CN111961597A - 天麻内生真菌Ws01及其在提高天麻中天麻素含量上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种天麻内生真菌Ws01及其在提高天麻中天麻素含量上的应用，所述天麻内生真菌Ws01的分类命名为似射脉菌(Phlebiopsis sp.)Ws01，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2020年6月11日，保藏号：GDMCC No.61055。本发明的天麻内生真菌Ws01可以有效提高天麻中天麻素含量，含有该菌的天麻中天麻素含量可达0.451％，其含量明显高于不含天麻内生真菌Ws01的天麻中天麻素的含量(0.304‑0.292％)。

Description

天麻内生真菌Ws01及其在提高天麻中天麻素含量上的应用

技术领域：

本发明涉属生物技术领域，尤其涉及一种天麻内生真菌及其应用和使用方法。

背景技术：

天麻Gastrodia elata Bl.是一种无根的兰科腐生植物，种子萌发后主要依靠侵入表皮层的蜜环菌菌丝获得营养。其球茎属于中国的名贵药材，有两千多年的入药史，具有治疗偏头痛、抗抑郁、镇静催眠和抗炎等作用，天麻素为天麻中主要药用活性成分之一。

天麻采收后不宜长期存放，需及时干燥，否则容易霉烂。蒸熟后烘干、煮透后烘干以及鲜品直接烘干是目前最常用的3种加工方式，干燥过程中可进行发汗等工艺。朱仕豪等发现发汗、蒸制和煮制使天麻素和巴利森苷类增加，对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛降低。沈肖晶等的研究证明隔水蒸比水煮加工工艺，所制得的天麻饮片中天麻素和天麻苷元含量要高；周碧乾的实验表明不经高温蒸煮，直接干燥处理，由于天麻体内丰富的水解酶使苷类成分被水解、转化，使得天麻素和巴利森苷等苷类大幅度减少，对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛等苷元类成分大幅增加。

现有文献研究表明，天麻中天麻素含量受天麻生长地土壤生态因子的影响，郑亚玉等的研究发现土壤中真菌总数与天麻中天麻素含量总体趋势都呈正相关。植物内生菌在与植物共进化的过程中，与宿主植物形成了和谐的共生关系，靠入侵植物组织获取营养和得到宿主的保护，同时也会产生具有生物活性的次生代谢产物来提高宿主的抗逆性能，有些还能促进宿主合成活性成分。然而，目前仅有少量文献报道天麻内生真菌的研究，如柳靖婷报道了一株天麻内生真菌(天麻枝顶孢菌)对天麻病原菌抑菌活性研究，李红玉对云南昭通天麻的内生真菌(Aspergillus sp.T2-19)与蜜环菌(Armillaria sp.)共培养次级代谢产物进行了系统研究。目前，尚未有文献报道天麻内生真菌在提高天麻中天麻素产量的研究。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种天麻内生真菌Ws01在提高天麻中天麻素含量上的应用，本发明通过天麻内生真菌Ws01提高了天麻中天麻素含量。

为解决上述问题，本发明的技术方案是：

本发明的菌株分离自湖南省绥宁县神坡山的天麻球茎，经鉴定属于似射脉菌属，命名为Ws01，菌株的ITS基因序列表如SEQ ID NO.1所示，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2020年6月11日，保藏号：GDMCC No.61055。

一种天麻内生真菌Ws01，天麻内生真菌Ws01的分类学命名为似射脉菌Ws01，保藏号为GDMCC No.61055。

一种天麻内生真菌Ws01的应用，所述天麻内生真菌Ws01用于提高天麻中天麻素的含量；天麻内生真菌Ws01的保藏号为GDMCC No.61055。

进一步的改进，将天麻种子或天麻种球与含有天麻内生真菌Ws01的培养基混合后再进行种植。

进一步的改进，将天麻种子与含有天麻内生真菌Ws01的培养基混合后再进行种植的步骤如下所示：

步骤一、将天麻内生真菌Ws01接种到液体培养基中培养形成种子液；

步骤二、将天麻种子在种子液中浸泡，得到种子液浸泡过的天麻种子或；

步骤三、以种子液浸泡过的天麻种子作为天麻种子进行天麻种植。

进一步的改进，所述步骤一包括如下步骤：

a.将天麻内生真菌Ws01的菌丝块接种于斜面试管培养基，温度25℃培养7～15天，得到斜面菌种；斜面试管培养基为PDA固体培养基，每1000ml的PDA固体培养基中包括马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g，并加水至1000ml；

