JPS6221520B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ウロポルフイリンの製法に関し、
とくに、従来ウロポルフイリンを生産すること
の知られていないアースロバクター属に属する微
生物を利用して、医薬用途、その合成中間体、ビ
タミンB₁₂製造中間体、飲食物着色用赤色系色
素、その他の広い用途に注目されているポルフイ
リン構造を有する公知物質ウロポルフイリン
を、工業的に容易な操作で、安価に且つ優れた収
率で取得することのできるウロポルフイリンの
製法に関する。

更に詳しくは、アースロバクター
（Arthrobacter）属に属するウロポルフイリン
生産菌を培養して、得られた培養物からウロポル
フイリンを採取することを特徴とするウロポル
フイリンの製法に関する。

該ウロポルフイリンは、下記式、 で表わされる公知物質であつて、従来、該ウロポ
ルフイリンを生産する微生物としては、ロドプ
ソイドモナス・スフエロイデス（Rhodopseudo
−monas spheroides）、プロピオニバクテリウ
ム・グラヌロサム（Propionibacterium
granulosum）、プロピオニバクテリウム・アクネ
ス（Propionibacterium acnes）などのロドプソ
イドモナス属及びプロピオニバクテリウム属に属
する微生物が知られている。しかしながら、アー
スロバクター属に属する微生物が該ウロポルフイ
リンを生産することについては、従来、全く知
られていない。

更に、生産量が具体的に記載されたBiochem.J.
，62，78頁、1956年によれば、最も多く生産した
例でも、ロドプソイドモナス・スフエロイデスを
用いた液体培養によつて、高々４mg／培養物と
いう著るしく低い生産量にすぎず、到底、ウロポ
ルフイリンの工業的製造の実施には利用し難
い。

本発明者等は、液体培養によつても優れた且つ
実用性のある生産量でウロポルフイリンを取得
できる方法を開発すべく研究を進めてきた。その
結果、アースロバクター属に属する微生物が上記
ウロポルフイリンを生産するという新しい事実
を発見した。更に、これら属に属するウロポルフ
イリン生産菌は、従来公知の他の属に属する微
生物が培養液中に生産した上記高々４mg／培養
物の生産量に比して、約25倍にも達する例えば約
100mg／培養物というような著るしく優れた生
産量で、ウロポルフイリンを生産することを発
見した。

又更に、アースロバクター属に属するウロポル
フイリン生産菌株中、生産能のより優れた変異
もしくは変種菌の使用、Ｌ−シスチン及び／又は
0.5ｇ／培地以上のMg⁺⁺含有培地での培養、さ
らにはこれら条件の組み合わせによつて、ウロポ
ルフイリンの生産量を顕著に増大させ得ること
を発見した。

更に、上記ウロポルフイリン生産菌の培養に
際しては、ミネラル源としてFe塩を含有しない
培地の利用がとくに好ましいこと及び溶存酸素の
供給速度を低レベル条件として培養することが好
ましいことを発見した。

従つて、本発明の目的は、従来、ウロポルフイ
リン生産菌の存在の全く知られていなかつたア
ースロバクター属に属するウロポルフイリン生
産菌を利用して、工業的に容易な操作で、安価且
つ優れた収率をもつてウロポルフイリンを採取
できるウロポルフイリンの製法を提供するにあ
る。

