KR101054039B1 - Ｈａｌｏｍｏｎａｓ 속으로부터 9Ｚ 헥사데센노이드산의 생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 해양미생물인 Halomonas 속으로부터 9Z 헥사데센노이드산(9Z-Hexadecenoic acid) 조제방법에 관한 것이다.
Halomonas 속, 9Z-Hexadecenoic acid

Description

Ｈａｌｏｍｏｎａｓ 속으로부터 9Ｚ 헥사데센노이드산의 생산방법{A method for preparing 9Z-Hexadecenoic acid from Halomonas sp.}
본 발명은 갯벌 해양미생물인 Halomonas CCRB608(KCTC 11313BP)로부터 9Z 헥사데센노이드산(9Z-Hexadecenoic acid) 조제방법에 관한 것이다.
일반적으로 9Z-Hexadecenoic acid는 불포화 지방산으로써 16개의 탄소 중 9번 탄소에 이중 결합을 하나 가진 구조를 갖는 화합물이다. 9Z-Hexadecenoic acid는 palmitoleic acid라고도 불리며 자연계에서는 동물성지방, 식물의 열매 등에서 존재한다. Palmitoleic acid는 지방산이지만 일부 지방산이 갖는 특성외의 다른 여러 가지 기능을 갖고 있기 때문에 산업적 이용가치가 매우 크다.
Palmitoleic acid는 산업적으로 이용가치가 큰 7,10-dihydroxy-8(E)- hexadecenoic acid의 기질로 사용된다. 7,10-dihydroxy-8(E)- hexadecenoic acid는 페인트, 잉크, 화장품, 계면활성제, 농약, 의약품에 원료로 이용되고 있다. 특히 pseudomonas aeruginosa는 palmitoleic acid를 기질로 7,10-dihydroxy -8(E)- hexadecenoic acid를 생산한다. 이로인해 지방산은 점성이나 반응성 등 특이한 성질을 갖도록 만들어준다(Appl Microbiol Biotechnol (2007) 75:435440).
동물의 피부에 존재하는 palmitoleic acid는 cis-6-hexadecenoic acid (C16:1△6)로써 피부의 유연제로 작용한다. 또한 피부에 존재하는 cis-6-hexadecenoic acid는 Staphylococcus aureus와 같은 외부 침입세균파괴하거나 세균의 발육, 증식을 억제하는 항세균작용을 한다. Atopic dermatitis 환자의 피지에는 cis-6-hexadecenoic acid의 수준이 매우 낮으며 Staphylococcus aureus 같은 세균이 침입하여 colony 형성이 용이하다고 보고되었다 (Dermatology. 2005;211(3):240-8, Skin Pharmacol Appl Skin Physiol. 2003 May-Jun;16(3):176-87). 피부 보호제, 유연제로 작용하는 9Z-Hexadecenoic acid는 피부가 노화될수록 분해가 이루어지기 때문에 보충의 필요하기 때문에 9Z-Hexadecenoic acid는 피부 유연제의 주요성분으로 사용되고 있다.
9Z-Hexadecenoic acid는 당뇨병 발병에 중요한 베타세포 사멸을 억제을 억제하는 기능이 있다. 긴사슬 포화 지방산(Long-chain saturated fatty acids)는 췌장의 베타세포의 사멸을 유도하지만 짧은 사슬(shorter-chain saturated) 또는 긴사슬 불포화 지방산 (long-chain unsaturated molecules)은 베타세포사멸을 유도하지않고 오히려 긴사슬 포화 지방산에 대한 베타세포 사멸을 억제하는 기능을 갖고 있다(Apoptosis. 2006;11:12311238, FEBS Letters. 2004; 560: 103-108).
이와 같이 자연계에 존재하는 palmitoleic acid는 지방산의 특성외에 여러 기능들을 갖고 있으며 이는 산업적으로 이용가치가 크다. 그러나 미생물을 이용하 여 9Z-Hexadecenoic acid을 생산하려는 연구는 아직 시도된바 없다. 본 발명자들은 갯벌 해양미생물인 Halomonas CCRB608에서 9Z-Hexadecenoic acid을 수월하게 생산하는 방법을 개발하였으며 이는 산업적으로 이용가치가 있으리라 판단된다.
