JPH05328982A - クレゾール異性体混合物から異性体を分離する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】従来の多段蒸留や、圧力晶析法によって分離し
ていたｏ−，ｍ−，ｐ−クレゾール異性体の分離を、省
エネルギー的な微生物を用いた方法により、安価に分離
する方法。 【構成】微生物を用いて、ｏ−，ｍ−，ｐ−クレゾール
各異性体の混合物からｐ−クレゾールをｐ−ヒドロキシ
安息香酸にして、ｏ−，ｍ−クレゾール異性体を分離す
るクレゾール異性体混合物から異性体を分離する方法。
例えば、シュードモナス属細菌および／またはエンテロ
バクター属細菌を用いて、前記微生物の菌体を培養して
増殖させた後、前記各異性体の混合物を添加して培養を
継続するか、増殖後、菌体を回収し、前記各異性体の混
合物を添加した培地に移植し、あるいはさらにその後、
間欠的にまたは連続的に混合物を添加して、ｏ−，ｍ−
クレゾール異性体を分離する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ｏ−，ｍ−，ｐ−クレ
ゾール異性体混合物から微生物学的方法によりｏ−，ｍ
−，ｐ−クレゾール各異性体を分離する方法に関する。
さらに詳しく述べると、本発明は、ｏ−，ｍ−，ｐ−ク
レゾール異性体混合物に、シュードモナス属またはエン
テロバクター属に属する細菌あるいはその混合物を作用
させて、ｐ−クレゾールをｐ−ヒドロキシ安息香酸に選
択的に変換して、ｐ−クレゾールのみを沸点の離れたｐ
−ヒドロキシ安息香酸とし、ｏ−，ｍ−クレゾールを分
離する異性体混合物から異性体を分離する方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来、クレゾールのｏ−，ｍ−，ｐ−各
異性体をそれらの混合物から分離する方法として、蒸留
法を用いると、各異性体の間で沸点が非常に近いため
（ｏ−クレゾール １９１．０℃、ｍ−クレゾール ２
０２．２℃、ｐ−クレゾール ２０１．９℃）、分離が
難しく、多くのエネルギーを消費してきた。特に、ｍ−
クレゾールとｐ−クレゾールの蒸留による分離は極めて
困難で、ｏ−クレゾールを低沸点で初留として分離して
も、さらに高段数による精密な蒸留分離が必要であった
り、あるいはｍ−クレゾール、ｐ−クレゾールをスルホ
ン化した後、水蒸気分解により、まず分離しやすいｍ−
クレゾールを分離し、最後にｐ−クレゾールを得る方法
や、または、ｍ−クレゾールとｐ−クレゾール混合物を
約１，０００ｋｇ／ｃｍ² の高圧で加圧する圧力晶析法
によって分離する方法などが行われてきた。しかし、い
ずれもエネルギー消費量が大きく、経費がかかり高価な
分離方法が行われているのが現状である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、常温
・常圧で進行する経済的な微生物による物質の変換法を
利用して、ｏ−，ｍ−，ｐ−クレゾール異性体混合物中
のｐ−クレゾールを高選択的に種々の原料として有用な
ｐ−ヒドロキシ安息香酸に変換することにより、クレゾ
ールの各異性体を省エネルギー的に分離する方法を提供
することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、沸点が近
似しているクレゾールの各異性体混合物からｏ−，ｍ
−，ｐ−クレゾール異性体をそれぞれ分離するために、
微生物による省エネルギー的な方法によって、混合物中
のｐ−クレゾールのみをｐ−ヒドロキシ安息香酸に変換
して沸点を変化させ、沸点の近いｍ−クレゾールとｐ−
クレゾールを蒸留や圧力晶析法によらないで、効率的で
省エネルギー的に分離する方法を見出だし、本発明を完
成した。

