CN104762348A - 一种天麻素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药或食品技术领域，具体涉及一种天麻素的制备方法，该方法将富产天麻素天麻内生菌和富产天麻素蜜环菌菌株接种于共生发酵培养基中发酵，再从发酵产物中提取得到天麻素。该方法工艺简单，适合工业化生产，不会造成资源浪费以及环境污染，以本发明制备方法得当的天麻素为原料，制备成注射液具有更好的稳定性。

Description

一种天麻素的制备方法

技术领域

本发明属于医药或食品技术领域，具体涉及一种共生发酵法生产天麻素的方法。

背景技术

天麻，又名赤箭、独摇芝等，是兰科天麻属多年生草本植物。根状茎肥厚，无绿叶，蒴果倒卵状椭圆形，常以块茎或种子繁殖。其根茎入药用以治疗头晕目眩、肢体麻木、小儿惊风等症，是名贵中药。

天麻的有效成分之一为天麻素，天麻素有镇静、抗惊厥、抗炎及增强机体免疫功能等作用。临床上广泛用于眩晕(美尼尔氏病、病毒性眩晕、神经痛等)、头痛(神经衰弱及神经衰弱综合症、血管性头痛、紧张性头痛、脑外伤综合症、偏头痛等，以及癫痫的辅助治疗等。

目前天麻素的工艺化生产中，主要是两种：一类是从天麻中提取得到，一类是化学合成得到；天麻素在天麻中含量只有0.1％，因此，从天麻中提取得到的方法，浪费了大量的原药材，并且还耗费时间、能量和提取剂等，天麻素的产品在临床用量越来越大，提取效率的提高也无法满足(天麻素在天麻含量低的原因，因此，从天麻提取得到天麻素的方法已经无法满足市场需要；化学合成方法虽然能够满足产品的大量生产，但化学合成方法得到天麻素因其安全性和环境污染等潜在风险，被研究者和消费者关注。因此，研究开发新的制备方法获得天麻素，具有重要理论价值和实际科学意义。

发明内容

基于上述原因，本发明人在多年研究的基础上，得到一种新的天麻素的方法，该方法采用将富产天麻素天麻内生菌和富产天麻素蜜环菌菌株接种于共生发酵培养基中发酵，再从发酵产物中提取得到天麻素，该方法工艺简单，适合工业化生产，不会造成资源浪费以及环境污染，以本发明制备方法得当的天麻素为原料，制备成注射液具有更好的稳定性。

本发明通过下述技术方案实现的。

一种天麻素的制备方法，该方法为：将富产天麻素天麻内生菌和富产天麻素蜜环菌菌株接种于共生发酵培养基中发酵，再从发酵产物中提取得到天麻素。

其中富产天麻素天麻内生菌的制备方法为：

采集新鲜天麻的块茎、花茎、花或果实，在无菌条件下，用75％酒精消毒，无菌水冲洗，吸干多余水分，分别切成0.3cm*0.3cm左右的小段或用无菌研钵磨成浆状，接种在查氏培养基和PDA培养基上，在20-60℃恒温培养1-10天，获得天麻内生菌的微生物菌株，然后用筛选培养基发酵实验，采用高效液相色谱定性检测发酵液中天麻素的含量，从中筛选出富产天麻素天麻内生菌，备用；

所述筛选培养基为：葡萄糖1-50g/L、酵母膏1-10g/L、蛋白胨1-10g/L、硫酸镁0.1-10g/L、磷酸二氢钾0.1-5g/L、蜜环菌汁200-800ml/L。

其中富产天麻素蜜环菌菌株的制备方法为：

采集天麻生长点的菌材，将其在无菌条件下，用75％酒精消毒，无菌水冲洗，吸干多余水分后分别切成0.3cm*0.3cm左右的小段或用无菌研钵磨成浆状，分别接种在查氏培养基和PDA培养基上，在20-30℃恒温培养1-10天，长出微生物，用筛选培养基发酵实验，利用高效液相色谱定性定量检测发酵液中天麻素的含量，从中筛选出富产天麻素蜜环菌菌株，备用；

所述筛选培养基为：葡萄糖1-50g/L、酵母膏1-10g/L、蛋白胨1-10g/L、硫酸镁0.1-10g/L、磷酸二氢钾0.1-5g/L、榛叶汁200-800ml/L。

