DE3042092A1 - Verfahren zur herstellung von uroporphyrin iii - Google Patents
Verfahren zur herstellung von uroporphyrin iiiInfo
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Description
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von
Uroporphyrin III und insbesondere ein Verfahren zur Erzeugung einer bekannten Substanz, Uroporphyrin, mit einer Porphyrin-Struktur,
welche ausgedehnte Anwendungen in Arzneimitteln als Zwischenprodukt für die die Synthese von Arzneimitteln
als Zwischenprodukte für die Herstellung von Vitamin B12 und· als roter Farbstoff für Nahrungsmittel und Getränke
besitzt, in hoher Ausbeute bei niedrigen Kosten durch· ein industriell leicht durchführbares Verfahren,unter Verwendung eines
Mikroorganismus des Genus Arthrobacter, von dem in der Vergangenheit nicht bekannt war, daß er Uroporphyrin bildet.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Uroporphyrin III, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man einen Uroporphyrin III liefernden Mikroorganis mus des Genus Arthrobacter in einem Kulturmedium züchtet,
welches eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und
ein Mineral enthält, und Uroporphyrin III aus der Kulturbrühe gewinnt.
Uroporphyrin III ist eine bekannte Substanz der folgenden Formel
CH2CH2COOH
CH0COOH
HOOCH C-HOOCH2C
CH2CH2COOH
NH N 7> - CH2COOH
CH2COOH
COOH
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COPY
Es ist bereits bekannt, daß Mikroorganismen, die zum Genus Rhodopseudomonas gehören, wie Rhodopseudomonas spheroides,
und Mikroorganismen, die zum Genus Propionibacterium gehören, wie Propionibacterium granulosum und Propionibacterium
acnes, die Fähigkeit besitzen, Uroporphyrin III zu bilden. Es ist jedoch bis jetzt noch nicht bekannt gewesen, daß
Mikroorganismen des Genus Arthrobacter Uroporphyrin bilden.
In Biochem, J., 62, Seite 78, 1956, wo insbesondere die
Menge an gebildetem Uroporphyrin III beschrieben wird, wird angegeben, daß 4 mg/l Kulturbrühe als maximale Menge
an Uroporphyrin III in einer submersen Kultur unter Verwendung von Rhodopseudomonas spheroides erhalten werden.
Ein solches Verfahren kann kaum für die industrielle Herstellung von Uroporphyrin III verwendet werden.
Die Anmelderin hat ausgedehnte Untersuchungen hinsichtlich eines Verfahrens zur Herstellung von Uroporphyrin III in
hohen und technisch geeigneten Ausbeuten, selbst unter Verwendung eines submersen Fermentationsverfahrens, durchgeführt.
Die Anmelderin hat überraschenderweise gefunden, daß Mikroorganismen
des Genus Arthrobacter Uroporphyrin III erzeugen. Es wurde weiterhin gefunden, daß Uroporphyrin III liefernde
Mikroorganismen des Genus Arthrobacter Uroporphyrin III in einer Menge von sogar etwa 100 mg/l Kulturbrühe erzeugen,
welche der etwa 25fachen maximalen Menge (4 mg/l Kulturbrühe) entspricht, die ein Mikroorganismus des Genus
Rhodopseudomonas oder Propionibacterium erzeugen kann.
Es wurde gefunden, daß die Menge an Uroporphyrin III, die gebildet wird, wesentlich erhöht werden kann, wenn man Varianten
oder Mutanten von Uroporphyrin III erzeugenden Stämmen des Genus Arthrobacter verwendet, welche eine größe-
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re Fähigkeit aufweisen, Uroporphyrin III zu bilden, die
Mikroorganismen in einem L-Cystin und/oder Mg++ enthaltenden
Kulturmedium züchtet, wobei diese Bedingungen auf geeignete Weise kombiniert werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Uroporphyrin III in hohen
Ausbeuten bei niedrigen Kosten zur Verfügung zu stellen, das industriell leicht durchgeführt werden kann und bei dem ein
Uroporphyrin III liefernder Mikroorganismus des Genus Arthrobacter verwendet wird, von dem früher nicht bekannt
war, daß er die Fähigkeit aufweist, Uroporphyrin III zu bilden.