本発明の上記目的及び更に多くの他の目的及び
利点は以下の記載から一層明らかとなるであろ
う。

本発明方法で用いるアースロバクター属に属す
るウロポルフイリン生産菌としては、例えば、
アースロバクター・ヒアリナス（Arthrobacter
hyalinus）、アースロバクター・パセンス
（Arthrobacter pascens）及びこれらの変異もし
くは変種株を例示することができる。該アースロ
バクター・ヒアリナスは、FRI，Japanに微工研
菌寄第3125号として、又、アメリカン・タイプ・
カルチヤー・コレクシヨンATCC31263として寄
託された公知自由分譲菌株である。その菌学的性
質の詳細は例えば、特開昭52−94498号に記載さ
れている。又、該アースロバクター・ヒアリナス
の変異株５メチル−DL−トリプトフアン抵抗株
は、FRI，Japanに寄託されている（微工研菌寄
受理第5256号）。又、アースロバクター・ヒアリ
ナスの変異株コプロポルフイリン抵抗株は
FRI，Japanに寄託されている（微工研菌寄第
5259号）。更に、上記アースロバクター・パセン
スは、（財）発酵研究所にIFO12139号として、
又、アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシ
ヨンにATCC13346号として寄託された公知菌株
であつて、アメリカン・タイプ・カルチヤー・コ
レクシヨンのカタログ第９版（1970年）に記載さ
れた自由分譲菌である〔カタログ第15版〕（1982
年）では、アースロバクター・グロブホルムスに
属する一菌株名として記載されている。その菌学
的性質の詳細は例えば、Bergey′s Manual of
Determinative Bacteriology8版に記載されてい
る。又、該アースロバクター・パセンスの変異株
Ｌ−トリプトフアン抵抗株は、FRI，Japanに寄
託されている（微工研菌寄第5257号）。

上記変異もしくは変種株は、親株から例えば紫
外線照射、コバルト60放射線照射の如き公知の手
段で得ることができる。例えば、照射処理株を、
ウロポルフイリン生産阻害剤含有ミネラル−寒
天培地に培養し、必要に応じ、照射処理及び培養
をくり返して、ウロポルフイリン生産能の増大
した菌株を採取することにより得ることができ
る。培養は親菌株に公知の培養条件で行うことが
でき、又阻害剤としては、たとえばウロポルフイ
リン、コプロポルフイリン、Ｌ−トリプトフ
アン、５−メチル−DL−トリプトフアン、その
他各種の阻害剤を利用することができる。得られ
る変異もしくは変種株の菌学的性質は親菌株のそ
れと実質的に同じであり、ウロポルフイリン生
産能が親菌株より向上している点で異なる。

従つて、本発明によれば、アースロバクター属
に属するウロポルフイリン生産菌を照射処理
し、ウロポルフイリン生産阻害物質含有培地で
培養し、ウロポルフイリン生産能の向上した菌
株を採取することを特徴とするウロポルフイリン
生産変異もしくは変種菌の製造法を提供するこ
とができる。

本発明によれば、上述の如きアースロバクター
属に属するウロポルフイリン生産菌を培地に培
養して、得られた培養物からウロポルフイリン
を直接もしくは間接的に採取することにより、ウ
ロポルフイリンを製造することができる。更に
又、Ｌ−シスチン含有培地もしくはMg⁺⁺含有培
地の利用により、屡々、ウロポルフイリン生産
量を更に向上させることができる。

本発明方法の実施に際して、上記培地として
は、炭素源、窒素源、無機塩類などを含有する培
地が使用できる。該培地はまた、Ｌ−シスチン、
Mg⁺⁺、消泡剤その他の成分を含有することがで
きる。

斯かる炭素源の例としては、たとえば、糖質、
アルコール類、炭化水素類、ふすまなどの如き炭
素源をあげることができる。また、窒素源として
は、たとえば、コーンスチーブ・リカー、酵母エ
キス、肉エキス、ペプトン、フイツシユミール、
アンモニウム塩類、硝酸塩類、尿素など窒素源を
あげることができ、更に、無機塩類としては、例
えば、燐酸塩類、マグネシウム塩類、亜鉛塩類、
カルシウム塩類、マンガン塩類、モリブデン塩
類、銅塩類などを挙げることができる。

培地組成は適宜に変更でき、また培養中に適宜
に追加添加することもできる。例えば、炭素源と
してのアルコール類を利用するに際して、アルコ
ールの残存濃度が少なくなつたとき、あるいはウ
ロポルフイリンの生産開始の時期またはその前
後でアルコールを追加することによつてウロポル
フイリンの生産を増加できる。培養に際して
は、培地中に鉄塩類が実質的に存在しないことが
好ましい。

