JPS6262155B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は酵母を用いて不飽和脂肪酸又はその
エステルから不飽和ジカルボン酸を製造する方法
に関するものである。 マレイン酸、フマル酸など炭素数の少ない不飽
和ジカルボン酸は工業的に広く利用されているが
長い炭素鎖をもつ不飽和ジカルボン酸については
有利な合成法がなく、そのために高価で利用の道
もほとんど開けていなかつた。しかしこのような
不飽和二塩基酸はエステル、アミド、ポリマー
鎖、大環状化合物、付加化合物など種々の化合物
の合成原料として利用でき、有利な合成法さえ見
出されればプラスチツク、塗料、香料その他の産
業分野において利用価値はきわめて大きいもので
ある。 ジカルボン酸の合成法としては第一アルコール
基など酸化によりカルボキシル基となり得る基を
もつ化合物の酸化法であるが、不飽和結合をもつ
原料を用いた場合これが酸化、開裂を受けやすく
不飽和ジカルボン酸の合成法としては適していな
い。 また酵母を用いて酸化発酵によりジカルボン酸
を製造する方法も知られている。例えば特公昭50
−19630号公報によると炭素数12〜18の飽和・不
飽和の炭化水素、アルコール、アルデヒド、モノ
カルボン酸などから飽和ジカルボン酸が得られて
いる。この技術の中では不飽和化合物例えばヘキ
サデセン―１も原料として用いられているが、酸
化反応の結果得られる主生成物は炭素数の減少し
た飽和ジカルボン酸である。他の生成物も飽和ジ
カルボン酸であり不飽和結合は酸化、開裂などの
反応で失なわれたものと理解される。 その他のものを含めて、これまでは知られてい
る酵母を用いたジカルボン酸の製法ではいずれも
飽和ジカルボン酸が得られており、原料の不飽和
結合の位置、立体構造を維持したまま不飽和ジカ
ルボン酸を得る技術は全く知られていなかつた。 本発明者らは飽和脂肪酸エステルからジカルボ
ン酸を生産する能力を有しているキヤンデイダ・
トロピカリスに属する菌株の不飽和脂肪酸及びそ
のエステルに対する作用を検討の結果、これらの
菌株の中に不飽和脂肪酸又はそのエステルから、
それらの不飽和結合の位置及び立体構造を維持し
た状態で脂肪酸と同炭素数の不飽和ジカルボン酸
を生産する能力を有する菌株を認め、これらの菌
株の性質を利用して不飽和ジカルボン酸を製造す
る本発明を完成した。即ち本発明は、キヤンデイ
ダ・トロピカリスに属し不飽和脂肪酸又はそのエ
ステルから不飽和ジカルボン酸を生産する能力を
有する酵母を、炭素数14〜22個の不飽和脂肪酸又
はそのエステルを含む培地で好気的に培養する
か、あるいは資化しうる炭素源であらかじめ培養
して得られる上記酵母の菌体の存在下に上記物質
（炭素数14〜22個の不飽和脂肪酸又はそのエステ
ル）を酸化して、炭素数14〜22個の不飽和ジカル
ボン酸を生成させ、これを採取することを特徴と
する不飽和ジカルボン酸の製造方法である。 本発明によれば炭素数14〜22個の不飽和ジカル
ボン酸を入手の容易な原料から工業的に有利に製
造することができる。以下本発明の詳細について
説明する。 本発明に於いて用いることのできる酵母はキヤ
ンデイダ・トロピカリス（Candida Tropicalis）
に属する酵母で、、不飽和脂肪酸又はそのエステ
ルから不飽和ジカルボン酸を生産する能力を有す
るもので、その例としてはキヤンデイダ・トロピ
カリス401（FERM―P1367号）、キヤンデイダ
トロピカリス（Candida tropicalis）104―04
（微工研菌寄第5713号、FERM―ＰNo.5713）等が
あげられる。 これらの菌株の菌学的諸性質は次の通りであ
る。 糖の醗酵性 グルコース ＋ ガラクトース ＋ ラクトース − マルトース ＋ メリビオース − ラフイノース − サツカロース ＋ 糖の資化性 グルコース ＋ ソルビトール ＋
