TWI805161B - 纖維素分解菌劑、短小芽孢桿菌之醱酵產物及製備方法、以及促進沼氣產量之方法 - Google Patents

Abstract

本揭露提供一種纖維素分解菌劑，其包含短小芽孢桿菌（ Bacillus pumilus）。

Description

纖維素分解菌劑、短小芽孢桿菌之醱酵產物及製備方法、以及促進沼氣產量之方法

本揭露係關於一種纖維素分解菌劑及短小芽孢桿菌（ Bacillus pumilus）之醱酵產物及其製備方法。本揭露又提供一種促進沼氣產量之方法。

生質能發電是近年來綠能發電的趨勢，生質能發電燃料主要為有機廢棄物及沼氣。沼氣能夠經由將有機廢棄物進行厭氧醱酵而產生，其組成含有大量甲烷，是具有多功能的再生能源產物。將沼氣經過純化後，除了可直接燃燒作為烹飪、加熱的熱源之外，亦可用於發電等用途。並且，藉由將有機廢棄物加工產生沼氣，也能減少廢棄物在廢棄過程的溫室氣體排放量。

上述有機廢棄物中，可透過微生物將其中的有機物質分解以產生沼氣，而有機物質中又以纖維素為常使用的料源之一。在以有機物質中的纖維素作為料源進行沼氣生產時，料源需進行預處理，以破壞分解料源中的纖維素，使微生物更容易將其轉化為沼氣。預處理方法可分為物理法、化學法、生物法。物理法包括粉碎、擠壓、蒸氣爆破、熱水蒸煮、微波等。然而，物理法的能量需求較高，設備的維護成本也較高。化學法包括強酸預處理、鹼處理等，然而，強酸強鹼可預期將造成環境問題，需要後續處理化學廢液，且即便經過化學反應之後仍會產生不利於沼氣生產的抑制物。生物法包括纖維素分解菌劑，不需要額外的能量需求，亦不會產生化學廢液，是符合綠能環保的方式。

然而，纖維素分解速度慢、產氣啟動時間長，是目前以纖維素為料源的沼氣的厭氧醱酵製程中最大的問題。

因此，發展一種符合綠能環保之纖維素分解菌劑，仍為當前重要的課題。

本揭露提供一種纖維素分解菌劑，其包含短小芽孢桿菌（ Bacillus pumilus）。

本揭露還提供一種短小芽孢桿菌之醱酵產物，其中醱酵產物的形成方法包括：將至少一種短小芽孢桿菌以培養基進行醱酵培養，以形成醱酵液，其中培養基成分包括：氯化鈉、胰化蛋白、及酵母萃取物。

本揭露另提供一種短小芽孢桿菌之醱酵產物之製備方法，包括：將至少一種短小芽孢桿菌以培養基進行醱酵培養，以形成醱酵液，其中培養基成分包括：氯化鈉、胰化蛋白、及酵母萃取物。

本揭露又提供一種促進沼氣產量之方法，包括下列步驟：提供含纖維素之料源，接種步驟，將前述之纖維素分解菌劑或前述之醱酵產物接種至上述料源以獲得混合物，及厭氧醱酵步驟，將混合物於厭氧環境下進行醱酵。

本揭露再提供一種新穎之短小芽孢桿菌（ Bacillus pumilus），其為在2021年12月6日寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心之短小芽孢桿菌，其寄存編號為BCRC 911086。

為了讓本揭露之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖示，其詳細說明如下：

本揭露可藉由下述實施方式中所揭露的各種實施態樣、實施例及相關敘述所瞭解。

在本揭露中，表示範圍之「X~Y」是指「X以上、Y以下」，並且，不同範圍之上限與上限之間、以及下限與下限之間可分別組合，例如10~50、20~40，亦可組合為20~50。

另外，除非另有說明，於本揭露說明書或請求項中使用之單數格式「一」、「一種」及「該」亦包含複數表示。

以下就本揭露之短小芽孢桿菌及其應用予以詳細說明。

一般而言，沼氣生產過程包括提供有機物質料源以及將料源進行厭氧醱酵。厭氧醱酵步驟中，來自環境中的厭氧菌（厭氧微生物），分解消化有機物質產生沼氣。當有機物質料源富含植物纖維時，由於植物纖維的主要成分包含纖維素（cellulose）、木質素（lignins）以及半纖維素（hemicellulose），皆為高分子量物質，因此提升植物纖維，特別是纖維素的分解率，是提升沼氣產量與速度的關鍵。

鑒於上述課題，於本揭露中篩選出具有纖維素分解酵素活性之菌株，並進一步進行馴化改質，作為纖維素分解菌株，解決提升料源中的纖維素的分解率，並且提升沼氣產量與速度之問題。