b.液体培养基对斜面菌种进行扩大培养，得到种子液：在250ml锥形瓶中装入50ml液体培养基，灭菌，然后将斜面菌种接种到液体摇瓶种子培养基中，在温度22～28℃、转速100～180r/min下振荡培养4～8天，得到种子液；液体培养基的每1000ml水中含有马铃薯200g，葡萄糖20g，复合维生素B片2片，pH为6.5；所述复合维生素B片，每片中含有维生素B13mg，维生素B2 1.5mg，维生素B6 0.2mg，烟酰胺10mg和泛酸钙1mg。

进一步的改进，所述步骤二中，每0.1g天麻种子倒入50ml种子液中，转速100～120r/min，浸泡12h。

进一步的改进，所述天麻种植括如下步骤：

a.天麻种球培育时：将段木平铺于窖床底部，相邻段木之间形成间隙，且段木树皮面朝上，然后覆盖上一层1-2cm厚的薄土，在两端的段木与段木之间摆放含蜜环菌的菌材，菌材周边洒上种子液浸泡过的天麻种子和萌发菌，然后覆盖上一层1-2cm厚薄土，然后再盖上一层段木，最后覆盖上4-6cm厚的土壤；6个月后采收时形成的天麻种球，期间每隔3天洒水一次。

b.商品麻种植时：于3或4月份将段木铺于窖床底部，相邻段木之间形成间隙，且段木树皮面朝上，覆盖上一层1-2cm厚的薄土，在两端的段木与段木之间摆放含蜜环菌的菌材，菌材旁边摆放头朝外的天麻种球，覆盖上一层1-2cm厚的薄土，再盖上一层段木最后覆盖上4-6cm土壤；当年11月份进行采挖。

进一步的改进，将天麻种球与含有天麻内生真菌Ws01的培养基混合后再进行种植的步骤如下所示：

步骤一)天麻内生真菌Ws01的菌丝块接种于斜面试管培养基，温度25℃培养7～15天，得到斜面菌种；

步骤二)天麻种球培育：将段木平铺于窖床底部，覆盖上一层1-2cm厚的薄土，在两端的段木与段木之间摆放含蜜环菌的菌材，菌材周边洒上天麻种子和萌发菌，覆盖上一层1-2cm厚的薄土，上面再盖上一层段木，最后覆盖上4-6cm厚的土壤；6个月后采收时即大量的小球茎统称为天麻种球，期间每隔3天洒水一次；

步骤三)通过固体栽培培养基进行扩大培养：在扁平为17cm、长为33cm、厚度为0.05mm的耐高温聚乙烯菌种袋中装入固体栽培培养基500g，在高温高压121℃下灭菌2h，待自然冷却至室温，将斜面菌种的菌丝块接种到固体栽培培养基中，在温度22～28℃下，培养20天，得到含有天麻内生真菌Ws01的固体栽培培养基，备用；

步骤四)天麻种球的包埋：将含有天麻内生真菌Ws01的固体栽培培养基粉碎，包裹在天麻种球表面，在湿度为80-88％，温度为22-25℃下，孵育24h，得到孵育后的天麻种球备用；

步骤五)于3或4月份将段木平铺于窖床底部，覆盖上一层1-2cm厚的薄土，在两端的段木与段木之间摆放含蜜环菌的菌材，菌材旁边摆放孵育后的天麻种球,孵育后的天麻种球头部朝外，覆盖上一层1-2cm厚的薄土，上面再盖上一层段木，最后覆盖上4-6cm厚的土壤，当年11月份进行采挖。

