CN100999750B - 一种微生物细胞生物转化对羟基苯甲醇合成天麻素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物细胞生物转化对羟基苯甲醇合成天麻素的方法，以灭菌过的马铃薯葡萄糖液体为培养液，加入黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞和0.22μm微孔膜过滤除菌的对羟基苯甲醇溶液，在20～25℃、摇床转速50～200r/min转化反应1～3天，每100ml培养液中黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞用量为1-10g，每升转化反应体系中对羟基苯甲醇用量为0.1～3.1mmol，所述的马铃薯葡萄糖液体含质量百分比浓度2％的马铃薯和0.5％的葡萄糖。本发明的生物合成方法与报道的植物细胞转化合成天麻素方法相比，其主要优点是微生物细胞培养时间短、操作简便、易于控制，整个生物转化周期较短。
Description
技术领域
本发明涉及利用生物工程技术高密度培养高原珍稀食用真菌，并利用该培养细胞以对羟基苯甲醇为作用底物生物合成天麻素，是属于生物工程和微生物发酵领域。
背景技术：
天麻素即4-羟基甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷或对羟基甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷为兰科(Orchidaceae)植物天麻(Gastrodia elata Blume)的主要活性成分，有镇静、抗惊厥、抗炎及增强机体免疫功能等作用。临床上广泛用于眩晕(美尼尔氏病、病毒性眩晕、前庭神经元炎、枕大神经痛等)、头痛(神经衰弱及神经衰弱综合症、血管性头痛、紧张性头痛、脑外伤综合症、偏头痛等)及癫痫的辅助治疗。
生物转化是利用植物离体细胞或器官、动物细胞、微生物及其细胞器，以及游离酶对外源性化合物进行结构修饰的生化反应。一方面天然产物一直是人类寻找有效活性成分的源泉；另一方面在开发新药过程中，具有以天然产物为先导化合物，通过化学或生物的手段，对其结构进行修饰，得到更多结构新颖的化合物，进而发现毒性更低、疗效更好的药物。微生物作为一个完整个体，其体积虽小，但也具有一套自身特异性的酶体系。同时由于微生物资源丰富，种类繁多，对于特异的底物，可供筛选的菌株很多。以多种不同催化功能的酶系对天然活性成分进行生物转化，可产生新的组合性的天然化合物库，再通过活性筛选，可寻找新的高效低毒的天然活性先导化合物，或通过对活性组分中不同成分结构变化与活性强度消长关系的分析发现关键活性成分。而利用微生物转化可以发现新一代的先导化合物，已取得了巨大的社会效益和经济效益。生物转化规律还可以指导新药的结构修饰，获得高效长效的新一代药物，足以说明生物转化对新药开发的重要性。
微生物转化是通过微生物整体细胞或酶将复杂的底物进行结构修饰，也就是利用生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物进行的催化反应。微生物转化具有许多优点，譬如，微生物倍增时间短，生物量积累快，从而产生的酶量就相应的多，转化时间短；微生物的基因工程研究工作成熟，转化酶的高效表达成为可能；微生物发酵工艺成熟，便于工业化生产。随着现代提取、分离、鉴定手段的进步，使微生物技术的应用不再局限于酿传统造及小分子化合物的转化，正广泛地应用于药物前体化合物的转化、生物催化的不对称合成、光学活性化合物的拆分、新药开发、药物代谢体外模型预测等领域，已成为生物转化技术中发展最为迅速的分支之一。微生物作为一个完整的生命体，其体积虽小，但也具有一套自身特异性的酶体系。在它的生长过程中有许多酶的参与，如合成酶、水解酶、异构酶、氧化酶、还原酶等都可能对加入其中的底物发生作用，使其结构发生变化。同时由于微生物资源丰富、种类繁多，对于特异的底物可供筛选的菌株很多。利用微生物还可以模仿生源合成途径，合成贵重药品或者其半化学合成前体，提高原料利用率，有效延缓资源消耗。如美国施贵宝公司利用微生物转化进行紫杉醇的半合成，他们分别从Nocardioides albusSC 13911，Nocardioides luteus SC 13912，Morexellasp三种微生物的发酵液中分离出C-13 taxolase，C-7 xylosidase，C-10 deacetylase，分别将红豆杉中的几种紫杉烷的7、10、13位进行水解，得到较多而单一的10-去乙酰-Baccatin II，该产物为紫杉醇合成的重要前体化合物，再利用化学反应，连接上13位的侧链，即可得到紫杉醇。