【０００５】すなわち、本発明は、微生物を用いて、ｏ
−，ｍ−，ｐ−クレゾール各異性体の混合物からｐ−ク
レゾールをｐ−ヒドロキシ安息香酸にして、ｏ−，ｍ−
クレゾール異性体を分離するクレゾール異性体混合物か
ら異性体を分離する方法を提供する。また、前記微生物
がシュードモナス属細菌および／またはエンテロバクタ
ー属細菌である、クレゾール異性体混合物から異性体を
分離する方法を提供する。さらに、前記微生物が、Pseu
domonas aeruginosa（シュードモナス・エルギノーザ）
ＫＳ−０１８１株、Pseudomonas putida（シュードモナ
ス・プチダ）ＫＳ−０１８０株、Pseudomonas putida
（シュードモナス・プチダ）ＫＳ−０１６０株から選ば
れる少なくとも１つである、クレゾール異性体混合物か
ら異性体を分離する方法を提供する。また、前記微生物
の菌体を培養して増殖させた後、前記ｏ−，ｍ−，ｐ−
クレゾール各異性体の混合物を添加して培養を継続し、
ｐ−クレゾール異性体をｐ−ヒドロキシ安息香酸に選択
的に変換する、クレゾール異性体混合物から異性体を分
離する方法を提供する。また、前記微生物の菌体を培養
して増殖させた後、菌体を回収し、前記ｏ−，ｍ−，ｐ
−クレゾール各異性体の混合物を該菌体の静止菌体反応
によって、クレゾール異性体混合物から異性体を分離す
る方法を提供する。また、前記ｏ−，ｍ−，ｐ−クレゾ
ール各異性体の混合物を間欠的または連続的に、前記微
生物の培地に添加する、クレゾール異性体混合物から異
性体を分離する方法を提供する。

【０００６】ｏ−，ｍ−，ｐ−クレゾール異性体混合物
を分離する方法を以下に詳細に説明する。本発明の方法
に使用する細菌菌株は、シュードモナス属に属する細菌
およびエンテロバクター属に属する細菌の内、ｐ−クレ
ゾールをｐ−ヒドロキシ安息香酸に微生物学的に変換す
る能力を有する菌体を包含する。前記菌体は、土壌中か
ら通常の菌体分離の方法によって、新たに分離してもよ
いが、下記の菌体を工業技術院微生物工業技術研究所、
特にＩＦＯ株については、財団法人発酵研究所（大阪
市）から入手することができる。

【０００７】シュードモナス属としては、平成４年３月
１７日付で寄託されたシュードモナス・プチダ（Pseudo
monas pitida) ＫＳ−０１８０株（微工研菌寄第１２８
８０号）、平成４年３月１７日付で寄託されたシュード
モナス・プチダ（Pseudomonas pitida) ＫＳ−０１６０
株（微工研菌寄第１２８７９号）および平成４年３月１
７日付で寄託されたシュードモナス・エルギノーザ（Ps
eudomonas aeruginosa) ＫＳ−０１８１株（微工研菌寄
第１２８８１号）が挙げられ、エンテロバクター属とし
ては、エンテロバクター・クロッカエ（Enterobactor c
loacae) ＩＦＯ １３５３５株が挙げられる。

【０００８】本発明の方法で使用する細菌菌株の培養の
ための培地としては、通常の細菌用培地を使用してもよ
い。この時に用いる培地は、培地成分として、適当な炭
素源、窒素源および無機塩などを含有しうる。

【０００９】炭素源としては、本発明の菌株が利用でき
る任意の炭素源を使用できる。かかる炭素源として利用
できる有機物には、グリセリンなどの有機化合物、グル
コース、フラクトースなどの炭水化物、オリーブ油、大
豆油などの脂質、メタノール、エタノールなどのアルコ
ール、コーンスティープリカー、廃糖蜜などの農産物抽
出・精製残渣、あるいはマロン酸、クエン酸などの有機
酸が例示できる。さらに、本発明の菌株が利用し得る１
種または２種以上の炭素化合物を任意に炭素源として利
用できる。炭素源の含有量は、炭素源の種類によっても
異なるが、培地中２〜１０重量％以上であるのが好まし
い。

【００１０】窒素源としては、特に限定されないが、硫
酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素化合
物、およびペプトン、酵母エキスなどの有機窒素源が利
用できる。有機窒素化合物を用いた場合、これには炭素
も含まれているので、別の炭素源は必ずしも必要でな
い。

【００１１】無機塩類としては、各種の硫酸塩、リン酸
塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネ
シウム塩などが使用できる。さらに、微量の重金属類
（例えば、鉄塩、マンガン塩など）を培地に含有させて
もよい。

【００１２】培養方法としては、振盪培養法、深部通気
攪拌培養法などの方法により行うことができる。培養温
度は、２０〜３７℃、ＰＨは中性付近、攪拌は８０〜４
００ｒｐｍ、培養日数は反応の進行に応じて決めること
ができるが、通常は１〜２日が適当である。２日を超え
ると、副生物を生じることや若干の変換生成物の分解を
生じる点で好ましくない。

【００１３】これらの細菌菌株は、ｐ−クレゾールをｐ
−ヒドロキシ安息香酸に変換することができる。ｏ−，
ｍ−，ｐ−クレゾール異性体混合物を、本発明の微生物
菌体と共存させることによって、ｐ−クレゾールのみを
ｐ−ヒドロキシ安息香酸に選択的に変換することができ
る。