进一步的改进，所述斜面试管培养基为PDA固体培养基，1000ml的PDA固体培养基中含马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g，然后加水至1000ml；所述固体栽培培养基的原料和重量为：松木屑77％，麸皮20％，玉米粉1％，蔗糖1％，石膏粉0.5％，过磷酸钙0.3％，硫酸镁0.2％，含水量为固体料的3倍。

进一步的改进，所述段木的长为30cm，宽为7-8cm；所述萌发菌为紫萁小菇或石斛小菇或开唇小菇。

本发明的优点：

本发明方法的天麻中天麻素含量可达0.451％，其含量明显高于不含天麻内生真菌Ws01的天麻中天麻素的含量(0.292％)，因此利用本发明方法可以有效提高天麻中天麻素含量。

附图说明：

图1天麻内生真菌Ws01菌株GDMCC No.61055图，其中A为PDA平板上生长5天的Ws01菌株菌落；B为种子液中的Ws01菌株菌丝球；C为Ws01菌株在固体栽培培养基中形成菌索；D为Ws01菌株在固体栽培培养基中形成子实体。

图2实施例2的天麻素标准品高效液相色谱图；其中1号峰为天麻素标准品，2号峰为对羟基苯甲醇标准品。

图3实施例2种植得到的商品麻的高效液相色谱图；其中1号峰为天麻素。

图4为天麻内生真菌菌株Ws01基于ITS基因序列构建的系统发育树。

具体实施方式

发明方法流程为：采用我们从天麻中分离的内生真菌Ws01菌株→

活化到斜面试管→通过液体摇瓶进行扩大培养，得到种子液→将天麻种子浸泡在种子液中→浸泡过的天麻种子、萌发菌(紫萁小菇)、含蜜环菌菌材及段木置于室内窖床中，栽培→6个月后采收时即可形成大量的小球茎(称为白麻或米麻，统称为种球)→商品麻种植→测定天麻中的天麻素。

实施例1

天麻内生真菌Ws01菌株的分离与鉴定

以2017年11月从湖南省绥宁县神坡山的获得天麻球茎，进行表面消毒：流水冲洗新鲜天麻球茎，然后用75％乙醇浸泡洗净的球茎3-5min，无菌水漂洗次，次氯酸钠(有效氯1.5％)浸泡1-2min，无菌水洗3次，无菌吸水纸吸干表面备用。无菌条件下，从表面消毒好的天麻球茎中心部位取约为绿豆大小的组织到PDA固体培养基上，在温度22～28℃，静置培养15天，获得一种天麻内生真菌，即本发明所使用的天麻内生真菌Ws01菌株。

本发明所述天麻内生真菌Ws01经分子生物学技术鉴定，包括进行ITS-PCR扩增和测序，将获得的ITS序列(如SEQ NO.1所示)与Genbank中所登录的序列比对。用邻位加入法(neighbor-joining，NJ)构建Ws01菌株与原毛平革菌科(Phanerochaetaceae)系统发育树，系统进化树的测试方法为Bootstrap method，重复次数为1000，模型为Kimura2-parameter，其他参数为默认设置。得到的系统发育树如图4，进化分析显示Ws01菌株与似射脉菌属(Phlebiopsis)的真菌处于同一类群；与Phlebiopsis pilatii 5048(H)、Phlebiopsis pilatii He 5165、Phlebiopsis pilatii He 5114和Phlebiopsis pilatiiDai17041处于同一分枝。

该内生真菌Ws01为原毛平革菌科真菌，菌丝无锁状联合，纤细有分枝，具有明显的隔膜。该菌在马铃薯葡萄糖琼脂平板上的生长状态为：5-7天菌丝铺满直径为75mm的平板，具有特有甜药香味的芳香味。菌丝白色，爬壁能力强，呈放射状，培养温度28℃以上易形成菌索。

综合菌落、菌体形态和序列分析等结果，将该内生真菌Ws01初步鉴定为似射脉菌Phlebiopsis sp.命名为Ws01。

实施例2

天麻内生真菌Ws01在提高天麻中天麻素含量的应用

1.选用我们从天麻中分离的内生真菌Ws01菌株，其分类命名为似射脉菌(Phlebiopsis sp.)Ws01，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2020年6月11日，保藏号：GDMCC No.61055