Beispiele von Uroporphyrin III liefernden Mikroorganismen des Genus Arthrobacter, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden können, sind Arthrobacter hyalinus, Arthrobacter pascens und ihre Varianten und Mutanten. Ein
Beispiel ist Arthrobacter pascens ATCC Nr. 14358. Arthrobacter hyalinus ist ein bekannter, frei verfügbarer
Stamm, der als FERM-P Nr. 3125 beim Fermentation Research
Institute (FRI), Agency of Industrial Science and Technology, Japan; als ATCC 31263 bei der American Type Culture Collection;
und als DMS 867 bei der German Collection of Microorganisms
hinterlegt worden ist. Die mikrobiologischen Eigenschaften dieses Stamms werden z. B. in der JA-OS 94498/77
beschrieben. Der 5-Methyl-DL-tryptophan-resistente Stamm
NOC1.1OO1, eine Mutante von Arthrobacter hyalinus, ist als
FERM-P Nr. 5256 bei FRI, Japan, als ATCC . bei
der American Type Culture Collection und als DSM 1932 bei der deutschen Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen
hinterlegt. Der Coproporphyrin III-resistente Stamm NOC-11002,
eine Mutante von Arthrobacter hyalinus, ist als FERM-P Nr. 5259 bei FRI, Japan, als ATCC bei der
American Type Culture Collection und als DSM 1933 bei der deutschen Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen hinterlegt.
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Arthrobacter pascens ist ein bekannter, freiverfügbarer Stamm, der als IFO 12139 beim Institute for Fermentation,
Osaka, Japan, und als ATCC 133^6 bei der American Type
Culture Collection hinterlegt wurde. Die mikrobiologischen Eigenschaften dieses Stamms werden z.B. in Bergey's Manual
of Determinative Bacteriology, 8. Edition, beschrieben. Der L-Tryptophan-resistente Stamm NOC11OO3, eine Mutante
von Arthrobacter pascens, ist als FERM-P Nr. 5257 bei FRI,
Japan, als ATCC bei der American Type Culture
Collection und als DSM 1934- bei der deutschen Hinterlegungsstelle
für Mikroorganismen hinterlegt.
Die obigen Varianten der Mutanten unterscheiden sich von den Mutter- bzw. Grundstämmen nur in der Hinsicht, daß ihre
Fähigkeit, Uroporphyrin III zu bilden, gegenüber der des Mutterstamms verbessert ist. Ihre mikrobiologischen Eigenschaften
sind im wesentlichen gleich wie die der Mutterstämme, und sie können leicht aus den zuvor erwähnten und
freiverfügbaren Mutterstämmen nach an sich bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können solche
Varianten oder Mutanten durch bekannte Mutierungsbehandlungsverfahren, wie ultraviolette Bestrahlung oder Bestrahlung
mit Co -Isotopen, hergestellt werden. Gemäß einer Ausführungsform wird ein Mutterstamm der zuvor erwähnten
Bestrahlungsbehandlung unterworfen, und der behandelte Stamm wird in einem Mineral-Agar-Medium, welches ein Mittel
zur Inhibierung der Produktion von Uroporphyrin III enthält gezüchtet. Gegebenenfalls können die obige Bestrahlungsund
Fermentationskultivierung wiederholt werden, und ein Stamm mit erhöhter Fähigkeit, Uroporphyrin III zu erzeugen,
kann gewonnen werden. Die obige Züchtung kann bei den gleichen Züchtungsbedingungen, wie sie für die Züchtung des Mut
terstamms bekannt sind, durchgeführt werden. Beispiele von Mitteln für die Inhibierung sind Uroporphyrin III, Coproporphyrin
III, L-Tryptophan, 5-Methyl-DL-tryptophan und
andere bekannte Inhibitoren.
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ORIGINAL INSPECTED
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung
einer Varianten oder Mutanten eines Uroporphyrin III liefernden Mikroorganismus, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man einen Uroporphyrin .III liefernden Mikroorganismus, der zum Genus Arthrobacter gehört, der Bestrahlung
unterwirft, den so behandelten Mikroorganismus in einem ein Mittel zur Inhibierung der Bildung von Uroporphyrin III
enthaltenden Kulturmedium züchtet und dann einen Stamm mit verbesserter Fähigkeit, Uroporphyrin III zu erzeugen, aus
der Kulturbrühe isoliert.
