CN115736244B - 一种天麻丹贝及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品生物发酵技术领域，具体涉及一种天麻丹贝及其制备方法与应用。一种天麻丹贝的制备方法，包括如下步骤：(1)发酵剂的制备：将丹贝菌接种至PDA固体培养基中培养，获得菌丝和孢子后，碾碎，碾碎后的菌丝和孢子与发酵基质混匀，烘干冷却后制得发酵剂；(2)将步骤(1)制备得到的发酵剂接种于洗净削皮后的天麻中进行固体发酵，获得天麻丹贝。本发明所述技术发酵天麻时间短，发酵效率高，丹贝菌发酵不仅大大减轻了天麻的异味，而且大大提高了天麻素、总酚、总黄酮等生理活性物质，赋予了天麻丰富的γ‑氨基丁酸。

Description

一种天麻丹贝及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于食品生物发酵技术领域，具体涉及一种天麻丹贝及其制备方法与应用。

背景技术

天麻为常用的名贵中药，来源于为兰科植物天麻的块茎，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络的功效。除了药用之外，天麻还具有悠久而广泛的食用历史。2019年国家卫生健康委员会和国家市场监管总局联合发布了《关于对党参等9种物质开展按照传统既是食品又是中药材的物质管理试点工作的通知》(国卫食品函[2019]311号)，包含了对天麻进行药食同源的试点工作。现代药理研究表明，天麻不仅具有抗癫痫、抗惊厥、改善睡眠等传统功效相关的药理作用，还具有改善记忆、抗焦虑、抗疲劳等作用，在药品、保健品、化妆品等领域具有广泛的应用前景。学者对天麻的化学成分进行了深入的研究，除含量丰富的多糖成分外，已从天麻块茎中鉴定了200多种化学成分，在报道中，一般按化合物的结构特征、可能的生源途径等，习惯性地将其称为酚性成分、天麻素衍生物、酚苷化合物等。这些物质构成了天麻药效和保健功能的物质基础。但天麻其本身的味道不能被广泛接受，并且粘性较高，有粘牙的缺点，这极大的限制了天麻在食品领域的应用。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)由谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸而来，是人体中枢神经系统中一种重要的抑制性神经递质，具有很多重要的生理功能，它能够抑制交感神经系统的兴奋，起到催眠、镇静和抗焦虑等作用。近年来有很多学者对γ-氨基丁酸的生物活性做了大量研究，表明γ-氨基丁酸具有抗糖尿病、抗高血压、保护肝肾、促进睡眠等活性。γ-氨基丁酸具有多种生物活性，故近年来市场需求不断增加，而天然来源的γ-氨基丁酸的量有限，无法满足市场需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，即天麻特有的不被人们接收的“马尿味”重、粘牙缺陷和γ-氨基丁酸的量无法满足市场需求的不足，提供一种天麻丹贝。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述天麻丹贝的制备方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述天麻丹贝在制备天麻食品中的应用。

本发明设计思路：丹贝菌少孢根霉是严格好氧真菌，而天麻块茎较大，不利于少孢根霉发酵，为保证其能在天麻上高效、快速生长，对天麻切丁，增加天麻比表面积，使发酵过程中充分获得氧气生长的同时增大与天麻的接触面积，同时利用不宜黏连或成块小米作为少孢根霉保存或附着基质，一方面小米较大的比表面积可使少孢根霉更加充分的接触氧气，另一方面小米丰富的营养物质可为少孢根霉提供营养，促进少孢根霉生长。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种天麻丹贝的制备方法，包括如下步骤：

