CN1268749C - 用于改变植物中酶和乙酰辅酶a水平的材料和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了乙酰辅酶A合成酶(ACS)、质体丙酮酸脱氢酶(pPDH)、ATP柠檬酸裂合酶(ACL)、拟南芥丙酮酸脱羧酶(PDC)、和拟南芥醛脱氢酶(ALDH)，具体是ALDH-2和ALDH-4的核酸序列和氨基酸序列。本发明还提供了一种重组载体，包含一条编码上述酶之一的核酸序列，其反义序列或其核酶，被这样的载体转化的细胞，这些酶的抗体，在酶水平上被改变的一种植物细胞，一种植物组织、一种植物器官或一种植物，和产生这样的植物细胞、植物组织、植物器官或植物的方法。理想的，酶水平上的改变导致该植物细胞、植物组织、植物器官或植物中乙酰辅酶A水平的改变。另外，本发明提供了一种重组载体，包含编码丙酮酸脱羧酶(PDC)、pPDH的E1α亚基、pPDH的E1β亚基、pPDH的E2亚基、线粒体丙酮酸脱氢酶(mtPDH)或醛脱氢酶(ALDH)的核酸序列的反义序列，或包含一种能切割编码PDC、E1αpPDH、E1βpPDH、E2pPDH、mtPDH或ALDH的RNA分子的核酶。

Description

用于改变植物中酶和乙酰辅酶A水平的材料和方法
                             政府资助
本发明部分由国家科学基金补助金号IBN-9696154和能源部对植物生物技术研究联合会的基本协议号DE-FC05-92OR22072资助。因此，美国政府对本发明具有一定权利。
                             发明技术领域
本发明涉及乙酰辅酶A合成酶(ACS)、质体丙酮酸脱氢酶(pPDH)、ATP柠檬酸裂合酶(ACL)、拟南芥丙酮酸脱羧酶(PDC)、和拟南芥醛脱氢酶(ALDH)的核酸和氨基酸序列。本发明还涉及一种重组载体，包含(i)一条编码上述酶之一的核酸序列，(ii)其反义序列或(iii)其核酶，被这样的载体转化的细胞，这些酶的抗体，在酶或乙酰辅酶A水平，或产生乙酰辅酶A的能力上已被改变的一种植物细胞，一种植物组织、一种植物器官或一种植物，和产生这样的植物细胞、植物组织、植物器官或植物的方法。另外，本发明涉及一种重组载体，包含(i)编码PDC、pPDH的E1α亚基、pPDH的E1β亚基、pPDH的E2亚基、线粒体丙酮酸脱氢酶(mtPDH)或醛脱氢酶(ALDH)的核酸的反义序列，或(ii)一种能切开编码PDC、E1αpPDH、E1βpPDH、E2pPDH、mtPDH或ALDH的RNA分子的核酶。
                             发明背景
ACS和pPDH是两种负责在植物的质体，如叶绿体中产生乙酰辅酶A的酶。ACS如下产生乙酰辅酶A：
，
其中ATP代表三磷酸腺苷，CoASH代表辅酶A，乙酰-CoA代表乙酰辅酶A，AMP代表一磷酸腺苷，和PPi代表无机焦磷酸，和其中乙酸包括从乙醛和NAD+转化成乙酸和NADH得到的乙酸，其中乙醛又是来自丙酮酸分解，其释放CO2。pPDH如下产生乙酰CoA：
，
其中NAD+代表烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，而NADH代表NAD+的还原形式，其中丙酮酸来自糖酵解。糖酵解涉及糖磷酸酯(来自淀粉、光合作用或丙糖的输入，和来自细胞液的已糖磷酸酯)转化成丙酮酸。
已进行了各种对植物(如菠菜、蓖麻、大麦和芸苔)胚胎和叶子中酶相对活性的研究(见，Kang和Rawsthrorne，植物杂志，6：795-805(1994)；Miernyk和Dennis，实验植物学杂志，34：712-718(1983)；Smith等，植物生理学，98：1233-1238(1992)；Liedvogel和Bauerle，Planta169：481-489(1986)；Murphy和Leech，FEBS Letter 77：164-168(1977)；Roughan等，生物化学杂志158：593-601(1976)；Roughan等，生物化学杂志，184：565-569(1978)；Roughan等，生物化学杂志184：193-202(1979)；Spinger和Heise，Planta177：417-421(1989)；Schulze-Siebert和Schultz，植物生理学84：1233-1237(1987)；和Heintze等，植物生理学93：1121-1127(1990))。这些研究提示，乙酸是叶绿体中脂肪酸合成的优选底物，而丙酮酸是胚胎质体中脂肪酸合成的优选底物。
乙酰辅酶A还涉及脂肪酸的生物合成，即，膜脂、脂肪和蜡的基础结构单元的合成。在线粒体中由mtPDH进行类似的反应。
ACS广泛发现于植物质体中，并由光调节(Sauer和Heise，Z.Naturforsch38c：399-404(1983))。ACS量在菠菜、豌豆和苋菜叶绿体之间是相当恒定的；玉米叶绿体中约20％多。已知部分纯化的该酶是完全DTT依赖性的，提示了其体内活性受铁氧还蛋白/硫氧还蛋白系统的调节(Zeiher和Randall，植物生理学，96：382-389(1991))。还有一些乙酰辅酶A的弱反馈抑制。该酶还需要高pH，以及对高ATP(Mg2+-ATP)/ADP比率的依赖性(Sauer和Heise(1983)，见上)。ACS反应必须是底物饱和的，因为菠菜(Sauer和Heise(1983)，见上；Zeiher和Randall(1991)，见上；和Treede和Heise，Z.Naturforsch 40c：496-502(1985))，豌豆(Treede和Heise(1985)，见上)，苋菜(Roughan和Ohlrogge，生物化学年鉴216：77-82(1994))和土豆(Roughan和Stumpf，农业生物化学生物物理学140：158-173(1970))中乙酸的Km值在0.02和0.10mM之间，而估计细胞乙酸的浓度是约1.0mM(Kuhn等，农业生物化学生物物理学209：441-450(1981))。
pPDH看来与mtPDH具有相同的一般结构，由丙酮酸脱氢酶组分(E1α和E1β)，乙酰转移酶组分(E2)，和脱氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)亚基构成。pPDH的分子量和其辅因子要求也和mtPDH相似，虽然对NAD+和TPP的亲和力有些不同(Camp和Randall，植物生理学77：571-577(1985)；Miernyk等(1983)，见上；和Conner等，Planta200：195-202(1996))。比起mtPDH，对乙酰辅酶A较不敏感的pPDH具有约8.0的最佳pH，并且达到最大活性需要约10mM的Mg2+。虽然mtPDH的活性受复杂的激酶/磷酸酶系统控制(该系统磷酸化E1α亚基，从而使其灭活)，但pPDH不受该调控。然而，pPDH强烈的受到NADH/NAD+比率的调节，并受光中等调节。受ATP、NADPH、脂肪乙酰辅酶A和糖酵解中间产物轻微调控(Camp等，生物化学生物物理学学报933：269-275(1988)；和Qi等，实验植物学杂志47：1889-1896(1996))。
PDH活性随组织不同而变化，而mtPDH活性差别15倍，pPDH活性差别6倍(Lernmark和Gardestrom，植物生理学106：1633-1638(1994))。pPDH/mtPDH在植物之间也不同，小麦叶的叶绿体中比线粒体中活性高6.5倍，豌豆线粒体中比叶绿体中活性高6.7倍。虽然与小麦比较，豌豆中叶绿体比线粒体PDH活性的比例小，叶绿体与线粒体PDH绝对量几乎一样大。
ACL是一种负责产生乙酰辅酶A的酶。ACL如下产生乙酰辅酶A：
，
其中ADP代表二磷酸腺苷，而Pi代表正磷酸，而其中柠檬酸是线粒体TCA循环中产生的。已发现ACL的活性与蔓菁的发育种子(Brassica napusL.)(Ratledge等，脂类32(1)：7-12(1997))和发育中的大豆上清液(Glycinemax L.Merr.，var.Harosoy 63)子叶匀浆(Nelson等，植物生理学，55：69-72(1975))中的脂质的积累有关。还在发芽的蓖麻子胚乳组织粗抽提物中发现了ACL(Ricinus communis cv.Hale)并发现在4-5日龄的幼苗中活性最大(Fritsch等，植物生理学63：687-691(1979))。
PDC是一种负责从丙酮酸产生乙醛的细胞液酶。PDC如下产生从丙酮酸产生乙醛：
.
