JPH05328981A

JPH05328981A - パラヒドロキシ安息香酸の製造方法

Info

Publication number: JPH05328981A
Application number: JP14433592A
Authority: JP
Inventors: Daizo Takeuchi; 内大造武; Kenichi Uehara; 原健一上; Masaharu Ishikura; 倉正治石
Original assignee: Kawasaki Steel Corp
Current assignee: JFE Steel Corp
Priority date: 1992-06-04
Filing date: 1992-06-04
Publication date: 1993-12-14

Abstract

(57)【要約】【目的】従来は高温・高圧の反応で化学合成されていた
パラヒドロキシ安息香酸を省エネルギー的に微生物によ
る変換によりパラクレゾールから安価に製造する方法。【構成】エンテロバクター属に属し、パラクレゾールを
パラヒドロキシ安息香酸に変換する能力を持った菌体を
用いて、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変
換するパラヒドロキシ安息香酸の製造方法。例えば、前
記菌体を増殖させた後、パラクレゾールを添加して培養
を継続するか、または増殖の開始点でパラクレゾールを
添加して培養し、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息
香酸に変換させた後、その培養液からパラヒドロキシ安
息香酸を分離するパラヒドロキシ安息香酸の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、パラクレゾールを微生
物を用いて変換し、パラヒドロキシ安息香酸を製造する
方法に関する。さらに詳しく述べると、本発明は、エン
テロバクター属に属し、パラクレゾールをパラヒドロキ
シ安息香酸に変換する能力を持った菌体を用いて、パラ
クレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換するパラヒ
ドロキシ安息香酸の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、パラヒドロキシ安息香酸の製造
は、フェノールを原料とし、そのカリウム塩に二酸化炭
素を高温・高圧下で作用させるコルベ・シュミット法に
よる化学合成法が一般に行われてきた。しかし、反応条
件として高温・高圧を要するためにエネルギー消費量が
大きく、またアルカリ塩を多量に使用するなどの問題が
あった。

【０００３】一方、微生物を用いたパラヒドロキシ安息
香酸の製造法は、常温・常圧で進行し、エネルギー的に
も有利なことが期待される。しかし、これまでの微生物
転換法はアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger
(ＵＢＣ８１４））の菌体抽出酵素による安息香酸から
のパラヒドロキシ安息香酸の生成（Reddy,C.C. & Vaidy
anathan,C.S.;Biochim.Biophys.Acta 384, 46-57) や、
パラキシレンを唯一の炭素源とするシュードモナス−エ
ルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa) のパラキシレン
代謝経路でパラクレゾールやパラヒドロキシ安息香酸を
検出している例（大森など、Agri.Biol.Chemi.Vol 31,
1337(1967)) 、シュードモナス属菌株のパラクレゾール
代謝(S.Dagrey およびM.D.Patel; Biochem. J., 66, 22
7(1967))が知られている程度で、しかもいずれの反応も
安息香酸からの生成や代謝分解中間体としてパラヒドロ
キシ安息香酸を検出して、パラキシレンの分解がパラヒ
ドロキシ安息香酸を経て進行することを明らかにしてい
るに過ぎない。パラクレゾールを微生物に原料として与
え、これを変換してパラヒドロキシ安息香酸を生成させ
て培地中に著量蓄積させて採取することは示唆されてい
ない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、常温
・常圧で進行する経済的な微生物転換法を利用して、パ
ラヒドロキシ安息香酸を製造する新規な方法を提供する
ことである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、化学的合
成法よりも省エネルギー的である微生物の物質変換能に
着目した。すなわち、微生物に増殖を支える基質を与え
て増殖させ、この培養液にパラクレゾールを共存させ
て、これを酸化し、変換させるコ・オキシデーション
（Co-oxidation) の方法によってパラヒドロキシ安息香
酸を生成させ、これを分解させることなく著量蓄積させ
る方法を完成することを目的とした。そこで、本発明者
らはコ・オキシデーションによりパラクレゾールからパ
ラヒドロキシ安息香酸を生成する能力を持つ微生物を検
索した結果、エンテロバクター属に属する細菌菌株に、
パラクレゾールのみをパラヒドロキシ安息香酸に変換す
る菌株を見いだし、本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明は、エンテロバクター属
に属し、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変
換する能力を持った菌体を用いて、パラクレゾールをパ
ラヒドロキシ安息香酸に変換するパラヒドロキシ安息香
酸の製造方法を提供する。前記エンテロバクター属に属
し、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換す
る能力を持った菌体をパラクレゾールを添加した培地で
培養するパラヒドロキシ安息香酸の製造方法を提供す
る。前記エンテロバクター属に属し、パラクレゾールを
パラヒドロキシ安息香酸に変換する能力を持った菌体を
培養して菌体を増殖させた後、パラクレゾールを一度に
あるいは分割して添加して培養を継続するパラヒドロキ
シ安息香酸の製造方法を提供する。前記エンテロバクタ
ー属に属する菌体を培養させた後、菌体を回収して、該
菌体を用いてパラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸
に変換するパラヒドロキシ安息香酸の製造方法を提供す
る。前記エンテロバクター属に属し、パラクレゾールを
パラヒドロキシ安息香酸に変換する能力を持った菌体
が、エンテロバクター・クロッカエ（Enterobacter clo
acae）であるパラヒドロキシ安息香酸の製造方法を提供
する。