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 미생물을 이용한 9Z 헥사데센노이드산(9Z-Hexadecenoic acid) 제조방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a) Halomonas 속 해양 미생물 균주를 배양하는 단계;
b) 상기 배양된 균주의 대사체를 용매를 이용하여 추출하고 농축하는 단계를 포함하는 9Z-헥사데센노이드산(Hexadecenoic acid)을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서 본 발명의 방법은 c) 상기 농축된 대사체를 크로마토그래피를 수행하는 단계를 더욱 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 Halomonas 속 해양 미생물 균주는 Halomonas CCRB608(KCTC 11313BP)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 용매는 알코올, 헥산, 및 염화메틸렌으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니하며, 상기 알코올은 메탄올인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 공정에서, 미생물 세포(또는 미생물)는 먼저 (예를 들면, 수성) 배양 배지를 함유하는 발효조 용기에서와 같이 적당히 배양되거나 발효시킬 수 있다. 발효 조건은 생성되는 지방산 함량을 위해 최적화될 수 있다. 원할 경우 및 예를 들면, 발효를 마친 후, 미생물은 사멸되고/사멸되거나 저온살균시킬 수 있다. 이러한 과정은 바람직하지 않은 효소, 예를 들면 지방산을 분해시키거나 그 지방산의 수율을 감소시킬 수 있는 효소를 불활성화시킬 수도 있다.
이어서, 발효 브로쓰(바이오매스와 배양 배지)를 발효조로부터 제거(예를 들면, 유출 let out)시킬 수 있으며, 세포벽 파괴 장치(예를 들면, 호모지나이저)로 보내질 수 있다. 필요하다면, 액체(통상적으로 물)는 그로부터 (우선) 제거될 수 있다. 적당한 고체 액체 분리 기술이 이용될 수 있다. 이러한 과정(탈수)은 원심분리 및/또는 여과에 의해 수행될 수 있다. 세포는 예를 들면, (물과 같은) 수용액을 사용하여 세척하여 예를 들면, 세포외 수용성 또는 수-분산성 화합물을 제거할 수 있다. 이어서, 세포를 파괴 또는 용해에 즉시 쓸 수 있다.
세포 용해(단계 (a))
이어서, 미생물 세포를 파괴(또는 용해)시킬 수 있다. 이러한 과정은 하나 이상의 효소적, 물리적 또는 기계적 방법 또는 기술을 사용하여 예를 들면, 고 전단 조건에서 달성될 수 있다. 물리적 기술로는 세포벽이 파열되는 충분한 온도로 세포를 가열 및/또는 건조시키는 과정이 포함된다. 이러한 과정은 비등을 포함할 수 있다.
효소적 방법은 하나 이상의 효소, 예를 들면 세포벽 분해 효소에 의한 용해를 포함한다. 세포벽 분해 효소는 용해 효소일 수 있다. 다른 효소로는 (예를 들면, 알칼라인) 프로테아제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 키티나제 및/또는 펙티나제가 포함된다. 다른 세포벽 분해물질, 예를 들면, 염, 알칼리, 및/또는 하나 이상의 계면활성제 또는 세제가 하나 이상의 효소와 병행하여 또는 그 대신에 사용될 수 있다. 물리적, 기계적 및/또는 효소적 방법의 조합이 또한 고려된다.
기계적 기술이 사용될 경우, 이는 예를 들면 호모지나이저를 사용하는 균질화를 포함할 수 있다. 이는 세포벽을 파괴할 수 있는 볼 밀 또는 여타 기계일 수 있다. 적당한 호모지나이저는 폴리트론 호모지나이저 같은 고압 호모지나이저(예를 들면, 300 내지 500 kg/cm2 또는 바의 압력에서)를 포함한다. 다른 균질화 기술은 입자, 예를 들면 모래 및/또는 글래스 비드(예를 들면, 비드 밀의 사용)와의 혼합을 수반할 수 있다. 대안의 기계적 기술은 밀링 장치의 사용을 포함한다. 세포벽의 다른 파괴 방법은 초음파, 스프레이 건조 및/또는 가압이나 고압의 어플라이언스를 포함한다. 여기에서의 마지막 기술은 콜드-프레싱으로 불린다: 이 기술은 150 내지 500바, 최적으로는 200 내지 400바와 같이, 100 내지 600 또는 700바(Atm 또는 kg/cm2)의 압력에서 수행될 수 있다.
균질화는 세포벽 파괴의 바람직한 방법이다. 파괴(예를 들면, 균질화)하는 동안 고압 및/또는 저압에서, 호모지나이저를 1 내지 3회 통과할 수 있다. 예를 들면, GaulinTM 호모지나이저를 사용할 수 있다. 파괴(예를 들면, 균질화)하는 동안의 압력은 400 내지 800바, 최적으로는 500 내지 600 또는 700바(Atm 또는 kg/m2)와 같이 300 내지 900바일 수 있다. 필요에 따라 저압, 예를 들면 150 내지 300바가 사용될 수 있다. 따라서 작업 압력은 호모지나이저의 유형, 통과 횟수 등에 따 라 150 내지 900바로 다양할 수 있다.