这样产生的乙醛可能受到ALDH的作用。
ALDH负责从乙醛产生乙酸。ALDH如下从乙醛产生乙酸：
乙醛+NAD++H2O→乙酸+NADH++H+.
这样产生的乙酸然后可进入质体，在其中它可通过ACS的作用转化成乙酰辅酶A。
ACH是一种已知存在于酵母中，并据信存在于植物线粒体中的酶。据信ACH从存在于线粒体中的乙酰辅酶A库中产生乙酸。这样产生的乙酸据信从线粒体中释放入胞质溶胶。然后胞质溶胶中的乙酸可进入质体，其中它可通过ACS的作用被转化成乙酰辅酶A。
乙酰辅酶A是许多植物化学物质的共同前体，这些化学物质具有各种各样生物功能，并代表农业上可更新的，富含能量的产物(如脂肪、油、蜡、异戊二烯化合物和生物塑料(如聚羟基丁酸酯))或影响农业生产(如类黄酮、类芪(stibenoid)、异戊二烯化合物和丙二酰衍生物)(Goodwin和Mercer，植物生物化学介绍，第二版，Pergamon Press，New York(1988))。这些植物化学物质是由乙酰辅酶A的羧化作用或连续缩合合成的。
乙酰辅酶A的羧化(通过中间产物丙二酰辅酶A)导致脂肪酸(如膜、油、角质层、木栓质和表皮质)，类黄酮(如色素、植物抗毒素和植物保护剂)、类芪(如植物保护剂和药物)、吖啶酮、丙二酸和各种丙二酰衍生物(氨基环丙烷羧酸、D-氨基酸、类黄酮和杀虫剂)的生物合成。脂肪酸是所有细胞膜的结构单元。另外，在生物合成植物油、角质层、表皮质和木栓质的发育调控过程中，使用了脂肪酸。大部分植物油是三酰基甘油。类黄酮是一组水溶性酚化合物，作为色素具有广泛的生物作用，而且它们在植物对生物和非生物压力(如，干旱、真菌和细菌病原体，和盐压力)的反应中聚集。认为类芪在植物防御机制中起作用。吖啶酮是一类生物碱，具有广谱的抗菌、抗拟软体动物和抗病毒活性。在植物中存在许多丙二酰衍生物，包括D-氨基酸，类黄酮和杀虫剂等异型生物质。乙烯前体，氨基环丙烷羧酸的丙二酸化，可影响激素乙烯的产生。
乙酰辅酶A的缩合(通过中间产物乙酰乙酰辅酶A和HMG CoA)导致异戊二烯化合物的生物合成。异戊二烯化合物的例子包括甾醇、植物抗毒素、脱落酸、赤霉素、八氢番茄素、β-胡萝卜素、植醇、天然橡胶、植物保护剂和药物。异戊二烯化合物还是许多香精油和香料的重要组分。
另外，对生物技术工业振奋的是，乙酰乙酰辅酶A是从转基因植物产生一种新的农业产物，称为聚羟基丙酸酯(PHB，一种生物塑料)的前体。目前的研究指出，转基因生物塑料的生产可能受到乙酰辅酶A供应的限制(Nawrath等，PNAS USA 91：12760-12764(1994))。
利用乙酰辅酶A作为前体的途径是在空间和时间上分隔的。所有细胞合成脂肪酸和甾醇是为了膜的生物合成。大部分其它乙酰辅酶A-衍生的植物化学物质的积聚是高度细胞特异性的，而且在发育的具体阶段，或对具体环境信号的反应中发生在特异的亚细胞区室中。例如，乙酰辅酶A是质体中从头合成脂肪酸(产生18-碳脂肪酸)必需的。18-碳脂肪酸延伸到20碳或更长的脂肪酸需要细胞液乙酰辅酶A库。在细胞液中，为了生物合成异戊二烯化合物、类黄酮、或几种(如不是全部)丙二酸衍生物，也需要乙酰辅酶A。另外，质体中脂肪酸的合成在含油种子的三酰基甘油沉积过程中，以及在最大膜形成，如前质体转化成叶绿体过程中应是最大化的。
因此，综上所述，仍然需要改变参与乙酰辅酶A产生的酶水平和因此植物中的乙酰辅酶A水平的材料和方法。因此，本发明的一个目的是提供这样的材料和方法。本发明的这些和其它目的，以及优点，和其它发明特征，通过下文描述，本领域普通技术人员将会明白。
                             发明简述
在一个实施例中，本发明提供了分离或纯化的核酸分子。一种分离或纯化的核酸分子编码一种植物质体ACS，如从拟南芥中分离的质体ACS，及其含有至少约20个核苷酸的连续片段。优选的，编码ACS的核酸分子是(i)DNA，并包含SEQ ID NO：1或编码SEQ ID NO：2的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO：1编码的序列或编码SEQ ID NO：2的序列，或(iii)一条核酸分子，其在严格条件下能与上述两核酸的任何一条杂交。还提供了一条分离或纯化的核酸分子，它编码修饰的ACS，及其含有至少约20个核苷酸的连续片段。
对此，本发明还提供了一种分离或纯化的核酸分子，它编码植物pPDH的E3亚基(E3 pPDH)，如从拟南芥分离而得的核酸分子，及其包含至少约20个核苷酸的连续片段。优选的，编码E3pPDH的核酸分子是(i)DNA，并包含SEQ ID NO：27(E3-1 pPDH)或SEQ ID NO：29(E3-2pPDH)或编码SEQ ID NO：28(E3-1 pPDH)或SEQ ID NO：30(E3-2 pPDH)的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：29编码的序列或编码SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：30的序列，或(iii)一条核酸分子，其在严格条件下能与前述两核酸分子的任何一条杂交。还提供了一条分离或纯化的核酸分子，它编码修饰的pPDH E3亚基，及其包含至少约20个核苷酸的连续片段。
另一种分离或纯化的核酸分子编码植物ACL的A亚基(ACL-A)，例如从拟南芥分离得的核酸分子，及其包含至少约20个核苷酸的连续片段。优选的，该编码ACL-A的核苷酸是(i)DNA，并包含SEQ ID NO：7或编码SEQ ID NO：8的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO：7编码的序列，或编码SEQ ID NO：8的序列，或(iii)一条核酸分子，其在严格条件下能与上述两核酸分子之一杂交。还提供了一条分离或纯化的核酸分子，它编码ACL的修饰的A亚基及其包含至少约20个核苷酸的连续片段。
对此，本发明还提供了一种编码植物ACL的B亚基(ACL-B)的分离或纯化的核酸分子，例如从拟南芥分离得的该核酸分子，及其包含至少约20个核苷酸的连续片段。优选的，该编码ACL-B的核苷酸是(i)DNA，并包含SEQ ID NO：9(ACL-B1)或SEQ ID NO：11(ACL-B2)或编码SEQ ID NO：10(ACL-B1)或SEQ IDNO：12(ACL-B2)的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11编码的序列，或编码SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12的序列，或(iii)一条核酸分子，其在严格条件下能与上述两核酸分子之一杂交。还提供了一条分离或纯化的核酸分子，它编码ACL的修饰的B亚基及其包含至少约20个核苷酸的连续片段。
本发明还提供了一种分离和纯化的核酸分子，它包含SEQ ID NO：15或SEQID NO：17的核苷酸序列，或编码SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18的氨基酸序列。
同样的，一种分离和纯化的核酸分子，包含SEQ ID NO：21的核苷酸序列，或编码SEQ ID NO：22的氨基酸序列，及上述两核酸分子之一的各包含至少约20个核苷酸的连续片段，或能与前述核苷酸任意一种在严格条件下杂交的核酸分子。
同样的，一种分离和纯化的核酸分子，包含SEQ ID NO：25的核苷酸序列，或编码SEQ ID NO：26的氨基酸序列，及上述两核酸分子之一的各包含至少约20个核苷酸的连续片段，或能与前述核苷酸任意一种在严格条件下杂交的核酸分子。
在另一个实施例中，本发明还提供了一种载体，它包含如上所述的一条核酸分子，一种包含这样的载体的宿主细胞，以及这样的宿主细胞产生的多肽。还提供了多个载体，它们包含或编码一条反义序列或一种核酶，该反义序列能与编码质体ACS、pPDH的E1α亚基、pPDH的E1β亚基、pPDH的E2亚基、pPDH的E3亚基、ACL的A亚基、ACL的B亚基、PDC、ACH、mtPDH或ALDH的RNA分子杂交，而该核酶能切割这些RNA分子，以及提供含有这样的载体的宿主细胞。另外，提供了反义分子、核酶和抗体。