其中天麻素的制备方法为：

(1)将富产天麻素蜜环菌菌株按照5-20％的体积比接种到共生发酵培养基中发酵30-180小时后，再将富产天麻素天麻内生菌按照5-20％的体积比接入共生培养基中于温度为20-70℃、搅拌转速为10-600转/分钟条件下发酵1-20天；所述共生发酵培养基为：蔗糖10-100g/L、麸皮浸出汁10-200ml/L、硫胺素0.1-50g/L、乙醇1-50g/L、磷酸二氢钾0.1-10g/L、基质10-900ml/L；所述的基质为榛叶汁、榛树疏松愈伤组织浆、榛树内生菌发酵液、板栗叶汁、栎皮汁中的一种；

(2)将发酵好的共生发酵液加入1-10％重量比复合酶于40℃-55℃下酶解20-60小时，将酶解后的共生发酵液浓缩，得到发酵天麻浸膏；所述的复合酶为重量比为1∶1的纤维素酶和淀粉酶；

(3)将发酵天麻浸膏与70％甲醇溶液按照体积比1∶10-30比例混匀，浸提30-90min，然后在功率400W温度50-70℃条件下，微波提取10-50min，过滤，浓缩，干燥，得天麻素。

本发明所述采集天麻生长点的菌材是指天麻生长处于其共生的菌材。

试验例

稳定性试验：取实施例1、实施例3、实施例5的天麻素，制备成注射液，制剂制备工艺为：取天麻素100g，加注射用水至1000ml，溶解完全，0.22μm滤芯过滤，灌装，121℃灭菌15分钟，包装，得到注射液1000支。取每个实施例样品30支，按《药物稳定性指导原则》进行长期稳定性试验，分别于0、1、2、3月取样考察样品中天麻素含量及有关物质含量，试验结果见表1。

制剂天麻素含量测定方法：

照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸水(3∶97)为流动相；检测波长为220nm。取天麻素与杂质I各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中含天麻素与杂质I分别约为50μg的溶液，作为系统适用性溶液。取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，理论板数按天麻素峰计算不低于5000，天麻素峰与杂质I峰的分离度应大于10。

测定法精密量取本品适量，用水定量稀释制成每1ml中含50μg的溶液，摇匀，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取天麻素对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。

杂质I：4-(3，4，5-三羟基-6-羟甲基)-四氢-2H-吡喃-2-基氧基苯甲醛，C₁₃H₁₆O₇，分子量284.36

有关物质：取本品适量，加水稀释制成每1ml中含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的30％；再精密量取供试品溶液与对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0，5％)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积(1.0％)。

表1不同实施例天麻素注射液稳定性比较试验结果

试验结论：按照本发明制备方法得到的天麻素为原料，制备成注射液，稳定性试验表明，该注射液具有很好的稳定性。

实施例

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例1

富产天麻素天麻内生菌的制备方法为：

采集新鲜天麻的块茎，在无菌条件下，用75％酒精消毒，无菌水冲洗，吸干多余水分，切成0.3cm*0.3cm左右的小段，接种在查氏培养基和PDA培养基上，在40℃恒温培养5天，获得天麻内生菌的微生物菌株，然后用筛选培养基发酵实验，采用高效液相色谱定性检测发酵液中天麻素的含量，从中筛选出富产天麻素天麻内生菌，备用；

所述筛选培养基为：葡萄糖25g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨5g/L、硫酸镁5g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、蜜环菌汁500ml/L。

富产天麻素蜜环菌菌株的制备方法为：

采集天麻生长点的菌材，将其在无菌条件下，用75％酒精消毒，无菌水冲洗，吸干多余水分后切成0.3cm*0.3cm左右的小段，分别接种在查氏培养基和PDA培养基上，在25℃恒温培养5天，长出微生物，用筛选培养基发酵实验，利用高效液相色谱定性定量检测发酵液中天麻素的含量，从中筛选出富产天麻素蜜环菌菌株，备用；

所述筛选培养基为：葡萄糖25g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨5g/L、硫酸镁5g/L、磷酸二氢钾3g/L、榛叶汁450ml/L。

天麻素的制备方法为：

(1)将富产天麻素蜜环菌菌株按照15％的体积比接种到共生发酵培养基中发酵100小时后，再将富产天麻素天麻内生菌按照15％的体积比接入共生培养基中于温度为45℃、搅拌转速为300转/分钟条件下发酵10天；所述共生发酵培养基为：蔗糖50g/L、麸皮浸出汁100ml/L、硫胺素25g/L、乙醇25g/L、磷酸二氢钾5g/L、基质450ml/L；所述的基质为榛叶汁；

(2)将发酵好的共生发酵液加入5％重量比复合酶于45℃下酶解35小时，将酶解后的共生发酵液浓缩，得到发酵天麻浸膏；所述的复合酶为重量比为1∶1的纤维素酶和淀粉酶；