Erfindungsgemäß kann Uroporphyrin III durch Züchten der Uroporphyrin III liefernden Mikroorganismen des Genus Arthrobacter
in einem Kulturmedium und Gewinnung von Uroporphyrin III direkt oder indirekt aus der Kulturbrühe erhalten werden. Die Menge an gebildetem Uroporphyrin III kann oft weiter
erhöht werden, indem man ein Kulturmedium verwendet,
,1 r
das L-Cystin oder Mg oder beide Verbindungen enthält.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann
ein eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, ein Mineral
usw. enthaltendes Kulturmedium als zuvor erwähntes Medium verwendet werden. Dieses Kulturmedium kann weiterhin
L-Cystin, Mg++, ein
ponenten enthalten.
ponenten enthalten.
L-Cystin, Mg , ein Antischäumungsmittel oder andere Kom-
Beispiele von Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, Alkohole,
Kohlenwasserstoffe und Kleie. Beispiele von Stickstoff
quellen sind Maiaquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Ammoniumsalze, Nitratsalze
und Harnstoff. Die Mineralquelle umfaßt anorganische Salze, wie Phosphate, Magnesiumsalze, Zinksalze, Calciumsalze,
Mangansalze, Molybdänsalze und Kupfersalze.
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Die Zusammensetzung des Kulturmediums kann nach Bedarf geändert werden, und während der Fermentation können diese
Kohlenstoff-, Stickstoff- und Mineralquellen zusätzlich zugegeben
werden. Wird beispielsweise ein Alkohol als Kohlenstoff quelle verwendet, so kann die Menge an gebildetem Uroporphyrin
III erhöht werden, indem man den Alkohol zugibt, wenn die Konzentration an Restalkohol niedrig ist, oder
vor, während oder nach dem Beginn der Erzeugung von Uroporphyrin III. Bevorzugt ist ein Eisensalz im Kulturmedium
während der Züchtung im wesentlichen abwesend.
Die Züchtung erfolgt unter aeroben Bedingungen durch Schütteln oder Rühren. Es ist bevorzugt, Luft mit relativ niedriger
Rate durchzuleiten. In anderen Worten ist es bevorzugt, die Zufuhrrate an Luft auf einen niedrigen Wert während der
Züchtung einzustellen, so daß die Menge' an gelöstem Sauerstoff in dem Kulturmedium bei einem niedrigen Wert gehalten
wird. :
Die Züchtungstemperatur beträgt beispielsweise etwa 20 bis
etwa 40°C, und der pH-Wert des Kulturmediums liegt bei etwa 4 bis etwa 9,5. Die geeignete Züchtungszeit beträgt normalerweise
etwa 2 bis etwa 30 Tage und kann auf geeignete Weise, abhängig von der Auswahl der anderen Kulturbedingungen,
geändert werden.
Die Menge an gebildetem Uroporphyrin III kann oft erhöht werden, indem man L-Cystin und/oder Mg zu dem Kulturmedium
zugibt. Als Mg ergebende Verbindungen können verschiedene wasserlösliche Magnesiumverbindungen verwendet
werden. Spezifische Beispiele sind Magnesiumsulfat, Magnesi umchlorid, Magnesiumnitrat, Magnesiumacetat und andere Magnesiumverbindungen.
Die Menge an L-Cystin und/oder Mg kann auf geeignete Weise ausgewählt werden. Beispielsweise
beträgt die Menge an L-Cystin etwa 0,1 bis etwa 5 g/l KuI-
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turmedium und die Menge an Mg beträgt etwa 0,5 bis etwa
10 g/l Kulturmedium.
Uroporphyrin III sammelt sich in d er Kulturbrühe in einer
Menge an, die wesentlich höher ist als die bei der Verwendung bekannter, Uroporphyrin III erzeugender Mikroorganismen.
Uroporphyrin III kann aus der Kulturbrühe nach verschiedenen Verfahren isoliert werden. Beispielsweise kann
Uroporphyrin III aus der Kulturbrühe in guten Ausbeuten isoliert werden, indem man mit Essigsäure angesäuertes
Äthylacetat und andere geeignete Esterextraktionsmittel verwendet. Bei der Extraktion ist es übliche Praxis, die
Kulturbrühe zu extrahieren, nachdem die Mikrobenzellen und andere, feste Bestandteile davon abgetrennt worden sind.