【０００７】本発明で使用する菌株は、エンテロバクタ
ー属に属するものの内、パラクレゾールを選択的にパラ
ヒドロキシ安息香酸に変換する能力を有する菌株であれ
ばよい。したがって、土壌から単離した菌株で、バージ
ース・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオ
ロジー（Bergey's Mannual of Systematic Bacteriolog
y)，Ｖｏｌ．１（１９８４）に記載の基準により、エン
テロバクター属に属する菌株であると同定した菌株であ
ってもよい。本発明の具体的なエンテロバクター属に属
する菌体としては、エンテロバクター・クロッカエ（En
terobacter cloacae) ＩＦＯ１３５３５が挙げられ
る。

【０００８】本発明者は、この細菌菌株が、上述したよ
うに、コ・オキシデーション作用によりパラクレゾール
を変換して、パラヒドロキシ安息香酸を生成することが
できることを知見し本発明に至った。

【０００９】本発明の製造方法は、エンテロバクター属
に属する菌体のコ・オキシデーション作用を利用するこ
とにより、微生物の培養液中に出発物質を共存させ、微
生物の増殖は変換させたい出発物質とは別の、増殖に必
要な炭素源、窒素源で行い、増殖した微生物が培養液中
に共存させた出発原料を酸化・変換させること、あるい
は増殖した微生物を分離回収した後、微生物菌体を懸濁
した反応液を調整して変換反応に必要なエネルギー源を
供給しながら微生物の酸化能力を利用して出発原料を酸
化・変換させることであり、本発明では、エンテロバク
ター属に属する細菌、例えばエンテロバクター・クロッ
カエに属する菌株、特にエンテロバクター・クロッカエ
ＩＦＯ１３５３５株を用いて、パラクレゾールをパ
ラヒドロキシ安息香酸に酸化・変換することである。

【００１０】本発明の製造方法は、微生物を増殖させる
工程および微生物を利用してパラクレゾールをパラヒド
ロキシ安息香酸に変換する工程を包含する。また、微生
物を増殖させる工程（増殖工程）と微生物を利用してパ
ラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換する工程
（変換工程）は、別々の工程であっても、同時に行われ
る工程であってもよい。

【００１１】本発明の方法で使用する細菌菌株を増殖す
る（増殖工程）ための培地としては、通常の細菌用培地
を使用してもよいが、この菌株が良好に成育できる培地
で、かつ微生物変換反応を進行させるものであれば、い
かなる組成の培地も使用できる。この時に用いる培地
は、培地成分として、適当な炭素源、窒素源および無機
塩などを含有しうる。また、本発明の変換工程に使用す
る培地は、菌体増殖用と同様の培地を用いてもよく、ま
た異なる培地を用いてもよい。また、菌体を増殖させた
後、菌体の変換作用を維持できる溶液、例えば、生理食
塩水のような溶液を培地の代わりに用いてもよい。培地
成分に、前記菌体を増殖するための培地に含まれる成分
と同じ成分を含み得る。

