JPS6321477B2 - - Google Patents
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- JPS6321477B2 JPS6321477B2 JP55049130A JP4913080A JPS6321477B2 JP S6321477 B2 JPS6321477 B2 JP S6321477B2 JP 55049130 A JP55049130 A JP 55049130A JP 4913080 A JP4913080 A JP 4913080A JP S6321477 B2 JPS6321477 B2 JP S6321477B2
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Classifications
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Description
本発明はシユードモナス テストステロニ
（Pseudomonas testosteroni）の変種を用いてメ
タ−ハイドロキシ安息香酸のカチオン塩から高収
量に２，３−ジハイドロキシ安息香酸またはその
カチオン塩を製造する微生物による変換に関す
る。本発明は３−ハイドロキシベンゾアート−２
−ハイドロキシラーゼ活性についての最初の生化
学的発明である。 メタ−ハイドロキシ安息香酸のカチオン塩は
種々の微生物の生長基質として役立つことがこれ
までに示されて来た。これらの微生物はこの化合
物に環開裂の準備段階として４あるいは６位の炭
素を水酸化する。これらの参考文献は以下のもの
がある：J.Bacteriol.107 468−475（1971）；
Dokl.Acad.Nauk SSR.234 696−698（1977）；
Bull.Agr.Chem.Soc.Japan24、211−216（1960）；
Ann.Jnst.Pastem、Paris177、47−57（1969）；
Arch.Mikrobiol、59、302−314（1967）；および
J.Gen.Appl.Microbiol.４、241−258（1958）．メ
タ−ハイドロキシ安息香酸のカチオン塩をプロト
カテクアートおよびゲンチザートにする水酸化の
触媒を行う酵素がシユードモナス テストステロ
ニ（Pseudomonas testosteroni）〔Biochem.
Biophys.Res.Commun.55、1102−1110（1955）〕
からおよびシユードモナス アエルギノサ
（Pseudomonas aeruginosa）、〔Biochem.
Biophys.Res.Commun.55、897−903（1973）〕か
らそれぞれ精製された。 メタ−ハイドロキシ安息香酸のカチオン塩の生
物学的変換に対する既報の処理法では、この化合
物を水酸化して目的の２，３−ジヒドロキシ安息
香酸のカチオン塩（これは化学的に合成すること
も困難である）を生成するものはなかつた。２，
３−ジヒドロキシ安息香酸のカチオン塩は以下の
文献に論じられる通り、非常に有用な鉄−キレー
ト試薬である。〔J.Pharmacol.Exp.Ther.190(3)、
187−92（1974）およびIron Metabolism.
Thalassemia Conf.p.187−192（1975）〕。 シユードモナス テストステロニ
（Pseudomonas testosteroni）株139ATCC17511
の変異株は紫外線照射により発生したもので、メ
タ−ハイドロキシ安息香酸のカチオン塩を２，３
−ジヒドロキシ安息香酸のカチオン塩に変換する
能力をテストされた。 目的の変異株はアメリカン・タイプ・カルチヤ
ー・コレクシヨン（The American Type
Culture Cllection）（於ロツクブレイ、メリーラ
ンド州）に登録番号ATCC31492として保管され
た。ATCC（The American Type Culture
Cllection）（Rockville、Maryland）において、
この株が恒久的に保管され、特許が認可された場
合、特許の有効期間中容易に利用出来ることが便
利である。特許出願中でも、本株は37CFR1.14お
よび35USC112の番号で入手可能である。保管さ
れた株を一般人が利用する上での制約はすべて特
許が許可された時に除かれるであろう。日本にお
いても昭和55年９月29日に微工研菌寄第5731号と
して寄託された。 シユードモナス テストステロニ
（Pseudomonas testosteroni）ATCC31492の細