在另一个实施例中，本发明提供了一种改变植物细胞、植物组织、植物器官或植物中的酶水平的方法。该方法包含：使植物细胞、植物组织、植物器官或植物与一载体接触，该载体包含一种核酸分子，其选自(i)编码一种酶，或如果该酶是由亚基构成的，则编码酶的亚基，这些酶选自质体ACS、pPDH、ACL、丙酮酸脱羧酶、乙酰辅酶A水解酶、线粒体丙酮酸脱氢酶，(ii)一条核酸分子，它包含或编码一条由(i)的基因转录而得的RNA分子的反义分子，和(iii)一条核酸分子，它包含或编码针对从(i)的基因转录而得的RNA分子的核酶。该包含核酸分子(i)的载体能提高或降低植物细胞、植物组织、植物器官或植物中的酶水平，而包含或编码(ii)或(iii)的核酸分子的载体能降低植物细胞、植物组织、植物器官或植物中的酶水平。优选的，该酶的改变导致植物细胞、植物组织、植物器官或植物中乙酰辅酶A水平的改变。因此，本发明还提供了一种植物细胞、植物组织、植物器官和植物，其中乙酰辅酶A的水平已根据该方法被改变。
                             附图简述
图1描述了ACS的cDNA[SEQ ID NO：1]和氨基酸[SEQ ID NO：2]序列。
图2描述了pPDH的E1α亚基的cDNA[SEQ ID NO：3]和氨基酸[SEQ ID NO：4]序列。
图3描述了pPDH的E1β-1亚基的cDNA[SEQ ID NO：5]和氨基酸[SEQ ID NO：6]序列。
图4描述了ACL的A亚基的cDNA[SEQ ID NO：7]和氨基酸[SEQ ID NO：8]序列。
图5描述了ACL的B-1亚基的cDNA[SEQ ID NO：9]和氨基酸[SEQ ID NO：10]序列。
图6描述了ACL的B-2亚基的cDNA[SEQ ID NO：11]和氨基酸[SEQ ID NO：12]序列。
图7描述了pPDH的E1β-2亚基的cDNA[SEQ ID NO：13]和氨基酸[SEQ IDNO：14]序列。
图8A描述了拟南芥的PDC-1的cDNA序列[SEQ ID NO：15]。
图8B描述了拟南芥的PDC-1的氨基酸序列[SEQ ID NO：16]。
图9A描述了拟南芥的PDC-2的cDNA序列[SEQ ID NO：17]。
图9B描述了拟南芥的PDC-2的氨基酸序列[SEQ ID NO：18]。
图10A描述了拟南芥的ALDH-1的cDNA序列[SEQ ID NO：19]。
图10B描述了拟南芥的ALDH-1的氨基酸序列[SEQ ID NO：20]。
图11A描述了拟南芥的ALDH-2的cDNA序列[SEQ ID NO：21]。
图11B描述了拟南芥的ALDH-2的氨基酸序列[SEQ ID NO：22]。
图12A描述了拟南芥的ALDH-3的cDNA序列[SEQ ID NO：23]。
图12B描述了拟南芥的ALDH-3的氨基酸序列[SEQ ID NO：24]。
图13描述了拟南芥的ALDH-4的cDNA[SEQ ID NO：25]和氨基酸[SEQ IDNO：26]序列。
图14描述了拟南芥的pPDH的E3-1亚基的cDNA[SEQ ID NO：27]和氨基酸[SEQ ID NO：28]序列。
图15描述了拟南芥的pPDH的E3-2亚基的cDNA[SEQ ID NO：29]和氨基酸[SEQ ID NO：30]序列。
                             发明详述
在一个实施例中，本发明提供了分离或纯化的核酸分子。“分离的”指从其天然环境中取出核酸。“纯化的”指一种不论从天然取出的(包括基因组DNA和mRNA)还是合成的(包括cDNA)，和/或在实验室条件下经过扩增的给定核酸，纯度已提高，其中“纯度”是相对术语，不是“绝对纯度”。“核酸分子”将包含一种DNA或RNA的多聚物，即，一种多核苷酸，其可以是单链或双链的，而且可含有非天然或改变的核苷酸。
一种分离或纯化的核酸分子编码植物ACS，如从拟南芥分离得到的，及其包含至少约20个核苷酸的连续片段。优选的，编码ACS的核酸分子是(i)DNA，并包含SEQ ID NO：1或编码SEQ ID NO：2的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ IDNO：1编码的序列或编码SEQ ID NO：2的序列，或(iii)一条核酸分子，其在严格条件下与上述两条核酸的任何一条杂交。还提供了一条分离或纯化的核酸分子，它编码包含一个或多个插入、缺失和/或取代的修饰的ACS，及其包含至少约20个核苷酸的连续片段。理想的，该修饰的ACS与对应的未修饰ACS(例如包含SEQ ID NO：2的)的功能相同。优选的，如用标记乙酸体外试验测定的该修饰ACS将以对应的(包含SEQ ID NO：2等的)未修饰ACS的至少约50％，更优选的至少约75％，和最优选的至少约90％，把乙酸转化成乙酰辅酶A。本文所用的词语“标记的”指任何检测方法，如放射性同位素。
编码拟南芥ACS的cDNA编码了一个76.7kDa的蛋白质。拟南芥的ACS与大肠杆菌和酵母的相似，含有两个同工型。拟南芥DNA的DNA印迹分析表明，ACS是单拷贝基因。拟南芥的ACS序列与酵母的ACS序列有56％相似性和48％相同性，与大肠杆菌ACS序列有66％相似性和58％相同性。ACS序列可从GenBank以登录号AF036618获得。
本发明提供的另一种分离或纯化的核酸分子编码植物pPDH的E1α亚基(E1αpPDH)，如从拟南芥分离得到的，及其包含至少约20个核苷酸的连续片段(也见Johnston等，BBA1321：200-206(1997))。优选的，编码pPDH E1α的核酸分子是(i)DNA，并包含SEQ ID NO：3或编码SEQ ID NO：4的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO：3编码的序列或编码SEQ ID NO：4的序列，或(iii)一条核酸分子，其在严格条件下与上述两核酸任何一条杂交。还提供了一条分离或纯化的核酸分子，编码包含一个或多个插入、缺失和/或取代的修饰的E1αpPDH亚基，及其包含至少约20个核苷酸的连续片段。理想的，该修饰的E1αpPDH亚基与对应的未修饰E1αpPDH(例如包含SEQ ID NO：4的)的功能相同。优选的，该修饰的植物pPDH的E1αpPDH亚基和剩余的pPDH的未修饰亚基一起，与对应的未修饰pPDH功能相同。优选的，如用标记丙酮酸体外试验测定的那样，该修饰pPDH将以对应的(包含SEQ ID NO：4等的)未修饰E1α亚基的至少约50％，更优选的至少约75％，和最优选的至少约90％，把丙酮酸转化成乙酰辅酶A。
编码拟南芥pPDH的E1α亚基的cDNA编码了一个47kDa的蛋白质。E1α亚基与紫菜(Porphyra purpurea)叶绿体的相似。拟南芥DNA的DNA印迹分析表明，E1α是单拷贝基因。拟南芥的E1α序列与紫菜的E1α亚基的E1α亚基序列有61％相同性。
对此，本发明还提供了一种分离或纯化的核酸分子编码植物pPDH的E1β亚基(E1βpPDH)，如从拟南芥分离得到的，及其包含至少约20个核苷酸的连续片段(也见Johnston等，(1997)见上)。优选的，编码E1βpPDH的核酸分子是(i)DNA，并包含SEQ ID NO：5(E1β-1pPDH)或SEQ ID NO：13(E1β-2pPDH)或编码SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：14的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：13编码的序列或编码SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：14的序列，或(iii)一条核酸分子，其在严格条件下与上述两核酸任何一条杂交。还提供了一条分离或纯化的核酸分子，编码包含一个或多个插入、缺失和/或取代的修饰的E1βpPDH亚基，及其包含至少约20个核苷酸的连续片段。理想的，该修饰的E1βpPDH亚基与对应的未修饰E1βpPDH(例如包含SEQ ID NO：6或SEQID NO：14的)亚基的功能相同。优选的，植物pPDH的该修饰的E1βpPDH亚基和剩余的pPDH的未修饰亚基一起，与对应的未修饰pPDH功能相同。优选的，如用标记丙酮酸体外试验测定的那样，该修饰的pPDH将以对应的(包含SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：14等的E1β亚基的)未修饰pPDH的至少约50％，更优选的至少约75％，和最优选的至少约90％，把丙酮酸转化成乙酰辅酶A。