【００１２】炭素源としては、本発明の菌株が利用でき
る任意の炭素源が使用できる。かかる炭素源として利用
できる有機物には、上記の菌学的性質において示したよ
うに、グリセリンなどの有機化合物、グルコース、フラ
クトースなどの炭水化物、オリーブ油、大豆油などの脂
質、エタノールなどのアルコールあるいはコーンスティ
ープリカー、廃糖蜜など農産物の抽出・精製残渣、ある
いはマロン酸、クエン酸などの有機酸が例示できる。菌
体増殖工程の培地の場合には、上述したような本発明の
菌株が利用し得る１種または２種以上の炭素化合物を任
意に炭素源として利用できる。また、変換工程の培地の
場合には、菌体増殖工程と同じ炭素源が利用できるが、
グリセリンなどの有機化合物、グルコース、フラクトー
スなどの炭水化物が好ましい。炭素源の含有量は、炭素
源の種類によっても異なるが、培地中２重量％以上であ
るのが好ましい。

【００１３】窒素源としては、特に限定されないが、硫
酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素化合
物、およびペプトン、酵母エキス、カザミノ酸などの有
機窒素源が利用できる。有機窒素化合物を用いた場合、
これには炭素も含まれているので、別の炭素源を新たに
加えることは増殖用培地の場合には必ずしも必要としな
い。

【００１４】無機塩類としては、各種のリン酸塩、硫酸
マグネシウム、ナトリウム塩、カリウム塩等が使用でき
る。さらに、微量の重金属類（例えば、鉄塩、マンガン
塩、銅塩、カルシウム塩、亜鉛塩、コバルト塩など）を
培地に含有させてもよい。

【００１５】培養方法としては、振盪培養法、深部通気
攪拌培養法などの方法により行うことができる。培養温
度は、２０〜３７℃、ＰＨは中性付近、攪拌は８０〜４
００ｒｐｍ、培養日数は反応の進行に応じて決めること
ができるが、通常は菌体増殖に１〜２日、パラクレゾー
ルをパラヒドロキシ安息香酸に変換するのには、約２日
が適当である。２日を超えると、菌体の増殖工程では、
増殖能の低下の点で好ましくなく、変換工程では、副生
成物が生成する点で好ましくない。両方の工程を合せ
て、２〜３日程度であるのが適当である。この時に変換
の原料となるパラクレゾールは水に難溶性であるため
に、ポリオキシエチレンソルビタンなどの各種の界面活
性剤を培地に添加することも可能である。また、必要に
応じて、脂肪酸エステル系、シリコン系などの消泡剤を
添加してもよい。

【００１６】本発明の製造方法に用いるパラクレゾール
は、菌体の増殖培養開始時に添加してもよく、また、菌
体の増殖培養後添加してもよい。さらに、増殖培養時お
よび増殖培養後の両方に添加してもよい。菌体の増殖培
養開始時に添加する場合、添加するパラクレゾールの培
養液中の濃度は、３重量％以下、特に１重量％以下であ
るのが好ましく、さらに０．２〜０．５重量％であるの
が好ましい。３重量％超では、微生物が十分に作用しな
くなるので好ましくない。また、菌体の増殖培養後添加
する場合、パラクレゾールを添加する時期は、菌体濃度
が、６６０ｎｍの吸光度で、１．０〜１０．０の時に添
加するのが好ましい。また、経時的に添加する場合、増
殖後１日目、２日目に等量に分割して添加してもよい
し、さらに低濃度で、例えば０．２〜０．３重量％濃度
を保ちながら、菌体の増殖にあわせて連続的に添加して
もよい。添加するパラクレゾールの培養液中の濃度は、
３重量％以下、特に１重量％以下であるのが好ましく、
さらに０．２〜０．５重量％であるのが好ましい。５重
量％超では、微生物が十分に作用しなくなるので好まし
くない。パラクレゾールを添加する時期を、菌体の増殖
前にするのと増殖後にするのとでは、菌体の増殖後に添
加した方が５〜１０％変換率が高い。