在本揭露一第一實施態樣中，本揭露提供一種纖維素分解菌劑。纖維素分解菌劑中，短小芽孢桿菌的含量可為1x10 ⁶~9x10 ⁹cell/g-Ts，例如為約1x10 ⁷~5x10 ⁹cell/g-Ts、5x10 ⁷~3x10 ⁹cell/g-Ts或1x10 ⁸~5x10 ⁹cell/g-Ts，但本揭露不限於此 。

微生物分解菌劑中所包含的短小芽孢桿菌具有分解纖維素的酵素活性，因此能夠促進料源中纖維素的分解，提升沼氣產量、加快產氣速度。

在一特定實施例中，上述短小芽孢桿菌為2021年12月6日寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心（Bioresource Collection and Research Center; BCRC），寄存編號為BCRC 911086。

在另一實施例中，短小芽孢桿菌之16S rDNA序列與序列辨識號:1所示之序列相同或具有99%之序列相似性。在又一實施例中，短小芽孢桿菌之gyrB基因序列與序列辨識號:2所示之序列相同或具有99%之序列相似性。

微生物分解菌劑可為乾燥的菌株，乾燥菌株可為粉狀或塊狀。微生物分解菌劑亦可為菌株懸浮液。懸浮用的溶液可為水、生理食鹽水、或培養基，但不限於此，懸浮溶液的種類及含量可依照需求選擇。

在本揭露一第二實施態樣中，本揭露提供一種短小芽孢桿菌（ Bacillus pumilus）之醱酵產物。本揭露之短小芽孢桿菌之醱酵產物具有促進纖維素的分解的功效，可提升沼氣產量、加快產氣速度，但不限定於此。

醱酵產物的形成方法包括但不限於：將至少一種短小芽孢桿菌以培養基進行醱酵培養，形成醱酵液，獲得所述短小芽孢桿菌之醱酵產物。

上述培養基成分包括：氯化鈉、胰化蛋白（Tryptone）、及酵母萃取物（Yeast extract），但不限於此。

氯化鈉的含量可為約1~15 g/L，例如可為1~10 g/L、2~8 g/L、3~7 g/L，但不限於此。在一特定實施例中，氯化鈉的含量可為5 g/L。

胰化蛋白的含量可為約2.5~40 g/L，例如可為3~30 g/L、5~20 g/L、6~14 g/L、8~12 g/L，但不限於此。在一特定實施例中，胰化蛋白的含量可為10 g/L。

酵母萃取物的含量可為約1.25~20 g/L，例如可為2~15 g/L、3~10 g/L、4~8 g/L，但不限於此。在一特定實施例中，酵母萃取物的含量可為5 g/L。

上述培養基亦可依照需求添加額外的添加劑，例如葡萄糖、糖蜜、豆類萃取物、動物蛋白萃取物、或甘油。

短小芽孢桿菌為好氧或兼性厭氧，因此可在好氧環境下培養，並且在沼氣生產的厭氧醱酵步驟中，仍可生存與發揮作用。

上述醱酵培養的溫度並無特別限制，只要適合短小芽孢桿菌生長即可，例如可為25~41°C、28~40°C、30~38°C，但不限於此。在一實施例中，醱酵培養的溫度可為37°C。

上述醱酵培養的方式也無特別限制，可為批次培養或連續培養。醱酵培養亦可由培養槽進行。

上述醱酵培養的培養槽的轉速可為100~200 rpm，例如可為110~190 rpm或120~180 rpm，但不限於此，在一實施例中，醱酵培養的培養槽的轉速可為150 rpm。

上述醱酵培養的培養時間可為約12~72小時，例如可為約15~65小時、20~50小時、20~36小時等，但不限於此，在一實施例中，醱酵培養的培養時間可為24小時。

在另一實施例中，形成前述短小芽孢桿菌之醱酵產物之後，更包括將醱酵液進行固液分離，獲得醱酵上清液。固液分離可使用離心法或過濾法。離心法可使用市售之離心機。

在又一實施例中，更包括將醱酵上清液進行濃縮或乾燥。例如，可使用液體濃縮法、冷凍乾燥法。

用於形成本揭露之短小芽孢桿菌之醱酵產物之實施例中所採用的至少一種短小芽孢桿菌的例子可包括，在2021年12月6日寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 911086。

在本揭露一第三實施態樣中，本揭露提供一種促進沼氣產量之方法，包括下列步驟：提供含纖維素之料源；接種步驟，將本揭露之纖維素分解菌劑或醱酵產物接種至含纖維素料源獲得混合物；及厭氧醱酵步驟，將混合物進行醱酵。

本揭露之纖維素分解菌劑及醱酵產物，具有纖維素分解能力，加速料源中的纖維素的分解。因此可促進後續厭氧醱酵的效率，提升沼氣產量、加快產氣速度。再者，增加料源的利用率，亦可減少生質廢棄物。