胞を適当な水性培地、出来れば0.5％イーストエ
キスを補充したスタニール（staniers）基礎塩類
培地へ移す。一夜培養した細胞を遠心分離により
無菌的に取り出し、滅菌基礎塩類溶液で洗滌す
る。これらの洗滌した細胞の懸濁液を乳酸塩およ
びメタ−ハイドロキシ安息香酸のカチオン塩の滅
菌過溶液を含む滅菌フラスコ中に移す。メタ−
ハイドロキシ安息香酸のカチオン塩の重量に対し
細胞塊の乾燥重量比は約２：１から約10：１の範
囲で好適比は５：１である。メタ−ハイドロキシ
安息香酸のカチオン塩の濃度は約２ｍＭから約10
ｍＭにわたり、好適濃度は７ｍＭである。微生物
による変換のPHは５から９で中性が好ましい。温
度は20から45℃で好適温度は30℃である。微生物
による変換の時間は生成された２，３−ジヒドロ
キシ安息香酸のカチオン塩の量を高圧液体クロマ
トグラフイーで定量することにより監視される。
実質的な微生物による変換は約３から10時間で得
られる。微生物細胞は遠沈あるいは過により除
かれ、２，３−ジヒドロキシ安息香酸のカチオン
塩が分離され、既知の方法により精製される。こ
こでこの２，３−ジヒドロキシ安息香酸は培地中
のカチオンと塩を形成しているが、培地を酸性化
することにより遊離の安息香酸となる。 いずれにしても、メタ−ハイドロキシ安息香酸
のカチオン塩をシユードモナス テストステロニ
（Pseudomonas testosteroni）ATCC31492細胞
から単離された３−ヒドロキシベンゾエート−２
−ヒドロキシラーゼとの接触により生物変換が常
法の酵素技術を用いて行われる。 逆相高圧液体クロマトグラフイーを行い、その
移動相は50ｍＭ酢酸とメタノールの容量比４：１
の液体が用いられる。流速は1.2ml／minで一定
に保持し、カラムから溶出される物質を280nｍ
で紫外線（UV）吸収により定量する。 本発明の新規な工程はまず第一にメタ−ヒドロ
キシ安息香酸のカチオン塩を目的の２，３−ジ−
ヒドロキシ安息香酸またはそのカチオン塩へ生物
学的変換を行うことである。この簡易な工程によ
り、２，３−ジ−ヒドロキシ安息香酸のカチオン
塩の工業生産を可能にし、かつこの臨床的に非常
に有用な、重要な産物を開発および利用を可能に
する。 実施例 １ シユードモナス テストステロニ
（Pseudomonas testosteroni）ATCC31492を0.5
％イーストエキス培地で補充したスタニールの
（Staniers）基礎塩類培地４中、28℃18時間培
養した。得られた細胞塊はメタ−ハイドロキシ安
息香酸のカチオン塩１ｇおよび乳酸塩１ｇを補充
した基礎塩類培地１中30℃で１夜培養した。培
養後過した肉汁を凍結乾燥し、得られた固形物
を飽和食塩水100mlに溶解した。PHを6N HCLで
2.5に調整し、水層を酢酸エチル（４×50ml）で
抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥
し、真空蒸溜した。残渣を水から再結晶後、灰色
がかつた白色固体470mgを得た。この物質は高圧
液体クロマトグラフイーで２，３−ジヒドロキシ
安息香酸およびメタ−ヒドロキシ安息香酸89：11
の比の混合物であることが示された。 水から再結晶して得た３種類の結晶は高圧液体
クロマトグラフイーで均一な結晶化合物であり物
理的およびスペクトルの性状、融点および標品の
２，３−ジヒドロキシ安息香酸（Aldrich
Chemical Co.）と混融の結果同一であつた。 実施例 ２ 実施例１の工程はメタ−ヒドロキシ安息香酸の
カチオン塩とシユードモナス テストステロニ
（Pseudomonas testosteroni）ATCC31492の細
胞から単離された３−ヒドロキシベンゾエート−
２−ヒドロキシラーゼを接触させても同様な結果
が繰り返され得る。 実施例 ３ シユードモナス テストステロニ
（Pseudomonas testosteroni）ATCC31492によ
る、メタ−ジヒドロキシ安息香酸のカチオン塩濃
度の関数として、メタ−ヒドロキシ安息香酸のカ
チオン塩から２，３−ジヒドロキシ安息香酸のカ
チオン塩への生物学的変換の結果が次表に示され
る：
（Pseudomonas testosteroni）の変種を用いてメ
タ−ハイドロキシ安息香酸のカチオン塩から高収
量に２，３−ジハイドロキシ安息香酸またはその
カチオン塩を製造する微生物による変換に関す
る。本発明は３−ハイドロキシベンゾアート−２
−ハイドロキシラーゼ活性についての最初の生化
学的発明である。 メタ−ハイドロキシ安息香酸のカチオン塩は
