CN102417884B

CN102417884B - 一株黑曲霉菌株及其在富集提取桑白皮中1-脱氧野尻霉素的应用

Info

Publication number: CN102417884B
Application number: CN 201110168168
Authority: CN
Inventors: 王俊; 吴福安; 谢谢; 方水琴; 张妍; 吕荣宾
Original assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Current assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Priority date: 2011-06-21
Filing date: 2011-06-21
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2031-06-21
Also published as: CN102417884A

Abstract

一株黑曲霉菌株及其在富集提取桑白皮中1-脱氧野尻霉素的应用，黑曲霉菌株(Aspergillus niger)WDNJ1，保藏日期为2010年12月8日，保藏登记号为CGMCCNo.4421。黑曲霉Aspergillus niger WDNJ1用于富集提取桑白皮中的1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)。

Description

一株黑曲霉菌株及其在富集提取桑白皮中1-脱氧野尻霉素的应用

技术领域

本发明属农业微生物技术领域，特别涉及一种高产纤维素酶的黑曲霉菌株及其在富集提取桑白皮中1-脱氧野尻霉素的应用。

背景技术

我国作为桑树发源地，栽培历史悠久，资源丰富，桑园面积约1000万亩。桑枝是桑树组织中仅次于桑叶的生物产量最大的部分。在实际蚕桑生产中，由于需要大量的高质桑叶以满足养蚕农业的现实需求，每年都要定期剪伐枝条，作为垃圾丢弃，造成生物质资源的极大浪费。桑枝经简单剥皮即可获得桑白皮，因此综合考虑桑枝组织的化学组成及现实状况，可以对桑园农业生产过程中的剪伐桑枝资源加以充分利用：桑白皮用于提取降血糖天然产物1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)，剩余的桑枝用于制备高比表面积活性炭(专利CN101643207A已公开桑枝基活性炭的制备方法)。因此，综合利用桑枝资源具有重要的科学意义和极高的实用价值，其产业化带来的经济效益与社会效益均相当可观。

桑白皮是目前发现的1-DNJ含量最高的植物原料。现代药理研究发现，桑树中的1-脱氧野尻霉素不仅能止渴消热、明目长发、益血凉血、补益生津，而且还具有降血糖、抗病毒、抗肿瘤转移的显著疗效，是一种无副作用、纯天然的活性物质。从天然产物中提取1-DNJ的报道较多，如专利CN101654428A公开了从桑叶、桑枝、桑白皮、桑椹、蚕沙等天然产物中采用亲水溶剂提取、酸化、离子交换、溶剂萃取、凝胶层析等步骤制备高纯1-DNJ的方法，授权专利ZL200710067498.3公开了采用提取液酸化后柱层析从桑叶中提取1-DNJ的方法，CN101314586A公开了采用离子交换、重结晶法从桑叶总生物碱中分离1-DNJ单体的方法，CN101671294A公开了采用串联离子交换从桑叶中连续提取分离1-DNJ和桑叶黄酮的方法，CN101336964A公开了采用醇水混合溶液从桑皮中提取生物碱并制备具有降血糖活性的桑皮提取物及其方法。在1-DNJ的这些常规提取过程中，由于细胞壁的作用，1-DNJ不易从植物组织中溶出，降低了其提取的效果。已报道的提取方法均是在后续的提取分离1-DNJ工艺上优化参数，未对提取原料进行有效处理以达到富集提取1-DNJ的目的。由于这些传统提取技术上的限制，使得 1-DNJ的提取效率很低，难以实现大规模的生产，导致现有的部分产品中1-DNJ含量较低，难以发挥其降血糖的生物学功能。

桑白皮细胞壁主要由纤维素、半纤维素和木质素等物质组成，而纤维素酶和木聚糖酶是一类复合酶，能分别专一降解纤维素和木聚糖，破坏植物细胞壁的结构，从而增加细胞内化学物质的溶出。因此，寻找一种通过产纤维素酶微生物或酶促富集桑白皮中1-DNJ的工艺方法就显得十分迫切和必要。

目前，采用产酶微生物或酶法提取天然产物中的化学物质已表现出良好的工艺可行性和实效性，如CN 101353675A公开了利用黑曲霉发酵花生根提取白藜芦醇的方法，CN 101709151A公开了采用酶法提取姜黄色素的方法，CN 101967137A公开了采用酶法提取植物黄酮化合物的方法，CN 101962386A公开了采用生物复合酶法提取青蒿素的方法。然而，对于采用微生物或酶法富集提取桑白皮中1-DNJ的研究未见报道。