本揭露之纖維素分解菌劑以單株菌即可達到加速纖維素分解、促進沼氣生產的效果，因此，相較於混菌系統無微生物族群競合問題。

本揭露之纖維素分解菌劑及醱酵產物能夠以纖維素作為料源，將纖維素分解。含纖維素之料源包括農業廢棄物、肥料及/或食品廢棄物。農業廢棄物包括但不限於，小麥稻桿、大麥稻稈、稻稈、稻草、向日葵稻稈、玉米桿等採收農作物之後的剩餘的莖；廢棄的菇培養基質（廢菇包）；柳杉、柳樹、雲杉、樹皮、廢木材等木材類；豆渣、茶渣、甘蔗渣、椰子纖維、油菜籽等加工後的殘餘物；蘆葦、芒草、雜草、蕨類、海藻等，以及木質纖維素、玉米青貯飼料、乾草、燕麥、三葉草等。在一些實施例中，農業廢棄物為豆渣、茶渣。

食品廢棄物包含生廚餘、或是食品加工後的剩餘物等，可列舉例如香蕉皮、花椰菜葉、玉米、甜菜葉、葡萄渣、麥草、馬鈴薯、柑橘類廢棄物、高麗菜。在一實施例中，食品廢棄物為高麗菜。

肥料包含動物糞便，例如草食動物的糞便。動物糞便可列舉例如牛糞、羊糞、豬糞、家禽糞便或其他動物糞便。在一實施例中，纖維素來源為牛糞，新鮮牛糞（未經過乾燥）中的纖維素含量為90%以上，能夠作為纖維素料源。

進行接種處理前，纖維素料源亦可先以物理法或化學法進行料源預處理。物理法包括但不限於粉碎、擠壓、蒸氣爆破、熱水蒸煮、微波等。化學法包括但不限於強酸處理、強鹼處理。

以分解菌劑進行接種處理時，接種的菌量可為10 ⁷~10 ¹¹cell/g-Ts（亦即、每克固形物料源重量接種10 ⁷~10 ¹¹菌數量），例如約10 ⁸~5x10 ¹⁰cell/g-Ts或5x10 ⁸~10 ¹⁰cell/g-Ts，但不限於此。在一實施例中，接種的菌量可為10 ⁹cell/g-Ts。其中，Ts是指總固體含量（Total Solid）。

以醱酵產物進行接種處理時，能夠以分光光度計測定菌液的OD ₆₀₀之吸光值，換算為每毫升含有的菌數量。醱酵產物的用量可為10 ⁷~10 ¹¹cell/g-Ts，例如約10 ⁸~5x10 ¹⁰cell/g-Ts或5x10 ⁸~10 ¹⁰cell/g-Ts，但不限於此。在一實施例中，醱酵產物的用量可為10 ⁹cell/g-Ts。

將本揭露之纖維素分解菌劑或醱酵產物接種至纖維素料源，形成混合物之後，進行厭氧醱酵步驟。厭氧醱酵步驟中，來自環境中的厭氧菌（厭氧微生物），分解料源，產生沼氣。

厭氧醱酵步驟可在厭氧環境下進行。由於本揭露之纖維素分解菌劑及醱酵產物能夠直接應用於沼氣生產的厭氧醱酵產氣步驟，因此可在不需額外變更反應器的硬體設施，以及減少變更厭氧醱酵的條件的情況下，達到促進沼氣生產的效果，以及降低成本。

進行厭氧醱酵步驟之前、或之後，亦可進一步包含以好氧環境培育的步驟。當在厭氧醱酵步驟之前進行好氧培育時，本揭露之纖維素分解菌劑及/或醱酵產物能夠先與纖維素料源中的纖維素作用，之後再變更為厭氧環境進行時，則可加速後續厭氧醱酵產氣的過程。

在沼氣生產過程中，系統（醱酵裝置）中的氧氣於醱酵2~3天之後，逐漸被料源中存在的自然環境中的好氧菌消耗，而達到厭氧環境。在實驗室進行沼氣生產實驗時，能夠以填充氮氣的方式達到厭氧環境。在一實施例中，厭氧環境，例如在氮氣環境下。在另一實施例中，厭氧醱酵步驟亦可於密封的發酵裝置中進行，例如BMP瓶。在又一實施例中，厭氧醱酵步驟於沼氣生產製程的發酵裝置中進行。好氧環境，例如大氣環境。

厭氧醱酵步驟的溫度可為10~65°C，例如可為25~60°C。在一實施例中，厭氧醱酵步驟的溫度可為55°C。

厭氧醱酵時間則無限定，可依照實際需求設定合適的時間。例如為1~60天、7~50天、14~40天。在一實施例中，厭氧醱酵時間可為25天。

厭氧醱酵可為批次式，亦可為連續式。如採取連續式厭氧醱酵，可在厭氧醱酵步驟中，經過一定時間後，視實際需求添加新的纖維素料源與新的本揭露之纖維素分解菌劑及/或醱酵產物。