비록 세포 용해가 화학적으로 수행될 수는 있지만, 공정(에서의 이러한 단계)가 바람직하게는 무-용매성임에 따라 이는 바람직하게 사용되지 않는다.
세포벽의 파괴는 발효로부터 생기는 브로쓰에서 수행될 수 있거나, 예를 들면 세포는 여전히 배양 배지에 함유될 수 있거나 그러한 배지가 존재할 수 있다. 파괴하는 동안 1종 이상의 첨가제가 첨가되거나 존재할 수 있거나(알칼리 금속 염, 예를 들면 NaCl 같은) 또는 파괴 후에 첨가될 수도 있다(예를 들면, 균질화된 브로쓰에). 파괴하는 동안 유기 용매(예를 들면, MeOH, 클로로포름)는 바람직하게는 존재하지 않는다. 파괴는 (임의로 세척 및/또는 농축된) 바이오매스상에서(예를 들면, 고체 액체 분리 후) 수행될 수 있다. 파괴는 따라서 세포와 물을 포함하되 용매를 함유하지 않는 (예를 들면, 수성) 조성물상에서 수행된다.
세포벽 파괴를 개선하기 위하여, 파괴는 약 10 내지 200 g/l의 건조 물질 함량에서 수행될 수 있다. 이는 발효 브로쓰상에서, 예를 들면 발효 후에 수행될 수 있거나, 브로쓰로부터, 예를 들면 브로쓰를 탈수 및/또는 고체/액체 분리에 투입시킨 후 유도될 수 있다.
필요에 따라, 분리 유도물질을 파편으로부터 지방산의 분리를 조장하기 위하여 이 단계에서, 예를 들면 균질화된 물질에 첨가될 수 있다.
세포 파편으로부터 지방산의 분리(단계 (b))
미생물 지방산을 세포벽 파편의 적어도 일부로부터 분리해낸다. 이 단계에서 오일 또는 지질 상 또는 층에 존재할 수 있다(그리고 이는 지방산을 포함할 수 있 다). 이는 상부층일 수 있다. 이러한 층은 예를 들면, 세포벽 파편을 함유하는 (더 낮은) 수성층 위에 존재할 수 있다. 지방산을 포함하는 층은 이어서 수성층(또는 상)으로부터 분리시킬 수 있다. 1종 이상의 계면활성제 또는 세제가 이러한 과정을 돕기 위해 존재하거나 첨가될 수 있다.
세포벽 파편의 적어도 일부로부터 지방산의 분리는 기계적 방법, 특히 원심분리를 이용하여 바람직하게 달성되거나 보조된다. 적당한 원심분리는 WestfaliaTM(반- 및 공업적 규모) 또는 BeckmanTM(예를 들면, 실험실용 원심분리기)로부터 달성될 수 있다. 원심분리(예를 들면, 실험실 규모 원심분리)는 3 또는 5 내지 7 또는 12, 최적으로는 4 또는 5 내지 6 또는 10분(체류시간)과 같이 2 또는 4 내지 8 또는 15분간 지속될 수 있다.
원심분리력(g)은 3,000 또는 5,000 내지 8,000 또는 20,000g, 최적으로는 4,000 내지 6,000g, 또는 7,000 내지 9,000g와 같이 1,000 또는 2,000 내지 10,000 또는 25,000g일 수 있지만, 원심분리는 6000 내지 12,000g, 15,000g, 20,000g 또는 25,000g까지의 중력에서 사용될 수 있다. 원심분리는 12,000 rpm, 최적으로는 8,000 내지 10,000 rpm과 같은 4,000 내지 14,000 rpm에서 수행될 수 있다. 1회 이상의 원심분리가 필요할 수도 있다. 특정 원심분리기를 사용할 경우 최대 중력은 더 낮을 수도 있으며, 예를 들면 WestfaliaTM 원심분리기(예를 들면, 모델 NA-7)를 사용할 경우 6000g일 수 있다. 유량은 150 내지 450 l/hr, 최적으로는 200 내지 400 l/hr과 같이 100 내지 500 리터/시간일 수 있다. 원심분리에 의해 2상 시스템(지방 또는 오일 상층 및 하부 수성층) 또는 3상 시스템(지방 또는 오일 상층, 중앙 수성층 및 통상적으로 세포 파편을 함유하는 바닥층)이 초래될 수 있다.