(1)发酵剂的制备：将丹贝菌接种至PDA固体培养基中培养，获得菌丝后，碾碎，碾碎后的菌丝与发酵基质混匀，烘干冷却后制得发酵剂；

(2)将步骤(1)制备得到的发酵剂接种于洗净削皮后的天麻中进行固体发酵，获得天麻丹贝。

其中，步骤(1)中，所述的丹贝菌为少孢根霉Rhizopus oligosporus，菌种号为ATCC46348。

其中，步骤(1)中，所述的培养，其培养条件为：20-30℃培养5-7天。优选的培养条件为：30℃培养7天。

其中，步骤(1)中，所述的发酵基质为小米、大米、过60目筛的小米粉、过60目筛的大米粉中的任意一种。优选的发酵基质为小米。

其中，步骤(1)中，所述的菌丝与发酵基质混匀，其比例为每500g发酵基质分别与7块从培养基上撕下的放入研钵中研碎的菌丝混匀。

其中，步骤(1)中，所述的烘干冷却，烘干的条件为45℃烘4h。

其中，步骤(2)中，所述的接种，其接种量为1-2.5％重量比(g/g)，优选的接种量为2％重量比(g/g)。

其中，步骤(2)中，所述的天麻，是将天麻切成的方丁，其尺寸是长宽厚分别为0.1-1.5cm。优选的天麻，是将天麻切成的方丁，其尺寸是长宽厚分别为0.3-0.5cm，最优选的为0.5cm。

其中，步骤(2)中，所述的固体发酵，其培养条件为：25-30℃条件下发酵培养20-32h。优选的培养条件30℃条件下发酵培养，直至菌丝完全覆盖天麻丁，停止发酵。

上述天麻丹贝的制备方法制备得到的天麻丹贝也在本发明所保护的范围之内。

其中，所述的天麻丹贝降低了天麻的异味，提高了天麻素、总多酚、总黄酮和γ-氨基丁酸的含量，增加了风味物质。

具体的，采用高效液相色谱法测定发酵前和发酵后的天麻素含量变化。结果，发酵前样品中天麻素含量为6.846μg/mL，即427.875μg/g，发酵后样品中天麻素含量为16.16μg/mL，即1010.0μg/g，即经发酵后天麻中的天麻素含量是发酵前天麻素含量的2.36倍。

具体的，分别采用福林-酚比色法、亚硝酸钠-硝酸铝比色法和Berthelo比色法测定发酵前后天麻的总多酚含量、总黄酮含量和γ-氨基丁酸含量。结果，可以看出天麻发酵后的总多酚和总黄酮和γ-氨基丁酸含量都比发酵前的有所提高。天麻发酵前总多酚含量约为1.615mg/g，发酵后约为4.468mg/g，提高了约1.8倍。发酵前总黄酮含量约为0.119mg/g，发酵后约为0.461mg/g，虽然提高了约2.9倍，但整体含量还是偏低。发酵前γ-氨基丁酸含量约为0.765mg/g，发酵后约为4.062mg/g，提高了约4.3倍。

具体的，用GC/MS仪器进行分离测定，分析发酵前后风味物质的变化。发现，发酵后的天麻整体香味物质多样性增加，且总体含量增加，因此闻起来要比发酵前可接受度高。

上述天麻丹贝在制备天麻食品中的应用也在本发明所保护的范围之内。

有益效果：

1、天麻切丁，增加了丹贝菌与天麻接触面积，增加了少孢根霉与氧气接触，提高了发酵效率；

2、以小米作为丹贝菌的保藏和附着基质，不仅为丹贝菌提供了丰富的营养物质而且，小米完整和较大的颗粒进一步隔开天麻丁，使丹贝菌进一步获得更多的氧气，有利于提高发酵效率；

3、天麻经丹贝菌发酵后不愉快的风味大大降低，提高了可食用性；

4、丹贝菌发酵天麻中的天麻素、总酚、总黄酮等功能成分大大增加，增强了天麻功能特性；

5、丹贝菌发酵天麻赋予天麻丰富的γ-氨基丁酸。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1天麻发酵前后感官评价差异

图2天麻发酵过程(从左到右依次是发酵前、发酵24h后、冻干后)

图3天麻素标准品(A)、发酵后的样品(B)和发酵前的样品(C)的高效液相色谱图

图4天麻素标准曲线

图5没食子酸标准曲线

图6芦丁标准曲线

图7γ-氨基丁酸标准曲线

图8发酵前天麻的GC/MS图谱

图9发酵后天麻的GC/MS图谱

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

1、少孢根霉ATCC46348发酵剂的制备

分别将小米、大米、过60目筛的小米粉、过60目筛的大米粉160℃干热灭菌4h后备用。将少孢根霉ATCC46348(购自美国模式培养物集存库American type culturecollection，缩写为ATCC)接种至PDA固体培养基(称量已去皮的马铃薯200g切块，放入1L水中，煮沸30min，用8层纱布过滤，滤液中放入20g葡萄糖，30g琼脂，5g酵母浸粉，再次煮沸让琼脂充分融化，然后定容到1L，分装入锥形瓶，121℃高压蒸汽灭菌20min)，30℃培养7d。以灭菌后的小米、大米、过60目筛的小米粉、过60目筛的大米粉为发酵基质，每500g发酵基质分别与7块从培养基上撕下的放入研钵中研碎的菌丝混匀后45℃烘4h，将其中未被完全磨碎的黑色菌丝挑拣出来放入研钵中研碎，再重新加入到小米、大米、过60目筛的小米粉、过60目筛的大米粉中混合均匀，即为四种不同组分的发酵剂。将做好的四种发酵剂分别放入灭过菌的瓶子中4℃保存备用。