2.斜面试管菌种活化培养。将天麻内生真菌似射脉菌(Phlebiopsis sp.)菌株Ws01，菌丝块接种于斜面试管培养基，温度25℃培养7～15d，得到斜面菌种；

斜面试管培养基为PDA固体培养基，1000ml的PDA固体培养基中含马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g，加水至1000ml，自然pH。

3.通过液体摇瓶进行扩大培养，得到种子液。在250ml锥形瓶中装入50ml液体摇瓶种子培养基，在高温高压下121℃灭菌20min，待自然冷却至室温，将斜面天麻内生真菌Ws01菌丝块接种到液体摇瓶种子培养基中，在温度22～28℃、转速100～180r/min下振荡培养4～8天，得到液体摇瓶种子液。

液体摇瓶种子培养基的原料和重量为：马铃薯200g，葡萄糖20g，维生素B片2片，水1000mL，pH 6.5；所述复合维生素B片，每片中含有维生素B1 3mg，维生素B2 1.5mg，维生素B6 0.2mg，烟酰胺10mg和泛酸钙1mg。

4.将天麻种子浸泡在上述种子液中。将0.1g天麻种子倒入上述已经培养好的入50ml液体种子液中，转速100～120r/min，浸泡12h.

5.天麻种球培育：将段木(一般30cm长，7-8cm宽)平铺于窖床底部(相邻两根段木间间隔两个手指头宽，树皮面朝上)，覆盖上一层1-2cm厚的薄土，在两端的段木与段木之间摆放含蜜环菌的菌材，菌材周边洒上种子液浸泡过的天麻种子和萌发菌，覆盖上一层1-2cm厚的薄土，上面再盖上一层段木(该段木可以适当小些)，最后覆盖上土壤(土壤厚度约4-6cm)。6个月后采收时即可形成大量的小球茎(称为白麻或米麻，统称为种球)，期间每隔3天洒水一次；

6.商品麻种植：将段木(一般30cm长，7-8cm宽)平铺于窖床底部(相邻两根段木间间隔两个手指头宽，树皮面朝上)，覆盖上一层1-2cm厚的薄土，在两端的段木与段木之间摆放含蜜环菌的菌材，菌材旁边摆放天麻种球(头朝外)，覆盖上一层1-2cm厚的薄土，上面再盖上一层段木(该段木可以适当小些)，最后覆盖上土壤(土壤厚度约4-6cm)。3、4月份种植的天麻，当年11月份可采挖。

7.真菌Ws01菌株的分离。对新鲜商品麻球茎进行表面消毒，再从球茎内部取组织，接入PDA斜面培养基，获得的菌丝经纯化后，通过分子生物学技术鉴定，包括进行ITS-PCR扩增和测序，测序后的ITS区的扩增序列与GenBank相关序列进行比对及同源性分析。获得的序列与Ws01菌株的ITS序列比对，与Phlebiopsis sp.Ws01相似性为100％。

8.测定天麻素含量。将新鲜天麻样品100℃蒸煮30min，40℃干燥至恒重后研磨成粉末后，精密称取粉碎天麻样品2.5g，至具塞锥形瓶中，加入25mL乙腈-0.1％磷酸溶液，称定质量。浸泡12h，40℃超声(200W、40kHz)30min，冷却至室温，用乙腈-0.1％磷酸溶液补足减失的质量，取上清液1.0mL至10mL容量瓶中，加流动相溶液定容，用0.45μm微孔有机滤膜滤过，取滤液，上清液即为待测样品溶液。

采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，色谱条件：Diamonsil C18柱色谱柱(规格为250mm×4.6mm，5μm)；流动相乙腈-0.1％磷酸溶液(4：96，v/v)，流速为1.0mL/min，检测波长为220nm，柱温为30℃。天麻素标准品和对羟基苯甲醇标准品的保留时间分别为8.7min和17.8min，典型色谱图见图2。种植的商品麻的液相色谱图见图3。