(3)将发酵天麻浸膏与70％甲醇溶液按照体积比1∶20比例混匀，浸提50min，然后在功率400W温度60℃条件下，微波提取25min，过滤，浓缩，干燥，得到天麻素，其中天麻素含量为99.95％。

实施例2

富产天麻素天麻内生菌的制备方法为：

采集新鲜天麻的花茎，在无菌条件下，用75％酒精消毒，无菌水冲洗，吸干多余水分，用无菌研钵磨成浆状，接种在查氏培养基和PDA培养基上，在20℃恒温培养10天，获得天麻内生菌的微生物菌株，然后用筛选培养基发酵实验，采用高效液相色谱定性检测发酵液中天麻素的含量，从中筛选出富产天麻素天麻内生菌，备用；

所述筛选培养基为：葡萄糖1g/L、酵母膏1g/L、蛋白胨1g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、蜜环菌汁200ml/L。

富产天麻素蜜环菌菌株的制备方法为：

采集天麻生长点的菌材，将其在无菌条件下，用75％酒精消毒，无菌水冲洗，吸干多余水分后分别切成0.3cm*0.3cm左右的小段，用无菌研钵磨成浆状，分别接种在查氏培养基和PDA培养基上，在20℃恒温培养10天，长出微生物，用筛选培养基发酵实验，利用高效液相色谱定性定量检测发酵液中天麻素的含量，从中筛选出富产天麻素蜜环菌菌株，备用；

所述筛选培养基为：葡萄糖1g/L、酵母膏1g/L、蛋白胨1g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、榛叶汁200ml/L。

天麻素的制备方法为：

(1)将富产天麻素蜜环菌菌株按照5％的体积比接种到共生发酵培养基中发酵180小时后，再将富产天麻素天麻内生菌按照5％的体积比接入共生培养基中于温度为20℃、搅拌转速为600转/分钟条件下发酵1天；所述共生发酵培养基为：蔗糖50g/L、麸皮浸出汁100ml/L、硫胺素25g/L、乙醇25g/L、磷酸二氢钾5g/L、基质450ml/L；所述的基质为榛树疏松愈伤组织浆；

(2)将发酵好的共生发酵液加入1％重量比复合酶于40℃下酶解60小时，将酶解后的共生发酵液浓缩，得到发酵天麻浸膏；所述的复合酶为重量比为1∶1的纤维素酶和淀粉酶；

(3)将发酵天麻浸膏与70％甲醇溶液按照体积比1∶10比例混匀，浸提90min，然后在功率400W温度50℃条件下，微波提取50min，过滤，浓缩，干燥，得天麻素，其中天麻素含量为99.13％。

实施例3

富产天麻素天麻内生菌的制备方法为：采集新鲜天麻的果实，在无菌条件下，用75％酒精消毒，无菌水冲洗，吸干多余水分，分别切成0.3cm*0.3cm左右的小段，接种在查氏培养基和PDA培养基上，在35℃恒温培养6天，获得天麻内生菌的微生物菌株，然后用筛选培养基发酵实验，采用高效液相色谱定性检测发酵液中天麻素的含量，从中筛选出富产天麻素天麻内生菌，备用；

所述筛选培养基为：葡萄糖15g/L、酵母膏4g/L、蛋白胨4g/L、硫酸镁4.5g/L、磷酸二氢钾3g/L、蜜环菌汁250ml/L。

富产天麻素蜜环菌菌株的制备方法为：

采集天麻生长点的菌材，将其在无菌条件下，用75％酒精消毒，无菌水冲洗，吸干多余水分后分别切成0.3cm*0.3cm左右的小段，分别接种在查氏培养基和PDA培养基上，在23℃恒温培养8天，长出微生物，用筛选培养基发酵实验，利用高效液相色谱定性定量检测发酵液中天麻素的含量，从中筛选出富产天麻素蜜环菌菌株，备用；

所述筛选培养基为：葡萄糖15g/L、酵母膏4g/L、蛋白胨4g/L、硫酸镁2.5g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、榛叶汁250ml/L。

天麻素的制备方法为：

(1)将富产天麻素蜜环菌菌株按照10％的体积比接种到共生发酵培养基中发酵155小时后，再将富产天麻素天麻内生菌按照8％的体积比接入共生培养基中于温度为30℃、搅拌转速为100转/分钟条件下发酵16天；所述共生发酵培养基为：蔗糖20g/L、麸皮浸出汁30ml/L、硫胺素5g/L、乙醇8g/L、磷酸二氢钾2g/L、基质150ml/L；所述的基质为栎皮汁；