2、固态发酵天麻丹贝

用丹贝的发酵方法制备天麻丹贝，相比于天麻粉和天麻片，未经过任何加工的新鲜天麻，可以保留更多的活性物质和营养成分。

本实施例选购云南昭通新鲜乌天麻，将天麻洗净削皮后，切成长宽厚约0.1cm、0.2cm、0.3cm、0.5cm、0.7cm、1.0cm、1.5cm的小方丁，增大发酵时与发酵剂的接触面积，有利于其更充分的发酵，蒸30min，置于超净台中放至冷却。称取一定量的天麻丁，使其填满培养皿(约70g)，分别接种2％重量比(g/g)的四种发酵剂，拌匀后置于30℃培养箱中发酵直至表面被白色菌丝完全覆盖，天麻黏连在一起，可以闻到发酵香味为止(图2)。对四种不同发酵剂(小米、大米、小米粉或大米粉发酵剂)在长宽厚0.5cm左右天麻丁上发酵情况进行分析。发酵完成时间如表1所示，以小米为基质的发酵剂发酵天麻完成时间最短，发酵效率最高。

表1不同发酵剂对发酵效率的影响

以小米为发酵基质，分析不同天麻丁尺寸对发酵天麻的情况，发酵完成时间如表2所示，当天麻丁的长宽厚在0.3-0.5cm时，发酵完成时间最短，在22-24h之间，发酵效率最高。

表2天麻丁尺寸对发酵效率的影响

采用综合评分法对以小米为发酵基质的发酵剂，发酵尺寸为长宽厚0.5cm的天麻发酵前后的品质特征进行感官评价。感官评价由10名感官评价员组成，对样品的外观色泽、香味、口感以及滋味进行评价。评分标准如表3所示。

表3感官品质评价标准

感官差异图如图1所示，综合来讲，在外观上天麻发酵前色泽较白且色泽均匀，发酵后依然呈白色但由于添加小米发酵剂，冻干后有部分黄褐色杂点；在气味上未发酵的天麻有明显的臭味，而发酵后的天麻丹贝闻到较淡的清香和天麻味道；在滋味上未发酵天麻入口即可感受到天麻味道，天麻的后味也更重一些，发酵后的天麻丹贝品尝起来没有明显的味道，但也可感受到天麻的后味；口感上未发酵天麻入口有些黏腻，而发酵后的天麻丹贝嚼食没有明显的黏腻感，口感较好；在组织上未发酵天麻粉质更细腻一点，发酵后的天麻丹贝相对而言颗粒感明显一些。

3、发酵后天麻丹贝中活性物质的含量变化

3.1实验试剂

天麻素(源叶，货号S31318)、对羟基苯甲醇(麦克林，货号H811051)、乙腈(阿拉丁，货号A104440)、亚硝酸钠(麦克林，货号S818033)、福林酚(麦克林，货号P824172)、没食子酸(阿拉丁，货号G131992)、芦丁(麦克林，货号R817259)、γ-氨基丁酸(源叶，货号B21979)、硼酸(麦克林，货号B802844)、苯酚(麦克林，P815401)、无水碳酸钠(南试，货号C0130700223)、十水合四硼酸钠(南试，货号C0131540223)、无水乙醇(安耐吉，货号W320322)、次氯酸钠溶液(南试，货号C0134520826)、氢氧化钠(南试，货号C0131510225)、九水合硝酸铝(南试，货号C0150520223)。