pPDH的E1β亚基是由至少两条拟南芥基因，称为E1β-1和E1β-2(在氨基酸水平有95％相同性)。编码的拟南芥pPDH的E1β-1亚基的cDNA编码了一个44kDa的蛋白质。拟南芥pPDH的E1β-1亚基与紫菜的pPDH有78％相似性和70％相同性，与mtPDH的E1β亚基有52％相似性和41％相同性。
对此，本发明还提供了一种分离或纯化的核酸分子编码植物pPDH的E3亚基(E3pPDH)，如从拟南芥分离得到的，及其包含至少约20个核苷酸的连续片段。优选的，编码E3pPDH的核酸分子是(i)DNA，并包含SEQ ID NO：27(E3-1pPDH)或SEQ ID NO：29(E3-2pPDH)或编码SEQ ID NO：28(E3-1pPDH)或SEQID NO：30(E3-2pPDH)的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：29编码的序列或编码SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：30的序列，或(iii)一条核酸分子，其在严格条件下能与上述两核酸分子任何一条杂交。还提供了一种分离或纯化的核酸分子，编码包含一个或多个插入、缺失和/或取代的修饰的E3pPDH亚基，及其包含至少约20个核苷酸的连续片段。理想的，该修饰的E3pPDH亚基与对应的未修饰E3pPDH(例如包含SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：30的)亚基功能相同。优选的，植物pPDH的该修饰的E3pPDH亚基和剩余的pPDH的未修饰亚基一起，与对应的未修饰pPDH功能相同。优选的，如用标记的丙酮酸体外试验测定的那样，该修饰的pPDH将以对应的(包含SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：30等的E3亚基的)未修饰pPDH的至少约50％，更优选的至少约75％，和最优选的至少约90％，把丙酮酸转化成乙酰辅酶A。
另一种分离或纯化的核酸分子编码植物ACL的A亚基(ACL-A)，例如从拟南芥分离得的，及其包含至少约20个核苷酸的连续片段。优选的，该编码ACL-A的核苷酸是(i)DNA，并包含SEQ ID NO：7或编码SEQ ID NO：8的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO：7的序列，或编码SEQ ID NO：8的序列，或(iii)一条核酸分子，其在严格条件下与上述两核酸任何一条杂交。还提供了一条分离或纯化的核酸分子，编码包含一个或多个插入、缺失和/或取代的植物ACL的修饰的A亚基，及其包含至少约20个核苷酸的连续片段。理想的，该修饰的ACL-A亚基与对应的未修饰ACL-A(例如包含SEQ ID NO：8的)的功能相同。优选的，如用标记的柠檬酸体外试验测定的那样，该修饰的ACL将以对应的(包含SEQ ID NO：8的A亚基的)未修饰ACL的至少约50％，更优选的至少约75％，和最优选的至少约90％，把柠檬酸转化成乙酰辅酶A。
在此，本发明还提供了一种分离或纯化的核酸分子编码植物ACL的B亚基(ACL-B)，例如从拟南芥分离得的，及其包含至少约20个核苷酸的连续片段。优选的，该编码ACL-B的核酸分子是(i)DNA，并包含SEQ ID NO：9(ACL-B1)或SEQ ID NO：11(ACL-B2)或编码SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11编码的序列，或编码SEQ IDNO：10或SEQ ID NO：12的序列，或(iii)一条核酸分子，其在严格条件下与上述两核酸任何一条杂交。还提供了一种分离或纯化的核酸分子，编码包含一个或多个插入、缺失和/或取代的植物ACL的修饰的B亚基，及其包含至少约20个核苷酸的连续片段。理想的，该修饰的ACL-B亚基与对应的未修饰ACL-B(例如包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12的)的功能相同。优选的，如用标记的柠檬酸体外试验测定的那样，该修饰的ACL将以对应的(包含SEQ IDNO：10或SEQ ID NO：12的B亚基的)未修饰ACL的至少约50％，更优选的至少约75％，和最优选的至少约90％，把柠檬酸转化成乙酰辅酶A。
ACL也由拟南芥中的小基因家族编码。编码拟南芥ACL-A的cDNA编码了一个45kDa蛋白，而编码拟南芥ACL-B的cDNA编码了一个70kDa蛋白。ACL-A由至少两个拟南芥中称为ACL-A1和ACL-A2的基因编码。ACL-B由至少两个拟南芥中称为ACL-B1和ACL-B2的基因编码。拟南芥的ACL与人和大鼠的有50％相似性。
本发明还提供了一种分离和纯化的核酸分子，包含SEQ ID NO：15或SEQ IDNO：17的核苷酸序列，或编码SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18的氨基酸序列。
类似的，一种分离和纯化的核酸分子，包含SEQ ID NO：21的核苷酸序列，或编码SEQ ID NO：22的氨基酸序列，及上述两核酸分子之一的各含有至少约20个核苷酸的连续片段，或能与前述核苷酸之一在严格条件下杂交的核酸分子。
本发明还提供了另一种分离或纯化的核酸分子，编码植物ACH。这样的核酸分子，包括其长度至少约20个核苷酸的连续片段，可根据实施例9从植物中分离出来。
根据上文，本领域普通技术人员知道如何在给定的核酸分子中产生插入、缺失和/或取代。还根据上文，“与…功能相同”指修饰酶具有未修饰酶的酶活性特征。换言之，它作用于同一底物并产生同一产物。然而修饰的酶根据本发明的需要，可比未修饰酶活性大或小。
可从任何植物来源分离得到编码ACS、pPDH和ACL的核酸分子。合适的植物来源包括但不限于：拟南芥、紫花苜蓿(soybean alfalfa)、玉米、小麦、高粱、大麦、稻、燕麦、黑麦、大豆、油菜籽、canola、棉花、红花、花生、棕榈、高粱、向日葵、甜菜、各种蔬菜和水果作物，如黄瓜、番茄、辣椒等。
对于上述分离或纯化的核酸分子，优选一个和多个取代不导致酶的氨基酸改变。另外和优选的是一个或多个取代导致一个氨基酸被另一个大小、形状和电荷接近相等的氨基酸所取代。
还对于上述分离和纯化的核酸分子，一个“至少约20个氨基酸的该分离或纯化的核酸分子的连续片段，其中可被鉴定成衍生自”某给定核酸分子的该片段是一个编码一氨基酸分子的连续片段，该氨基酸分子执行了对应的完整氨基酸分子相同的功能。例如，一个编码植物ACS的分离和纯化的核酸分子的片段，可以是编码ACS的核酸分子的连续片段，其编码能在ATP和CoASH存在下将乙酸转化成乙酰辅酶A的氨基酸分子，但不需要是对应的完整氨基酸分子。
对上述分离或纯化的核酸分子也可以作“序列相同性百分数”特性分析。对此，将上述某给定的核酸分子与编码对应基因的核酸分子(即参照序列)通过将核酸序列在比较窗口上最佳排列来比较，其中对于两条序列的最佳排列，在比较窗口内的多核苷酸序列部分可包含(如与不包含添加或缺失的参照序列作比较)添加或缺失(即缺口)。确定两条序列中相同核酸碱基的位置数，即匹配的位置数，除以比较窗中总位置数，结果乘以100，来计算得到序列相同性百分数。可通过计算机化实施已知算法(如Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机组(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI，或从生物技术信息国家中心可得到的BlastN和BlastX，Bethesda，MD)，或通过观察来进行用于比较的最佳序列排列。序列一般采用BESTFIT或BlastN用默认参数进行比较。
“基本序列相同性”指某给定核酸分子至少75％，优选80％，和更优选的至少90％，和最优选的至少95％与某给定参照序列是相同的。通常，考虑两条多肽是基本相同的条件是，如果多肽的至少40％、优选至少60％、更优选至少90％，和最优选至少95％氨基酸是相同的，或代表某给定参照序列的氨基酸的保守性替换。