(2)将发酵好的共生发酵液加入3％重量比复合酶于45℃下酶解50小时，将酶解后的共生发酵液浓缩，得到发酵天麻浸膏；所述的复合酶为重量比为1∶1的纤维素酶和淀粉酶；

(3)将发酵天麻浸膏与70％甲醇溶液按照体积比1∶15比例混匀，浸提45min，然后在功率400W温度55℃条件下，微波提取40min，过滤，浓缩，干燥，得天麻素，含量为99.97％。

实施例4

富产天麻素天麻内生菌的制备方法为：

采集新鲜天麻的花，在无菌条件下，用75％酒精消毒，无菌水冲洗，吸干多余水分，用无菌研钵磨成浆状，接种在查氏培养基和PDA培养基上，在60℃恒温培养1天，获得天麻内生菌的微生物菌株，然后用筛选培养基发酵实验，采用高效液相色谱定性检测发酵液中天麻素的含量，从中筛选出富产天麻素天麻内生菌，备用；

所述筛选培养基为：葡萄糖50g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨10g/L、硫酸镁10g/L、磷酸二氢钾5g/L、蜜环菌汁800ml/L。

富产天麻素蜜环菌菌株的制备方法为：

采集天麻生长点的菌材，将其在无菌条件下，用75％酒精消毒，无菌水冲洗，吸干多余水分后用无菌研钵磨成浆状，分别接种在查氏培养基和PDA培养基上，在30℃恒温培养2天，长出微生物，用筛选培养基发酵实验，利用高效液相色谱定性定量检测发酵液中天麻素的含量，从中筛选出富产天麻素蜜环菌菌株，备用；

所述筛选培养基为：葡萄糖50g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨10g/L、硫酸镁10g/L、磷酸二氢钾5g/L、榛叶汁800ml/L。

天麻素的制备方法为：

(1)将富产天麻素蜜环菌菌株按照20％的体积比接种到共生发酵培养基中发酵35小时后，再将富产天麻素天麻内生菌按照20％的体积比接入共生培养基中于温度为70℃、搅拌转速为20转/分钟条件下发酵2天；所述共生发酵培养基为：蔗糖100g/L、麸皮浸出汁200ml/L、硫胺素50g/L、乙醇50g/L、磷酸二氢钾10g/L、基质900ml/L；所述的基质为板栗叶汁；

(2)将发酵好的共生发酵液加入10％重量比复合酶于55℃下酶解25小时，将酶解后的共生发酵液浓缩，得到发酵天麻浸膏；所述的复合酶为重量比为1∶1的纤维素酶和淀粉酶；

(3)将发酵天麻浸膏与70％甲醇溶液按照体积比1∶30比例混匀，浸提35min，然后在功率400W温度70℃条件下，微波提取15min，过滤，浓缩，干燥，得天麻素，含量为99.04％。

实施例5

富产天麻素天麻内生菌的制备方法为：

采集新鲜天麻的块茎，在无菌条件下，用75％酒精消毒，无菌水冲洗，吸干多余水分，分别切成0.3cm*0.3cm左右的小段，接种在查氏培养基和PDA培养基上，在45℃恒温培养7天，获得天麻内生菌的微生物菌株，然后用筛选培养基发酵实验，采用高效液相色谱定性检测发酵液中天麻素的含量，从中筛选出富产天麻素天麻内生菌，备用；

所述筛选培养基为：葡萄糖40g/L、酵母膏8g/L、蛋白胨8g/L、硫酸镁6g/L、磷酸二氢钾4g/L、蜜环菌汁650ml/L。

富产天麻素蜜环菌菌株的制备方法为：

采集天麻生长点的菌材，将其在无菌条件下，用75％酒精消毒，无菌水冲洗，吸干多余水分后切成0.3cm*0.3cm左右的小段，分别接种在查氏培养基和PDA培养基上，在28℃恒温培养4天，长出微生物，用筛选培养基发酵实验，利用高效液相色谱定性定量检测发酵液中天麻素的含量，从中筛选出富产天麻素蜜环菌菌株，备用；

所述筛选培养基为：葡萄糖45g/L、酵母膏8g/L、蛋白胨8g/L、硫酸镁8g/L、磷酸二氢钾4g/L、榛叶汁750ml/L。

天麻素的制备方法为：

(1)将富产天麻素蜜环菌菌株按照15％的体积比接种到共生发酵培养基中发酵165小时后，再将富产天麻素天麻内生菌按照15％的体积比接入共生培养基中于温度为65℃、搅拌转速为550转/分钟条件下发酵3天；所述共生发酵培养基为：蔗糖45g/L、麸皮浸出汁50ml/L、硫胺素45g/L、乙醇40g/L、磷酸二氢钾6g/L、基质750ml/L；所述的基质为榛叶汁；