虽然现有技术表明微生物能够产生纤维素酶，但产量及转化率报道很不稳定，对从桑白皮中生物富集提取1-DNJ的应用研究缺乏基础数据。若能采用自行设计的快速筛选体系筛选到能高产纤维素酶菌株高效富集桑白皮中的1-DNJ，结合传统提取方法即可应用于工业化生产。因而，筛选高效的微生物菌株并将其用于从桑白皮中富集提取1-DNJ，将大大促进降血糖天然产物1-DNJ及其为基础的新型天然保健品开发，在医药和食品工业中扩大1-DNJ的新用途具有十分重要的意义。

发明内容

技术问题：本发明针对上述技术缺陷，提供一株高产纤维素酶的黑曲霉菌株及其用于从桑白皮中富集提取1-DNJ。

技术方案：一株黑曲霉菌株Aspergillus niger WDNJ1，保藏日期为2010年12月8日，保藏登记号为CGMCC No.4421。

黑曲霉Aspergillus niger WDNJ1在富集提取桑白皮中1-脱氧野尻霉素的应用。

黑曲霉Aspergillus niger WDNJ1在富集提取桑白皮中的1-脱氧野尻霉素的应用步骤为：利用黑曲霉Aspergillus niger WDNJ1进行液体发酵制备种子：在温度25～40℃的培养基中接菌，以转速100～200r/min摇瓶培养1～6d得种子悬液，所述培养基的pH 5.0～8.0，其质量百分比含量为：磷酸氢二钾0.1％～1.5％、磷酸二氢钾0.1％～1.5％、硫酸铵0.1％～1.5％、硝酸钠0.01％～0.5％、硫酸镁0.01％～0.5％、七水合硫酸亚铁0.001％～0.5％、硫酸锌0.001％～0.5％、蔗糖1～5％，其余为水；Aspergillus niger WDNJ1用于富集提取桑白皮中的1-脱氧野尻霉素：种子液的菌数约10⁷cfu/mL，将培养好的种子悬液稀释1～10倍喷洒到桑白皮粉上，在温度为15～55℃、湿度为60～95％条件下，培养1～5d后，即可富集提取得到1-脱氧野尻霉素。

有益效果：本发明的微生物分类命名为黑曲霉Aspergillus niger WDNJ1，菌种保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，，简称CGMCC，保藏单位地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏登记号为CGMCCNo.4421，保藏日期为2010年12月8日。

筛菌过程利用桑白皮粉为唯一碳源建立了新型快速筛选产纤维素酶和富集1-DNJ的菌株培养体系和对目的菌株筛选的快速检验方法，结合初筛、复筛过程成功筛选出黑曲霉Aspergillus niger WDNJ1。所筛选到的黑曲霉Aspergillus niger WDNJ1是一种好气性、易培养、产多种复合酶系的真菌，生长速度快，繁殖力强，产酶效率高，安全高效，产纤维素酶具有生物富集桑白皮中1-DNJ的功能，大大提高了1-DNJ的提取率。

本发明菌株黑曲霉Aspergillus niger WDNJ1系从桑园土壤中分离得到，综合分析了该菌形态特征、菌丝特征、生理特性、代谢特征及分子鉴定，结果表明该菌株具有以下特征：(1)形态学特征：该菌生长迅速，菌落形态呈褐色，正反颜色不同，初生成时为无色透明，有明显的折光性；成熟菌落较大，呈扇状，中心形成同心圆，边缘不圆润齐整，质地疏松，外观干燥，不透明，呈现毡状；(2)菌丝特征：呈透明胶管状，菌丝有分枝，许多分枝的菌丝相互交织形成菌丝体，并可见子实体及孢囊孢子；(3)生理特征：对碳源、氮源及温度有广泛的适应性，易培养；(4)代谢特征：将该菌液体扩大培养后应用纤维素酶活分析发现，其发酵产纤维素酶的活力高；(5)分子鉴定：ITS区域选择真菌生物ITS通用扩增引物，ITS区域PCR反应体系与18S rDNA反应体系相同，PCR产物回收后与T载体连接，转化到大肠杆菌，经过蓝白斑筛选，挑取白斑，活化后经引物PCR扩增鉴定，测序结果经ITS比对表明与黑曲霉的同源性为98％-99％。因此，综合菌落形态、孢子形态、生理特征、代谢特征及18Sr RNA通用引物基因扩增序列的ITS比对结果，可以确定该菌株为Aspergillus niger WDNJ1。

黑曲霉Aspergillus niger WDNJ1的18SrRNA通用引物基因扩增序列测序(PCR产物回收后，与T载体连接，转化到大肠杆菌，经过蓝白斑筛选，挑取白斑，活化后经引物PCR扩增鉴定，测序大小为599bp。