분리를 보조하는 분리 유도물질, 또는 유도제가 첨가될 수 있다. 이는 단계 (a) 동안, 단계 (a) 후 단계 (b) 전, 또는 단계 (b) 동안 존재하거나 보충될 수 있다. 이는 분리된 지방산과 수성상의 형성을 보조할 수 있다. 유도물질은 수성상의 밀도를 증가시킬 수 있으며, 이는 이어서 지방산 상보다 한층 더 조밀하게 될 수 있다. 적당한 유도물질로는 알칼리 금속 염, 예를 들면 NaCl이 포함된다. 유도물질은 30 내지 130 g/l, 최적으로는 50 내지 100 g/l와 같이 10 내지 150 g/l의 농도로 첨가될 수 있다.
본 발명은 Halomonas CCRB608에서 9Z-Hexadecenoic acid를 분리 정제 하는 방법을 최적화 하였으며 9Z-Hexadecenoic acid의 구조와 효능을 확인하였다.
또한 본 발명의 일 구체예에 있어서 본 발명은 a) Halomonas CCRB608 갯벌 해양 미생물 균주를 배양하는 단계;b) 상기 배양된 균주의 대사체를 용매를 이용하여 추출하고 농축하는 단계;c) 상기 농축된 대사체를 sephadex LH-20 컬럼 크로마토 그래피를 수행하여 9Z-Hexadecenoic acid을 분리하는 단계; 및 d)9Z-Hexadecenoic acid 분획 물질을 HPLC, GC-MS 및 NMR로 확인하는 단계를 포함한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 갯벌 해양미생물인 Halomonas CCRB608(KCTC 11313BP)로부터 9Z 헥사데센노이드산(9Z-Hexadecenoic acid)조제방법에 관한 것이다. 강화도 갯벌에서 분리된 Halomonas CCRB608(KCTC 11313BP)은 9Z-Hexadecenoic acid의 생산능이 우수 함을 확인하였으며, 배양학적, 및 생리학적 특성 조사를 통해서 최적 생산 조건을 확립하였다. 본 발명의 균주 Halomonas CCRB608은 해양 완전고체배지(sea water complete agar medium: 5 g Bacto tryptone, 3g Yeast extract, 3 ml Glycerol, Aged Sea water 75, agar 30% in D.W. pH 7.5-8.0)에서 25℃, 호기 조건으로 72 시간 고체배양 시 가장 많은 9Z-Hexadecenoic acid을 생산한다. 상기 조건으로 균주를 배양시 9Z-Hexadecenoic acid의 생산량은 7.8 μg/100 cm2이였으며, 상기 조건으로 9Z-Hexadecenoic acid의 생산시 수득율은 12.4% (62 mg/500 mg) 였다. Halomonas는 배양하기가 쉽고 경제적이며 불포화 지방산인 9Z-Hexadecenoic acid 함량이 높아서 산업적 이용가능성이 있을 것으로 예상된다.
이하에서는 본 발명을 첨부된 도면을 참고로 하여, 상세하게 살펴보기로 한다.
1. Halomonas CCRB608 동정
본 발명에서 사용한 미생물은 강화도 갯벌에서 분리한 Halomonas CCRB608으로 대한민국 대전시 유성구 소재 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2008년 4월 15일 기탁번호 KCTC11313BP로 기탁된 것을 이용하였다.
도 1a, b 및 도 2는 9Z-Hexadecenoic acid 생산 균주를 Easy24plusE kit와 16s rDNA를 분리하여 sequencing하여 균주 동정을 한 결과 Halomonas CCRB608임을 조사하였다. 9Z-Hexadecenoic acid 생산 균주의 생리학적 활성은 도 1B에, 16s rDNA를 분리해 조사한 sequencing은 도 2에 도시하였으며 그 결과는 사용한 미생물이 Halomonas CCRB608임 확인하였다.
2. Halomonas CCRB608 배양 및 대사체 추출
도 3은 갯벌 해양미생물에서 9Z-Hexadecenoic acid의 추출방법을 나타내는 흐름도이다.