此外，於厭氧醱酵步驟中，亦可額外添加甲烷菌群以加速沼氣的生產。自然環境料源中即存在少量甲烷菌群，常見的甲烷菌包括巴氏甲烷八疊球菌( Methanosarcina barkeri)或甲酸甲烷桿菌( Methanobacterium formicium)，惟，多數的甲烷菌群雖能分解料源產生甲烷，卻需要比較多個醱酵代次後，甲烷產量才會逐漸提升。例如，活性污泥中的微生物成分（甲烷菌群）可以有機物質作為基質進行厭氧醱酵以產生沼氣，或可添加事先進行醱酵的料源，其中含有經過多個醱酵代次的甲烷菌群。所獲得的沼氣經過純化之後，可做為一般燃料或使用於發電。

在本揭露一第四實施態樣中，本揭露提供一種新穎之短小芽孢桿菌（ Bacillus pumilus），其為在2021年12月6日寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心之短小芽孢桿菌，其寄存編號為BCRC 911086。

為了讓本揭露之上述和其他的目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉數個實施例，用以說明本揭露所述之纖維素分解菌劑及短小芽孢桿菌之醱酵產物以及促進沼氣產量之方法。但本揭露之權利範圍不受限於下述實施例。發明所屬技術領域具有通常知識者，在不違背本揭露之精神或範疇的情況下對本文所討論之實施例進行的修改及變化，仍屬於本揭露之範圍。

[實施例]

[實施例1]

菌株之篩選

纖維素分解試驗

以羧甲基纖維素（Carboxymethyl Cellulose，以下簡稱CMC）培養基，搭配剛果紅（congo red）染劑，進行菌株篩選。由於剛果紅可與纖維素產生紅色的複合物，若纖維素被分解，則分解後產物不會與剛果紅產生紅色複合物。因此，在以剛果紅染色之後，具有纖維素分解能力菌株，菌落外圍出現透明環。

首先，調配CMC液態培養基，其組成為去離子水中含有1 g/L酵母萃取物、1 g/L NH ₄H ₂PO ₄、1 g/L MgSO ₄．7H ₂O、0.2 g/L KCl、及26 g/L 羧甲基纖維素，以高溫滅菌釜滅菌90分鐘。

另外製備CMC平板培養基，將未進行高壓滅菌之CMC液態培養基加入3 g/L瓊脂（Agar）之後，以高溫滅菌釜滅菌90分鐘後，待降溫於無菌操作台內倒入培養皿。

以來自新社花市的廢棄蘭花殘枝（含花葉與莖）進行採樣，篩選具有纖維素分解能力的菌株。

取蘭花殘枝以不鏽鋼剪刀剪為不超過3公分的小片段後，將其浸泡於50mL之經過滅菌的去離子水中。將裝有去離子水及蘭花殘枝片段的容器翻覆倒置1分鐘進行混合後，取10µL於CMC平板培養基進行四區畫盤。於37℃環境中培養16小時後，以下述步驟進行剛果紅染色。於培養皿中倒入0.02%剛果紅染劑，輕晃均勻之後，於室溫放置5~10分鐘，之後倒掉剛果紅染劑，此時培養基染色為紅色。倒入0.9% 氯化鈉溶液，輕晃培養皿之後，靜置30分鐘，倒掉0.9% 氯化鈉溶液。重複上述以氯化鈉溶液清洗的退染步驟2~3次，直到可於培養基中觀察到透明環為止。

觀察各個菌落，挑選菌落外圍出現透明環的菌株，接種於CMC液態培養基。培養24小時後，將菌液稀釋百倍至十萬倍，每十倍塗盤於一個平板培養基（稀釋倍數為每個平板培養基長有10~30個菌落），培養48小時後，記錄與冷凍保存。

[實施例2]

經篩選之菌株的馴養改質

由上述菌落外圍出現透明環的菌株中，挑選1株，以馴養培養基進行馴養改質。馴養培養基是在LB Broth（氯化鈉 5 g/L、胰化蛋白（Tryptone） 10 g/L、酵母萃取物 5 g/L，購自Sigma-Aldrich）中額外添加羧甲基纖維素及微晶纖維素（Avicel）。在37℃、震盪轉速150 rpm條件，首先以含1%羧甲基纖維素及1%微晶纖維素之LB Broth培養基培養三代（generation），每代三天共九天。接著，提升LB Broth中的纖維素濃度為5%羧甲基纖維素及5%微晶纖維素，以同樣條件培養三代共九天。其次，提升LB Broth中的纖維素濃度為10%羧甲基纖維素及10%微晶纖維素，繼續以同樣條件培養三代共九天。獲得經馴養改質的菌株。