種々の微生物の生長基質として役立つことがこれ
までに示されて来た。これらの微生物はこの化合
物に環開裂の準備段階として４あるいは６位の炭
素を水酸化する。これらの参考文献は以下のもの
がある：J.Bacteriol.107 468−475（1971）；
Dokl.Acad.Nauk SSR.234 696−698（1977）；
Bull.Agr.Chem.Soc.Japan24、211−216（1960）；
Ann.Jnst.Pastem、Paris177、47−57（1969）；
Arch.Mikrobiol、59、302−314（1967）；および
J.Gen.Appl.Microbiol.４、241−258（1958）．メ
タ−ハイドロキシ安息香酸のカチオン塩をプロト
カテクアートおよびゲンチザートにする水酸化の
触媒を行う酵素がシユードモナス テストステロ
ニ（Pseudomonas testosteroni）〔Biochem.
Biophys.Res.Commun.55、1102−1110（1955）〕
からおよびシユードモナス アエルギノサ
（Pseudomonas aeruginosa）、〔Biochem.
Biophys.Res.Commun.55、897−903（1973）〕か
らそれぞれ精製された。 メタ−ハイドロキシ安息香酸のカチオン塩の生
物学的変換に対する既報の処理法では、この化合
物を水酸化して目的の２，３−ジヒドロキシ安息
香酸のカチオン塩（これは化学的に合成すること
も困難である）を生成するものはなかつた。２，
３−ジヒドロキシ安息香酸のカチオン塩は以下の
文献に論じられる通り、非常に有用な鉄−キレー
ト試薬である。〔J.Pharmacol.Exp.Ther.190(3)、
187−92（1974）およびIron Metabolism.
Thalassemia Conf.p.187−192（1975）〕。 シユードモナス テストステロニ
（Pseudomonas testosteroni）株139ATCC17511
の変異株は紫外線照射により発生したもので、メ
タ−ハイドロキシ安息香酸のカチオン塩を２，３
−ジヒドロキシ安息香酸のカチオン塩に変換する
能力をテストされた。 目的の変異株はアメリカン・タイプ・カルチヤ
ー・コレクシヨン（The American Type
Culture Cllection）（於ロツクブレイ、メリーラ
ンド州）に登録番号ATCC31492として保管され
た。ATCC（The American Type Culture
Cllection）（Rockville、Maryland）において、
この株が恒久的に保管され、特許が認可された場
合、特許の有効期間中容易に利用出来ることが便
利である。特許出願中でも、本株は37CFR1.14お
よび35USC112の番号で入手可能である。保管さ
れた株を一般人が利用する上での制約はすべて特
許が許可された時に除かれるであろう。日本にお
いても昭和55年９月29日に微工研菌寄第5731号と
して寄託された。 シユードモナス テストステロニ
（Pseudomonas testosteroni）ATCC31492の細
胞を適当な水性培地、出来れば0.5％イーストエ
キスを補充したスタニール（staniers）基礎塩類
培地へ移す。一夜培養した細胞を遠心分離により
無菌的に取り出し、滅菌基礎塩類溶液で洗滌す
る。これらの洗滌した細胞の懸濁液を乳酸塩およ
びメタ−ハイドロキシ安息香酸のカチオン塩の滅
菌過溶液を含む滅菌フラスコ中に移す。メタ−
ハイドロキシ安息香酸のカチオン塩の重量に対し
細胞塊の乾燥重量比は約２：１から約10：１の範
囲で好適比は５：１である。メタ−ハイドロキシ
安息香酸のカチオン塩の濃度は約２ｍＭから約10
ｍＭにわたり、好適濃度は７ｍＭである。微生物
による変換のPHは５から９で中性が好ましい。温
度は20から45℃で好適温度は30℃である。微生物
による変換の時間は生成された２，３−ジヒドロ
キシ安息香酸のカチオン塩の量を高圧液体クロマ
トグラフイーで定量することにより監視される。
実質的な微生物による変換は約３から10時間で得
られる。微生物細胞は遠沈あるいは過により除
かれ、２，３−ジヒドロキシ安息香酸のカチオン
塩が分離され、既知の方法により精製される。こ
こでこの２，３−ジヒドロキシ安息香酸は培地中
のカチオンと塩を形成しているが、培地を酸性化
することにより遊離の安息香酸となる。 いずれにしても、メタ−ハイドロキシ安息香酸
のカチオン塩をシユードモナス テストステロニ
（Pseudomonas testosteroni）ATCC31492細胞