Halomonas CCRB608로부터 9Z-Hexadecenoic acid의 최대생산 조건을 찾기 위하여 미생물을 해양완전고체배지와 해양완전액체배지에서 배양하고 활성을 비교 조사하였다. 그 결과 해양완전고체배지 추출물의 활성이 해양완전액체배지 추출물에 비해 탁월한 효능을 나타냈으므로 9Z-Hexadecenoic acid의 생산은 완전해양고체배지(sea water complete agar medium: 5 g Bacto tryptone, 3g Yeast extract, 3 ml Glycerol, Aged Sea water 75, agar 30% in D.W. pH 7.5-8.0)를 이용하였다. Halomonas CCRB608 SWC에 도말하고 25℃, 호기 조건으로 72 시간 배양한 후 균주를 건조시키고, 잘게 잘라 5 L들이 유리병에 넣고 메탄올을 첨가하여 24시간 교반 후 배지덩어리는 제거하는 방법을 이용하였다. 그 후 동량의 핵산을 첨가하고 교반을 반복하고 총 추출액을 Saperatory Funnel에 넣어 상층액(헥산층)을 분리하고 Rotary Evaporator (감압 농축기)로 농축시킨다.
3. 9Z-Hexadecenoic acid의 분리 및 동정
미생물 대사체 추출물 500 mg에 염화메틸렌과 메탄올을 부피비 1:1로 혼합한 용액을 가하고 상온에서 흔든 후 여과하여 상등액과 침전 (MCW1)을 분리하였다. 상등액을 감압 농축한 후 다시 염화메틸렌-메탄올 (1:1) 혼합용액을 가하고 진탕한 후 여과하여 상등액과 침전(MCW2)를 분리하였다. 상등액을 다시 감압 농축한 후 염화메틸렌-메탄올(1:1) 혼합용액을 유출용매로 하는 Sephadex LH-20 (직경 25mm x 길이 400 mm) 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 7개의 소분획을 획득하였다. 그 중 상대적으로 양이 많은 N5와 N6을 합하여 아세토니트릴에 용해시킨 후 고속유체크로마토그래피를 (HPLC) 수행하여 화합물 11종의 소분획물을 수득하였다. HPLC를 통하여 분리한 11종의 분획물의 활성을 검색한 결과 5(6)-8이 그 중 가장 강한 활성을 나타내었다. GC-MS 및 NMR을 이용하여 5(6)-8의 구조를 분석하여 구조를 동정하였다. 그 결과 9Z-Hexadecenoic acid로 동정하였다.
4. 9Z-Hexadecenoic acid의 효능 확인
9Z-Hexadecenoic acid의 효능을 확인하기 위하여 INS-1 세포와 SD 백서의 췌장에서 분리한 소도를 이용하였다. INS-1 세포는 고농도의 포도당과 palmitate를 처리하고 SD 백서 소도에는 palmitate를 처리하여 베타세포 사멸 모델을 구축하였다(Karaskov E et al., Endocrinology. 147(7):3398-407. 2006). INS-1 베타세포와 SD 백서의 췌장에서 분리한 소도 베타세포에 Halomonas CCRB608에서 분리한 9Z-Hexadecenoic acid를 처리한 경우 palmitate에 의한 세포사멸억제 효능을 나타냈다(도 5).
본 발명은 Halomonas CCRB608에서 생산하는 9Z-Hexadecenoic acid의 구조와 효능을 확인하였으며, 미생물 대사체로 부터 9Z-Hexadecenoic acid를 분리 정제 하는 방법을 최적화 하였다.
이하에서는 본 발명을 비한정적인 실시예를 통하여 더욱 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 이해를 돕고자 예시하는 것으로 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되지 아니한다.
실시예1: Halomonas CCRB608 동정
상기 기재된 방법에 따라서 생리학적 검사 및 16s rDNA sequencing으로 균주 동정을 수행하였다. 자세한 결과는 도 1a. b 및 도 2에 도시하였다.
균주의 형태는 1000 X 광학 현미경 하에서 수행하였다. 생리학적 검사는 장내 세균 동정 키트인 Easy24plusE kit (Komed 사, 한국)를 사용하였고, 활성이 확인된균주는 16s rDNA sequencing를 통해 동정 작업을 수행하였다. 해양 미생물에서 chromosomal DNA를 분리한 후 16s rDNA에 특이한 primer를 이용하여 sequencing하였다. 그 결과 상기 출물은 Halomonas 균에 속하는 것임을 확인하였다. 16s rDNA sequencing 결과는 도 2에 그 결과를 기록하였다.
