発現し、葉緑体に転流して、コリスメートがパラヒドロキシ安息香酸グルコシドとパラヒドロキシ安息香酸誘導体へと変換するような条件のもとで前記植物を栽培する工程、
   ｃ）パラヒドロキシ安息香酸とパラヒドロキシ安息香酸誘導体を前記植物体から回収する工程、ならびに
   ｄ）前記パラヒドロキシ安息香酸グルコシドとパラヒドロキシ安息香酸誘導体を処理して遊離パラヒドロキシ安息香酸にする工程
   を含むことを特徴とする方法。
2. 前記ルビスコトランジットペプチドが、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オートムギ、モロコシ、コメ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、テンサイ、サトウキビ、キャノーラ、キビ、マメ、エンドウマメ、ライムギ、アマ、および飼草からなる群から選択される植物に由来することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記プロモーターが、３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、オクトピンシンターゼプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼプロモーターおよびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
4. 前記コリスメートピルベートリアーゼ酵素が配列番号３に示す核酸配列によってコードされることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
5. 前記成熟コリスメートピルベートリアーゼタンパク質のＮ−末端に融合する葉緑体標的配列を含む前記キメラタンパク質が、配列番号８に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
6. 前記成熟コリスメートピルベートリアーゼタンパク質のＮ−末端に融合する葉緑体標的配列を含む前記キメラタンパク質が処理されて、配列番号１６に示すアミノ酸配列となることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. 植物バイオマスの乾燥重量当たり少なくとも２％の濃度のパラヒドロキシ安息香酸グルコシドで前記ｐＨＢＡグルコシドを生産することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
8. 植物バイオマスの乾燥重量当たり少なくとも１０％の濃度のパラヒドロキシ安息香酸グルコシドで前記パラヒドロキシ安息香酸グルコシドを生産することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
9. コリスメートピルベートリアーゼ発現カセットを含む前記緑色植物が、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オートムギ、モロコシ、コメ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、テンサイ、サトウキビ、キャノーラ、キビ、マメ、エンドウマメ、ライムギ、アマ、および飼草からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
10. 植物バイオマスの乾燥重量当たり４．５％を超える濃度のｐＨＢＡで前記パラヒドロキシ安息香酸を生産することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
11. 配列番号４に示すアミノ酸配列を有するコリスメートピルベートリアーゼ酵素をコードする核酸分子に作動可能に結合する、配列番号１５に示すアミノ酸配列を有するリブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット葉緑体標的配列をコードする核酸分子を有するキメラ遺伝子を含むことを特徴とする、コリスメートピルベートリアーゼ発現カセット。
12. 前記キメラ遺伝子が配列番号８に示すポリペプチドをコードすることを特徴とする、請求項１１に記載のコリスメートピルベートリアーゼ発現カセット。
13. 請求項１１に記載のＣＰＬ発現カセットを含むことを特徴とする植物。
14. ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オートムギ、モロコシ、コメ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、テンサイ、サトウキビ、キャノーラ、キビ、マメ、エンドウマメ、ライムギ、アマ、および飼草からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の植物。
15. 配列番号８に示すアミノ酸配列を有する成熟コリスメートピルベートリアーゼタンパク質のＮ−末端に融合する葉緑体標的配列を含むことを特徴とするキメラタンパク質。
16. 配列番号１５に示すアミノ酸配列を有する成熟ＣＰＬタンパク質のＮ−末端に融合する葉緑体標的配列を含むキメラタンパク質をコードすることを特徴とする、分離された核酸断片。
17. 配列番号７に示す前記配列を有することを特徴とする、請求項１６に記載の分離された核酸断片。
18. 配列番号１６に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１５に記載の葉緑体開裂生成物。
19. 請求項１８に記載の処理されるタンパク質をコードすることを特徴とする、核酸断片。

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