使用經馴養改質的菌株，以與實施例1同樣方式進行纖維素分解試驗。改質前的菌株其透明環（半徑）為3 mm（第1圖），而改質後的菌株其透明環（半徑）為7 mm（第2圖）。由上述結果可知，經改質後的菌株，其纖維素分解能力提升。

菌種鑑定

將改質後的菌株進行16S rDNA定序分析。改質後的菌株的16S rDNA為序列辨識號:1（請參照序列表之序列辨識號:1），與已知的芽胞桿菌屬（ Bacillus）幾乎100%相同，可知該改質後的菌株屬於芽胞桿菌屬。接著進一步以gyrB基因鑑定其菌種（Species）。改質後的菌株的gyrB基因片段為序列辨識號:2（請參照序列表之序列辨識號:2），將其與現有已知的短小芽胞桿菌（ Bacillus pumilus）之gyrB基因比對序列相似性，結果如表1。

[表1]經改質菌株與已知的短小芽胞桿菌之gyrB基因差異

已知短小芽孢桿菌菌株（ Bacillus pumilus）	相似性（%）	參考文獻
F3	96.65	Compant,S., Mitter,B., Colli-Mull,J.G., Gangl,H. and Sessitsch,A.（2016）
Ku-bf1	97.78	Ulaganathan,K.（2018）
C4	97.89	Fellahi,S., Chibani,A., Westman,J., Feuk-Lagerstedt,E. and Taherzadeh,M.J.（2016）
GLB197	98.28	Zhang,X. and Wang,Q.（2018）
TUAT1	98.47	Okazaki,S. and Tadashi,Y.（2015）

由表1可知，經改質菌株與目前公開資料庫中的已知的短小芽胞桿菌之gyrB基因，具有1.5~3.4%的差異，本揭露之經改質菌株應為新穎短小芽胞桿菌。將此菌株在2021年12月6日寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 911086。

[實施例3]

驗證BCRC 911086對於牛糞料源之促進產氣效果。

製備短小芽孢桿菌的醱酵產物

在500 mL的錐形瓶中，以350 mL LB培養基（氯化鈉 5 g/L、胰化蛋白 10 g/L、酵母萃取物 5 g/L，購自Sigma-Aldrich），以37℃、震盪轉速150 rpm的條件，在好氧環境下，分別培養對照菌株（高山芽孢桿菌 Bacillus altitudinis，從環境樣品分離篩選獲得）、改質前菌株以及改質後菌株（BCRC 911086）24小時。之後，接種繼代於LB培養基放大培養，歷經共兩代細胞活化後，以分光光度計測定菌液的OD ₆₀₀吸光值，換算為每毫升菌體量，製備短小芽孢桿菌的醱酵產物。

產氣驗證

以相當於5g Ts（固形物重量）之牛糞（纖維素含量90%以上）作為料源。將料源置於250mL的透明玻璃螺旋瓶口容器（簡稱為BMP瓶，BMP為biochemical methane potential之簡稱）中，分別加入前述短小芽孢桿菌的醱酵產物用於纖維素分解，醱酵產物添加量為相當於10 ⁹cell/g-Ts（相當於每克固形物料源添加10 ⁹菌數量）。以不添加菌株的LB培養基作為未添加菌株組。

考量BCRC 911086菌株為好氧或兼性厭氧，封瓶前不以氮氣充填，保留瓶內氧氣供菌株利用。添加相當於5 g Ts經醱酵之牛糞作為甲烷菌群來源之後立刻封蓋。將培養瓶置於旋轉均質培養箱，箱內溫度55℃，均質轉速30 rpm，進行培養。

分別於培養的第0、1、4、6、8、13、19、25天，以氣體採樣針筒採取瓶內沼氣，按針筒刻度量測沼氣產量，將測得數值轉計為mL/g-Ts，量測產氣量後、計算累積產氣量。將數值紀錄於表2，並繪製為第3圖。

[表2]以牛糞為料源時之累積產氣量

天數（天）	未添加菌株（mL/g-Ts）	對照菌株（ Bacillus） （mL/g-Ts）	改質前（mL/g-Ts）	改質後（BCRC 911086） （mL/g-Ts）
0	0	0	0	0
1	5	5.5	6	7
4	14.5	17.5	19.5	21.5
6	17	20.5	24	25.5
8	21.5	23.25	27	28.5
13	25.5	25.75	30.25	31.5
19	26.5	27.9	31.5	33.5
25	27	28.4	31.75	34.25

由表2及第3圖結果可知，添加BCRC 911086組別在第4天時，累積產氣量為21.5 mL/g-Ts；相較於此，未添加菌株的組別在第4天時，累積產氣量為14.5 mL/g-Ts，添加對照菌株的組別在第4天時，累積產氣量為17.5 mL/g-Ts，添加改質前的菌株組別在第4天時，累積產氣量為19.5 mL/g-Ts。由上述可知，相較於未添加、添加對照菌株、以及添加改質前菌株的組別，添加BCRC 911086的組別在第4天時有較多的產氣量，提升產氣速率。