Weiterhin ist es möglich, ein Uroporphyrin-Konzentrat. zu erhalten, indem man den pH-Wert der von Mikrozellen und
anderen festen Bestandteilen befreiten Kulturbrühe auf etwa 1,6 bis 3f6 zur isoelektrischen Ausfällung von Uroporphyrin
III einstellt und den Niederschlag einer geeigneten Feststoff-Flüssigkeits-Trennung,
wie einer Filtration oder einer Zentrifugentrennung, unterwirft.
Das Uroporphyrin III kann in Form eines Methylesters gewonnen werden, indem man das Konzentrat oder Extrakt, die
auf obige Weise erhalten wurden, mit beispielsweise HCl-Methanol behandelt, um Uroporphyrin III in seinen Methylester
zu überführen, und gegebenenfalls den Methylester mit Hilfe eines chromatographischen Verfahrens unter Verwendung
von Aluminiumoxid reinigt. Man kann auch Uroporphyrin III gewinnen, indem man das entstehende Konzentrat oder den Extrakt
durch Flüssigkeitschromatographie, z.B. Hochleistungs-FlüssigkeitsChromatographie
an einer Säule aus einem Styrol-Divinylbenzyl-Gel,
behandelt. Wird Uroporphyrin III in Form eines Esters gewonnen, kann es gegebenenfalls in das
Salz durch Hydrolyse überführt werden. Beispielsweise kann dies erfolgen, indem man den Uroporphyrin III-ester in ei-
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nem organischen Lösungsmittel, wie Toluol, Pyridin, Dichloräthan,
Trichloräthan, Tetrahydrofuran und Dimethylsulfoxid,
löst, eine geringe Menge Alkali zusetzt, das Gemisch zur Ausfällung des Alkalisalzes von Uroporphyrin III erhitzt
und das Salze beispielsweise durch Filtration gewinnt. Es ist weiterhin möglich, den Ester mit einer Mineralsäure zu
hydrolysieren, das Hydrolysierungsprodukt mit einem geeigneten Alkali zu neutralisieren und das ausgefällte Alkalisalz
von Uroporphyrin zu gewinnen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es ebenfalls möglich, Uroporphyrin III aus dem Reaktionsprodukt der Mikrobenzellen
zu gewinnen, die aus der entstehenden Kulturbrühe abgetrennt worden sind, bevorzugt Mikrobenzellen, die von
der Kulturbrühe abgetrennt worden sind, die man erhält, indem man einen Uroporphyrin III liefernden Mikroorganismus
des Genus Arthrobacter in einem Kulturmedium unter Uroporphyrin III erzeugenden Bedingungen, die für das Wachstum
der Mikrobenzellen geeignet sind, kultiviert, oder indem man den rohen Enzymextrakt davon mit einer Uroporphyrin III
liefernden Substanz kultiviert. Das Uroporphyrin III bildende Substrat kann Glycin, Fumarsäure, α-Ketoglutarsäure,
Bernsteinsäure, (£-Aminolävulinsäure, Salze dieser Säuren
und diese Verbindungen enthaltende Substanzen umfassen. Die Salze dieser Säuren kann z.B. Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze
dieser Säuren sein. Die zuvor erwähnte Rohenzym-Extraktion kann durchgeführt werden, indem man die Mikrobenzellen
mahlt, die Mikrobenzellen durch Ultraschallbehandlung bricht, die Mikrobenzellen unter Verwendung eines
plötzlichen Druckunterschieds bricht oder indem man die Mikrobenzellen bricht, indem man ein Enzym mit der Fähigkeit,
Zellwände zu zersetzen, verwendet. Die Extraktion kann auf gleiche Weise durchgeführt werden, wie es bei der Extraktion
von Uroporphyrin III aus der Kulturbrühe beschrieben wurde.