另一个多肽序列基本相同的指标是，如果两个分子能在严格条件下彼此选择性杂交。词组“与…选择性杂交”指当异源DNA和/或RNA的制备物中存在靶序列时，某单链核酸探针与某单链靶DNA或互补序列的RNA序列选择性结合。严格条件是序列依赖性的，而且在不同环境下是不同的。一般严格条件选自在限定离子强度和pH下，比特异性序列的热解链温度(Tm)低20℃。Tm是(在限定离子强度和pH下)50％靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。
根据上文，“严格条件”优选允许从约25％-5％错配，更优选从15％-5％错配，和最优选从约10％-5％错配。“在最不适度的严格条件下”优选允许约40％-15％错配，更优选约30％-15％错配，和最优选的约20％-15％错配。“低严格条件”优选允许约60％-35％错配，更优选约50％-35％错配，和最优选约40％-35％错配。对于前面的错配范围，解链温度每降低1℃，相应有1％错配。
然而本领域技术人员将会理解，由于基因密码子的简并性，两条多核苷酸序列在核酸水平可以是基本不同的，但可编码基本相似(如不相同)的氨基酸序列。本发明将包含这样的多核苷酸序列。
关于本发明的方法，可全部或部分(即，作为片段)使用上述核酸分子，以及下文所述的其它核酸分子，用本领域已知的常规方法来鉴定和分离其它植物和非植物(如酵母和细菌)的对应基因，用于本发明方法中。例如，可根据本领域熟知方法将这些分子或其片段用于染色体步行(walking)、基因组扣除，其中需要得到含有靶基因缺失的细胞株(Strauss和Ausubel，PNAS USA87：1889-1893(1990)；和Sun等，植物细胞4：119-128(1992))，转位子(Chuck等，植物细胞5：371-378(1993)；Dean等，植物杂志2：69-81(1992)；Grevelding等，PNAS USA 899：6085-6089(1992)；Swinburne等，植物细胞4：583-595(1992)；Fedoroff和Smith，植物杂志3：273-289(1993)；和Tsay等，科学260：342-344(1993))和T-DNA标记(Feldmann，植物杂志1：71-82(1991)；Feldmann等，科学243：1351-1354(1989)；Herman等，植物细胞11：1051-1055(1989)；Konz等，EMBO J 9：1337-346(1989)：和Kieber等，细胞72：427-441(1993))，和异源探针选择技术中。虽然T-DNA标记、染色体步行或异源探针选择可鉴定推测含有感兴趣基因的DNA片段，但必须通过基因互补或其它方法确认该DNA片段。
在另一个实施例中，本发明还提供了一个载体，包含如上所述的核酸分子。可将如上所述的核酸分子克隆入任何合适的载体，用于转化或转染任何合适宿主。载体的选择和构建它们的方法是本领域技术人员公知的，而且在一般技术文献中(一般见，“重组DNA部分D”酶学方法，153卷，Wu和Grossman编，Academic Press(1987))。理想的，该载体包含调控序列，例如转录和翻译起始和终止密码子，它们对要引入载体的宿主类型(例如，细菌、真菌、植物或动物)是特异的，同时要考虑该载体是DNA还是RNA是合适的。优选的，该载体包含对宿主的属是特异性的调控序列。最优选的，该载体包含对宿主的种是特异性的调控序列。
可制备环状或线状的载体构建物，以含有如上所述的完整核酸序列或其一部分，连接于在原核或真核宿主细胞中能发挥功能的复制系统。复制系统可衍生自ColE1、2mμ质体、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。
除了复制系统和插入的核酸，该构建物可包含一个或多个标记基因，其允许选择转化或转染的宿主。标记基因包括杀菌剂抗性，如对抗生素、重金属等的抗性，营养缺陷型宿主中的互补，来提供原养型等。
合适的载体包括那些设计成用于增殖和扩增，或用于表达，或两者的载体。一种优选的克隆载体选自：pUC系列，pBluescript系列(Stratagene，Lajolla，CA)，pET系列(Novagen，Madison，WI)，pGEX系列(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)，和pEX系列(Clonetech，Palo Alto，CA)。也可使用噬菌体载体，如λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。植物表达载体的例子包括：pBI101、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clonetech，Palo Alto，CA)。动物表达载体的例子包括pEUK-C1、pMAM和pMAMneo(Clonetech)。
植物表达载体可包含一种天然或非天然启动子，它可操作性连接于编码如上所述的ACS、pPDH或ACL的核酸分子。启动子的选择，如强、弱、可诱导、组织特异性和发育特异性在本领域技术人员所知的范围内。相似的，如上所述核酸分子与启动子的结合也在本领域技术人员所知的范围内。
表达载体还可任选的在启动子和编码序列之间包含一转运肽序列。对于那些在线粒体或质体中正常表达的基因，优选分别包含线粒体或质体转运肽的表达载体。已知许多植物基因产物含有转运肽序列。例如，核酮糖二磷酸羧化酶的小亚基、铁氧还蛋白、叶绿素a/b结合蛋白等，包含转运肽序列。这些转运肽序列可被分离/合成，并用于本发明的表达载体。不管编码转运肽的DNA片段来源，它应包含一个翻译起始密码子和一条能被宿主植物细胞的细胞器或植物识别，并在其中起作用的氨基酸序列。
本发明不仅提供了包含上述核酸分子的载体，还提供了一种载体，包含或编码一条与切割RNA分子的核酶杂交的反义序列，所述RNA分子编码植物质体乙酰辅酶A合成酶、植物质体丙酮酸脱氢酶的E1α亚基，植物质体脱氢酶的E1β亚基、植物质体丙酮酸脱氢酶的E2亚基、植物质体丙酮酸脱氢酶的E3亚基、植物ATP-柠檬酸裂合酶的A亚基、植物ATP-柠檬酸裂合酶的B亚基、植物丙酮酸脱羧酶、植物乙酰辅酶A水解酶、植物线粒体丙酮酸脱氢酶和植物醛脱氢酶。本发明还提供反义分子(其优选长度至少约20个核苷酸)和核酶，其优选包含至少约20个与该核酶活性部位两侧的靶序列互补的连续核苷酸。
根据上文，本发明提供了一种包含上述载体的宿主细胞。另外，本发明提供了由包含上述载体的宿主细胞产生的多肽。
合适的宿主包括：大肠杆菌、芽胞杆菌、铜绿假单胞菌、酿酒酵母和黑曲霉。大肠杆菌，特别是大肠杆菌TB-1、TG-2、DH5α、XL-Blue MRF’(Stratagene)、SA2821和Y1090是优选的宿主。更优选的宿主是XL-Blue MRF’或TG02。
除上述外，本发明还提供了对ACS、pPDHE1α和E1β、和ACL A和B的多克隆抗体。这些多克隆抗体可根据实施例2、4和6或其它本领域已知的其它方法产生。
在另一个实施例中，本发明提供了一种改变植物细胞、植物组织、植物器官或植物中酶水平的方法。该方法包括使植物细胞、植物组织、植物器官或植物与包含核酸分子的载体接触，该核酸分子选自(i)一种基因，其编码以下的酶，或如果这些酶由亚基构成，则编码酶的亚基，这些酶选自质体乙酰辅酶A合成酶、质体丙酮酸脱氢酶、ATP-柠檬酸裂合酶、丙酮酸脱羧酶、乙酰辅酶A水解酶、线粒体丙酮酸脱氢酶和醛脱氢酶的酶亚基，(ii)一条核酸分子，包含或编码从(i)的基因转录而得的RNA分子的反义分子，和(iii)一条核酸分子，它包含针对从(i)的基因转录而得的RNA分子的核酶。包含(i)核酸分子的载体能提高植物细胞、植物组织、植物器官或植物中的酶水平，而包含(ii)或(iii)核酸分子的该载体能降低植物细胞、植物组织、植物器官或植物中的酶水平。优选的，酶的改变导致植物细胞、植物组织、植物器官或植物中乙酰辅酶A水平的改变。因此，本发明还提供了一种植物细胞、植物组织、植物器官和植物，其中乙酰辅酶A的水平已按照该方法被改变。
优选，本发明方法中所用的核酸分子是上述或下述核酸之一。对此，对应于上述植物核酸分子但分离自动物、细菌或酵母源的核酸分子，可用于本发明的方法，来提高植物细胞、植物组织、植物器官和植物中的酶水平，如果在动物、细菌或酵母基因组序列含有可能在植物中不被正确加工的内含子的情况下使用eDNA序列。另外，改变cDNA序列，使其含有在植物物种中比在动物、细菌或酵母中优选的密码子序列可能是必须的。然而，对于在本发明方法中使用的反义或核酶序列的范围而言，使用分离自与其中酶水平待改变的植物细胞、植物组织、植物器官和植物的同一来源植物的核酸分子是有好处的。
