CN102676626B - 一种微生物转化法制备胆固醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物转化法制备胆固醇的方法，该方法完全通过微生物转化，以羊毛脂为原料生产胆固醇，步骤包括1）将原料粉碎，加入碳源和氮源，制备种子培养基和发酵培养基；2）筛选菌种；3）接入菌种，搅拌发酵；4）分离提纯结晶；上述方法制备胆固醇，具有条件温和、反应专一、污染小等特点。通过该方法制得的胆固醇的纯度较高，且收率大，符合环保理念。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物转化法制备胆固醇的方法，属于生物化学领域。
背景技术
羊毛脂是由羊皮脂腺分泌且粘附于羊毛毛被中的酯类物质的多组份混合物，主要是由脂肪酸与大致等量的脂肪醇、固醇、三甲基甾醇等所形成的酯。羊毛脂中约含有10％左右的胆固醇，胆固醇可作为一种具有生物活性的多功能化妆品助剂，美国CTFA(化妆品香料香精协会)化妆品原料手册已经将胆固醇列为可加入化妆品的天然活性物质，胆固醇也是合成维生素D3的主要原材料。我国有大量的羊毛脂资源，研究从中提取胆固醇的技术很有意义。
目前从羊毛脂中提取胆固醇的方法大致分为五类：色谱法、溴化法、分子蒸馏法、超临界萃取法、溶剂选择结晶法和配合法。这些方法均为化学法，用到了多种有机溶剂，且反应过程中易产生多种副产物，容易造成环境污染，若处理，则需消耗大量的人力物力，不符合生态环保的科学理念且增加了企业的生产成本。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种微生物转化法制备胆固醇的方法，以生物方法制备有机物，纯度较高，且科学环保。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种微生物转化法制备胆固醇的方法，其特征是：该方法完全通过微生物转化，以羊毛脂为原料生产胆固醇，步骤如下：
1）将原料粉碎，加入碳源和氮源，制备种子培养基和发酵培养基；
2）筛选菌种；
3）接入菌种，搅拌发酵；
4）分离提纯结晶；
进一步，所制备的种子培养基为：马铃薯汁1000ml，糖类20g，琼脂 20g，羊毛脂30g；
进一步，所制备的发酵培养基为：马铃薯汁1000ml～2000 ml，糖类90g～200 g，琼脂 60g～150g，羊毛脂80g～150g；
优选的，所制备的发酵培养基为：马铃薯汁1000ml，麦芽糖 90g，琼脂 60g，羊毛脂80g；
进一步，所述的菌种筛选方法为：
1）在洗羊毛废弃物倾倒处和胆固醇生产工厂分别采集土壤样品；
2）取上述采集的土壤样品1.0g，置消毒试管中，加入无菌水10ml后以涡旋振荡器振荡摇匀，静置后取上层清液，滴于种子培养基上，以玻璃棒涂匀，置于27℃恒温培养箱中培养2-5d，待平板上长出菌落后，挑出单菌落于种子培养基上，根据形态特征判断纯的菌株，编号保存；
3）将分离得到的几十个菌株分别接种在种子培养基中，待长出单菌落后，取菌落下面的培养基1.0g放置于试管中，加三氯甲烷10ml并震荡，使培养基中可能存在的胆固醇充分溶解，再加入硫酸10ml；观察，若三氯甲烷层显血红色，则此菌株具备转化能力；若不显血红色，则不具备转化能力；
4）将筛选获得的菌株在种子培养基上培养，菌落质地致密、表面呈较紧密的绒状或坚实、干燥、多皱，可初步猜测菌株为放线菌。