から単離された３−ヒドロキシベンゾエート−２
−ヒドロキシラーゼとの接触により生物変換が常
法の酵素技術を用いて行われる。 逆相高圧液体クロマトグラフイーを行い、その
移動相は50ｍＭ酢酸とメタノールの容量比４：１
の液体が用いられる。流速は1.2ml／minで一定
に保持し、カラムから溶出される物質を280nｍ
で紫外線（UV）吸収により定量する。 本発明の新規な工程はまず第一にメタ−ヒドロ
キシ安息香酸のカチオン塩を目的の２，３−ジ−
ヒドロキシ安息香酸またはそのカチオン塩へ生物
学的変換を行うことである。この簡易な工程によ
り、２，３−ジ−ヒドロキシ安息香酸のカチオン
塩の工業生産を可能にし、かつこの臨床的に非常
に有用な、重要な産物を開発および利用を可能に
する。 実施例 １ シユードモナス テストステロニ
（Pseudomonas testosteroni）ATCC31492を0.5
％イーストエキス培地で補充したスタニールの
（Staniers）基礎塩類培地４中、28℃18時間培
養した。得られた細胞塊はメタ−ハイドロキシ安
息香酸のカチオン塩１ｇおよび乳酸塩１ｇを補充
した基礎塩類培地１中30℃で１夜培養した。培
養後過した肉汁を凍結乾燥し、得られた固形物
を飽和食塩水100mlに溶解した。PHを6N HCLで
2.5に調整し、水層を酢酸エチル（４×50ml）で
抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥
し、真空蒸溜した。残渣を水から再結晶後、灰色
がかつた白色固体470mgを得た。この物質は高圧
液体クロマトグラフイーで２，３−ジヒドロキシ
安息香酸およびメタ−ヒドロキシ安息香酸89：11
の比の混合物であることが示された。 水から再結晶して得た３種類の結晶は高圧液体
クロマトグラフイーで均一な結晶化合物であり物
理的およびスペクトルの性状、融点および標品の
２，３−ジヒドロキシ安息香酸（Aldrich
Chemical Co.）と混融の結果同一であつた。 実施例 ２ 実施例１の工程はメタ−ヒドロキシ安息香酸の
カチオン塩とシユードモナス テストステロニ
（Pseudomonas testosteroni）ATCC31492の細
胞から単離された３−ヒドロキシベンゾエート−
２−ヒドロキシラーゼを接触させても同様な結果
が繰り返され得る。 実施例 ３ シユードモナス テストステロニ
（Pseudomonas testosteroni）ATCC31492によ
る、メタ−ジヒドロキシ安息香酸のカチオン塩濃
度の関数として、メタ−ヒドロキシ安息香酸のカ
チオン塩から２，３−ジヒドロキシ安息香酸のカ
チオン塩への生物学的変換の結果が次表に示され
る：
【表】
【表】
〓 キシ安息香酸のカチオン塩 〓
実施例 ４ シユードモナス テストステロニ
（Pseudomonas testosteroni）ATCC31492によ
る、時間の関数として、メタ−ヒドロキシ安息香
酸のカチオン塩から２，３−ジヒドロキシ安息香
酸のカチオン塩への生物学的変換の結果が次表に
示される：
実施例 ４ シユードモナス テストステロニ
（Pseudomonas testosteroni）ATCC31492によ
る、時間の関数として、メタ−ヒドロキシ安息香
酸のカチオン塩から２，３−ジヒドロキシ安息香
酸のカチオン塩への生物学的変換の結果が次表に
示される：
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ メターヒドロキシ安息香酸のカチオン塩をシ
ユードモナス テストステロニ（Pseudomonas
testosteroni）ATCC31492（微工研菌寄第5731号）
の細胞あるいはこの菌株から得た３−ヒドロキシ
ベンゾエート−２−ヒドロキシラーゼと、PH５か
ら９、そして20から45℃の温度で、生物学的変換
が実質的に完結する迄、接触させることからなる
２，３−ジヒドロキシ安息香酸またはそのカチオ
ン塩の製造法。 ２ 当該PHが6.8から7.2である特許請求の範囲第
１項記載の方法。 ３ 当該温度が28〜30℃である特許請求の範囲第
１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/031,626 US4217416A (en) | 1979-04-19 | 1979-04-19 | Biotransformation preparation of 2,3-dihydroxybenzoic acid |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS55144888A JPS55144888A (en) | 1980-11-12 |