可根据本领域已知方法获得用于本发明方法的编码PDC的分离或纯化的核酸分子。一条编码玉米PDC1的cDNA克隆可从GenBank以登录号X177555(基因组DNA X59546)得到。玉米的PDC-22的部分克隆Z21721和L11312和PDC-3的部分克隆Z21722和L11313也可从GenBank得到。本文图7-9B列出的SEQ IDNOS：15-18提供了拟南芥PDC-1和PDC-2的cDNA和推导的氨基酸序列。另外，可使用编码已被一个或多个插入、缺失和/或取代修饰的PDC(其中编码的PDC与未修饰的PDC功能相同)的分离或纯化的核酸分子。优选的，如用标记丙酮酸体外试验测定的那样，该修饰的PDC将以未修饰PDC的至少约50％，更优选的至少约75％，和最优选的至少约90％，把丙酮酸转化成乙醛。
可根据本领域已知方法获得用于本发明方法的编码pPDH的E2亚基的分离或纯化的核酸分子。一条编码E2pPDH的cDNA克隆可从Mooney等，Biochemistry Department，University of Missouri(Mooney等，植物生理学120：443-451(1999))得到。另外，可使用编码已被一个或多个插入、缺失和/或取代修饰的E2pPDH亚基(其中编码的pPDH的E2亚基与未修饰的pPDH的E2亚基功能相同)的分离或纯化的核酸分子。优选的，如用标记丙酮酸体外试验测定的那样，包含pPDH修饰的E2亚基的pPDHPDC将以包含未修饰的E2亚基的pPDH的至少约50％，更优选的至少约75％，和最优选的至少约90％，把丙酮酸转化成乙醛辅酶A。
可根据本领域已知方法从植物中分离用于本发明方法中使用酿酒酵母ACH基因(Genbank登录号M31036；Lee等，生物化学杂志265：7413-7418(1990))的分离或纯化的编码ACH的核酸分子。例如，现存酿酒酵母突变子(Lee等，生物化学生物物理学学报1297(1)：105-109(1996)；和Minet等，植物杂志2：417-422(1992))可能与质体(其可在酵母中复制和表达这些基因)中表达拟南芥cDNA的文库互补(见例如Wang等，植物分子生物学31：1093-1104(1996))。选出能与该酵母突变体互补，并恢复野生型生长能力的克隆。另外，可通过纯化ACH至均一，并获得部分N-末端序列分析来获得一克隆。然后将该序列分析反向翻译成DNA序列。然后用该DNA序列筛选拟南芥cDNA文库，寻找含有ACH的cDNA的克隆。
可根据本领域已知方法获得用于本发明方法的编码mtPDH的分离或纯化的核酸分子。mtPDH包含4个亚基。在Luethy等，基因164(2)：251-254(1995)中描述了编码拟南芥mtPDH的E1α亚基的cDNA克隆。该cDNA克隆包含1435个碱基对，其中有一个1167个碱基对的开放阅读框，编码一条含389个氨基酸的43.0kD的多肽(pI7.1)。拟南芥的E1α亚基和其它真核序列在氨基酸水平上有47-51％的相同性。在Luethy等，生物化学生物物理学学报1187(1)：95-98(1994)中描述了编码拟南芥mtPDH的E1β亚基的cDNA克隆。该cDNA克隆包含1320个碱基对，其中有一个1089个碱基对的开放阅读框编码分子量为39，190Da，等电点4.9的363个氨基酸的一个多肽。在其氨基端存在29个氨基酸的推定的线粒体寻靶序列。在Guan等，生物化学杂志270(10)：5412-5417(1995)中描述了编码拟南芥mtPDH的E2亚基(二氢硫辛酰胺乙酰转移酶)的cDNA。该cDNA克隆是2.2kb。可在本发明方法中使用这些序列。
另外，一条分离或纯化的核酸分子，它编码mtPDH的E1α、E1β或E2亚基(其分别与Luethy等的mtPDH的E1α或E1β亚基，或Guan等的mtPDH的E2亚基有一个或多个插入、缺失和/或取代的差异)，其中修饰的E1α、E1β或E2亚基，和其它未修饰的Leuthy等或Guan等的mtPDH亚基一起，与未修饰的mtPDH功能相同。优选的，如存在标记的丙酮酸体外试验所测定的那样，该修饰的亚基与其它未修饰亚基一起，将以包含Leuthy等和Guan等公开的亚基的未修饰mtPDH的至少约70％，优选至少75％，更优选的至少约85％，和最优选的至少约90％，把丙酮酸转化成乙酰辅酶A。
可根据美国专利号5,684,242(‘242专利)的方法获得用于本发明方法的，编码ALDH的分离或纯化的核酸分子。‘242专利公开了如SEQ ID NO：1的ALDH的核酸序列，和如SEQ ID NO：2的对应氨基酸序列。本文提供了如图10A-13的SEQ ID NOS：19-26的拟南芥ALDH-1、ALDH-2、ALDH-3和ALDH-4的cDNA和推导的氨基酸序列。另外，可使用本文列出的一种分离或纯化的核酸分子，其编码与‘242专利的ALDH或本文列出的拟南芥ALDH序列不同的有一个或多个插入、缺失和/或取代的ALDH，其中编码的ALDH与前述ALDH功能相同。优选的，如存在标记的乙醛体外试验所测定的那样，该修饰的ALDH将以未修饰的ALDH的至少约70％，优选至少75％，更优选的至少约85％，和最优选的至少约90％，把乙醛转化成乙酸。
用于本发明方法的优选载体确定了如上的特征。类似的包含编码如上所述PDC、E2pPDH、ACH、ALDH或mtPDH的核酸的载体也是优选的。可将这些载体用任何合适方法引入植物。例如，可用载体转化组织培养物中的细胞。该方法特别对类似玉米的植物是有用的。另一方面，优选用脓杆菌介导的浸润方法转化拟南芥(见例如Chang等，植物杂志5(4)：551-558(1994)；Katavic等，分子通用遗传学245(3)：363-370(1994)；和http：//www.bio.net：80/hypermail/ARABIDOPSIS/9707/0015.html)。
如果需要提高某种给定基因的表达，优选通过引入一种基因，其编码以下的酶，或如果该酶由亚基构成，则编码酶的亚基，这些酶选自质体乙酰辅酶A合成酶、质体丙酮酸脱氢酶、ATP-柠檬酸裂合酶、醛脱氢酶、线粒体丙酮酸脱氢酶、丙酮酸脱羧酶和乙酰辅酶A水解酶。优选将该基因通过一载体方法引入。优选将该基因的多个额外拷贝引入植物细胞、植物组织、植物器官或植物，或将包含一个强启动子、如CaMV35S启动子的载体引入植物细胞、植物组织、植物器官或植物，使基因以更高的速率表达，从而产生更多mRNA，其被翻译成更多编码的酶。理想的，含有亚基的酶的表达是通过提高所有亚基的表达来提高的。包含亚基的酶的表达可因减少单个亚基的表达而减少。
对此，如果需要在给定组织中表达，可在载体中使用组织特异性启动子。组织特异性启动子和增强子的例子包括Guerineau，分子生物学方法49：1-32(1995)；Meisel等，Gent.Eng.19：183-199(1997)；和Edwards等，遗传学年度综述24：275-303(1990)描述的那些。类似的，可在载体中使用器官特异性的启动子。还可使用发育特异性启动子和可诱导启动子，例如Grunder等，欧洲生物化学杂志220(1)：247-255(1994)；Caddick等，国家生物技术16(2)：177-180(1998)；Moore等，PNAS USA 95(1)：376-381(1998)；和Mett等，PNASUSA 90(10)：4567-4571(1993)所描述的那些。苹果酸合成酶和异柠檬酸裂合酶植物启动子是发育特异性启动子的例子。Napin、云扁豆蛋白、油质蛋白、大豆球蛋白、十字花科球蛋白(cruciferin)和β-共大豆球蛋白(betaconglycinin)是种子储藏蛋白启动子的例子。可用于需要在宿主植物达到成熟后表达某给定基因的情况中的可诱导启动子包括：温度敏感型调控元件，热休克启动子，压力应答启动子和可化学诱导的启动子。
如果需要减少某给定基因的表达，优选通过引入一核酸分子，该分子包含(就RNA载体而言)或编码(就DNA载体而言)一个上述基因转录的RNA分子的反义核酸分子，或一条核酸分子，它包含对上述基因转录的RNA分子的核酶(见例如，Senior，Biotech.Genet.Eng.Rev15：79-119(1998)；Bird等，Biotech.Genet.Eng.Rev 9：207-227(1991)；Matzke等，遗传学趋势11(1)：1-3(1995)；Baulcombe，植物分子生物学32(1-2)：79-88(1996)；Castanatto等，Crit.Rev.Eukaryot.Gene Exp.2(4)：331-357(1992)；和Rossi，生物技术趋势13(8)：301-306(1995))。在反义技术中，可将来自所需植物基因的核酸区段克隆并可操作性的与启动子序列连接，从而可转录RNA的反义链。例如，可将CaMV的35S启动子与编码某给定酶的cDNA融合，但是与正常的朝向相反。