接着挑取细菌制作玻片，在显微镜下，细菌呈分枝丝状，进一步确定菌株为放线菌。
进一步，将筛选获得的放线菌置于发酵培养基中，进行发酵培养，取菌落下的培养基于具塞试管中，加入50%～100%的乙醇，充分震荡，然后加入乙醚，摇动，再加入石油醚，充分震荡后静置使液层分离，取上层有机相用氮气吹干，并以50%～100%乙醇溶解反复结晶；
进一步，发酵过程条件为：PH为6.0-8.5，温度20-50℃，发酵时间70—160h；
优选的，发酵过程条件为：PH为7.6，温度30℃，发酵时间110h；
本发明的有益效果是：微生物转化法是利用微生物的酶系进行催化的化学反应，具有条件温和、反应专一、污染小等特点。更重要的是适当的微生物和合理的工艺开发研究，可以使原料直接发酵，得到较高收率的目标产物的同时起到了环保的作用。通过该方法制得的胆固醇的纯度较高，且收率大，符合环保理念。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明：
实施例1
一种微生物转化法制备胆固醇的方法，该方法完全通过微生物转化，以羊毛脂为原料生产胆固醇，步骤如下：
土壤采集：在洗毛废弃物倾倒处和胆固醇生产工厂分别采集土壤样品。
种子培养基：马铃薯汁1000ml，糖类20g，琼脂 20g，羊毛脂30g。
发酵培养基：马铃薯汁1000ml，麦芽糖 90g，琼脂 60g，羊毛脂80g；
筛选菌种
取上述采集的土壤样品1.0 g，置消毒过的试管中，加人无菌水10ml后以涡旋振荡器振荡摇匀，静置后取上层清液，滴于平板培养基上，以玻璃棒涂匀，置于27℃恒温培养箱中培养2一5d，待平板上长出菌落后，挑出单菌落于分离培养基上，根据形态特征判断纯的菌株，编号保存。
将分离得到的几十个菌株分别接种在培养基中，待长出单菌落后，取菌落下面的培养基1.0g放置于试管中，加三氯甲烷10ml并震荡，使培养基中可能存在的胆固醇充分溶解，再加入硫酸10ml。观察，若三氯甲烷层显血红色，则推测此菌株具备转化能力;若不显血红色，则不具备转化能力。
将筛选获得的菌株在种子培养基上培养，菌落质地致密、表面呈较紧密的绒状或坚实、干燥、多皱，初步猜测菌株为放线菌。
接着挑取细菌制作玻片，在显微镜下，细菌呈分枝丝状，可进一步确定菌株为放线菌。
接入菌种，发酵培养
将筛选获得的放线菌置于发酵培养基中，进行半固体培养基发酵培养，发酵过程条件为：PH为7.6，温度30℃，发酵时间110h；
分离提纯结晶
然后取菌落下的培养基于具塞试管中，加入95%的乙醇，充分震荡，然后加入乙醚，摇动，再加入石油醚，充分震荡后静置使液层分离，取上层有机相用氮气吹干，并以95%乙醇溶解反复结晶；
实施例2
一种微生物转化法制备胆固醇的方法，该方法完全通过微生物转化，以羊毛脂为原料生产胆固醇，步骤如下：
土壤采集：在洗毛废弃物倾倒处和胆固醇生产工厂分别采集土壤样品。
种子培养基：马铃薯汁1000ml，糖类20g，琼脂 20g，羊毛脂30g。
发酵培养基：马铃薯汁1000ml，葡萄糖 90g，琼脂 60g，羊毛脂80g；
筛选菌种
取上述采集的土壤样品1.0 g，置消毒过的试管中，加人无菌水10ml后以涡旋振荡器振荡摇匀，静置后取上层清液，滴于平板培养基上，以玻璃棒涂匀，置于27℃恒温培养箱中培养2-5d，待平板上长出菌落后，挑出单菌落于种子培养基上，根据形态特征判断纯的菌株，编号保存。