【００１７】さらに、増殖工程および変換工程を、パラ
クレゾールを添加する時期の組み合わせで考えると、以
下の組み合わせが例示される。１）パラクレゾールを、増殖工程の開始点で加え、増殖
工程と変換工程を同時に行う。２）微生物を増殖させた後パラクレゾールを加えて、変
換工程を行う。パラクレゾールの添加は、変換工程の途
中、または開始点と途中の両方で添加する。３）パラクレゾールの添加を増殖工程と変換工程とに各
々少なくとも１回以上行い、増殖工程の後に菌体を培地
から分離して変換工程の培地に移植する。上述の変換工程の培地は、増殖工程に用いた培地と同様
の培地であってもよく、また、本発明の菌体が有する変
換作用を妨げない溶液、例えば、生理食塩水のような溶
液であってもよい。また、前記２）の方法では、菌体を
増殖後、パラクレゾールを添加して培養を継続すること
が含まれる。

【００１８】変換反応終了後、生成したパラヒドロキシ
安息香酸を培養液から分離・精製する方法は、一般の有
機化合物の分離・精製と同様に、溶媒抽出、カラムクロ
マトグラフィー、中和、濃縮、結晶化などの当業者に周
知の手段を適宜組合わせることにより行うことができ
る。たとえば、培養液から固体を遠心分離によって除い
た後、上清を濃縮し、次いで酸性化してパラヒドロキシ
安息香酸を沈殿させて固液分離する方法、あるいは上記
上清を酸性化した後、酢酸エチル、クロロホルムなどの
有機溶媒による溶媒抽出で生成物を分離する方法があ
る。また、パラヒドロキシ安息香酸が生成後沈澱してい
る場合は、酢酸エチルなどの溶媒抽出による回収が有効
な方法である。得られた粗製物を各種のカラムクロマト
グラフィーあるいは再結晶などの方法によって精製する
ことができる。

【００１９】本発明の方法により製造されるパラヒドロ
キシ安息香酸は、防腐剤として使用される他、医薬品、
農薬、染料、液晶などの原料として有用である。

【００２０】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。

【００２１】（実施例１）本実施例は、本発明の方法に
よるパラクレゾールからパラヒドロキシ安息香酸への微
生物による変換を例示する。使用した培地は下記組成の
ものであった。（ＰＨ調整後、１２０℃、１．２Ｋｇ／ｃｍ²、２０分
間滅菌して使用）

【００２２】上記培地１００ｍＬにエンテロバクター・
クロッカエＩＦＯ１３５３５の菌株１白金耳を接種
し、３０℃で１夜振盪培養した。得られた培養液の１０
ｍＬを、同様の培地１００ｍＬを仕込んだ３００ｍＬ容
フラスコに接種して１日間振盪培養を行った。培養条件
は、温度３０℃、ＰＨ６．８、１８０ｒｐｍであった。
培養開始１日後および２日後にパラクレゾールを各々
０．１ｇづつ添加して合計３日間の培養を行った。培養
終了後、遠心分離によって菌体を除き、減圧下で２０ｍ
Ｌに濃縮し、２０ｍＬの酢酸エチルで３回抽出を行っ
た。酢酸エチル層を合わせて蒸発乾固し、エタノール：
キシレンの１：１混合溶媒により再結晶させて、０．１
８ｇ（７０．４％）の精製物を得た。得られた物質は、
元素分析およびＮＭＲ測定によって、パラヒドロキシ安
息香酸と確認された。元素分析値（Ｃ７，Ｈ６，Ｏ３）計算値：Ｃ６０．８７％、Ｈ４．３８％実測値：Ｃ６０．８６％、Ｈ４．３７％¹³ Ｃ−ＮＭＲ（δｐｐｍ、ＤＭＳＯ−ｄ₆中のＴＭＳ）カルボニルＣ：１６９．１フェニレンＣ：１１５．４、１２１．３、１３２．１、
１６１．８