检测结果：种植的商品麻中可分离到Ws01菌株，天麻中天麻素含量可达0.451％。

实施例3：与实施例2中的步骤3-6略有不同，其余相同。具体为：

1.选用我们从天麻中分离的内生真菌Ws01菌株，其分类命名为似射脉菌(Phlebiopsis sp.)Ws01，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2020年6月11日，保藏号：GDMCC No.61055

2.斜面试管菌种活化培养。将天麻内生真菌似射脉菌(Phlebiopsis sp.)菌株Ws01，菌丝块接种于斜面试管培养基，温度25℃培养7～15天，得到斜面菌种；

斜面试管培养基为PDA固体培养基，1000ml的PDA固体培养基中含马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g，加水至1000ml，自然pH。

3.天麻种球培育：将段木(一般30cm长，7-8cm宽)平铺于窖床底部(相邻两根段木间间隔两个手指头宽，树皮面朝上)，覆盖上一层1-2cm厚的薄土，在两端的段木与段木之间摆放含蜜环菌的菌材，菌材周边洒上天麻种子和萌发菌，覆盖上一层1-2cm厚的薄土，上面再盖上一层段木(该段木可以适当小些)，最后覆盖上土壤(土壤厚度约4-6cm)。6个月后采收时即可形成大量的小球茎(称为白麻或米麻，统称为种球)，期间每隔3天洒水一次；

4.通过固体栽培培养基进行扩大培养。在扁平为17cm、长为33cm、厚度为0.05mm的耐高温聚乙烯菌种袋中装入固体栽培培养基500g，在高温高压121℃下灭菌2h，待自然冷却至室温，将斜面天麻内生真菌Ws01菌丝块接种到固体栽培培养基中，在温度22～28℃下，培养20天，得到Ws01菌的固体栽培菌种，备用。

固体栽培培养基的原料和重量为：松木屑77％，麸皮20％，玉米粉1％，蔗糖1％，石膏粉0.5％，过磷酸钙0.3％，硫酸镁0.2％，含水量为固体料的3倍，pH值自然。

5.天麻种球的包埋。用上述4中的含Ws01菌株的固体栽培培养基捏碎，包裹在将上述3中的天麻种球表面，在湿度为80-88％，温度为22-25℃下，孵育24h，备用。

6.商品麻种植：将段木(一般30cm长，7-8cm宽)平铺于窖床底部(相邻两根段木间间隔两个手指头宽，树皮面朝上)，覆盖上一层1-2cm厚的薄土，在两端的段木与段木之间摆放含蜜环菌的菌材，菌材旁边摆放上述5中已裹上Ws01菌株的天麻种球(头朝外)，覆盖上一层1-2cm厚的薄土，上面再盖上一层段木(该段木可以适当小些)，最后覆盖上土壤(土壤厚度约4-6cm)。

7.真菌Ws01菌株的分离。对新鲜商品麻球茎进行表面消毒，再从球茎内部取组织，接入PDA斜面培养基，获得的菌丝经纯化后，通过分子生物学技术鉴定，包括进行ITS-PCR扩增和测序，测序后的ITS区的扩增序列与GenBank相关序列进行比对及同源性分析。获得的序列与Ws01菌株的ITS序列比对，与Phlebiopsis sp.Ws01相似性为100％。

8.测定天麻素含量。将新鲜天麻样品100℃蒸煮30min，40℃干燥至恒重后研磨成粉末后，精密称取粉碎天麻样品2.5g，至具塞锥形瓶中，加入25mL乙腈-0.1％磷酸溶液，称定质量。浸泡12h，40℃超声(200W、40kHz)30min，冷却至室温，用乙腈-0.1％磷酸溶液补足减失的质量，取上清液1.0mL至10mL容量瓶中，加流动相溶液定容，用0.45μm微孔有机滤膜滤过，取滤液，上清液即为待测样品溶液。

采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，色谱条件：Diamonsil C18柱色谱柱(规格为250mm×4.6mm，5μm)；流动相乙腈-0.1％磷酸溶液(4：96，v/v)，流速为1.0mL/min，检测波长为220nm，柱温为30℃。