培養は振盪もしくは通気撹拌などの好気条件下
に行われるが、比較的低通気条件を採用するのが
よい。培養温度としては一般に約20゜〜約40℃程
度の温度が利用され、PH約４〜約9.5程度のPH条
件が採用できる。培養時間は、通常、約２〜８日
程度がよく、他の培養条件の選択に応じて適当に
変更可能である。

本発明方法の実施に際しては、培地中にＬ−シ
スチン及び／又はMg⁺⁺を含有させることによつ
て、屡々、ウロポルフイリン生産量を一層増大
せしめることができる。上記Mg⁺⁺を与える化合
物としては、各種の水可溶性マグネシウム化合物
を利用でき、例えば、硫酸マグネシウム、塩化マ
グネシウム、硝酸マグネシウム、酢酸マグネシウ
ムの如きマグネシウム化合物を例示できる。Ｌ−
シスチン及び／又はMg⁺⁺の量は適宜に選択でき
るが、例えば、１の培地に0.1ｇから５ｇの如
きＬ−シスチンの使用量、例えば、0.5ｇから10
ｇの如きMg⁺⁺の使用量を例示することができ
る。

得られた培養物、たとえば培養液中には、従来
公知の他の属に属するウロポルフイリン生産菌
を使用した場合に比して格段に増大した量で、ウ
ロポルフイリンが蓄積する。培養物から生成し
たウロポルフイリンの採取は、種々の手段で行
うことができる。

例えば、酢酸酸性酢酸エチルその他適当なエス
テル抽出剤を用いて、好収率でウロポルフイリン
を培養物から抽出採取することができる。抽出
に際しては、菌体その他の固形分を分離除去した
培養液から抽出するのが普通である。又、例え
ば、菌体その他の固形分と分離された培養液のPH
を、1.6〜3.6程度に調節してウロポルフイリン
を等電点沈殿させ、適宜な固−液分離手段たとえ
ば過、遠心分離などの手段でウロポルフイリン
濃縮物を得ることができる。

上記例示の如くして得られる濃縮物や抽出液
を、例えば、塩酸メタノールを用いて含有される
ウロポルフイリンをメチルエステル化し、必要
に応じ、アルミナを用いてカラムクロマト方式に
より精製して、メチルエステルの形でウロポルフ
イリンを採取することができる。或は又、該濃
縮物や抽出液を、液体クロマト処理たとえばスチ
レン−ジビニルベンゼン系ゲルのカラムを用いる
高速液体クロマトグラフイーにより処理して、ウ
ロポルフイリンを採取することができる。又、
上記ウロポルフイリンのエステルの形で採取し
た場合には、所望により、加水分解処理して塩類
に変えることができる。例えば、ウロポルフイリ
ンのエステルを、例えば、トルエン、ピリジ
ン、ジクロルエタン、トリクロロエタン、テトラ
ヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの有機
溶媒に溶解し、少量のアルカリを加えて加熱する
とウロポルフイリンのアルカリ塩が析出してく
るので、この析出物を例えば別して塩の形で回
収することができる。更に又、鉱酸類を用いてエ
ステルを加水分解したのち、適当なアルカリで中
和して、析出するウロポルフイリンのアルカリ
塩を回収することもできる。

更に、本発明方法においては、得られた培養物
から分離した菌体、好ましくは菌体の増殖に適し
たウロポルフイリン生産条件下に、アースロバ
クター属に属するウロポルフイリン生産菌を培
地に培養して得られた培養物から分離した菌体ま
たはその菌体の粗酵素抽出液を、ウロポルフイリ
ン形成性基質と反応させた反応生成物から、ウ
ロポルフイリンを採取することもできる。上記
ウロポルフイリン形成性基質としては、例え
ば、グリシン、フマール酸、α−ケトグルタール
酸、こはく酸、δ−アミノレブリン酸もしくはこ
れらの塩類およびこれら化合物を含有する物質な
どを挙げることができる。