在反义抑制中引入的核酸序列一般是与内源基因或要抑制的基因至少一部分基本相同，优选至少约20个连续的核苷酸相同，但不必完全相同。因此，可设计该载体，使抑制效应作用于显示与靶基因同源或基本同源的基因家族中的其它蛋白质。引入的序列相对于初级转录产物或完全加工的mRNA也不需要是全长的。对较短序列的使用一般可用更高的同源性来补偿。另外，引入的序列不必具有相同的内含子或外显子模式，而且非编码区段的同源性将同样有效。
然后，使植物细胞、植物组织、植物器官或植物和该构建物接触，产生RNA的反义链。在植物细胞中，已显示反义RNA抑制了基因表达(见例如，Sheehy等，PNAS USA 85：8805-8809(1988)；和Hiatt等，美国专利号4,801,340)。可将得到的重组基因用农杆菌介导的转化转化入拟南芥。可在转化植物中，采用测量某给定酶的存在和/或活性的标准方法，确认对给定基因表达的抑制。对此，指出一些植物如拟南芥含有两种基因(即“共生同源基因”)编码一给定酶，如ACL、PDC和ALDH是重要的。在这些情况下，理想的是用反义RNA减少给定基因的表达，因为共生同源基因产生序列几乎相同的mRNA(如ACL、PDC和ALDH mRNA的情况)，而且一个反义RNA分子就能降低，甚至封闭两种共生同源基因的表达，这取决于所用的反义分子。
已报道核酶能用作抑制内源植物基因表达的工具。可以设计核酶，其能特异性与靶RNA实质配对，并在特定位置切开磷酸二酯骨架，从而从功能上灭活靶RNA。在进行该切割时，核酶本身不改变，因此能回收并切割其它分子，使其成为-真正的酶。在反义RNA中包含核酶序列赋予它们RNA切割活性，从而提高构建物的活性。在Haseloff等，自然334：585-591(1988)中描述了靶RNA特异性核酶的设计和使用。优选的，核酶含有至少约20个连续核苷酸。
用于使植物细胞、植物组织、植物器官或植物与载体接触，从而使载体被单独或作为植物组织、植物器官或植物的一部分被植物细胞摄取，并在其中表达的技术是本领域已知的。这样的方法涉及例如植物组织培养技术。本文中“接触”指，使细胞、组织、器官或植物与载体接触，其方式使载体能进入细胞，并在其中表达。
植物细胞、植物组织、植物器官或植物可以任何合适方法与载体接触，包括直接转化，如聚乙二醇沉淀(Paszkowski等，EMBO J3：2717-2722(1984))，细胞轰击，即，使DNA附着于金属颗粒，将它们轰入穿过植物细胞壁(Fromm等，生物/技术8：833-839(1990)；Gordon-Kamm等，植物细胞2：603-618(1990)；和Klein等，自然327：70-73(1987))。外源DNA可通过将核酸(编码与乙酰辅酶A产生有关的基因)插入农杆菌的Ti质体，引入双子叶植物细胞中，并加入合适组分来促进转化(Horsch等，科学223：496-498(1984)；Fraley等，PNAS USA 80：4803(1983)；和DeBlock等，EMBO J 3：1681-1689(1984))。将外源DNA引入植物和/或其组成细胞的亚组中的其它技术也是可行的，包括电穿孔(Fromm等，PNAS USA 82：5824(1995)，显微注射，原生质体介导的基因转移，和碳化硅晶体-介导的基因转移。在基因工程新闻14(4)：1，3和24页讨论了这些不同技术，而且是本领域已知的。见例如Weising等，遗传学年度综述22：421-477(1988))。
可培养由上述转化技术衍生而来的转化植物细胞，产生完整植物，其拥有所要的转化表型。在Evans等，原生质体分离和培养，植物细胞培养手册，MacMillan Publishing Co.，New York，pp.124-176(1983)；和Binding，植物再生，植物原生质体，CRC Press，Boca Raton，pp.21-73(1985)中描述了从培养的原生质体中再生植物。也可以从植物胼胝体、外植体、其器官或部分获得再生植物。一般在Klee等，植物生理学年度综述38：467-486(1987)中描述了这样的再生技术。
本领域普通技术人员将理解，在表达盒被稳定掺入转基因植物并被确认可操作后，可通过性交将其引入其它植物。可采用多种标准繁殖技术的一种，视要交配的物种而定。
另一种降低乙酰辅酶A水平的方法是共抑制。见例如，Que等，发育遗传学22(1)：100-109(1998)和Smyth，现有生物学7(12)：R793-R795(1997)。
另外，可用本领域熟知的反相遗传学系统来产生和分离下调的或无能的突变体。一种这样的系统，玉米的Trait Utility Sysytem，(TUSC)是基于其它生物体的成功系统(Ballinger等，PNAS USA 86：9402-9406(1989)；Kaiser等，PNAS USA 87：1686-1690(1990)；和Rushforth等，分子细胞生物学13：902-910(1993))。该系统的中心特征是鉴定感兴趣的DNA序列中Mu转座子插入物，来预测至少这些插入等位基因中的一些将是突变子。为了在玉米中发展该系统，从大量突变体转座子原种中收集DNA，然后将其自授粉增殖，来产生F2子代。为了找到特定的DNA序列中的Mu转座子插入物，通过PCR，用基因特异性引物和与Mu转座子反向重复序列退火的引物，来筛选收集的DNA样品。预计仅在模板DNA来自在靶基因内含有Mu转座子插入物的植物，才会产生PCR产物。一旦鉴定到这种DNA样品，筛选对应植物的F2子代的转座子插入物等位基因。通过TUSC程序(Bensen等，植物细胞7：75-84(1995))已获得了anl基因的转座子插入突变。该系统可用于其它植物物种，有时可根据本领域技术人员的知识和技术，按需修改。
可用T-DNA插入诱变在上述基因之一中产生插入突变，从而对给定基因的表达起反作用。理论上，为了在任何给定基因中95％可能得到插入，需要约100,000个独立的T-DNA插入物(McKinnet，植物杂志8(4)：613-622(1995)；和Forsthoefel等，Aust.J.Plant Physiol.19：353-366(1992))。现在，有12,000个这样的T-DNA标记的种系已是公众可得的(http：//aims.cps.msu.edu/aims)。其它T-DNA标记的植物种系正在产生，和制作可以得到。对此，Monsanto(St.Louis，MO)最近收集了T-DNA标记种系，报道它们含有90,000-150,000T-DNA插入物。T-DNA标记的植物种系可用PCR筛选。例如，对于T-DNA的一端可设计一种引物，对于感兴趣的基因可设计另一种引物，可将两种引物用于PCR。如果未获得PCR产物，那么在感兴趣基因中没有插入物。相反，如果获得了PCR产物，那么在感兴趣的基因中有插入物。然而，插入突变常常产生无能等位基因，其可能是致死的。另外，如果有一种以上的基因编码一种给定酶，那么这些基因之一的突变将不会导致该基因编码的酶表达减少。
另一种减少给定基因表达的方法是使用抑制上述基因之一的表达，或抑制上述基因之一编码的酶活性的化合物。例如，已知葡萄糖抑制PDC。
除以上所述，可用基因置换技术来增加或减少给定基因的表达。基因置换技术是基于同源重组(见，Schnable等，植物生物学的现有观点1：123(1998))。可通过诱变(例如插入、缺失、重复或置换)操纵感兴趣的酶的核酸，来增强或减弱酶功能。可将改变的序列引入基因组，通过同源重组替换存在的(如野生型)基因(Puchta和Hohn，植物科学趋势1：340(1996)；Kempin等，自然389：802(1997))。
还除以上所述外，可用细胞器重新靶向(re-targeting)来增加或减少与乙酰辅酶A产生有关的给定基因的表达。例如，可通过除去上述基因之一的细胞器靶向序列，并用新的细胞器靶向序列置换，来改变该基因(见例如，Roesler等，植物生理学113(1)：75-81(1997)，以将细胞质酶重新靶向于质体；Moloney等，Biotechnol.Genet.Eng.Rev 14：321-336(1997)；deCatro Silva等，植物分子生物学30(4)：769-780(1996)；和Cline等，细胞发育生物学年度综述12：1-26(1996))。然后将该改变的序列通过标准转化程序引入植物基因组。