检测结果：种植的商品麻中可分离到Ws01菌株，天麻中天麻素含量可达0.390％。

对比例1：在与实施例2其余步骤相同的基础上，天麻种子不用含Ws01菌株的种子液浸泡，而使用无菌新鲜液体种子培养基浸泡。种植的商品麻中分离不出Ws01菌株，天麻中天麻素的含量为0.292％。

对比例2：在与实施例3其余步骤相同的基础上，天麻种球不用含Ws01菌株的固体栽培培养基包埋，而使用无菌的固体栽培培养基包埋。种植的商品麻中分离不出Ws01菌株，天麻中天麻素的含量为0.304％。

从根源上提高了天麻中天麻素的含量。本发明方法的天麻中天麻素含量可达0.451％，其含量明显高于不含天麻内生真菌Ws01菌株的天麻中天麻素的含量0.292％。

天麻内生真菌Ws01专利菌株ITS序列含649bp，具体如SEQ ID NO.1所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 怀化学院

<120> 天麻内生真菌Ws01及其在提高天麻中天麻素含量上的应用

<130> 2020.8.17

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 649

<212> DNA

<213> Phlebiopsis sp.

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta tcgagttttg aaacaggttg tagctggctt 60

caaacgaagc atgtgcacgc ctggctcatc cactccttca acctctgtgc acttattgta 120

gatcggtgta aaggttagtt tggttaacaa actagctgta aagcctttct acgttttact 180

acaaacgctt cagttataga atgtattatc gcgtataacg catctttata caactttcag 240

caacggatct cttggctctc gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg 300

aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac cttgcgctct ctggtattcc 360

ggagagcatg cctgtttgag tgtcatggaa ttctcaacct tcaatacttt tttgtattga 420

aaggcttgga cttggaggct ttgtgctggc tgctcgttca gtcggctcct ctgaaatgca 480

ttagcgtgaa ttactacgga tcgcttcagc gtgataatta tctgcgctgt ggtcgtgaag 540

tgttaataag tttgcgcttc taatcgtcct tcattggaca attaacaacc ctgacttctg 600

acctcaaatc aggtaggact acccgctgaa cttaagcata tcaaaaagg 649

Claims (10)

1.一种天麻内生真菌Ws01，其特征在于，天麻内生真菌Ws01的分类学命名为似射脉菌Ws01，保藏号为GDMCC No.61055。

2.一种天麻内生真菌Ws01的应用，其特征在于，所述天麻内生真菌Ws01用于提高天麻中天麻素的含量；天麻内生真菌Ws01的保藏号为GDMCC No.61055。

3.如权利要求2所述的天麻内生真菌Ws01的应用，其特征在于，将天麻种子或天麻种球与含有天麻内生真菌Ws01的培养基混合后再进行种植。

4.如权利要求3所述的天麻内生真菌Ws01的应用，其特征在于，将天麻种子与含有天麻内生真菌Ws01的培养基混合后再进行种植的步骤如下所示：

步骤一、将天麻内生真菌Ws01接种到液体培养基中培养形成种子液；

步骤二、将天麻种子在种子液中浸泡，得到种子液浸泡过的天麻种子或；

步骤三、以种子液浸泡过的天麻种子作为天麻种子进行天麻种植。

5.如权利要求4所述的天麻内生真菌Ws01的应用，其特征在于，所述步骤一包括如下步骤：

a.将天麻内生真菌Ws01的菌丝块接种于斜面试管培养基，温度25℃培养7～15天，得到斜面菌种；斜面试管培养基为PDA固体培养基，每1000ml的PDA固体培养基中包括马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g，并加水至1000ml；

b.液体培养基对斜面菌种进行扩大培养，得到种子液：在250ml锥形瓶中装入50ml液体培养基，灭菌，然后将斜面菌种接种到液体摇瓶种子培养基中，在温度22～28℃、转速100～180r/min下振荡培养4～8天，得到种子液；液体培养基的每1000mL水中含有马铃薯200g，葡萄糖20g，复合维生素B片2片，pH为6.5；所述复合维生素B片，每片中含有维生素B1 3mg，维生素B2 1.5mg，维生素B6 0.2mg，烟酰胺10mg和泛酸钙1mg。