マンニトール ＋ ガラクトース ＋ キシロース ＋ マルトース ＋ アラビノース − ラクトース − ラフイノース − エタノール資化性＋ 硝酸カリウム資化性− ゼラチン液化カ − アルブチン分解性 ＋ ビタミン要求性 ビオチン 本発明において不飽和ジカルボン酸の直接原料
として用いられる炭素源は炭素数14〜22個をもつ
不飽和脂肪酸又はそのエステルである。これらの
炭素源は単独で用いても、混合物として用いても
よい。 ここに炭素数14〜22個の不飽和脂肪酸としては
直鎖のものの他、分岐鎖を含んでいてもよく、天
然物例えば動植物等から採取したものでも、また
人工的に合成されたものでもよい。さらに不飽和
結合の位置、数にも限定されないが、末端不飽和
のものは酸化の影響を受けるので不適当である。
上記脂肪酸中でも原料入手の容易さ、製品の工業
的用途等から例えばミリストオレイン酸、２―ヘ
キサデセン酸、パルミトオレイン酸、オレイン
酸、エライジン酸、リノール酸、リノレン酸、エ
ルカ酸等が好ましい。 これら例示の不飽和脂肪酸は、本発明の方法に
より、それぞれその末端のメチル基がカルボキシ
ル基に変つた下記の不飽和ジカルボン酸を主生成
物として与える。５―テトラデセン二酸、２―ヘ
キサデセン二酸、７―ヘキサデセン二酸、９―
cis―オクタデセン二酸、９―trans―オクタデセ
ン二酸、６，９―オクタデカジエン二酸、３，
６，９―オクタデカトリエン二酸、５―ドコセン
二酸。 不飽和脂肪酸エステルは、上記不飽和脂肪酸の
エステルであり、通常用いられるアルコール成分
としては炭素数１〜４のアルコール、例えばメチ
ルアルコール、エチルアルコール、ｎ―プロピル
アルコール、ｎ―ブチルアルコール等の１級アル
コール及びイソプロピルアルコールで代表される
ような二級アルコールがある。また不飽和脂肪酸
のグリセリンエステルも用いられる。 これら不飽和脂肪酸エステルからはアルコール
成分に関係なく不飽和脂肪酸成分に対応するジカ
ルボン酸、即ち原料の末端メチル基及びエステル
基が共にカルボキシル基に変つた不飽和ジカルボ
ン酸が主生成物として得られる。 本発明ではこれら不飽和脂肪酸又はそのエステ
ルを主炭素源として前記の菌を好気的に培養する
ことにより炭素数14〜22個の不飽和ジカルボン酸
を生成させる。またこの方法の変法として使用菌
株が資化し得る他の炭素源、例えば酢酸、クエン
酸、コハク酸、グルコース、ソルビトール、ｎ―
パラフインなどを用いて菌を生育させ、菌が十分
に生育した時の前後に不飽和脂肪酸を添加して好
気的に培養して不飽和ジカルボンを生成させても
よい。 更に前記菌の静止菌体を用いて不飽和ジカルボ
ン酸を得ることもできる。即ちまず前に例示した
ような直接原料となる不飽和脂肪酸以外で使用菌
株が資化し得る炭素源を用いて前記の菌を培養
し、ついで採取した菌体を用いて不飽和脂肪酸又
はそのエステルを酵素的に酸化して不飽和ジカル
ボン酸を得ることができる。この反応は、例えば
培養混合物から採取し、生理食塩水で洗浄した菌
体を通常用いられる緩衝溶液例えばリン酸緩衝液
（PH7.5）に懸濁し、不飽和脂肪酸又はそのエステ
ルの適当量を加え恒温振盪機で振盪するなどの方
法で実行できる。 上記醗酵法、静止菌体法いずれをとる場合も原
料炭素源を水相及び菌体と十分接触させることが
望ましいが、不飽和脂肪酸もそのエステルも共に
液状であるものが多いので一般には激しく撹拌又
は振盪する方法で満足である。勿論必要に応じ界
面活性剤の添加等より良好に接触させる手段を用
いてもよい。 本発明で用いる菌の培養には前記の炭素源の他
に通常用いられる栄養源を含む培地を用いる。 例えば、窒素源としてペプトン、尿素、リン酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム等の有機・無機窒素化合
物；無機塩類としてナトリウム、カリウム、マグ