黄绿蜜环菌属于担子菌亚门伞菌目的一种著名的食药用真菌，是天麻生长过程中必不可少的共生菌。国内外研究主要从密环菌中分离得到蜜环菌多糖、倍半萜类化合物和嚓吟类化合物等多种活性成分。其理化特性和生物活性研究表明，蜜环菌菌丝体和发酵液都具有与天麻相似的药理作用和临床疗效，但还没有与天麻主要药理活性成分一天麻素类似物质合成的报道，目前天麻素的来源主要依靠天麻药材提取或化学合成获得。而利用微生物细胞进行高效生物合成天麻素未见报道，更未见相关发明专利。
天麻素在实际生产中来源主要有两类：一类是天然天麻中提取的；另一类是化学合成的。天麻素的主要来源是从天麻中萃取。天麻素是天麻中的主要活性物质，在天麻中含量约为0.1％。针对目前已工业化的天麻制剂的生产存在对原药材的浪费；耗费时间、能量和提取剂、提取效率不高以及目前大部分制剂中有效成分—天麻素的含量较低这一现状，天麻的产品开发应该由简单的直接粗加工向提取、精制、深加工转化，扩大其药用价值，提高药品的质量和药效。但天麻中含量毕竟有限，而且天麻的生产依赖原始木材资源，以及天麻生产中真假天麻的出现，无形中给环境的保护和天麻药材资源的保护带来困难。化学合成虽然能实现产品的大量生产，但是化学合成的天麻素因其安全性和对环境污染等潜在风险，受到研究者和消费者极大关注，因此探讨细胞转化法合成天麻素是必然的选择和具有竞争优势的一种方法。
有关天麻素的生物法合成目前仅仅有蔡洁等进行了利用人参毛状根细胞生物合成天麻素转化体系将外源对羟基苯甲醇转化为天麻素的研究。以对羟基苯甲醇转化率和天麻素含量为指标，探索适宜于人参毛状根生物合成天麻素的培养条件如底物浓度、转化时间和培养阶段。结果表明，利用B5液体培养基培养22天的人参毛状根，在含有1.0mmol/L对羟基苯甲醇的生物合成培养基中转化24h，合成的天麻素含量占干重的6.65％，对羟基苯甲醇转化率达到84.8％。因此，以人参毛状根为反应器可以合成人参所不具有的天麻素。但是植物细胞转化合成天麻素也存在极大的缺陷，不仅细胞培养要求条件高、周期长，所需的转化时间长、产量低，同时人参等中药材细胞比较难以培养，导致天麻素的生物合成并不能取得实质性进展。微生物细胞因其复杂的酶系和培养快速、操作简单等特点，往往在生物转化合成新型药物中扮演重要作用，因此探讨微生物细胞转化法生产天麻素具有重要的理论价值和实际开发意义。
发明内容：
本发明提供一种微生物细胞生物转化对羟基苯甲醇合成天麻素的方法。
本发明所使用的微生物是黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens Sacc.)ZJUQH CGMCC No 1884，该菌株在本申请人的前一个发明专利申请中(申请号：2006l0155189.7)，详细描述了其获取、培养方法和形态，并发现其能在特定培养基与培养条件下分泌多糖。该菌株已经保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2006年12月08日，保藏号：CGMCC No 1884。
该黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens Sacc.)ZJUQH经过鉴定属于担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycentes)、伞菌目(Agaricales)、白蘑科(Tricholomataceae)、蜜环菌属(Armillaria)一种著名食用菌。该蜜环菌菌株ZJUQH为蜜环菌属，在察氏或马铃薯(PDA)培养基上，菌株生长较满，形成圆形菌落，具有辐射状沟纹；黄绿蜜环菌菌盖扁平，盖缘始终内卷，新鲜时呈柠檬黄色至硫磺色，在阳光下闪闪发光，干后近白色，不粘，菌盖表皮开裂形成近环状排列的纤毛状厚鳞片，在干燥环境中鳞片明显。子实体中等大，盖宽5～12cm；菌肉厚，肉质，白色至浅黄色，伤后不变色，味道鲜美柔和至甘甜，有特殊茴香气味。菌褶近直生，弯生至短延生，不等长，密，宽，黄色至菌盖色；菌柄圆柱形，长2～8cm，直径2～2.5cm，白色至黄色，菌环以下有黄色鳞片，肉质至纤维质，中突，老后内部松软至中空，菌柄茎部膨大，内菌幕幼时明显，棉絮状至近膜质，黄白色到浅黄色，后形成菌环至消失。菌环中位，单层，菌环以上为白色，菌环以下为黄色。在显微镜下观察，担孢子椭圆形，无色至微黄色，淀粉质，担子棒状，无色，具4个孢子。菌丝具明显锁状联合。在PDA固体培养基上形成淡绿色或绿色孢子。
一种微生物细胞生物转化对羟基苯甲醇合成天麻素的方法，以灭菌过的马铃薯葡萄糖液体为培养液，加入黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞和过滤除菌的对羟基苯甲醇溶液，在20～25℃、摇床转速50～200r/min转化反应1～3天，每100ml培养液中黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞用量为1-10g，每升转化反应体系中对羟基苯甲醇用量为0.1～3.1mmol，所述的马铃薯葡萄糖液体含质量百分比浓度2％的马铃薯和0.5％的葡萄糖。
所述的方法，优选条件为：以灭菌过的马铃薯葡萄糖液体为培养液，加入黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞和过滤除菌的对羟基苯甲醇溶液，在23℃、摇床转速150r/min转化反应2天，每100ml培养液中黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞用量为10g，每升转化反应体系中对羟基苯甲醇用量为1.0mmol，所述的马铃薯葡萄糖液体含质量百分比浓度2％的马铃薯和0.5％的葡萄糖。所述的黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞由黄绿蜜环菌ZJUQH种子经过预培养1～6天后通过冷冻离心或无菌过滤方法发酵液制得。优选预培养3天。
所述的过滤除菌的对羟基苯甲醇溶液为10mmol/L的对羟基苯甲醇水溶液，用0.22μm微孔膜过滤除菌。
所述的预培养的条件为：
发酵培养基：葡萄糖34.3g/L，酵母膏1.91g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.45g/L；
发酵培养方法：发酵培养基100ml盛于500ml三角瓶中，接1×106-1×108的孢子1-5ml，20℃-23℃，转速为120r/min。
本发明采用上述黄绿蜜环菌细胞作为生物催化的细胞载体，以培养和获得该细胞为起点，获得该细胞载体转化对羟基苯甲醇的转化体系、转化条件，从而获得适合工业化生产的最佳培养条件和技术参数，解决天麻素不能依靠微生物细胞生物合成的技术问题等，并为开发利用新型食药用真菌细胞反应器进行活性化合物的生物合成提供新思路和依据。
本发明的生物合成方法与报道的植物细胞转化合成天麻素方法相比，其主要优点是微生物细胞培养时间短、操作简便、易于控制，整个生物转化周期较短。
本发明的天麻素合成体系和合成条件易于控制，底物转化效率高，天麻素含量高。
本发明所采用的微生物细胞培养方法优，能最大程度获得转化所需要的细胞，与传统的植物细胞相比，其细胞培养简单、细胞生长速度快。本发明首次开展天麻的共生菌-黄绿密环菌细胞生物转化合成天麻素的基础研究，培育出能高效转化天麻素前体-对羟基苯甲醇合成天麻素的密环菌细胞。本发明为天麻素的生物法生产和应用提供理论依据和技术前提，同时能有效解决天麻素生产对资源的消耗和环境破坏问题，研究成果具有重要的理论价值和实际应用意义。
具体实施方式
实施例1 黄绿蜜环菌ZJUQH菌丝体的培养