실시예 2: Halomonas CCRB608 배양 및 활성 분획 분리
서해안 갯벌에서 채취한 Halomonas CCRB608 균주를 Sea Water Complete Medium :5 g Bacto tryptone, 3g Yeast extract, 3 ml Glycerol, Aged Sea water 75, agar 30% in D.W. pH 7.5-8.0(SWC) 배지 500장에 smearing 한 후, 28°C에서 72시간 배양하여 균주를 대량 생산하였다. 다음 2단계는 추출단계로 자란 균주를 건조 시킨 후 배지를 잘게 잘라 5L들이 유리병에 넣어 잠길 정도로 메탄올을 넣고 Stirrer (Labortechnik Co., Germany)로 24시간 교반하여 추출하였다. 24시간 후 배지 덩어리들은 체에 걸러내고 추출액에 동량의 핵산을 첨가하여 다시 잘 섞어준다. 6시간 정도 교반한 후 총 추출액을 Saperatory Funnel에 넣어 24시간 동안 분리시킨다. 그 결과 상층에는 Hexane과 sample, 중층에는 Methanol, 하층에는 배지 찌꺼기 순서로 sample이 정렬하게 된다. 본 발명자들은 상층액을 모아서 감압 농축기로 농축시켰다.
미생물 추출물 500 mg에 염화메틸렌과 메탄올을 부피비 1:1로 혼합한 용액 5 mL을 가하고 상온에서 5분간 흔든 후 여과하여 상등액과 침전 (MCW1)을 분리하였다. 상등액을 감압 농축한 후 다시 염화메틸렌-메탄올 (1:1) 혼합용액 3 mL을 가하고 40℃ 에서 3분간 진탕한 후 여과하여 상등액과 침전(MCW2)를 분리하였다. 상등액을 다시 감압 농축한 후 염화메틸렌-메탄올(1:1) 혼합용액을 유출용매로 하는 Sephadex LH-20 (직경 25mm x 길이 400 mm) 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 하기한 바와 같이 (도 3) 7개의 소분획을 (1~7) 획득하였다.
상기한 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피의 조건 및 분획법은 다음과 같다.
이동상 : 염화메틸렌-메탄올 (1:1)
고정상 : Sephadex LH-20 (Pharmacia, 컬럼직경 25mm x 길이400 mm)
유 속 : 1 mL/min
소분획 : 헥산 hexane -초산에틸 ethylacetate (3:1) 혼합액을 전개용매로 한 실리카겔 TLC로 각 vial의 시료액을 분석하여 동일한 TLC spot을 나타내는 시료액들을 합하여 다음과 같이 7개의 소분획을 조제하였다.
160H-1 (최초50 mL, 4.8 mg),
160H-2 (vial 3-vial 6; 8 mL, 8.5 mg),
160H-3 (vial 7-vial 10; 8 mL, 9.2 mg),
160H-4 (vial 11 vial 13; 6 mL, 20.6 mg),
160H-5 (vial 14-vial 16; 6 mL, 205.1 mg),
160H-6 (vial 17, 23 및 최종 40 mL; 44 mL, 135.3 mg)
160H-7 (vial 24, 25 및 최종 40 mL; 44 mL, 6.5 mg)
활성분획인 160H-5, 160H-6, 160H-MCW1 및 160H-MCW2를 실리카겔 박막크로마토그래피를 (전개용매 헥산:초산에틸 = 3:1 v/v) 이용하여 함유성분을 분석한 결과 상기 4종의 분획 모두 매우 유사한 지방산 유도체로 추정되는 물질이 주성분임을 추정할 수 있었다. 그 중 상대적으로 양이 많은 160H-5와 160H-6을 합하여 아세토니트릴 1.5 mL에 용해시킨 후 고속유체크로마토그래피를 (HPLC) 수행하여 화합물 160H- 5(6)-8 (62 mg)을 포함한 11종의 소분획물을 수득하였다.
HPLC 분리조건은 다음과 같다.
이동상 : 아세토니트릴-물 (4:6 v/v) 10 분 용출 후 50분동안 아세토니트릴-물 (4:6 v/v)로부터 100% 아세토니트릴까지 용매조성을 변화시킴.
고정상 : Phenomenex Luna C18(2) 15um 20x250 mm
유 속 : 10 mL/min
소분획 : 160H-5(6)-1 (Rt 5.0-8.0 min); 160H-5(6)-2 (Rt 15.0 28.5 min); 160H-5(6)-3 (Rt 28.5 36.0 min); 160H-5(6)-4 (Rt 36.0 44.0 min); 160H-5(6)-5 (Rt 44.0 47.5 min); 160H-5(6)-6 (Rt 47.5 51.0 min); 160H-5(6)-7 (Rt 51.0 54.0 min); 160H-5(6)-8 (Rt 54.0 56.0 min); 160H-5(6)-9 (Rt 56.0 57.5 min); 160H-5(6)-10 (Rt 57.5 61.0 min); 160H-5(6)-11 (Rt 61.0 65.0 min)
상기한 HPLC를 통하여 분리한 분획물의 활성을 검색한 결과 160H-5(6)-8이 그 중 가장 강한 활성을 나타내었다.