| JPS6321477B2 true JPS6321477B2 (ja) | 1988-05-07 |
Family
ID=21860517
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4913080A Granted JPS55144888A (en) | 1979-04-19 | 1980-04-14 | Production of 2*33 dihydroxy benzoic acid by biological conversion |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4217416A (ja) |
| EP (1) | EP0018149B1 (ja) |
| JP (1) | JPS55144888A (ja) |
| DE (1) | DE3061977D1 (ja) |
| DK (1) | DK164680A (ja) |
| GR (1) | GR67618B (ja) |
| IE (1) | IE49585B1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4134774A1 (de) * | 1991-10-22 | 1993-05-06 | Basf Ag, 6700 Ludwigshafen, De | Verfahren zur herstellung von 2,5-dihydroxyphenylessigsaeure |
| DE10135550A1 (de) * | 2001-07-20 | 2003-01-30 | Bayer Cropscience Ag | Verfahren zum Herstellen von neuen Spinosyn-Derivaten |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3634192A (en) * | 1966-03-03 | 1972-01-11 | Sun Oil Co | Fermentation of anthracene |
| US3645847A (en) * | 1968-02-08 | 1972-02-29 | Sun Oil Co | Microbiological hydroxylation of aromatic acids |
-
1979
- 1979-04-19 US US06/031,626 patent/US4217416A/en not_active Expired - Lifetime
-
1980
- 1980-04-08 EP EP80301103A patent/EP0018149B1/en not_active Expired
- 1980-04-08 DE DE8080301103T patent/DE3061977D1/de not_active Expired
- 1980-04-14 JP JP4913080A patent/JPS55144888A/ja active Granted
- 1980-04-17 IE IE775/80A patent/IE49585B1/en not_active IP Right Cessation
- 1980-04-17 GR GR61703A patent/GR67618B/el unknown
- 1980-04-18 DK DK164680A patent/DK164680A/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GR67618B (ja) | 1981-08-31 |
| EP0018149B1 (en) | 1983-02-16 |
| JPS55144888A (en) | 1980-11-12 |
| DE3061977D1 (en) | 1983-03-24 |
| EP0018149A1 (en) | 1980-10-29 |
| US4217416A (en) | 1980-08-12 |
| DK164680A (da) | 1980-10-20 |
| IE800775L (en) | 1980-10-19 |
| IE49585B1 (en) | 1985-10-30 |
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