由表2及第3圖結果可知，添加BCRC 911086組別在第25天時，累積產氣量為34.25 mL/g-Ts；相較於此，未添加菌株的組別在第25天時，累積產氣量為27 mL/g-Ts，添加對照菌株的組別在第25天時，累積產氣量為28.4 mL/g-Ts。由上述可知相較於未添加，以及添加對照菌株，添加BCRC 911086的組別分別提升了26.8%、及20.6%的累積產氣量。並且，相較於改質前的菌株，BCRC 911086的組別的累積產氣量亦提升了7.8%。由上述可知，經過改質的BCRC 911086的確具有較高的纖維素分解活性，提升沼氣產量、加快產氣速度（縮短產氣啟動時間）。

[實施例4]

纖維素酵素分析測試（DNS）

纖維素酵素將纖維素轉換為還原醣，而二硝基水楊酸與還原醣進行氧化還原反應後，經過加熱產生棕紅色的3-胺基-5-硝基水楊酸，可利用分光光度計測量在波長550nm之吸收值，在一定範圍內，吸收值與還原醣濃度成正比。因此，能夠利用二硝基水楊酸法（簡稱為DNS法）測定還原醣濃度，測量纖維素酵素的酵素活性。

首先調配DNS試劑。於50 mL蒸餾水中加入酒石酸鉀鈉18.2 g，加熱溶液，並依次加入3,5-二硝基水楊酸0.03g，NaOH2.1 g，苯酚0.5 g，攪拌至溶解。待溶液冷卻後，使用蒸餾水定容至100 mL，貯存於棕色瓶中，室溫保存（藥品皆購自友和貿易股份有限公司）。

製備葡萄糖檢量線

分別調配葡萄糖濃度為0、200、400、600、800、1000、1500、2000、5000 μg/mL之標準液，各取1 mL葡萄糖標準液與1 mL DNS試劑混合均勻後，於100℃水浴中加熱反應10 min，冷卻後於冰盒中降溫，之後加入蒸餾水3 mL，於波長550 nm下測定吸光值，將所有葡萄糖標準液與其吸光度繪製成葡萄糖濃度檢量線。檢量線顯示於第4圖。

纖維素酵素活性分析

在實施例3之產氣驗證的培養的第0、0.2、1、4、6、8天，採取醱酵液作為樣品液進行纖維素酵素活性分析。樣品液製備方法如下：以無菌取樣針筒自醱酵瓶中採取3 mL醱酵液，將經離心取得之醱酵上清液以0.22 μm液體過濾器過濾去除固形物及微生物，避免干擾分析結果。

各取1 mL樣品液與1 mL前述調配的DNS試劑混合均勻後，於100℃水浴中加熱反應10分鐘，冷卻後於冰盒中降溫，之後加入蒸餾水3 mL，於波長550 nm下測定吸光值。將所測得的吸光值，根據前述測得的葡萄糖溶度檢量線，換算為酵素活性（U/mL）。所得到的數值如表3，並繪製成第5圖。

[表3]各菌株之纖維素酵素活性

培養天數（天）	未添加菌株（U/mL）	對照菌株（U/mL）	改質前（U/mL）	改質後（BCRC 911086） （U/mL）
0	21	46	31	37
0.2	36	51	29	206
1	101	181	91	321
4	133.5	341	476	791
6	556	571	616	546
8	276	156	451	256

由表3及第5圖可知，培養5小時（0.2天）後，添加BCRC 911086的醱酵液組別的酵素活性由37 U/mL增加至206 U/mL，相較於此，添加改質前的菌株的醱酵液組別的酵素活性則與0小時無太大差異，由上述可知，添加經過改質的BCRC 911086菌株的醱酵液組別，在短時間（5小時）內，即可快速地提升纖維素分解酵素的活性。在培養第4天時，BCRC 911086的酵素活性為791  U/mL，而改質前的菌株的酵素活性為476 U/mL，證實經過改質的BCRC 911086菌株的纖維素分解酵素的活性大幅提升。此外，BCRC 911086的酵素活性亦高於對照菌株。並且相較於未添加菌劑的組別，添加BCRC 911086的組別在第4天時的酵素活性高達5.9倍。

[實施例5]

驗證BCRC 911086對於茶渣料源之促進產氣效果。

以與實施例3之相同方式，製備對照菌株以及BCRC 911086的短小芽孢桿菌的醱酵產物。以相當於5g Ts（固形物重量）之茶渣（纖維素含量42%）作為料源。將料源置於250 mL的BMP瓶中，分別加入前述短小芽孢桿菌的醱酵產物，菌劑添加量為10 ⁹/g-Ts。並添加相當於5 g Ts經醱酵之牛糞作為甲烷菌群來源。儘速封瓶後，將培養瓶置於旋轉均質培養箱，箱內溫度55 ℃，均質轉速30 rpm，進行培養。