(2)将发酵好的共生发酵液加入8％重量比复合酶于50℃下酶解55小时，将酶解后的共生发酵液浓缩，得到发酵天麻浸膏；所述的复合酶为重量比为1∶l的纤维素酶和淀粉酶；

(3)将发酵天麻浸膏与70％甲醇溶液按照体积比1∶25比例混匀，浸提35min，然后在功率400W温度55℃条件下，微波提取45min，过滤，浓缩，干燥，得天麻素，其含量为99.17％。

天麻素含量测定方法：

照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸水(3∶97)为流动相；检测波长为220nm。取天麻素与杂质I各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中含天麻素与杂质I分别约为50μg的溶液，作为系统适用性溶液。取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，理论板数按天麻素峰计算不低于5000，天麻素峰与杂质I峰的分离度应大于10。

测定法精密量取本品适量，用水定量稀释制成每1ml中含50μg的溶液，摇匀，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，计算天麻素含量。

Claims (4)

1.一种天麻素的制备方法，其特征在于：该方法为：将富产天麻素天麻内生菌和富产天麻素蜜环菌菌株接种于共生发酵培养基中发酵，再从发酵产物中提取得到天麻素。

2.根据权利要求1所述的一种天麻素的制备方法，其中富产天麻素天麻内生菌的制备方法为：

采集新鲜天麻的块茎、花茎、花或果实，在无菌条件下，用75％酒精消毒，无菌水冲洗，吸干多余水分，分别切成0.3cm*0.3cm左右的小段或用无菌研钵磨成浆状，接种在查氏培养基和PDA培养基上，在20-60℃恒温培养1-10天，获得天麻内生菌的微生物菌株，然后用筛选培养基发酵实验，采用高效液相色谱定性检测发酵液中天麻素的含量，从中筛选出富产天麻素天麻内生菌，备用；

所述筛选培养基为：葡萄糖1-50g/L、酵母膏1-10g/L、蛋白胨1-10g/L、硫酸镁0.1-10g/L、磷酸二氢钾0.1-5g/L、蜜环菌汁200-800ml/L。

3.根据权利要求1所述的一种天麻素的制备方法，其中富产天麻素蜜环菌菌株的制备方法为：

采集天麻生长点的菌材，将其在无菌条件下，用75％酒精消毒，无菌水冲洗，吸干多余水分后分别切成0.3cm*0.3cm左右的小段或用无菌研钵磨成浆状，分别接种在查氏培养基和PDA培养基上，在20-30℃恒温培养1-10天，长出微生物，用筛选培养基发酵实验，利用高效液相色谱定性定量检测发酵液中天麻素的含量，从中筛选出富产天麻素蜜环菌菌株，备用；

所述筛选培养基为：葡萄糖1-50g/L、酵母膏1-10g/L、蛋白胨1-10g/L、硫酸镁0.1-10g/L、磷酸二氢钾0.1-5g/L、榛叶汁200-800ml/L。

4.根据权利要求1所述的一种天麻素的制备方法，其中天麻素的制备方法为：

(1)将富产天麻素蜜环菌菌株按照5-20％的体积比接种到共生发酵培养基中发酵30-180小时后，再将富产天麻素天麻内生菌按照5-20％的体积比接入共生培养基中于温度为20-70℃、搅拌转速为10-600转/分钟条件下发酵1-20天；所述共生发酵培养基为：蔗糖10-100g/L、麸皮浸出汁10-200ml/L、硫胺素0.1-50g/L、乙醇1-50g/L、磷酸二氢钾0.1-10g/L、基质10-900ml/L；所述的基质为榛叶汁、榛树疏松愈伤组织浆、榛树内生菌发酵液、板栗叶汁、栎皮汁中的一种；

(2)将发酵好的共生发酵液加入1-10％重量比复合酶于40℃-55℃下酶解20-60小时，将酶解后的共生发酵液浓缩，得到发酵天麻浸膏；所述的复合酶为重量比为1∶1的纤维素酶和淀粉酶；

(3)将发酵天麻浸膏与70％甲醇溶液按照体积比1∶10-30比例混匀，浸提30-90min，然后在功率400W温度50-70℃条件下，微波提取10-50min，过滤，浓缩，干燥，得天麻素。