将分离得到的几十个菌株分别接种在种子培养基中，待长出单菌落后，取菌落下面的培养基1.0g放置于试管中，加三氯甲烷10ml并震荡，使培养基中可能存在的胆固醇充分溶解，再加入硫酸10ml。观察，若三氯甲烷层显血红色，则推测此菌株具备转化能力;若不显血红色，则不具备转化能力。
将筛选获得的菌株在种子培养基上培养，菌落质地致密、表面呈较紧密的绒状或坚实、干燥、多皱，初步猜测菌株为放线菌。
接着挑取细菌制作玻片，在显微镜下，细菌呈分枝丝状，可进一步确定菌株为放线菌。
接入菌种，发酵培养
将筛选获得的放线菌置于发酵培养基中，进行发酵培养，发酵过程条件为：PH为6.0，温度20℃，发酵时间70h；
分离提纯结晶
然后取菌落下的培养基于具塞试管中，加入50%的乙醇，充分震荡，然后加入乙醚，摇动，再加入石油醚，充分震荡后静置使液层分离，取上层有机相用氮气吹干，并以50%乙醇溶解反复结晶；
实施例3
一种微生物转化法制备胆固醇的方法，该方法完全通过微生物转化，以羊毛脂为原料生产胆固醇，步骤如下：
土壤采集：在洗毛废弃物倾倒处和胆固醇生产工厂分别采集土壤样品。
种子培养基：马铃薯汁1000ml，糖类20g，琼脂 20g，羊毛脂30g。
发酵培养基：马铃薯汁1000ml，蔗糖 90g，琼脂 60g，羊毛脂80g；
筛选菌种
取上述采集的土壤样品1.0 g，置消毒过的试管中，加人无菌水10ml后以涡旋振荡器振荡摇匀，静置后取上层清液，滴于平板培养基上，以玻璃棒涂匀，置于27℃恒温培养箱中培养2-5d，待平板上长出菌落后，挑出单菌落于分离培养基上，根据形态特征判断纯的菌株，编号保存。
将分离得到的几十个菌株分别接种在种子培养基中，待长出单菌落后，取菌落下面的培养基1.0g放置于试管中，加三氯甲烷10ml并震荡，使培养基中可能存在的胆固醇充分溶解，再加入硫酸10ml。观察，若三氯甲烷层显血红色，则推测此菌株具备转化能力;若不显血红色，则不具备转化能力。
将筛选获得的菌株在种子培养基上培养，菌落质地致密、表面呈较紧密的绒状或坚实、干燥、多皱，初步猜测菌株为放线菌。
接着挑取细菌制作玻片，在显微镜下，细菌呈分枝丝状，可进一步确定菌株为放线菌。
接入菌种，发酵培养
将筛选获得的放线菌置于发酵培养基中，进行发酵培养，发酵过程条件为：PH为8.5，温度50℃，发酵时间160h；
分离提纯结晶
然后取菌落下的培养基于具塞试管中，加入95%的乙醇，充分震荡，然后加入乙醚，摇动，再加入石油醚，充分震荡后静置使液层分离，取上层有机相用氮气吹干，并以95%乙醇溶解反复结晶；
实施例4
一种微生物转化法制备胆固醇的方法，该方法完全通过微生物转化，以羊毛脂为原料生产胆固醇，步骤如下：
土壤采集：在洗毛废弃物倾倒处和胆固醇生产工厂分别采集土壤样品。
种子培养基：马铃薯汁1000ml，糖类20g，琼脂 20g，羊毛脂30g。
发酵培养基：马铃薯汁1000ml，麦芽糖 90g，琼脂 60g，羊毛脂80g；
筛选菌种
取上述采集的土壤样品1.0 g，置消毒过的试管中，加人无菌水10ml后以涡旋振荡器振荡摇匀，静置后取上层清液，滴于平板培养基上，以玻璃棒涂匀，置于27℃恒温培养箱中培养2-5d，待平板上长出菌落后，挑出单菌落于种子培养基上，根据形态特征判断纯的菌株，编号保存。
将分离得到的几十个菌株分别接种在种子培养基中，待长出单菌落后，取菌落下面的培养基1.0g放置于试管中，加三氯甲烷10ml并震荡，使培养基中可能存在的胆固醇充分溶解，再加入硫酸10ml。观察，若三氯甲烷层显血红色，则推测此菌株具备转化能力；若不显血红色，则不具备转化能力。