首先通过种子培养和发酵培养基的培养获得生物转化的细胞，其关键步骤是获得真菌菌丝体的大量繁殖。其具体培养方法见下：
斜面种子培养基：采用葡萄糖酵母膏固体培养基(葡萄糖15g/L，酵母膏2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.3g/L，2％琼脂，pH自然)，于18-20℃下培养3-5天待用。
液体种子培养基：采用葡萄糖酵母膏基础液体培养基(葡萄糖15g/L，酵母膏2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.3g/L，pH自然)。
种子摇瓶发酵培养方法：发酵温度为23℃，转速为120r/min，培养3天后停止发酵，该培养细胞作为。
将一级种子经过预培养后，通过冷冻离心或无菌过滤方法除去发酵液，得到黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞。采用上述培养方法能实现黄绿蜜环菌细胞的快速繁殖和大量积累，同时可以降低杂菌污染。
一级种子经过预培养的条件为：
发酵培养基：葡萄糖34.3g/L，酵母膏1.91g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.45g/L。
发酵培养方法：发酵培养基100ml盛于500ml三角瓶中，接1×106-1×108的孢子1-5ml，20℃-23℃，转速为120r/min。
实施例2 不同培养时间的黄绿蜜环菌ZJUQH菌丝体细胞生物合成天麻素的实验
按照实施例1中的方法，分别得到经过预培养1～6天的黄绿蜜环菌ZJUQH细胞，并用于对羟基苯甲醇转化合成天麻素。
以灭菌过的马铃薯葡萄糖液体(马铃薯葡萄糖液体含质量百分比浓度2％的马铃薯和0.5％的葡萄糖)为基础培养基，每100ml基础培养基中黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞加量10g，对羟基苯甲醇先配制成10mmol/L的水溶液并用0.22μm微孔膜过滤除菌，以整个转化反应体系的体积为基准，每升转化反应体系中加入1.5mmol的对羟基苯甲醇，转化时间2天，生物转化温度23℃，摇床转速120r/min，具体实验结果见下表1：
表1 不同培养时间的黄绿蜜环菌ZJUQH菌丝体细胞合成天麻素的实验
| 培养时间(天) | 天麻素含量(％) | 底物转化率(％) |
| 1 | 2.68 | 25 |
| 2 | 4.12 | 68 |
| 3 | 6.64 | 84 |
| 4 | 5.15 | 67 |
| 5 | 4.85 | 58 |
| 6 | 3.02 | 60 |
实施例3 不同浓度底物(对羟基苯甲醇)合成天麻素实验
按照实施例1中的方法，得到经过预培养3天的黄绿蜜环菌ZJUQH细胞，并用于对羟基苯甲醇转化合成天麻素。
以灭菌过的马铃薯葡萄糖液体为基础培养基，对羟基苯甲醇先配制成10mmol/L的水溶液并用0.22μm微孔膜过滤除菌，在转化反应中加入不同用量对羟基苯甲醇，绿蜜环菌ZJUQH湿细胞加入量为1-10g/100ml基础培养基，转化时间2天，生物转化温度23℃，摇床转速120r/min，具体实验结果见下表2：
表2不同浓度底物合成天麻素实验
| 底物浓度(mol/L转化反应体系) | 天麻素含量(％) | 底物转化率(％) |
| 0.1 | 0.72 | 95 |
| 0.5 | 3.23 | 88 |
| 0.8 | 4.1 5 | 89 |
| 1.0 | 6.29 | 83 |
| 1.5 | 5.52 | 65 |
| 2.0 | 3.01 | 57 |
| 2.5 | 2.85 | 32 |
| 2.8 | 2.65 | 1 8 |
| 3.1 | 2.01 | 8 |
实施例4 不同ZJUQH细胞添加比例的合成天麻素的实验
按照实施例1中的方法，得到经过预培养3天的黄绿蜜环菌ZJUQH细胞，并用于对羟基苯甲醇转化合成天麻素。