【００１４】ｐ−クレゾールをｐ−ヒドロキシ安息香酸
に変換する方法は、上述のようにして得られたシュード
モナス属またはエンテロバクター属に属する細菌あるい
はその混合物の菌体培養物にｏ−，ｍ−，ｐ−クレゾー
ル異性体混合物を添加するか、または、前記菌体培養物
を遠心分離等により回収して、分離した微生物の生菌体
をグルコース０．１ｇを含有する０．８５％（０．８〜
０．９５％）生理食塩水あるいは各種緩衝液に懸濁し、
これにｏ−，ｍ−，ｐ−クレゾール異性体混合物を添加
することによって行われる。また、ｏ−，ｍ−，ｐ−ク
レゾール異性体混合物の添加は、培養後１度に添加する
か、または２回以上に分けて間欠的に添加してもよい。
さらに、パラクレゾールの含有量が０．１〜０．２重量
％となるように連続して添加してもよい。微生物の菌体
を生理食塩水、各種緩衝液に懸濁する場合、培養時と同
様の界面活性剤および消泡剤を添加してもよい。この変
換反応の条件は、常圧、２０〜３７℃、ＰＨは中性付近
である。また、変換反応の期間は、１時間〜２日位、特
に１２時間程度であるのが好ましい。添加するｏ−，ｍ
−，ｐ−クレゾール各異性体混合物は、培養液中３重量
％以下、特に１重量％以下であるのが好ましく。さらに
０．２〜０．５重量％であるのが好ましい。３重量％以
上であると、微生物が十分に作用しなくなるので好まし
くない。また、常法により、本発明の微生物菌体を固定
化菌体としてカラムに充填して、クレゾールの異性体の
混合物を流加するリアクター方式でｐ−クレゾールをｐ
−ヒドロキシ安息香酸に変換することもできる。

【００１５】上記変換反応が終了した後、ｏ−クレゾー
ル、ｍ−クレゾールおよび生成したｐ−ヒドロキシ安息
香酸を培養液から分離・精製する。この方法は、一般の
有機化合物の分離・精製と同様に、溶媒抽出、カラムク
ロマトグラフィー、中和、濃縮、結晶化などの当業者の
周知の手段を適宜組み合わせることにより行うことがで
きる。まず、反応液を遠心分離することにより、微生物
菌体を培養液から取り除く。次に、残った上清中に含ま
れるｏ−クレゾール、ｍ−クレゾールおよびｐ−ヒドロ
キシ安息香酸の混合物を分離する方法は、以下のとおり
である。

【００１６】先にｐ−ヒドロキシ安息香酸を分離する。
分離の方法は、たとえば、得られた上清を濃縮し、次い
で酸性化してｐ−ヒドロキシ安息香酸を沈殿させて固液
分離して、ｐ−ヒドロキシ安息香酸を分離することがで
きる。分離したｐ−ヒドロキシ安息香酸を再びｐ−クレ
ゾールに変換してもよい。

【００１７】次に、ｏ−クレゾールとｍ−クレゾール混
合物の分離は、一般の有機化合物の分離精製と同様の処
理により分離することが出来る。すなわち、ｐ−ヒドロ
キシ安息香酸を析出させて除いた後、ｏ−クレゾールと
ｍ−クレゾール混合物を蒸留し、ｏ−クレゾールとｍ−
クレゾール異性体混合物とを分離すればよい。

【００１８】別の方法として、反応液の蒸留によりｏ−
クレゾールを分離した後、残ったｍ−クレゾールとｐ−
ヒドロキシ安息香酸との混合物を濃縮して、ｐ−ヒドロ
キシ安息香酸を析出させることにより容易に分離するこ
とが出来る。

【００１９】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。

【００２０】（実施例１）本実施例は、本発明の方法に
よるｏ−，ｍ−，ｐ−クレゾール異性体の混合物からｏ
−，ｍ−，ｐ−クレゾールの各々を微生物によって分離
する方法を例示する。使用した培地は下記組成のもので
あった。 培地組成 リン酸２ナトリウム ３．０ｇ リン酸１カリウム ２．０ｇ 尿素 ２．０ｇ 硫酸マグネシウム・７水塩 ０．２ｇ 炭酸ナトリウム ０．１ｇ 塩化カルシウム・２水塩 ０．０１ｇ 硫酸鉄・７水塩 ０．００５ｇ グリセリン ２．０ｇ 酵母エキス １．０ｇ イオン交換水 １．０Ｌ ＰＨ ６．８ （ＰＨ調整後、１２０℃、１．２ｋｇ／ｃｍ² 、２０分間滅菌して使用）