ネシウム、鉄、ニツケル、亜鉛などのリン酸、硫
酸或いは塩酸塩類、例えばKH₂PO₄，K₂HPO₄，
Na₂HPO₄―12H₂O，MgSO₄，7H₂O，FeSO₄・
7H₂O，ZnSO₄・7H₂O，NiCl₂・6H₂O，NaClなど
の栄養源を用いる。又、その他の栄養源として酵
母の生育を良好にするために酵母エキス、コーン
ステイープリカー、肉エキス、Ｄ―ビオチン等も
普通に用いられる。 これらの添加物の種類、添加量は菌の培養にお
ける一般的技術知識にもとづいて適宜定めること
ができる。 培養温度は室温ないしやや高めで行なわれ、好
ましくは20〜40℃が用いられる。培地のPHは5.5
〜8.5が適当であるが、培養中にPHが低下するの
でアンモニア、カセイソーダ、カセイカリなどの
中和剤でPHを調節するのがよい。 培養法としては振盪培養又は通気撹拌培養など
を用いて好気的に行なう。これらの手段は原料不
飽和脂肪酸と培養液と気相との良好な接触に役立
つ。 このような培養を行なうことにより、菌が生育
し、不飽和脂肪酸又はエステルを酸化して培養液
中に不飽和ジカルボン酸が蓄積する。 栄養源としてＤ―ビオチンを存在させ、酢酸、
グルコース、ソルビトール、クエン酸、コハク酸
のような炭素源と不飽和脂肪酸及びそのエステル
を共存せしめた場合は培養初期では不飽和脂肪酸
及びそのエステル以外の炭素源で菌体を生成し、
その後生成菌体による不飽和脂肪酸及びそのエス
テルの酸化が行われる。 培地中に生成蓄積された不飽和ジカルボン酸は
公知の方法で分離採取できる。例えば有機溶媒抽
出法や培養液のPH調整による沈殿法が常法として
用いられる。更に具体的に例示すれば、培養液か
ら必要に応じて残存する基質と菌体を遠心分離又
は過等の適当な方法により除去後、酸性にして
エーテル等の溶媒で抽出するか、又はイオン交換
樹脂による選択吸脱着する方法等によつて効率良
く単離することができる。生成された不飽和ジカ
ルボン酸の同定定量は培養液又は反応液を水酸化
カリウムでアルカリ性にして不飽和ジカルボン酸
を溶解し、一定量を取り濃塩酸で酸性にした後、
エーテル抽出を行い、抽出物をジアゾメタンでメ
チル化後、ガスクロマトグラフイー及びGC―MS
によつて分析同定し、標準ジカルボン酸を用いて
予め作成した検量線から生成された不飽和ジカル
ボン酸の定量を行つた。 本発明の効果は不飽和脂肪酸及びそのエステル
より微生物によつて、有機合成の困難な長鎖の不
飽和ジカルボン酸を得る方法を提供したことにあ
る。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ 〔キヤンデイダ・トロピカリス401株又は104―
04株によるオレイン酸よりオクタデセン二酸の
製造〕 ソルビトール20ｇ，KH₂PO₄，１ｇ，
K₂HPO₄，３ｇ，MgSO₄・7H₂O0.2ｇ，尿素12
ｇ，FeSO₄・7H₂O10mg，ZnSO₄・7H₂O10mg，Ｄ
―ビオチン0.1mg，イオン交換水１よりなる液
体培地（PH7.0）15mlをヒダ付フラスコに入れ、
更にオレイン酸を0.3ml添加後、120℃，15分間蒸
気滅菌を行い培地とした。一方キヤンデイダ・ト
ロピカリス401株又は104―04株を酵母エキス、麦
芽エキス、グルコースの培地で前培養し、その数
滴を上記培地に接種する。培養は30℃で行い、菌
の増殖に従つてPHが低下するので、水酸化ナトリ
ウム溶液でPH7.0〜7.5に調整した。接種後48時間
目に培養液中の不飽和ジカルボン酸につき分析、
同定、定量したところ第一表に示す通りの不飽和
ジカルボン酸の生成蓄積が認められた。 更に培養液から常法により不飽和ジカルボン酸
をエーテルで抽出し、溶剤を留去すると21mgの粗
結晶が得られた。ｎ―ヘキサンで再結晶すると融
点は69〜70℃であり、９―cis―オクタデセン二
酸の文献値（69〜70℃：W.J.Gensier他，J.A.C.