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Die obige Reaktion kann bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 40°C und einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 9»5
während einer Zeit von etwa 5 h bis etwa 5 Tagen durchgeführt werden. Bei der Durchführung der Reaktion kann das
Reaktionssystem stationäre gehalten werden oder es kann geschüttelt oder gerührt werden. Uroporphyrin III kann abgetrennt
und aus dem Reaktionsprodukt auf gleiche Weise gewonnen werden, wie es bei der Gewinnung von uroporphyrin
III aus der Kulturbrühe zuvor beschrieben worden ist. Auf diese Weise kann Uroporphyrin in hohen Ausbeuten aus der
Kulturbrühe entweder direkt oder indirekt durch eine weitere Reaktion erhalten werden.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Uroporphyrin
III kann leicht durch Behandlung mit beispielsweise NaHg in Uroporphynogen III überführt werden. Das Uroporphynogen
III kann in Vitamin B12 über Cobyrinsäure, wie
in Bioorg.Chem., 6, 397 (1977) oder in J.Am.Chem.Soc., 94,
8269 (1972), beschrieben, umgewandelt werden. Es ist weiterhin nützlich in Arzneimitteln, synthetischen Zwischenprodukten
dafür und als rote Farbstoffe für Nahrungsmittel und Getränke.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Uroporphyrin III wird in der Kulturbrühe auf folgende Weise nachgewiesen.
10 ml Äthylacetat werden zu 1 ml der Kulturbrühe oder ihrem verdünnten Produkt zugegeben und dann werden 10 ml 1/10N
Acetatpuffer zur Durchführung der Extraktion zugesetzt. Coproporphyrin
III, das als Verunreinigung vorhanden ist, geht in die Äthylacetatschicht. Die Äthylacetatschicht wird
mit Wasser gewaschen und das Wasser wird mit der wäßrigen Schicht vereinigt. Das Gemisch wird mit 20 ml eines Gemisches
aus Äthylacetat und Essigsäure in einem Verhältnis von 3:1 extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mit 10 ml 5%iger
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Chlorwasserstoffsäure extrahiert und die Chlorwasserstoffsäureschicht
wird mit einem Spektrophotometer analysiert. Nachdem bestätigt wurde, daß die maximale Absorptionswellenlänge.
405,5 m/U ist, wird die Konzentration an Uroporphyrin
III unter Verwendung einer getrennt hergestellten Eichkurve berechnet.
Arthrobacter hyalinus (FERM-P Nr. 3125; ATCC 31263) wird in einem 500 ml Erlenmeyerkolben, welcher 200 ml sterilisiertes
Kulturmedium enthält, 3 Tage bei 300C unter Schütteln gezüchtet. Das Kulturmedium enthält pro Liter entionisiertem
reinem Wasser: 10 g Glucose, 1,0g Hefeextrakt, 3|O g
Pepton, 3,0 g Ammoniumnitrat, 0,4 g Monokaliumphosphat, 1,5 Dinatriumphosphat, 5,0 g Magnesiumsulfat, 10 mg Mangansulfat,
10 mg Zinksulfat, 200 /Ug Kupfersulfat, 10/ug Molybdän
und 5,0 g Calciumcarbonat. Nach der Züchtung wird eine 50&Lge wäßrige Lösung von Glucose an den Tagen 2 bis 3 zugegeben.
Während der Züchtungszeit von 17 Tagen werden 80 g Glucose/l Kulturbrühe zugesetzt.
Die Konzentration an angesammeltem Uroporphyrin III in der Kulturbrühe beträgt 89 mg/l.
4 1 Kulturbrühe, die sich in zwanzig 500 ml-Erlenmeyerkolbe:
befinden und die gemäß dem Züchtungsverfahren von Beispiel erhalten worden sind, werden 10 min bei 10 000 G zentrifugiert.
Der pH-Wert der entstehenden, überstehenden Flüssigkeit wird auf 2,6 eingestellt, und dann wird 10 min bei
1000 G zentrifugiert, um den Niederschlag zu sammeln· Metha nol und Chlorwasserstoffsäure werden zu dem Niederschlag
zugegeben, das Gemisch wird 30 min bei Zimmertemperatur ste hengelassen und anschließend mit Dichlormethan extrahiert.
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Die Dichlormethanschicht wird wiederholt mit Wasser gewaschen, bis die Chlorwasserstoffsäure daraus entfernt ist.
Die Dichlormethanschicht wird konzentriert und mittels Silikagel-Chroraatographie gereinigt. Man erhält 280 mg
Octamethylester von Uroporphyrin III in Form von Kristallen.
Das Absorptionsspektrum im sichtbaren Bereich des entstehenden Esters ist in Fig. 1 dargestellt, welches Absorptionsmaxima
bei 405,5, 501, 535, 571 und 626 m/U zeigt. Das Infrarot-Absorptionsspektrum
des Esters ist in Fig. 2 dargestellt, welches Absorptionsmaxima bei 3430, 2950, 1730, 1440, 1365,
1330, 1200, 1170, 1090 und 100 ei"1 zeigt.