3.2天麻素含量的变化

采用高效液相色谱法测定发酵前和发酵后的天麻素含量变化。

对照品溶液的制备：称取天麻素8.0mg置于50mL烧杯中，加25mL乙腈-水(5：95)混合溶液溶解，转移至50mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得含天麻素160μg/mL的对照品溶液。吸取对照品溶液，加适量乙腈-水(5：95)混合溶液稀释，分别制成浓度为2.0，4.0，8.0，16.0，32.0，64.0μg/mL的系列标准溶液，过0.22μm有机滤膜待测。

样品溶液的制备：将未发酵的鲜天麻洗净去皮后蒸30min，真空冷冻干燥2d后磨粉。将发酵后的天麻丹贝冻干后也磨成粉。分别称取发酵前和发酵后的天麻样品粉末各2g，置于具塞锥形瓶中，加入70％v/v乙醇50mL，称定重量，超声30min，待冷却后再称定重量，用70％v/v乙醇补足减失的重量，过滤，取滤液10mL，浓缩至近干无醇味，残渣加乙腈-水(5：95)混合溶液溶解，转移至25mL量瓶中，用乙腈-水(5∶95)混合溶液稀释至刻度，摇匀，用0.22μm有机滤膜过滤即得。

具体色谱条件为：

色谱柱：Agilent Eclipse pluse C18(250mm×4.6mm，5μm)

流动相：乙腈-水(5∶95)；检测波长：220nm；流速：1.0mL/min；进样量：20μL；柱温：25℃。

测定发酵前和发酵后样品的天麻素含量结果如图3所示，经绘制标准曲线(图4)可以得出，发酵前样品中天麻素含量为6.846μg/mL，即427.875μg/g，发酵后样品中天麻素含量为16.16μg/mL，即1010.0μg/g，即经发酵后天麻中的天麻素含量是发酵前天麻素含量的2.36倍。

3.3发酵前后总多酚、总黄酮、γ-氨基丁酸含量的测定

天麻的总酚含量与其抗氧化能力密切相关，因此分别采用福林-酚比色法、亚硝酸钠-硝酸铝比色法和Berthelo比色法测定发酵前后天麻的总多酚含量、总黄酮含量和γ-氨基丁酸含量。将未发酵的鲜天麻洗净去皮后蒸30min，真空冷冻干燥2d后磨粉。将发酵后的天麻丹贝冻干后也磨成粉。分别称取发酵前后的天麻样品粉各2g，加入15mL的60％乙醇溶液，4℃静置过夜，离心10min即得待测样品溶液。

3.3.1总多酚含量测定

总多酚含量的测定采用福林-酚比色法，按照下表添加各试剂，吸取没食子酸标准溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL分别置于10mL具塞试管中，加入0.5mL福林酚试剂、1.5mL15％ Na₂CO₃(w/v)溶液，用蒸馏水补足至10mL，混匀后75℃避光水浴10min，待冷却后测定各溶液在760nm处的吸光度值，以未加没食子酸标准溶液的试液用于扣除空白，以没食子酸浓度(c)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线(图5)。吸取样品溶液0.1mL，测定方法同上，重复三次，取平均值根据线性回归方程求总多酚含量。

表4测定总多酚含量各试剂及添加量

3.3.2总黄酮含量测定

总黄酮的测定采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法，按照下表添加各试剂，吸取芦丁标准溶液0.06mL、0.12mL、0.24mL、0.32mL、0.4mL分别置于10mL具塞试管中，加入5％NaNO₂(w/v)0.3mL，充分摇匀放置5min，加入0.3mL 10％ Al(NO₃)₃，充分混匀后静置6min，最后加入4mL4％ NaOH溶液，用蒸馏水补至10mL，摇匀后静置15min，在510nm处的吸光度值，以芦丁浓度(c，mg/mL)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线(图6)。吸取样品溶液1mL，测定方法同上，重复三次，根据线性回归方程求总黄酮含量。

表5测定总黄酮含量各试剂及添加量

3.3.3γ-氨基丁酸含量的测定

采用Berthelo比色法测定天麻发酵前后GABA(γ-氨基丁酸)含量的变化。配制浓度分别为1、0.5、0.25、0.125、0.0625mg/mL的GABA标准溶液，吸取GABA标准溶液0.5mL，加入硼酸盐缓冲液(0.2M，pH＝10)0.5mL，加入1mL 6％苯酚溶液，混匀后加入1mL次氯酸钠溶液(活性氯含量为5.2％)，充分混匀后沸水浴10min，随后立即冰浴20min，待溶液出现蓝绿色后加入60％乙醇溶液2mL，摇匀后于645nm处测吸光度值，以GABA浓度(c，mg/mL)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线(图7)。吸取样品溶液0.5mL，测定方法同上，重复三次，根据线性回归方程求GABA含量。