附图说明

图1黑曲霉Aspergillus niger WDNJ1的菌落照片

图2黑曲霉Aspergillus niger WDNJ1的镜检照片

图3黑曲霉Aspergillus niger WDNJ1的PCR产物回收凝胶电泳图(ITS区域选择真菌生物ITS通用扩增引物，ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。反应体系25μL，其中包括2.5μL10×rTaq buffer(Mg²⁺Plus)，0.5μL TaKaRa rTaq(5U/μl)，1μL dNTP Mixture(各2.5mmol/L)，2μL基因组DNA，上下游引物(20mmol/L)各0.5μL，加dd H₂O补足体积。ITS区域PCR反应体系与18S rDNA反应体系相同，反应条件为：94℃预变性3min；然后94℃变性40s，58℃退火30s，72℃延伸40s，32个循环；72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图中M为Marker，1为样品。)

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

本实施例说明Aspergillus niger WDNJ1的筛选过程。

采集多处桑园土壤样品，放入50mL无菌水的锥形瓶中，加入20颗左右的玻璃珠，剧烈震荡20min，使泥土完全捣碎，静置。在每只50mL无菌水的三角瓶中加入1mL土壤样品悬浮液，放入恒温震荡培养箱培养，37℃下培养2d。取悬液涂布于初筛平板培养基上，进行产酶菌株的初筛。初筛培养基的质量组成为：磷酸氢二钾1.0％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸铵0.1％、硝酸钠0.05％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.005％、硫酸锌0.005％、琼脂5％、余量为水，pH 6.5，并加入占培养基总质量5％的桑粉。温度35℃，培养时间1～6d。挑选产生菌落较大的菌株20株，接种到真菌完全培养基斜面培养。

将斜面上生长比较好的菌体转接到产纤维素酶培养基中，进行产纤维素酶菌株的复筛。产酶培养基质量比组成：磷酸氢二钾1.0％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸铵0.1％、硝酸钠0.05％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.005％、硫酸锌0.005％、余量为水，pH 6.5，并加入培养基总质量10％的桑粉，三角瓶装液量50mL。摇瓶转速150r/min，温度35℃，培养时间1～6d，取发酵液测定纤维素酶活及1-DNJ的含量，筛选到产纤维素酶酶活最大和培养基质中1-DNJ含量最高的一株菌株，命名为黑曲霉Aspergillus niger WDNJ1。

其中，纤维素酶的酶活采用葡萄糖标准曲线法，HPLC法测定1-DNJ的检测条件为：

色谱柱：Alltima C₁₈(250mm×4.6mm)；流动相：乙腈-0.1％醋酸(36∶64，V/V)；检测波长：254nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL。

样品中1-DNJ的提取方法：精确称取样品0.1g，加入5mL 0.05mol/L HCL，涡流1min，超声波处理40min，4000r/min离心30min，收集上清液，沉淀物再按上步重复抽提1次，合并2次上清液，定容至10mL，即得样品提取液。

样品中1-DNJ的FMOC-Cl衍生化方法：将1-DNJ测试样品液取100μL于1.5mL的离心管中，依次加入0.4mol/L pH 8.5的硼酸钾缓冲液100μL、0.05mol/LFMOC-Cl(溶解于50％乙腈)200μL，迅速混匀后25℃水浴20min。加入1mol/L甘氨酸100μL中和剩余的FMOC-Cl以终止反应。加入1.0％醋酸液100μL及纯净水400μL稀释，10000r/min离心5min，0.45μm微孔滤膜过滤，收集滤液待测。

本发明菌株黑曲霉Aspergillus niger WDNJ1系从桑园土壤中分离得到，综合分析了该菌形态特征、菌丝特征、生理特性、代谢特征及分子鉴定，结果表明该菌株具有以下特征：(1)形态学特征：该菌生长迅速，菌落形态呈褐色，正反颜色不同，初生成时为无色透明，有明显的折光性；成熟菌落较大，呈扇状，中心形成同心圆，边缘不圆润齐整，质地疏松，外观干燥，不透明，呈现毡状；(2)菌丝特征：呈透明胶管状，菌丝有分枝，许多分枝的菌丝相互交织形成菌丝体，并可见子实体及孢囊孢子；(3)生理特征：对碳源、氮源及温度有广泛的适应性，易培养；(4)代谢特征：将该菌液体扩大培养后应用纤维素酶活分析发现，其发酵产纤维素酶的活力高；(5)分子鉴定：ITS区域选择真菌生物ITS通用扩增引物，ITS区域PCR反应体系与18S rDNA反应体系相同，PCR产物回收后与T载体连接，转化到大肠杆菌，经过蓝白斑筛选，挑取白斑，活化后经引物PCR扩增鉴定，测序结果经ITS比对表明与黑曲霉的同源性为98％-99％。因此，综合菌落形态、孢子形态、生理特征、代谢特征及18Sr RNA通用引物基因扩增序列的ITS比对结果，可以确定菌株WDNJ1属于黑曲霉(Aspergillus niger)。