실시예 3: 9Z-Hexadecenoic acid의 동정
160H-5(6)-8 분획을 GC-MS로 분석하고 LC-MS 자료의 database 검색 결과 9-Hexadecenoic acid로 조사 되었고 그 결과는 도 4a에 도시하였다. Hexadecenoic acid에 이중결합이 어느 위치에 존재하는지 구조를 분석하기 위하여 NMR 기법을 이 용하였다. 160H-5(6)-8의 구조를 1H NMR, gHSQC, gHMBC NMR 스펙트럼을 분석한 결과 조사한 결과 160H-5(6)-8의 구조는 하기 도 4e의 화학식으로 표시되는 9Z-Hexadecenoic acid로 동정되었다. NMR 스펙트럼 분석 결과는 도 4 b, c, d에 도시하였다.
실시예 4: 베타세포에서 9Z-Hexadecenoic acid의 활성 확인
INS-1 베타세포, rat islet에 9Z-Hexadecenoic acid를 전 처리하고 포화지방산인 palmitate를 사용하여 베타세포 세포사멸 억제효능을 확인하였다.
4-1. INS-1 세포의 확보
INS-1 세포주는 백서의 베타 세포주 (insulinoma cell line: INS-1)로써, 인슐린이 분비되는 세포이다. 이 세포주는 미국 시카고 의과대학교 윤지원 박사님 실험실에서 분양받았다. INS-1 세포주는 NEDH 백서에서 분리한 radiation-induced insulinoma (M. Asfari, et.al., Endocrinology 130 167-178, 1992) 세포주이다. 분양 후 5-10 passage 배양 후 질소 탱크에 저장하였고 필요시마다 꺼내 다시 5-20 passage 내에서 배양한 세포를 사용하였다. 포도당 반응 인슐린분비 능력이 항상 유지되는지 검토 한 후 사용하였다. INS-1 세포를 배양하기 위한 배지로 RPMI 1640 (Cellgro Cat. No. 50-020-PB, mediatech, VA, USA)에 10% Fetal bovine serum (Cellgro Cat. No. 35-010-CV, mediatech, VA, USA), 100 ㎍/ml streptomycin (Cas. NO. 3810-74-0, Duchefa biochemie, Haarlem, Netherland)로 첨가하여 사용하였다. INS-1 세포주는 5% CO2와 37℃의 온도를 유지하면서 배양하였다.
4.2 9Z-Hexadecenoic acid 실험군 및 대조군
본 발명에 따른 베타세포 사멸억제 물질인 9Z-Hexadecenoic acid은 DMSO에 녹여서 주사기 여과기 (0.2 uM)를 이용하여 멸균상태를 유지하여 사용하였다. 또한 9Z-Hexadecenoic acid의 세포사멸억제 활성 측정 테스트를 위한 양성 대조군 시료로는 PPAR-α를 자극하는 물질인 0.5 mM bezafibrate, 음성 대조군 시료로는 BSA와 PBS를 3:1로 혼합하여 실험군과 동량 세포에 첨가하였다.
4.3 INS-1 베타세포에서 9Z-Hexadecenoic acid의 효능 확인
본 발명에 따른 추출물인 9Z-Hexadecenoic acid가 Palmitate에 의한 베타세포사멸에 효능이 있는지 MTT assay를 통해서 세포의 생존력 및 사멸을 확인하였다.
본 발명의 추출물인 9Z-Hexadecenoic acid를 INS-1 세포에 5 μg/ml, 2.5 μg/ml, 1.25 μg/ml의 농도로 전 처리하고, 30분 후 25 mM 포도당과 400 μM palmitate을 처리하고 24시간 37℃, CO2 배양기에서 배양한다. 광학 현미경과 MTT 분석을 통해 세포의 생존력을 측정하였다. 도 5는 INS-1 베타세포에서 9Z-Hexadecenoic acid의 세포사멸억제 실험을 한 결과 그래프이다.