【００２１】上記培地１００ｍＬにシュードモナス・プ
チダ（Pseudomonas putida) ＫＳ−０１８０菌株（微工
研菌寄第１２８８０号）の菌株１白金耳を接種し、３０
℃で１夜振盪培養した。得られた培養液の１０ｍＬを、
前記と同様の培地１００ｍＬを仕込んだ３００ｍＬ容フ
ラスコに接種して１日間振盪培養を行った。培養条件
は、温度３０℃、ＰＨ６．８、１８０ｒｐｍであった。
培養終了後、培養液を８，０００×Ｇで２０分間、５℃
で遠心分離し、生菌体を分離した。集菌した生菌体を生
理食塩水で洗浄した後、グルコース０．１ｇを含有する
０．８５％生理食塩水５０ｍｌに懸濁し、これにクレゾ
ールのｏ−，ｍ−，ｐ−各異性体の等モル混合物０．１
５ｇを添加して、３０℃で時々弱く攪拌しながら１２時
間反応を行った。反応終了後、前述と同じ遠心分離法に
より菌体を分離し、上清に硫酸を加えてＰＨ１とした
後、この酸性溶液をクロロホルム２０ｍｌで抽出し、抽
出液を濃縮して油状物を得た。これを減圧濃縮し、１８
７〜１９３℃の画分でｏ−クレゾール４７ｍｇを分取
し、次いで１９８〜２０３℃画分としてｍ−クレゾール
４６ｍｇを分取した。蒸留残渣をエタノール：キシレン
の１：１混合溶媒で再結晶することによりｐ−ヒドロキ
シ安息香酸の白色針状結晶６０ｍｇを得た。同定は、常
法によりｏ−，ｍ−クレゾールおよびｐ−ヒドロキシ安
息香酸は、ガスクロマトグラフィーと赤外吸収スペクト
ルで確認した。分離した各成分の純度は、ガスクロマト
グラフィーによる分析から、ｏ−クレゾール９９．４
％、ｍ−クレゾール９９．５％、ｐ−ヒドロキシ安息香
酸９９．２％であった。

【００２２】（実施例２）微生物としてシュードモナス
・プチダＫＳ−０１６０菌株（微工研菌寄第１２８７９
号）を使用した以外、実施例１と同じ条件で反応させ
て、ｏ−クレゾール４６ｍｇ、ｍ−クレゾール４６ｍ
ｇ、ｐ−ヒドロキシ安息香酸５８ｍｇを得た。

【００２３】（実施例３）実施例１で使用したものと同
じ組成の培地にｐ−クレゾール０．２ｇを添加した培地
１００ｍＬを仕込んだ３００ｍＬ容三角フラスコに実施
例１と同様にシュードモナス・プチダＫＳ−０１８０の
菌株を１白金耳接種して培養した。この培養液を前培養
液として１０ｍＬを、前記と同様のｐ−クレゾールを
０．２重量％含有した培地９０ｍＬに接種して１日間、
実施例１と同じ培養条件で培養を行った。１日後にｏ
−，ｍ−，ｐ−クレゾール異性体の等モル混合物０．３
ｇを添加して、さらに１日間培養を続けた。２日後の培
養液中のｏ−クレゾール、ｍ−クレゾールは各々９７ｍ
ｇ、９８ｍｇであり、ｐ−クレゾールは検出されず、ｐ
−ヒドロキシ安息香酸３７６ｍｇを生成した。この反応
液を、実施例１と同じ方法によって各々、ｏ−クレゾー
ル９５ｍｇ、ｍ−クレゾール９４ｍｇ、ｐ−ヒドロキシ
安息香酸３６５ｍｇを取得した。

【００２４】（実施例４）微生物としてシュードモナス
・エルギノーザＫＳ−０１８１菌株（微工研菌寄第１２
８８１号）を使用した以外、実施例３と同じ条件で反応
させて、ｏ−クレゾール９４ｍｇ、ｍ−クレゾール９４
ｍｇ、ｐ−ヒドロキシ安息香酸３４９ｍｇを取得した。

【００２５】（実施例５）微生物としてエンテロバクタ
ー・クロッカエ（Enterobacter cloacae) IFO１３５３
５株を使用した以外は、実施例１と同様の条件で反応さ
せて、ｏ−クレゾール４７ｍｇ、ｍ−クレゾール４６ｍ
ｇおよびｐ−ヒドロキシ安息香酸５７ｍｇを得た。