Die Ergebnisse der kernmagnetischen Resonanzspektroskopie des Produkts in Deuterochloroform sind in Fig. 3 dargestellt.
Das Produkt besitzt einen Schmelzpunkt von 256 bis 259°C, der dem in der Literatur [J.of Biol.Chem., 157, 323 (1945)] aufgeführten
Wert entspricht.
Aus den obigen Daten wird das Produkt als Uroporphyrin III identifiziert.
200 mg Uroporphyrin(III)-octamethylester, erhalten gemäß
Beispiel 2, werden in 4 ml Toluol gelöst. Dann gibt man eine wäßrige Lösung von Natriumhydroxid zu und erhitzt die Lösung
30 min bei 95°C. Nach der Umsetzung wird das Reaktionsgemisch filtriert und der Niederschlag wird aus dem Filtrat
gesammelt; man erhält 200 mg Uroporphyrin III, Octanatriumsalz. Seine nach einem colorimetrischen Verfahren bestimmte
Reinheit beträgt 9996.
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Die Züchtung erfolgt auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 während 17 Tagen, mit der Ausnahme, daß Arthrobacter pascens
IFO 12139 eingesetzt wird. Die Konzentration des in der entstehenden Kulturbrühe angesammelten Uroporphyrins III
beträgt 38 mg/l.
Arthobacter hyalinus (FERM-P Nr. 3125; ATCC 31263) wird in
einem Reagenzglas mit einem Außendurchmesser von 21 mm, das 15 ml sterilisiertes Kulturmedium enthält, 3 Tage bei 300C
unter Schütteln inokuliert. Das Kulturmedium enthält pro Liter entionisiertem, reinem Wasser 10 ml Isopropylalkohol,
1,0g Hefeextrakt, 3,0 g Pepton, 3,0 g Ammoniumnitrat, 0,4 ι
Monokaliumpho sphat, 1,5 g Dina tr iumpho sphat, 5,0 g Magnesiumsulfat, 10 mg Mangansulfat, 10 mg Zinksulfat, 200/ug
Kupfersulfat, 10/ug Molybdäntrioxid und 5,0 g Calciumcarbonat.
Isopropylalkohol wird jeweils 2 bis 3 Tage danach und während der KuItivierungszeit von 17 Tagen zugegeben. Insgesamt
werden 85 ml Isopropylalkohol/l Kulturbrühe zugesetz
Die Konzentration des in der Kulturbrühe angesammelten Uroporphyrins
III beträgt 64 mg/l.
Die Züchtung erfolgt während 17 Tagen auf gleiche Weise wie in Beispiel 5, mit der Ausnahme, daß zusätzlich 0,2 g
L-Cystin pro Liter entionisiertem, reinem Wasser zu dem Kulturmedium zugegeben werden.
Die Konzentration des in der Kulturbrühe angesammelten Uroporphyrins
III beträgt 101 mg/l.
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Die Züchtung erfolgt während 17 Tagen auf gleiche Weise wie in Beispiel 6, mit der Ausnahme, daß ein 5-Methyl-DL-tryptophan
resistenter NOC-Stamm NOC11OO1 (FERM-P Nr. 5256) von
Arthrobacter hyalinus anstelle von Arthrobacter hyalinus (FERM-P Nr. 3125) verwendet wird.
Die Konzentration des in der Kulturbrühe angesammelten Uroporphyrins·
III beträgt 260 mg/l.
Gemäß Beispiel 6 wird die Züchtung während 17 Tagen durchgeführt, wobei man jedoch einen Coproporphyrin III resistenten
Stamm (FERM-P Nr. 5259) von Arthrobacter hyalinus anstelle von Arthrobacter hyalinus (FERM-P Nr. 3125) einsetzt.
Die Konzentration des in der Kulturbrühe angesammelten Uroporphyrins
III beträgt 470 mg/l.
Die Züchtung erfolgt während 17 Tage auf gleiche Weise wie in Beispiel 4, mit der Ausnahme, daß zusätzlich 0,2 g
L-Cystin/l entionisiertes, reines Wasser zu dem Kulturmedium zugesetzt werden.
Die Konzentration des in der Kulturbrühe angesammelten Uroporphyrins
III beträgt 44 mg/l.