즉, INS-1 세포를 5X104의 농도로 96 well에 분주하고 배양기에서 24시간 배양한다. 본 발명의 추출물은 RPMI 1640 배지에 최종농도가 5 μg/ml, 2.5 μg/ml, 1.25 μg/ml 준비하였고, 음성 대조군은 RPMI1640 배지에 9Z-Hexadecenoic acid과 동량의 DMSO를 첨가하여 준비하였고, 양성대조군은 0.5 mM bezafibrate를 배지에 첨가하여 준비하였다. 충분히 자란 96 well의 INS-1 세포에서 배지를 제거한 후 준 비된 시료를 첨가하고 30분 후 palmitate와 glucose를 각각 400 μM, 25 mM이 되도록 첨가하여 24시간 동안 CO2 배양기에서 배양한다. 24시간 후 광학현미경으로 세포의 모양을 관찰하고 사진을 찍은 결과를 도 5에 나타내었다. 또한 세포의 생존력 실험은 다음과 같은 과정으로 진행되었다. 96 well plate에서 배양이 끝난 INS-1 세포의 배지를 제거하고 0.5 mg/ml MTT를 100 ㎕씩 첨가하여 2-3 시간 CO2 배양기에서 배양한다. 상등액을 제거한 후 acidic isopropanol (0.04 N HCl)을 첨가하여 RT에서 30분 동안 배양한 후 microplate reader (BIO-RAD, Hercules, CA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존력을 정량하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
결과를 정리하면, 도 5에 도시한 바와 같다. 각 실험은 3회 반복한 것으로 평균값으로 나타냈고 평균값 ± SD로 표시하였다. *는 통계 처리에 의한 유의성이 있음을 의미한다. 음성 대조군은 모두 베타세포사멸을 억제하지 못하였으며 양성 대조군인 bezafibrate는 약 80% 세포사멸억제 효과를 보였다. 이는 문헌에서 제공되는 정보와 일치하는 것으로 양성 대조군의 실험이 정확하게 되었음을 의미한다. 실험군인 9Z-Hexadecenoic acid 군은 상기에서 같이 음성대조군에 비교하여 통계적으로 의미있는 베타세포 사멸억제 효과를 보였다.
도 1과 2는 9Z-Hexadecenoic acid를 생산하는 Halomonas CCRB608를 확인한 결과이다. 1의 a와 b는 CCRB608을 생산하는 해양미생물의 생리학적 검사 (Easy24plusE kit)를,
도 2는 CCRB608을 생산하는 해양미생물의 균주 동정을 위한 16s rDNA sequencing 분석을 나타낸다.
도 3은 Halomonas CCRB608로부터 9Z-Hexadecenoic acid를 생산하는 방법을 나타냈다.
도 4는 Halomonas CCRB608로부터 생산된것이 9Z-Hexadecenoic acid임을 확인한 결과로 a)는 160H-5(6)-8 분획을 GC-MS로 분석한 결과이고, b,c,d)는 160H-5(6)-8의 구조를 1H NMR, gHSQC, gHMBC NMR 스펙트럼을 분석한 결과이며 e)는 NMR 스펙트럼 분석 결과를 화학식으로 표현한 것이다
도 5는 Halomonas CCRB608로부터 생산된 9Z-Hexadecenoic acid의 효능을 베타세포에서 확인한 결과이다. 9Z-Hexadecenoic acid의 지방독성에 의한 베타세포 사멸억제 효과 (MTT 분석을 통한 생존력 실험 결과)를 나타낸 것으로서, 그림은 INS-1 베타세포 사멸억제 효과 (생존력)를 나타낸다.

Claims (6)

  1. a) Halomonas CCRB608(KCTC 11313BP) 균주를 배양하는 단계; 및
    b) 상기 배양된 균주의 대사체를 용매를 이용하여 추출하고 농축하는 단계를 포함하는 9Z-헥사데센노이드산(Hexadecenoic acid)을 생산하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 생산방법은 b)단계 후에
    c) 상기 농축된 대사체를 크로마토그래피를 수행하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 9Z-헥사데센노이드산(Hexadecenoic acid)을 생산하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 용매는 알코올, 헥산, 및 염화메틸렌으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 9Z-헥사데센노이드산(Hexadecenoic acid)을 생산하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 알코올은 메탄올인 것을 특징으로 하는 9Z-헥사데센노이드산(Hexadecenoic acid)을 생산하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 미생물의 배양은 호기 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 9Z-헥사데센노이드산(Hexadecenoic acid)을 생산하는 방법.
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WO2009041531A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 好塩菌によるポリヒドロキシアルカノエート（PHAs）産生方法及び好塩菌

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4474882A (en) 1980-10-09 1984-10-02 Daicel Chemical Industries, Ltd. Microbiological process for the preparation of unsaturated dicarboxylic acids
KR100720658B1 (ko) 2006-01-04 2007-05-21 경북대학교 산학협력단 슈도모나스 에어루지노사에 의한 팔미토레산으로부터하이드록시 지방산의 제조방법
WO2009041531A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 好塩菌によるポリヒドロキシアルカノエート（PHAs）産生方法及び好塩菌
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