6.如权利要求4所述的天麻内生真菌Ws01的应用，其特征在于，所述步骤二中，每0.1g天麻种子倒入50ml种子液中，转速100～120r/min，浸泡12h。

7.如权利要求4所述的天麻内生真菌Ws01的应用，其特征在于，所述天麻种植括如下步骤：

a.天麻种球培育时：将段木平铺于窖床底部，相邻段木之间形成间隙，且段木树皮面朝上，然后覆盖上一层1-2cm厚的薄土，在两端的段木与段木之间摆放含蜜环菌的菌材，菌材周边洒上种子液浸泡过的天麻种子和萌发菌，然后覆盖上一层1-2cm厚薄土，然后再盖上一层段木，最后覆盖上4-6cm厚的土壤；6个月后采收时形成的天麻种球，期间每隔3天洒水一次；

b.商品麻种植时：于3或4月份将段木铺于窖床底部，相邻段木之间形成间隙，且段木树皮面朝上，覆盖上一层1-2cm厚的薄土，在两端的段木与段木之间摆放含蜜环菌的菌材，菌材旁边摆放头朝外的天麻种球，覆盖上一层1-2cm厚的薄土，再盖上一层段木最后覆盖上4-6cm土壤；当年11月份进行采挖。

8.如权利要求3所述的天麻内生真菌Ws01的应用，其特征在于，将天麻种球与含有天麻内生真菌Ws01的培养基混合后再进行种植的步骤如下所示：

步骤一)天麻内生真菌Ws01的菌丝块接种于斜面试管培养基，温度25℃培养7～15天，得到斜面菌种；

步骤二)天麻种球培育：将段木平铺于窖床底部，覆盖上一层1-2cm厚的薄土，在两端的段木与段木之间摆放含蜜环菌的菌材，菌材周边洒上天麻种子和萌发菌，覆盖上一层1-2cm厚的薄土，上面再盖上一层段木，最后覆盖上4-6cm厚的土壤；6个月后采收时即大量的小球茎统称为天麻种球，期间每隔3天洒水一次；

步骤三)通过固体栽培培养基进行扩大培养：在扁平为17cm、长为33cm、厚度为0.05mm的耐高温聚乙烯菌种袋中装入固体栽培培养基500g，在高温高压121℃下灭菌2h，待自然冷却至室温，将斜面菌种的菌丝块接种到固体栽培培养基中，在温度22～28℃下，培养20天，得到含有天麻内生真菌Ws01的固体栽培培养基，备用；

步骤四)天麻种球的包埋：将含有天麻内生真菌Ws01的固体栽培培养基粉碎，包裹在天麻种球表面，在湿度为80-88％，温度为22-25℃下，孵育24h，得到孵育后的天麻种球备用；

步骤五)于3或4月份将段木平铺于窖床底部，覆盖上一层1-2cm厚的薄土，在两端的段木与段木之间摆放含蜜环菌的菌材，菌材旁边摆放孵育后的天麻种球,孵育后的天麻种球头部朝外，覆盖上一层1-2cm厚的薄土，上面再盖上一层段木，最后覆盖上4-6cm厚的土壤，当年11月份进行采挖。

9.如权利要求8所述的天麻内生真菌Ws01的应用，其特征在于，所述斜面试管培养基为PDA固体培养基，1000ml的PDA固体培养基中含马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g，然后加水至1000ml；

所述固体栽培培养基的原料和重量为：松木屑77％，麸皮20％，玉米粉1％，蔗糖1％，石膏粉0.5％，过磷酸钙0.3％，硫酸镁0.2％，含水量为固体料的3倍。

10.如权利要求7或8所述的天麻内生真菌Ws01的应用，其特征在于，所述段木的长为30cm，宽为7-8cm；所述萌发菌为紫萁小菇或石斛小菇或开唇小菇。

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