以與實施例3相同方式，收集瓶內沼氣，按針筒刻度量測沼氣產量，將測得數值轉計為mL/g-Ts，並累計每日產氣量後、計算累積產氣量。所得到的數值如表4，並繪製成第6圖。

[表4] 以茶渣為料源時之累積產氣量

天數	對照菌株（mL/g-Ts）	BCRC 911086（mL/g-Ts）
0	0	0
1	34.71	42.31
2	76.06	92.79
3	152.6	151.54
4	172.21	198.94
5	197.21	242.79

由表4及第6圖結果可知，添加BCRC 911086組別在第5天時，累積產氣量為242.79 mL/g-Ts；相較於此，添加對照菌株的組別在第5天時，累積產氣量為197.21 mL/g-Ts。由上述可知，相較於添加對照菌株，添加BCRC 911086的組別的累積產氣量提升了23%。

將前述採樣的沼氣樣品中的10 mL沼氣樣品轉至真空氣體採集管，以氣相色譜法GC（Gas chromatography）分析其甲烷含量（%）。所得到的數值如表5，並繪製成第7圖。

[表5] 以茶渣為料源時之沼氣中的甲烷含量（%）

天數	對照菌株（%）	BCRC 911086（%）
4	44%	59%
5	47%	60%

由表5及第7圖結果可知，添加BCRC 911086組別在第5天時，沼氣中的甲烷含量（比例）為60%；相較於此，添加對照菌株的組別在第5天時，沼氣中的甲烷含量為47%。由上述可知，相較於添加對照菌株，添加BCRC 911086的組別中，沼氣中的整體甲烷含量提升了13個百分點，相當於增加了27.6%。由於沼氣的熱值主要來自甲烷氣體，所以同樣體積的沼氣量中，甲烷比例越高代表沼氣品質與熱值越佳。

[實施例6]

驗證BCRC 911086對於豆渣料源之促進產氣效果。

以與實施例3之相同方式，製備對照菌株以及BCRC 911086的短小芽孢桿菌的醱酵產物。以相當於5 g Ts之豆渣（纖維素含量42%）作為料源。之後以與實施例5相同之方式進行產氣驗證實驗。所得到的數值如表6，並繪製成第8圖。

[表6] 以豆渣為料源時之累積產氣量

天數	對照菌株（mL/g-Ts）	BCRC 911086（mL/g-Ts）
0	0	0
1	31.73	54.33
2	72.31	92.60
3	115.77	128.75
4	131.15	140.96
5	140.48	149.23
6	147.31	155.67
7	150.96	159.62
8	155.19	164.33
11	160.77	168.85

由表6及第8圖結果可知，添加BCRC 911086組別在第2天時，累積產氣量為92.6 mL/g-Ts；相較於此，添加對照菌株的組別在第2天時，累積產氣量為72.31 mL/g-Ts。由上述可知，添加BCRC 911086的組別在第2天時即有較多的產氣量，提升產氣速率。

[實施例7]

驗證BCRC 911086對於高麗菜料源之促進產氣效果。

以與實施例3之相同方式，製備對照菌株以及BCRC 911086的短小芽孢桿菌的醱酵產物。以相當於5 g Ts之高麗菜（纖維素含量11%）作為料源。之後以與實施例5相同之方式進行產氣驗證實驗。所得到的數值如表7，並繪製成第9圖。

[表7] 以高麗菜為料源時之累積產氣量

	累積產氣量ml/g-Ts
天數	對照菌株（mL/g-Ts）	BCRC 911086（mL/g-Ts）
0	0	0
1	250.95	248.85
2	256.55	268.45
3	330.05	354.20
6	379.75	458.5

由表7及第9圖結果可知，添加BCRC 911086組別在第6天時，累積產氣量為458.5 mL/g-Ts；相較於此，添加對照菌株的組別在第6天時，累積產氣量為379.75 mL/g-Ts。由上述可知，相較於添加對照菌株，添加BCRC 911086的組別的累積產氣量提升了20%。