【００２６】（実施例６）微生物としてエンテロバクタ
ー・クロッカエ（Enterobacter cloacae) IFO１３５３
５株を使用した以外は、実施例３と同様の条件で培養を
行った。１日後にｏ−，ｍ−，ｐ−クレゾール異性体の
等モル混合物０．１５ｇを添加して、さらに１日間培養
を続けた。２日後の培養液中のｏ−クレゾール、ｍ−ク
レゾールは各々４８ｍｇ、４８ｍｇであり、ｐ−クレゾ
ールは検出されず、ｐ−ヒドロキシ安息香酸２９５ｍｇ
を生成した。この反応液を、実施例１と同様の方法によ
って各々、ｏ−クレゾール４６ｍｇ、ｍ−クレゾール４
５ｍｇ、ｐ−ヒドロキシ安息香酸２８２ｍｇを取得し
た。

【００２７】（実施例７）実施例１で使用したものと同
じ組成の培地１００ｍＬを仕込んだ３００ｍＬ容三角フ
ラスコ３本を使用し、各々のフラスコにシュードモナス
・ブチダＫＳ−０１８０株を１白金耳接種して、３０
℃、１８０ｒｐｍで振盪培養した。得られた培養液３０
０ｍＬを母菌として、前記と同じ減菌した３．５Ｌの培
地を仕込んだ５Ｌ容のジャー・ファーメンターに接種し
て２日間培養を行った。培養条件は、温度３０℃、ｐＨ
７．０、攪拌３００ｒｐｍ、通気量０．５容量／容量／
分であった。培養終了後、１０，０００×Ｇで、１０分
間の遠心分離によって集菌した。菌体収量は、１０５
℃、２時間乾燥で５．３ｇ／Ｌであった。集菌した生菌
体全量をグリセリン０．１％を含有する０．２％の生理
食塩水５００ｍＬに懸濁し、これにｏ−，ｍ−，ｐ−ク
レゾール異性体の等モル混合物１．５ｇを添加して３０
℃で弱く攪拌しながら１時間反応させた。反応収量後の
反応液中のｏ−クレゾール、ｍ−クレゾールは各々４９
３ｍｇ、４９１ｍｇであり、ｐ−クレゾールは検出され
ず、ｐ−ヒドロキシ安息香酸６３０ｍｇを生成した。こ
の反応液を、実施例１と同じ方法によって各々、ｏ−ク
レゾール４７６ｍｇ、ｍ−クレゾール４７０ｍｇ、ｐ−
ヒドロキシ安息香酸６１０ｍｇを取得した。

【００２８】

【発明の効果】本発明の方法により、従来は多段蒸留
や、圧力晶析法によって分離していたｏ−，ｍ−，ｐ−
クレゾール各異性体の分離を、ｍ−，ｐ−クレゾールの
分離に関してはエネルギーをほとんど要せずに微生物的
な方法により安価に分離することができた。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】微生物を用いて、ｏ−，ｍ−，ｐ−クレゾ
   ール各異性体の混合物からｐ−クレゾールをｐ−ヒドロ
   キシ安息香酸にし、ｏ−，ｍ−クレゾール異性体を分離
   することを特徴とする、クレゾール異性体混合物から異
   性体を分離する方法。
2. 【請求項２】前記微生物がシュードモナス属細菌および
   ／またはエンテロバクター属細菌である請求項１に記載
   の分離する方法。
3. 【請求項３】前記微生物が、Pseudomonas aeruginosa
   （シュードモナス・エルギノーザ）ＫＳ−０１８１株、
   Pseudomonas putida（シュードモナス・プチダ）ＫＳ−
   ０１８０株、Pseudomonas putida（シュードモナス・プ
   チダ）ＫＳ−０１６０株から選ばれる少なくとも１つで
   ある請求項１または２に記載の分離する方法。
4. 【請求項４】前記微生物の菌体を培養して増殖させた
   後、前記ｏ−，ｍ−，ｐ−クレゾール各異性体の混合物
   を添加して培養を継続し、ｐ−クレゾール異性体をｐ−
   ヒドロキシ安息香酸に選択的に変換する請求項１〜３の
   いずれかに記載の分離する方法。
5. 【請求項５】前記微生物の菌体を培養して増殖させた
   後、菌体を回収して、該菌体を用いて前記ｏ−，ｍ−，
   ｐ−クレゾール各異性体の混合物からｐ−クレゾール異
   性体をｐ−ヒドロキシ安息香酸に選択的に変換する請求
   項１〜４のいずれかに記載の分離する方法。
6. 【請求項６】前記ｏ−，ｍ−，ｐ−クレゾール各異性体
   の混合物を間欠的または連続的に、前記微生物の培地に
   添加する請求項４または５に記載の分離する方法。