测定结果如表6所示，可以看出天麻发酵后的总多酚和总黄酮和γ-氨基丁酸含量都比发酵前的有所提高。天麻发酵前总多酚含量约为1.615mg/g，发酵后约为4.468mg/g，提高了约1.8倍。发酵前总黄酮含量约为0.119mg/g，发酵后约为0.461mg/g，虽然提高了约2.9倍，但整体含量还是偏低。发酵前γ-氨基丁酸含量约为0.765mg/g，发酵后约为4.062mg/g，提高了约4.3倍。

表6总多酚、总黄酮、γ-氨基丁酸含量测定结果

3.4发酵前后风味物质分析

发酵前天麻的处理：将鲜天麻切丁，蒸30min后，放入-20℃预冻，再真空冷冻干燥2d，磨粉，即得发酵前的天麻样品。

发酵后天麻的处理：将鲜天麻切丁，蒸30min后，接种2％重量比(g/g)的少孢根霉ATCC46348小米发酵剂，混匀后置于37℃培养箱中发酵24h，冻干2d，获得天麻丹贝。将天麻丹贝磨成粉，得到发酵后的天麻样品。

各取2g于顶空瓶中，60℃水浴萃取1h后进样，用GC/MS仪器进行分离测定。发酵前后的天麻主要挥发成分见表7、表8，GC/MS图谱见图8、图9。

表7发酵前天麻主要挥发性成分

天麻发酵前含有较高含量的苯酚，其次含有4-甲基苯酚、壬醛、邻甲基苯酚等挥发性成分；四甲基吡嗪带有烘烤芝麻、花生、可可豆的油脂味道；壬醛具有玫瑰、柑橘等香气，有强的油脂气味，多存在于红茶、绿茶中；β-苯乙醇具有清甜的玫瑰花香，在苹果、梨子、草莓、可可、蜂蜜等天然植物中发现；辛酸乙酯具有白兰地酒香味；正癸醛具有柑橘香、蜡香、花香等特点；壬酸乙酯有强烈葡萄香；石竹烯具有辛香、木香、柑橘香，有温和的丁香香气，但这些成分都相对较少。

表8发酵后天麻主要挥发性成分

天麻发酵制成天麻丹贝后，四甲基吡嗪、β-苯乙醇、辛酸乙酯和壬酸乙酯等香味物质含量都有所增加，并且产生了3-羟基丁酮、2,3,5-三甲基吡嗪、香橙烯和榄香烯含量，3-羟基丁酮具有特有的奶油香味，2,3,5-三甲基吡嗪多用于可可、咖啡、炒花生等焙烤食品香型香精；香橙烯具有柑橘香，榄香烯有辛辣的茴香气味，虽然壬醛和正癸醛含量减少，但发酵后的天麻整体香味物质多样性增加，且总体含量增加，因此闻起来要比发酵前可接受度高。

本发明提供了一种天麻丹贝及其制备方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (5)

1.一种天麻丹贝的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）发酵剂的制备：将丹贝菌接种至PDA固体培养基中培养，获得菌丝后，碾碎，碾碎后的菌丝与发酵基质混匀，烘干冷却后制得发酵剂；

（2）将步骤（1）制备得到的发酵剂接种于洗净削皮后的天麻丁中进行固体发酵，获得天麻丹贝；

其中，步骤（1）中，所述的丹贝菌为少孢根霉Rhizopus oligosporus，菌种号为ATCC46348；

步骤（1）中，所述的发酵基质为小米、大米、过60目筛的小米粉、过60目筛的大米粉中的任意一种；

步骤（2）中，所述的天麻丁，是天麻切成的方丁，其尺寸是长宽厚分别为0.1~1.5cm；

步骤（2）中，所述的固体发酵，其培养条件为：25-30℃条件下发酵培养20-32h。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的培养，其培养条件为：20-30℃培养5-7天。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的接种，其接种量为1-2.5%重量比 g/g。

4.权利要求1-3中任意一项所述的制备方法制备得到的天麻丹贝。

5.权利要求4所述的天麻丹贝在制备天麻食品中的应用。