Gemäß Beispiel 9 wird die Züchtung während 17 Tagen durchgeführt, wobei man jedoch einen L-Tryptophan resistenten
Stamm NOC11OO3 (FERM-P Nr. 5257) von Arthrobacter pascens
anstelle von Arthrobacter pascens (IFO 12139) einsetzt.
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Die Konzentration des in der Kulturbrühe angesammelten Uroporphyrins
III beträgt 72 mg/l.
Beispiel 11
Arthrobacter hyalinus FERM-P Nr. 3125 wird in ein Reagenzglas
mit einem Außendurchmesser von 21 mm, das 15 ml des in Beispiel 5 aufgeführten, sterilisierten Kulturmediums
(als P-Medium bezeichnet) enthält, inokuliert und 3 Tage unter Schütteln bei 30° C kultiviert. Die Kulturbrühe wird
in eine Petrischale gegeben und einer Ultraviolettstrahlung (zwei 15 V Lampen, die 40 cm über der Petrischale angebracht
sind) während 2 min unterworfen. Die behandelte Kulturbrühe wird mit 15,ml des sterilisierten P-Mediums, das
5-Methyl-DL-tryptophan enthält, in einem Reagenzglas mit
einem Außendurchmesser von 21 mm inokuliert. Das Gemisch wird 10 Tage in einem Reagenzglas kultiviert. Die entstehende
Kulturbrühe wird zum Inokulieren einer Platte verwendet, welche das 5-Methyl-DL-tryptophan und Agar aufweisende P-Medium
enthält, und dann wird bei 300C kultiviert. Von
den verbleibenden Kolonien werden diejenigen, die hohe Aktivität für die Bildung von Uroporphyrin III aufweisen,
als 5-Methyl-DL-tryptophan resistenter Stamm von Arthrobacter hyalinus abgetrennt.
Die Züchtung erfolgt auf gis iche Weise wie in Beispiel 1,
mit der Ausnahme, daß Coproporphyrin III anstelle von 5-Methyl-DL-tryptophan zu dem Kulturmedium zugesetzt wird.
Von den entstehenden Kolonien werden diejenigen, die hohe Aktivität für die Bildung von Uroporphyrin III aufweisen,
als Coproporphyrin III resistenter Stamm von Arthrobacter hyalinus abgetrennt.
13 0 0 3 7/0620 ömGmAL inspected '
Beispiel 13
Arthrobacter pascens (IFO 12139) wird zum Inokulieren eines
Reagenzglases mit einem Außendurchmesser von 21 mm, das 15 ml des in Beispiel 1 aufgeführten, sterilisierten Kulturmediums
(als G-Medium bezeichnet) verwendet und die Züchtung erfolgt während 3 Tagen bei 300C unter Schütteln.
Die Kulturbrühe wird in eine Petrischale gegeben und 2 min der Ultraviolettbestrahlung unter Verwendung von zwei 15 W
Lampen, die 40 cm über der Petrischale angeordnet sind,
unterworfen. Die behandelte Kulturbrühe wird zum Inokulieren von 15 ml des L-Tryptophan enthaltenden, sterilisierten
G-Mediums in einem Reagenzglas mit einem Außendurchmesser von 21 mm verwendet. Das Gemisch wird 10 Tage in dem Rohr
kultiviert. Die erhaltene Kulturbrühe wird zum Inokulieren einer Platte mit L-Tryptophan und Agar enthaltendem G-Medium
verwendet. Von den entstehenden Kolonien werden diejenigen, die eine hohe Fähigkeit zur Erzeugung von Uroporphyrin
III aufweisen, als L-Tryptophan resistenter Stamm von Arthrobacter pascens abgetrennt.
Ende der Beschreibung.
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Claims (12)
1. Verfahren zur Herstellung von Uroporphyrin III, dadurch
gekennzeichnet, daß man einen Uroporphyrin III erzeugenden Mikroorganismus des Genus Arthrobacter in einem eine
Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und ein Mineral
enthaltenden Kulturmedium züchtet und aus der Kulturbrühe Uroporphyrin III gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 40°C und einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 9,5 durchgeführ
wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium mindestens eine Komponente, ausgewähl
unter L-Cystin und Mg , enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an L-Cystia etwa 0,1 bis etwa 5 g/l Kulturmedium
beträgt.
ORJGtNAL INSPECTED
130037/0620
2744 AW/br
Nippon Oil Co., Ltd.
5. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet,
daß die ]
beträgt.
daß die Menge an Mg++ etwa 0,5 bis etwa 10 g/l Kulturmedium
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man Mikrobenzellen, die man aus der Kulturbrühe oder dem rohen Enzymextrakt der Mikrobenzellen abgetrennt hat,
mit einer Uroporphyrin III bildenden Substanz umsetzt und das Uroporphyrin III aus dem entstehenden Reaktionsprodukt
isoliert.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Uroporphyrin III liefernden Mikroorganismus
Arthrobacter hyalinus, Arthrobacter pascens oder eine Bariante oder eine Mutante davon verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß man als Uroporphyrin III liefernden Mikroorganismus
Arthrobacter hyalinus FERM-P Nr. 3125 Stamm ( = ATCC 31
= DSM 867), Arthrobacter pascens IFO 12139 Stamm (= ATCC 13346); einen gegenüber 5-Methyl-DL-tryptophan resistenten
Stamm FERM-P Nr. 5256 von Arthrobacter hyalinus (= DSM
1932), einen gegenüber Coproporphyrin III resistenten Stamm FERM-P Nr. 5259 von Arthrobacter hyalinus (= DSM 1933) oder
einen gegenüber L-Tryptophan resistenten Stamm FERM-P Nr. 5257 von Arthrobacter pascens (= DSM 1934) verwendet.
9. Uroporphyrin III, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 1 erhalten worden ist.
10. Uroporphyrin III nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß es nach dem Verfahren von Anspruch 6 erhalten worden ist.
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11. Uroporphyrin III, dadurch gekennzeichnet, daß es nach einem der Verfahren der Ansprüche 2-8 erhalten
worden ist.
12. Verfahren zur Herstellung einer Varianten oder Mutanten von Uroporphyrin III liefernden Mikroorganismen,
dadurch gekennzeichnet, daß man Uroporphyrin III liefernde Mikroorganismen des Genus Arthrobacter einer Bestrahlungsbehandlung unterwirft, den so behandelten Mikroorganismus
in einem Kulturmedium, welches ein Mittel zur Inhibierung der Produktion von Uroporphyrin III enthält, kultiviert
und die Mikrobenzellen, die eine gesteigerte Fähigkeit besitzen, Uroporphyrin III zu erzeugen, aus der Kulturbrühe
gewinnt.
130037/0620
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14319879A JPS5668398A (en) | 1979-11-07 | 1979-11-07 | Prduction of uroporphyrin 3 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3042092A1 true DE3042092A1 (de) | 1981-09-10 |
| DE3042092C2 DE3042092C2 (de) | 1984-06-07 |
Family
ID=15333146
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE3042092A Expired DE3042092C2 (de) | 1979-11-07 | 1980-11-07 | Verfahren zur Herstellung von Uroporphyrin III |
Country Status (5)
| Country | Link |
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| JP (1) | JPS5668398A (de) |
| DE (1) | DE3042092C2 (de) |
| FR (1) | FR2469456A1 (de) |
| GB (1) | GB2066834B (de) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5823791A (ja) * | 1981-08-04 | 1983-02-12 | Nippon Oil Co Ltd | ポルフイリン類の分離方法及びそれに用いる樹脂吸着剤 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5120599B2 (de) * | 1973-04-16 | 1976-06-25 | ||
| JPS5290694A (en) * | 1976-01-24 | 1977-07-30 | Nippon Oil Co Ltd | Preparation of protoporphyrine 1x |
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| JPS5576881A (en) * | 1978-12-06 | 1980-06-10 | Nippon Oil Co Ltd | Preparation of high-purity coproporphyrin 3 alkali salt |
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-
1980
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- 1980-11-07 US US06/204,789 patent/US4370415A/en not_active Expired - Lifetime
- 1980-11-07 DE DE3042092A patent/DE3042092C2/de not_active Expired
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
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Also Published As
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|---|---|
| FR2469456A1 (fr) | 1981-05-22 |
| US4370415A (en) | 1983-01-25 |
| DE3042092C2 (de) | 1984-06-07 |
| JPS6221520B2 (de) | 1987-05-13 |
| GB2066834B (en) | 1983-07-06 |
| JPS5668398A (en) | 1981-06-09 |
| FR2469456B1 (de) | 1984-01-13 |
| GB2066834A (en) | 1981-07-15 |
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