根據上述結果可知，本揭露之新穎短小芽孢桿菌能夠增加沼氣生產的產量，並且加快沼氣生產速度。

再者，本揭露之新穎短小芽孢桿菌能夠達到比對照菌株以及未經過馴化改質之短小芽孢桿菌更優良的促進沼氣生產功效。

無。

第1圖為短小芽孢桿菌改質前之纖維素分解試驗的影像。 第2圖為短小芽孢桿菌改質後（BCRC 911086）之纖維素分解試驗的影像。 第3圖為以牛糞為料源時，分別加入未添加菌株、對照菌株、改質前之短小芽孢桿菌菌株（改質前菌株）、及改質後之短小芽孢桿菌菌株（BCRC 911086）的醱酵產物，經產氣驗證試驗所得之累積產氣量。 第4圖顯示葡萄糖標準液與在波長550 nm之吸光值繪製成葡萄糖濃度檢量線。 第5圖為未添加菌株、對照菌株、改質前、及改質後（BCRC 911086）之DNS酵素活性之圖表。 第6圖為以茶渣為料源時，分別加入對照菌株及改質後之短小芽孢桿菌菌株（BCRC 911086）的醱酵產物，經產氣驗證試驗所得之累積產氣量。 第7圖為以茶渣為料源時，分別加入對照菌株及改質後之短小芽孢桿菌菌株（BCRC 911086）的醱酵產物，經產氣驗證試驗所得之甲烷含量。 第8圖為以豆渣為料源時，分別加入對照菌株及改質後之短小芽孢桿菌菌株（BCRC 911086）的醱酵產物，經產氣驗證試驗所得之累積產氣量。 第9圖為以高麗菜為料源時，分別加入對照菌株及改質後之短小芽孢桿菌菌株（BCRC 911086）的醱酵產物，經產氣驗證試驗所得之累積產氣量。

[國內寄存資訊] 短小芽孢桿菌ITRI HC1 （ Bacillus pumilusITRI HC1） 中華民國財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心 民國110年12月6日 寄存編號為BCRC 911086

Claims (20)

1. 一種纖維素分解菌劑，其包含短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，其中該短小芽孢桿菌為在2021年12月6日寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心之短小芽孢桿菌，其寄存編號為BCRC 911086。
2. 如請求項1所述之纖維素分解菌劑，其中該短小芽孢桿菌之16SrDNA序列與序列辨識號：1所示之序列相同。
3. 如請求項1所述之纖維素分解菌劑，其中該短小芽孢桿菌之gyrB基因序列與序列辨識號：2所示之序列相同。
4. 如請求項1所述之纖維素分解菌劑，其中該短小芽孢桿菌具有纖維素分解酵素活性。
5. 如請求項1所述之纖維素分解菌劑，更包括一懸浮液，該懸浮液為水、生理食鹽水、或培養基。
6. 如請求項1~5中任一項所述之纖維素分解菌劑，其用於提升沼氣產量及/或產氣速率。
7. 一種短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)之醱酵產物，其中該醱酵產物的形成方法包括：將至少一種短小芽孢桿菌以一培養基進行一醱酵培養，以形成一醱酵液，其中該培養基成分包括：氯化鈉、胰化蛋白(tryptone)、及酵母萃取物，其中該短小芽孢桿菌為在2021年12月6日寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心之短小芽孢桿菌，其寄存編號為BCRC 911086。
8. 如請求項7所述之醱酵產物，其中該氯化鈉的含量 為1~15g/L。
9. 如請求項7所述之醱酵產物，其中該胰化蛋白的含量為2.5~40g/L。
10. 如請求項7所述之醱酵產物，其中該酵母萃取物的含量為1.25~20g/L。
11. 如請求項7所述之醱酵產物，其中該醱酵培養的培養時間為12-72小時。
12. 如請求項7~11中任一項所述之醱酵產物，更包括將該醱酵液進行固液分離，以獲得一醱酵上清液。
13. 如請求項12所述之醱酵產物，更包括將該醱酵上清液進行濃縮或乾燥。
14. 一種短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)之醱酵產物之製備方法，包括：將至少一種短小芽孢桿菌以一培養基進行一醱酵培養，以形成一醱酵液，其中該培養基成分包括：氯化鈉、胰化蛋白、及酵母萃取物，其中該短小芽孢桿菌為在2021年12月6日寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心之短小芽孢桿菌，其寄存編號為BCRC 911086。
15. 一種促進沼氣產量之方法，包括下列步驟：提供含纖維素之料源；接種步驟，將請求項1~6中任一項所述之纖維素分解菌劑或請求項7~13中任一項所述之醱酵產物接種至該含纖維素之料源以獲得一混合物；以及厭氧醱酵步驟，將該混合物於厭氧環境下進行醱酵。
16. 如請求項15所述之方法，其中該含纖維素之料源 包括農業廢棄物、肥料或食品廢棄物。
17. 如請求項16所述之方法，其中該肥料包括草食動物糞便。
18. 如請求項15所述之方法，其中該厭氧醱酵步驟更包括添加甲烷菌群。
19. 如請求項15所述之方法，其中該厭氧醱酵步驟的操作溫度為10~65℃。
20. 一種新穎之短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，其為在2021年12月6日寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center；BCRC)之短小芽孢桿菌，其寄存編號為BCRC 911086。

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