該反応は、例えば、温度約20゜〜約40℃PH約４
〜約9.5程度の条件下に、例えば、約５時間〜約
５日間程度で行うことができる。この際、静置条
件下、振盪もしくは撹拌条件下などの条件を採用
することができる。反応生成物からのウロポルフ
イリンの分離採取は、既述した培養液からのウ
ロポルフイリンの採取同様に行うことができ
る。このようにして、本発明においては、培養物
から直接に、もしくは更に反応を経て間接に、ウ
ロポルフイリンを高収率で取得することができ
る。

本発明方法で得られるウロポルフイリンは、
例えば、NaHgで処理してウロポルフイノーゲン
に容易に転化でき、該ウロポルフイノーゲン
は、例えば、Bioorg.Chem.，６，397、（1977）
やJ.Am.Chcm.Scc.，94、8269、（1972）に記載
されているように、Cobyrinic acidを経由してビ
タミンB₁₂に転化できる。更に、医薬用途、その
合成中間体、飲食着色用赤色系色素その他の用途
にも有用である。

以下、実施例により、本発明方法実施の数態様
について更に詳しく説明する。

尚、培養物中のウロポルフイリンの定量は、
以下の方法により行つた。

培養液またはその希釈液１mlとPH4.7の1/10Ｎ
酢酸バフア10mlに酢酸エチル10mlを加え抽出す
る。夾雑するコプロポルフイリンは酢酸エチル
層に移行する。抽出後の水層および酢酸エチル層
の水洗液に対して酢酸エチル／酢酸＝3/1の混合
溶媒20mlを加え抽出する。酢酸エチル層に５％塩
酸10mlを加えて抽出し、塩酸層を分光光度計でで
分析し、極大吸収波長が405.5mμであることを
確認してから別に求めた検量線を用い、ウロポル
フイリンの濃度を算出する。

実施例 １ アースロバクター・ヒアリナス〔微工研菌寄第
3125号：ATCC31263〕を、イオン交換純水１
あたり、グルコース10ｇ、酵母エキス1.0ｇ、ペ
プトン3.0ｇ、硝酸アンモニウム3.0ｇ、リン酸−
カリウム0.4ｇ、リン酸二ナトリウム1.5ｇ、硫酸
マグネシウム5.0ｇ、硫酸マンガン10mg、硫酸亜
鉛10mg、硫酸銅200μｇ、三酸化モリブデン10μ
ｇ、炭酸カルシウム5.0ｇを含有する殺菌した培
地200mlを収容した500ml容三角フラスコに植菌し
て、30℃で３日間振盪培養した。以後２〜３日毎
にグルコース50％水溶液を添加し培養17日間で１
の培養液当り80ｇのグルコースを添加した。

このときの培養液に蓄積したウロポルフイリン
の濃度は89mg／であつた。

実施例 ２ 実施例１と同様に培養した500ml容三角フラス
コ20本に収容された４の培養液をまず10000G
で10分間遠心分離した。得られた上燈液のPHを
2.6にし沈殿物をとるため1000Gで10分間遠心分
離した。沈殿物にメタノールと塩酸を加え室温で
30分間放置後、ジクロルメタンで抽出した。ジク
ロルメタン層から塩酸が除去されるまで水洗を繰
返した。ジクロルメタン層を濃縮しこれをシリカ
ゲルのクロマトで精製することによりウロポルフ
イリンのオクタメチルエステルの結晶を280ml
得た。

このエステルの可視部の吸収スペクトルは、第
１図に示す通りで、405.5，501，535，571，
626mμに吸収極大を示す。また赤外線吸収スペ
クトルは、第２図に示す通りで、3430，2950，
1730，14401365，1330，1200，1170，1090，1000
cm^-1に吸収極大を示した。重クロロホルム中の核
磁気共鳴の結果は第３図に示す通りである。さら
に融点は256〜259℃であつた。この値は文献J.of
Biol.Chem.，157，323，（1945）の記載と一致し
た。以上よりウロポルフイリンであることを確
認した。