【００２３】（実施例２）実施例１で使用したものと同
じ組成の培地に対して０．２重量％のパラクレゾールを
添加した培地１００ｍｌに、実施例１と同様にエンテロ
バクター・クロッカエＩＦＯ１３５３５の菌株を１
白金耳接種して培養した前培養液１０ｍＬを、同様にパ
ラクレゾール０．２重量％を添加した培地１００ｍＬを
仕込んだ３００ｍＬ容フラスコに接種して２日間、実施
例１と同じ培養条件で培養を行った。２日後の培養液中
のパラヒドロキシ安息香酸の生成量は０．２０ｇ（７
８．３％）であった。培養液からのパラヒドロキシ安息
香酸の分離・精製は遠心分離によって菌体を除き、上清
に硫酸を加えＰＨを１とした後、この酸性溶液よりクロ
ロホルムでパラヒドロキシ安息香酸を抽出分離し、抽出
液を減圧濃縮することによって粗結晶を得た。この粗結
晶を実施例１と同様にエタノール：キシレンの１：１混
合溶媒により再結晶することによって白色針状結晶０．
１７ｇ（６６．５％）を得た。

【００２４】（実施例３）実施例１で使用したものと同
じ組成の培地１００ｍＬを仕込んだ３００ｍＬ容三角フ
ラスコ３本を使用し、エンテロバクター・クロッカエ
ＩＦＯ１３５３５を各々のフラスコに１白金耳接種
し、３０℃、１８０ｒｐｍで振盪培養した。得られた培
養液３００ｍＬを、母菌として実施例１と同様な培地
３．５Ｌを仕込んだ５Ｌ容のジャー・ファーメンターに
接種し、同時に基質としてパラクレゾール６ｇを添加し
て培養を行った。１日後さらにパラクレゾール５ｇを添
加して培養を継続し、合計３日間の培養を行った。培養
条件は、温度３０℃、ＰＨ７．０、攪拌３００ｒｐｍ、
通気量０．５容量／容量／分であった。培養終了後、１
０，０００×Ｇで２０分間の遠心分離によって菌体を除
き、硫酸によりＰＨ１とした後、実施例２と同様に処理
してパラヒドロキシ安息香酸１１．０ｇ（７８．３％）
を得た。

【００２５】（実施例４）実施例１で使用したものと同
じ組成の培地に対して０．２重量％のパラクレゾールを
添加した培地３．５Ｌで５Ｌ容のジャー・ファーメンタ
ーを用いて、実施例３と同様の培養条件で２日間エンテ
ロバクター・クロッカエＩＦＯ１３５３５を培養し
た。２日後に菌体を、８，０００×Ｇで、２０分間遠心
分離することによって集菌した。菌体収量は、１０５
℃、２時間乾燥で４．０ｇ／Ｌであった。集菌した生菌
体全量を０．２％の生理食塩水５００ｍＬに懸濁し、こ
れにパラクレゾール１．５ｇを添加して３０℃で弱く攪
拌しながら２時間反応させた。反応終了後、実施例３と
同様の方法によりパラヒドロキシ安息香酸を抽出し、精
製して再結晶によりパラヒドロキシ安息香酸１．５ｇを
得た。収率は７８．３％であった。

【００２６】

【発明の効果】本発明の方法により、従来は高温・高圧
の反応で化学合成されていた防腐剤、医薬品、農薬、染
料、液晶などの原料として有用なパラヒドロキシ安息香
酸をエネルギーをほとんど要せずに微生物酸化によって
パラクレゾールから安価に製造することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】エンテロバクター属に属する菌体を用い
て、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換す
ることを特徴とするパラヒドロキシ安息香酸の製造方
法。
【請求項２】前記エンテロバクター属に属する菌体を、
パラクレゾールを添加した培地で培養する請求項１に記
載のパラヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項３】前記エンテロバクター属に属する菌体を培
養して菌体を増殖させた後、パラクレゾールを一度にあ
るいは分割して添加して培養を継続する請求項１に記載
のパラヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項４】前記エンテロバクター属に属する菌体を培
養させた後、菌体を回収して、該菌体を用いてパラクレ
ゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換する請求項１ま
たは２に記載のパラヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項５】前記エンテロバクター属に属する菌体が、
エンテロバクター・クロッカエ（Enterobacter cloaca
e）である請求項１〜４のいずれかに記載のパラヒドロ
キシ安息香酸の製造方法。