将筛选获得的菌株在种子培养基上培养，菌落质地致密、表面呈较紧密的绒状或坚实、干燥、多皱，初步猜测菌株为放线菌。
接着挑取细菌制作玻片，在显微镜下，细菌呈分枝丝状，可进一步确定菌株为放线菌。
接入菌种，发酵培养
将筛选获得的放线菌置于发酵培养基中，进行发酵培养，发酵过程条件为：PH为7.0，温度35℃，发酵时间120h；
分离提纯结晶
然后取菌落下的培养基于具塞试管中，加入75%的乙醇，充分震荡，然后加入乙醚，摇动，再加入石油醚，充分震荡后静置使液层分离，取上层有机相用氮气吹干，并以75%乙醇溶解反复结晶；
凡在不脱离本发明核心的情况下做出的简单的变形或修改均落入本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种微生物转化法制备胆固醇的方法，其特征是：该方法完全通过微生物转化，以羊毛脂为原料生产胆固醇，步骤如下：
1）将原料粉碎，加入碳源和氮源，制备种子培养基和发酵培养基；
2）筛选菌种；
3）接入菌种，搅拌发酵；
4）分离提纯结晶；
所述步骤2中的菌种筛选方法为：
a、在洗羊毛废弃物倾倒处和胆固醇生产工厂分别采集土壤样品；
b、取上述采集的土壤样品1.0g，置消毒试管中，加入无菌水10ml后以涡旋振荡器振荡摇匀，静置后取上层清液，滴于种子培养基上，以玻璃棒涂匀，置于27℃恒温培养箱中培养2-5d，待平板上长出菌落后，挑出单菌落于新的种子培养基上，根据形态特征判断纯的菌株，编号保存；
c、将分离得到的几十个菌株分别接种在种子培养基中，待长出单菌落后，取菌落下面的培养基1.0g放置于试管中，加三氯甲烷10ml并震荡，使培养基中可能存在的胆固醇充分溶解，再加入硫酸10ml；观察，若三氯甲烷层显血红色，则此菌株具备转化能力；若不显血红色，则不具备转化能力；
d、将筛选获得的菌株在种子培养基上培养，菌落质地致密、表面呈较紧密的绒状或坚实、干燥、多皱，可初步猜测菌株为放线菌；
e、进一步挑取细菌制作玻片，在显微镜下观察，细菌呈分枝丝状，可进一步确定菌株为放线菌。
2.根据权利要求1所述的微生物转化法制备胆固醇的方法，其特征是：所制备的种子培养基为：马铃薯汁1000ml，糖类20g，琼脂 20g，羊毛脂 30g。
3.根据权利要求1所述的微生物转化法制备胆固醇的方法，其特征是：所制备的发酵培养基为：马铃薯汁1000ml～2000 ml，糖类90g～200 g，琼脂 60g～150g，羊毛脂80g～150g。
4.根据权利要求1或3所述的微生物转化法制备胆固醇的方法，其特征是：所制备的发酵培养基为：马铃薯汁1000ml，麦芽糖 90g，琼脂 60g，羊毛脂80g。
5.根据权利要求1所述的微生物转化法制备胆固醇的方法，其特征是：将筛选获得的放线菌置于发酵培养基中，进行发酵培养，取菌落下的培养基于具塞试管中，加入50%～100%的乙醇，充分震荡，然后加入乙醚，摇动，再加入石油醚，充分震荡后静置使液层分离，取上层有机相用氮气吹干，并以50%～100%乙醇溶解反复结晶。
6.根据权利要求1或5所述的微生物转化法制备胆固醇的方法，其特征是：发酵过程条件为：pH为6.0-8.5，温度20-50℃，发酵时间70—160h。
7.根据权利要求1或5或6所述的微生物转化法制备胆固醇的方法，其特征是：发酵过程条件为：pH为7.6，温度30℃，发酵时间110h。
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