実施例 ３ 実施例２で得られたウロポルフイリンオクタ
メチルエステル200mgをトルエン４mlに溶解さ
せ、これに苛性ソーダ液を加えて、95℃で30分間
加熱した。反応終了後、液より析出した沈殿を
集して、ウロポルフイリンオクタナトリウム
を200mg得た。この純度を比色法で求めたところ
99％であつた。

実施例 ４ アースロバクター・パセンス
（Arthrobacterpascems；IFO12139）を用いるほ
かは実施例１と同様に17日間培養を行つた。得ら
れた培養液に蓄積したウロポルフイリンの濃度
は38mg／であつた。

実施例 ５ アースロバクター・ヒアリナス〔微工研菌寄第
3125号：ATCC31263〕をイオン交換純水１あ
たり、イソプロピルアルコール10ml、酵母エキス
1.0ｇ、ペプトン3.0ｇ、硝酸アンモニウム3.0ｇ、
リン酸−カリウム0.4ｇ、リン酸二ナトリウム1.5
ｇ、硫酸マグネシウム5.0ｇ、硫酸マンガン10
mg、硫酸亜鉛10mg、硫酸銅200μｇ、三酸化モリ
ブデン10μｇ、炭酸カルシウム5.0ｇを含有する
殺菌した培地15mlを収容した外径21mmの試験管に
植菌して、30℃で３日間振盪培養した。以後２〜
３日毎にイソプロピルアルコールを添加し培養17
日間で１の培養液当り85mlのイソプロピルアル
コールを添加した。

このときの培養液に蓄積したウロポルフイリン
の濃度は64mg／であつた。

実施例 ６ 実施例５において、イオン交換純水１あた
り、さらにＬ−シスチン0.2ｇを添加して殺菌し
た培地を用いるほかは実施例５と全く同様に17日
間培養を行い１の培養液当り85mlのイソプロピ
ルアルコールを添加した。

このときの培養液に蓄積したウロポルフイリン
の濃度は101mg／であつた。

実施例 ７ 実施例６において、アースロバクター・ヒアリ
ナス〔微工研菌寄第3125号、ATCC31263〕を用
いる代りに、アースロバクター・ヒアリナスの５
メチル−DL−トリプトフアン抵抗株〔微工研菌
寄第5256号〕を用いるほかは実施例６と全く同様
に17日間培養を行つた。得られた培養液に蓄積し
たウロポルフイリンの濃度は260mg／であつ
た。

実施例 ８ 実施例６において、アースロバクター・ヒアリ
ナス〔微工研菌第3125号、ATCC31263〕を用い
る代りに、アースロバクター・ヒアリナスのコプ
ロポルフイリン抵抗株〔微工研菌第5259号〕を
用いるほかは実施例６と全く同様に17日間培養を
行つた。得られた培養液に蓄積したウロポルフイ
リンの濃度は470mg／であつた。

実施例 ９ 実施例４において、イオン交換純水１あたり
さらにＬ−シスチン0.2ｇを添加して殺菌した培
地を用いるほかは実施例４と全く同様に17日間培
養を行つた。得られた培養液に蓄積したウロポル
フイリンの濃度は44mg／であつた。

実施例 10 実施例９において、アースロバクター・パセン
ス〔Arthrobacter pascens；IFO12139〕を用い
る代りに、アースロバクター・パセンスのＬ−ト
リプトフアン抵抗株〔微工研菌寄第5257号〕を用
いるほかは実施例９と全く同様に17日間培養を行
つた。得られた培養液に蓄積したウロポルフイリ
ンの濃度は72mg／であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例２で得られた本発明化合物の可
視部吸収スペクトル図、第２図はその赤外線吸収
スペクトル図そして第３図はそのNMRチヤート
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アースロバクター属に属するウロポルフイリ
   ン生産菌を培地に培養して、得られた培養物か
   らウロポルフイリンを採取することを特徴とす
   るウロポルフイリンの製法。 ２ 該培地がＬ−シスチンを含有する特許請求の
   範囲第１項記載の製法。 ３ 該培地がMg⁺⁺を含有する特許請求の範囲第
   １項記載の製法。