以灭菌过的马铃薯葡萄糖液体为基础培养基，对羟基苯甲醇先配制成10mmol/L的水溶液并用0.22μm微孔膜过滤除菌，以整个转化反应体系的体积为基准，每升转化反应体系中加入1mmol的对羟基苯甲醇，生物转化温度23℃，摇床转速120r/min，转化时间2天，测定其天麻素含量和底物转化率。具体实验结果见表3：
表3 不同ZJUQH细胞添加比例的合成天麻素的实验
实施例5 不同转化时间合成天麻素实验
按照实施例1中的方法，得到经过预培养3天的黄绿蜜环菌ZJUQH细胞，并用于对羟基苯甲醇转化合成天麻素。
以灭菌过的马铃薯葡萄糖液体为基础培养基，每100ml基础培养基中黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞加量10g，对羟基苯甲醇先配制成10mmol/L的水溶液并用0.22μm微孔膜过滤除菌，以整个转化反应体系的体积为基准，每升转化反应体系中加入1mmol的对羟基苯甲醇，生物转化温度23℃，对羟基苯甲醇浓度为1.0mmol/L，摇床转速120r/min，转化不同时间后，测定其天麻素含量和底物转化率。具体实验结果见表4：
表4不同转化时间合成天麻素实验
| 转化时间(h) | 天麻素含量(％) | 底物转化率(％) |
| 0 | 0 | 0 |
| 24 | 2.46 | 28 |
| 36 | 4.24 | 46 |
| 48 | 6.59 | 65 |
| 60 | 6.85 | 79 |
| 72 | 7.22 | 89 |
从表中实施结果可以看出，天麻素含量与底物转化率是随着转化持续时间延长而增加的，但是因为对羟基苯甲醇是一种易氧化的化合物，过长的转化时间会使对羟基苯甲醇被氧化，因此采用24～72小时作为生物合成的合适时间，48小时尤佳。
实施例6 不同摇床转速合成天麻素实验
按照实施例1中的方法，得到经过预培养3天的黄绿蜜环菌ZJUQH细胞，并用于对羟基苯甲醇转化合成天麻素。
以灭菌过的马铃薯葡萄糖液体为基础培养基，每100ml基础培养基中黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞加量10g，对羟基苯甲醇先配制成10mmol/L的水溶液并用0.22μm微孔膜过滤除菌，以整个转化反应体系的体积为基准，每升转化反应体系中加入1mmol的对羟基苯甲醇，生物转化温度23℃，对羟基苯甲醇浓度为1.0mmol/L，于不同摇床转速下进行转化48小时后测定其天麻素含量和底物转化率。具体实验结果见表5：
表5不同摇床转速合成天麻素实验
实施例7 2升反应器中对羟基苯甲醇的转化合成天麻素
按照实施例1中的方法，得到经过预培养3天的黄绿蜜环菌ZJUQH细胞，并用于对羟基苯甲醇转化合成天麻素。
2升反应器中以灭菌过的马铃薯葡萄糖液体为基础培养基，每100ml基础培养基中黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞加量10g，以整个转化反应体系的体积为基准，每升转化反应体系中加入1mmol的0.22μm微孔膜过滤除菌的对羟基苯甲醇，采用100r/min的搅拌转速和0.3-0.5L/min通气条件，温度23℃转化48小时后测定其天麻素含量和底物转化率。研究实验结果发现，在该反应体系中天麻素含量达到7.32％，底物的转化效率达到91％。
实施例8 天麻素的定性与定量分析
本发明中对天麻素的测定采用了两步法，首先通过薄层层析(TLC)法进行定性，以判别转化溶液中是否有天麻素的生成，最后采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC法)进行天麻素的定量测定。
定性测定：将转化后的发酵液进行冷冻干燥处理，研成粉末，取0.5克加甲醇10毫升用超声波提取30分钟，过滤，作为样品溶液进行薄层层析。其展开剂为：乙酸乙酯∶甲醇∶水＝9∶2∶0.2，显色剂为5％磷钼酸乙醇溶液。以未转化的黄绿蜜环菌ZJUQH菌丝体细胞和天麻素标准品溶液(5毫克标准品/5毫升甲醇)作为对照。天麻素标准品溶液的迁移系数为0.37。
定量测定：色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为0.15％磷酸一乙腈(97∶3)；流速1.0ml/min；检测波长220nm；进样量10μl；柱温25℃。