实施例2

本实施例说明黑曲霉Aspergillus niger WDNJ1用于富集提取桑白皮中1-DNJ的方法。

种子培养基质量比组成：磷酸氢二钾0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸铵0.1％、硝酸钠0.01％、硫酸镁0.01％、七水合硫酸亚铁0.001％、硫酸锌0.001％、蔗糖1％，余量为水，pH 5.0。

在温度25℃的培养基中接菌Aspergillus niger WDNJ1，以转速100r/min摇瓶培养1d得培养好的种子悬液，稀释1倍喷洒到桑粉上，在温度为15℃、湿度为60％条件下，培养1d后，提取DNJ，经HPLC测定表明DNJ的提取率比未处理的对照组高16％，富集率达116％。

实施例3

本实施例的方法与实施例2相同，改变所用方法参数。

种子培养基质量比组成：磷酸氢二钾1.0％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸铵0.1％、硝酸钠0.05％、硫酸镁0.05％、七水合硫酸亚铁0.005％、硫酸锌0.005％、蔗糖3％，余量为水，pH 6.0。

在温度35℃的培养基中接菌Aspergillus niger WDNJ1，以转速120r/min摇瓶培养4d得培养好的种子悬液，稀释5倍喷洒到桑粉上，在温度为35℃、湿度为85％条件下，培养2d后，提取DNJ，经HPLC测定表明DNJ的提取率比未处理的对照组高107％，富集率达207％。

实施例4

本实施例的方法与实施例2相同，改变所用方法参数。

种子培养基质量比组成：磷酸氢二钾1.5％、磷酸二氢钾1.5％、硫酸铵1.5％、硝酸钠0.5％、硫酸镁0.5％、七水合硫酸亚铁0.5％、硫酸锌0.5％，余量为水，pH8.0。

在温度40℃的培养基中接菌Aspergillus niger WDNJ1，以转速200r/min摇瓶培养6d得培养好的种子悬液，稀释10倍喷洒到桑粉上，在温度为55℃、湿度为95％条件下，培养5d后，提取DNJ，经HPLC测定表明DNJ的提取率比未处理的对照组高35％，富集率达135％。

SEQUENCE LISTING

<110>江苏科技大学

<120>一株黑曲霉菌株及其在富集提取桑白皮中1-脱氧野尻霉素的应用

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>599

<212>DNA

<213>Aspergillus niger WDNJ1

<400>1

tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta ccgagtgcgg gtcctttggg cccaacctcc 60

catccgtgtc tattataccc tgttgcttcg gcgggcccgc cgcttgtcgg ccgccggggg 120

ggcgcctttg ccccccgggc ccgtgcccgc cggagacccc aacacgaaca ctgtctgaaa 180

gcgtgcagtc tgagttgatt gaatgtaatc agttaaaact ttcaacaatg gatctcttgg 240

ttccggcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataacta atgtgaattg cagaattcag 300

tgaatcatcg agtctttgaa cgcacattgc gccccctggt attccggggg gcatgcctgt 360

ccgagcgtca ttgctgccct caagcccggc ttgtgtgttg ggtcgccgtc cccctctccg 420

gggggacggg cccgaaaggc agcggcggca ccgcgtccga tcctcgagcg tatggggctt 480

tgtcacatgc tctgtaggat tggccggcgc ctgccgacgt tttccaacca ttttttccag 540

gttgacctcg gatcaggtag ggatacccgc tgaacttaag catatcaata agcggagga 599

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>引物

<400>2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

1.一株黑曲霉菌株（Aspergillus niger）WDNJ1，保藏日期为2010年12月8日，保藏登记号为CGMCC No.4421。

2.黑曲霉WDNJ1在富集提取桑白皮中1-脱氧野尻霉素的应用，所述黑曲霉WDNJ1，保藏日期为2010年12月8日，保藏登记号为CGMCC No.4421。

3.根据权利要求2所述黑曲霉WDNJ1在富集提取桑白皮中的1-脱氧野尻霉素的应用，其特征在于步骤为：

a.利用黑曲霉WDNJ1进行液体发酵制备种子：在温度25～40℃的培养基中接菌，以转速100～200r/min摇瓶培养1～6d得种子悬液，所述培养基的pH 5.0～8.0，其质量百分比含量为：磷酸氢二钾0.1％～1.5％、磷酸二氢钾0.1％～1.5％、硫酸铵0.1％～1.5％、硝酸钠0.01％～0.5％、硫酸镁0.01％～0.5％、七水合硫酸亚铁0.001％～0.5％、硫酸锌0.001％～0.5％、蔗糖1～5％，其余为水；

b.黑曲霉WDNJ1用于富集提取桑白皮中的1-脱氧野尻霉素：种子液的菌数约10⁷cfu/mL，将培养好的种子悬液稀释1～10倍喷洒到桑白皮粉上，在温度为15～55℃，湿度为60～95％条件下，培养1～5d后，即可富集提取得到1-脱氧野尻霉素。