S.77，4846，1955）と一致した。 元素分析値Ｃ：69.8，Ｈ：10.5（理論値Ｃ：
69.2，Ｈ：10.3）、赤外吸収スペクトルによつて
も取得した結晶が上記物質であることが確認され
た。

〔キヤンデイダ・トロピカリス104―04株によるオレイン酸エステルよりオクタデセン二酸の製造〕

実施例１で用いたオレイン酸の代りにオレイン
酸メチル、オレイン酸エチル、オレイン酸ブチル
の各エステル及びグリセリンエステルであるトリ
オレインを用い、他は実施例１と同様の条件、操
作を行い、接種後48時間目に培養液中の不飽和ジ
カルボン酸につき分析、同定、定量したところ第
二表に示す如き不飽和ジカルボン酸が生成蓄積し
ていた。

〔キヤンデイダ・トロピカリス104―04株による不飽和脂肪酸又はそのエステルよりジカルボン酸の製造〕

実施例１で用いたオレイン酸の代りにエライジ
ン酸、エライジン酸メチル、２―ヘキサデセン
酸、リノール酸、リノール酸メチル、エルカ酸又
はエルカ酸メチルを用い、他は実施例１と同様の
条件、操作用行い、接種後48時間目に培養液中の
不飽和ジカルボン酸につき分析、同定、定量した
ところ第三表に示す如き不飽和ジカルボン酸が生
成蓄積していた。

〔キヤンデイダ・トロピカリス104―04株静止菌体によるオレイン酸又はブチルエステルからのヘキサデセンジカルボン酸の製造〕

実施例１で用いたオレイン酸の代りにｎ―ヘキ
サデカンを0.5％添加した培地でキヤンデイダ・
トロピカリス104―04株を30℃、24時間培養し
た。遠心分離した菌体を生理食塩水で２回洗浄
し、これを0.5モル濃度のリン酸緩衝溶液（PH
7.5）15mlに懸濁し、オレイン酸又はオレイン酸
ブチルエステルを0.3ml加え、30℃で24時間振盪
を行い、反応液中の不飽和ジカルボンサンにつき
分析、同定、定量したところ第四表に示す如き不
飽和ジカルボン酸が生成蓄積していた。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ キヤンデイダ・トロピカリスに属し不飽和脂
   肪酸又はそのエステルから不飽和ジカルボン酸を
   生産する能力を有する酵母を、炭素数14〜22個の
   不飽和脂肪酸又はそのエステルを含む培地で好気
   的に培養するか、あるいは資化しうる炭素源であ
   らかじめ培養して得られる上記酵母の菌体の存在
   下に上記物質を酸化して、炭素数14〜22個の不飽
   和ジカルボン酸を生成させ、これを採取すること
   を特徴とする不飽和ジカルボン酸の製造方法。