溶液的制备和测定：精密称取2.5mg天麻素对照品，置25ml容量瓶中，加水溶解，定容，摇匀，即得对照品溶液。精密称取样品内容物0.5g，置索氏提取器中，加乙醚回流至无色，弃去乙醚液，残渣挥干溶剂，置锥形瓶中，加甲醇超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加流动相定容于10ml容量瓶中，作为供试品溶液。
Claims (6)
1.一种微生物细胞生物转化对羟基苯甲醇合成天麻素的方法，其特征在于：以灭菌过的马铃薯葡萄糖液体为培养液，加入黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞和过滤除菌的对羟基苯甲醇溶液，在20～25℃、摇床转速50～200r/min转化反应1～3天，每100ml培养液中黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞用量为1-10g，每升转化反应体系中对羟基苯甲醇用量为0.1～3.1mmol，所述的马铃薯葡萄糖液体含质量百分比浓度2％的马铃薯和0.5％的葡萄糖，所述的黄绿蜜环素ZJUQH的保藏号为CGMCC No 1884。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：以灭菌过的马铃薯葡萄糖液体为培养液，加入黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞和过滤除菌的对羟基苯甲醇溶液，在23℃、摇床转速150r/min转化反应2天，每100ml培养液中黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞用量为10g，每升转化反应体系中对羟基苯甲醇用量为1.0mmol，所述的马铃薯葡萄糖液体含质量百分比浓度2％的马铃薯和0.5％的葡萄糖。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的过滤除菌的对羟基苯甲醇溶液为10mmol/L的对羟基苯甲醇水溶液，用0.22μm微孔膜过滤除菌。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞由黄绿蜜环菌ZJUQH种子经过预培养1～6天后通过冷冻离心或无菌过滤方法除去发酵液制得。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞由黄绿蜜环菌ZJUQH种子经过预培养3天后通过冷冻离心或无菌过滤方法除去发酵液制得。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的预培养的条件为：
发酵培养基：葡萄糖34.3g/L，酵母膏1.91g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.45g/L；
发酵培养方法：发酵培养基100ml盛于500ml三角瓶中，接1×106-1×108的孢子1-5ml，20℃-23℃，转速为120r/min。
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| JP特开2003-48848A 2003.02.21 * |
| 朱宏莉等.微生物转化法合成天麻素.药学学报41 11.2006,41(11),1074-1077. * |
| 蔡洁等.人参毛状根生物合成天麻素转化体系的建立.植物资源与环境学报14 2.2005,14(2),29-31. * |
| 龚加顺等.白花曼陀罗悬浮培养细胞转化对羟基苯甲醛生成天麻素.药学学报41 10.2006,41(10),963-966. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN100999750A (zh) | 2007-07-18 |
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