可用标记底物体外测量给定酶的活性。可通过培育整个叶绿体、叶绿体抽提物或叶抽提物和标记乙酸、辅酶A、ATP和Mg，以及将等份的反应混合物转移到Whatman No.1DE81滤纸片上，如Roughan等，分析生物化学216：77-82(1994)所述，体外快速方便的测定ACS活性。然后洗涤滤纸片，除去未反应的乙酸。用闪烁计数测定与纸定量结合的乙酰辅酶A。如需要，可进一步如Zeiher等，植物生理学96：382-389(1991)所述纯化ACS，用于体外试验。
根据上述方法减弱pPDH预期将导致质体乙酰辅酶A库的减少，预计其反过来影响脂肪酸的从头生物合成，即18碳脂肪酸的合成。由于植物油聚集的减少，这将最易于观察。
预期细胞质ACL的减少将导致乙酰辅酶A库的减少，预计其反过来影响长链脂肪酸和类黄酮的生物合成。由于植物膜颜色的变淡(由于减少的类黄酮)，植物地面部分的角质层沉积减少，和植物油中20-和22-碳脂肪酸的减少(由于18-碳脂肪酸延伸的减少)这最易于观察。
预期减少PDC、ALDH和/或ACS将影响辅酶A库。已知ALDH减少会影响植物花粉发育(见美国专利号5,684,242)。
通过对产生乙酰辅酶A的基因表达的作用测定和体内产生的乙酰辅酶A库的测定，可确定某产生乙酰辅酶A的途径是否影响另一产生乙酰辅酶A的途径。例如，使用一种转基因植物，可确定某产生乙酰辅酶A的酶的减少是否会引起其它基因表达的补偿性变化。由于显微阵列芯片技术已建立并可得到(DeRisi等，科学278：680-686(1997))，可测定某基因改变对拟南芥所有克隆基因的表达的影响。可进行代谢法放射示踪研究来测量体内不同乙酰辅酶A库的产生。在这些研究中，向完整组织提供放射性标记的前体，当该前体被代谢时，监测放射性标记。通过比较野生型植物和产生乙酰辅酶A的酶之一活性减弱的植物，可确定不同乙酰辅酶A库的来源以及某给定的产生乙酰辅酶A的酶减少的影响。
除了用于对植物中乙酰辅酶A产生，包括对乙酰辅酶A产生所需酶编码基因表达的空间和时间模式的研究外，上述方法也可用于产生植物，来产生乙酰辅酶A衍生的植物化学物质。该方法可用于改变植物(包括野生型和突变型植物，如紫花苜蓿、玉米、小麦、高粱、大麦、稻、燕麦、黑麦、大豆、油菜、canola、棉花、红花、花生、棕榈、向日葵、甜菜和各种蔬菜和水果作物，例如黄瓜、番茄、辣椒等)中的乙酰辅酶A水平。“改变”是指某给定植物(或植物细胞、组织或器官)中乙酰辅酶A水平与类似植物(其乙酰辅酶A水平未因实施本发明方法而改变)比较，由于实施了本发明方法而不同。
根据上述方法，本发明还提供了细菌、酵母、动物，包括细胞、组织或器官、或植物，包括其细胞、组织或器官，其中酶水平已根据上述方法改变。优选本发明方法用于产生植物细胞、植物组织、植物器官或植物。可培养植物细胞，将其作为植物组织细胞保存，或可在培养基中加入某些本领域已知的植物激素，从而导致植物组织培养细胞分化，形成新的植物品种。在实施本发明该方面内容所用的植物培养方法是本领域熟知的。因此。本发明还提供了植物细胞、植物组织、植物器官或植物，其中酶水平已被改变。优选酶水平的改变导致乙酰辅酶A水平的改变。
上述方法可适用于体外产生乙酰辅酶A，其能用于产生乙酰辅酶A植物化学物质。例如，可从合适的宿主制备乙酰辅酶A合成所需的各种酶，并将其与合适的底物，能量来源，辅因子和本领域已知的其它成分一起置于反应容器中，来产生乙酰辅酶A。
                            实施例
本发明将联系下文实施例作进一步描述。这些例子将进一步说明本发明，但不限制本发明范围。
实施例1
该实施例描述了从拟南芥克隆ACS cDNA，并将其序列与大肠杆菌和酿酒酵母的序列比较。
用大肠杆菌和酿酒酵母ACS基因的推定的氨基酸序列，使用程序BLAST检索dbEST数据库(National Library of Medicine，National Istitute ofHealth，Bethesda，Maryland)。鉴定出一个拟南芥(Arabidopsisthaliana)cDNA克隆是可能的ACS基因。该克隆，220J9T7(登录号N38599)，获自俄亥俄州立大学的拟南芥生物学研究中心(ARBC)。
制备了该克隆的质体DNA，并由Biotechnology Instrumentation Facilityof Iowa State University测序。对该序列数据的分析发现该克隆(J9)编码了大约40％的ACSC-末端部分。对dbEST重复检索未能发现任何更长的克隆序列。
用cRACE(Maruyama等，核酸研究23：3796-3797(1995))分离了ACS基因的剩余部分。从新鲜植物组织中制备了拟南芥的mRNA。用嵌套ACS特异性引物(基于J9的5’端序列)在两个顺次cDNA合成反应中产生一特异性单链、反义cDNA片段，它编码已知的J9序列ACS DNA 5’片段。用RNA连接酶连接并环化该单链cDNA，然后进行两次PCR扩增，使用基于J9序列的嵌套引物对。该过程得到约320bp的DNA片段，它编码ACS基因的另一部分。将该片段克隆入载体pBS中(Stratagene)，称为J9E1，并测序。
PCR扩增构建在载体pSPORT(Life Technologies，Grand Island，NY)中的拟南芥cDNA文库，获得ACS基因的其余部分。设计并合成两种与J9E1的5’端杂交的嵌套反义引物。用这些引物和两种对载体pSPORT特异性的嵌套有义载体引物来依次用PCR扩增ACS cDNA另270bp的片段。该片段被克隆入pBS，给定名称J9E2，并测序。
类似的，设计并合成了另两种嵌套反义引物，其与J9E2的5’末端对应。用这些引物和载体引物对cDNA文库进行依次PCR扩增，得到一个cDNA片段，它编码ACS基因的剩余部分。将该片段克隆入pBS，称为J9E3，并测序。
将所有这些来自克隆J9、J9E1、J9E2和J9E3的序列数据排列并压缩，得到一条DNA序列，它编码完整拟南芥ACS基因。该序列被提交给GenBank登录号AF036618。该DNA编码一个693氨基酸的蛋白质，计算出的分子量76,678道尔顿。
拟南芥ACS的cDNA序列和大肠杆菌ACS的蛋白质序列，以及酿酒酵母ACS两种同工型蛋白质序列的MACAW排列对比显示，拟南芥ACS与大肠杆菌ACS有53％相同性，与酿酒酵母的I同工型有37％的相同性，和酿酒酵母ACS的II同工型有40％相同性。
实施例2
该实施例描述了对拟南芥ACS的多克隆抗体的产生。
设计了PCR引物，使克隆J9的编码区能被PCR扩增，作为被限制性位点终止的DNA片段，适合克隆入大肠杆菌蛋白表达质体pMALC-2(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)。根据载体供应商提供的说明书构建了表达载体克隆J9-NT1/pMALC-2。当转录入大肠杆菌并用异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)诱导时，该克隆导致产生一种重组嵌合融合蛋白质，由拟南芥ACS的C-末端部分与大肠杆菌麦芽糖结合蛋白质(MBP)融合而成。从一升转化大肠杆菌培养物中纯化该重组蛋白质，并用New England Biolabs的直链淀粉柱根据厂商的方案纯化。电泳分析纯化蛋白质的纯度，定量，并给予BiotechnologyInstrumentation Facility of Iowa State University，在兔中产生多克隆抗体。通过免疫印迹试验测试兔的免疫前和免疫血清对原始抗原重组蛋白质的特异性和滴度。
实施例3
该实施例描述了pPDH的E1α、E1β和E3亚基cDNA的克隆，和比较了编码E1β亚基的cDNA序列和红藻pPDH序列和拟南芥mtPDH序列。
使用程序BLAST，用紫菜PDH的E1α和E1β亚基的推定氨基酸序列检索dbEST数据库。从Ohio State University的ABRC获得了经鉴定可能为pPDH的克隆。
拟南芥EST克隆232D14T7(N65567)和232D13T7(N65566)显示了与紫菜的PDH E1α亚基显著程度的同源性。两个克隆含有相同的核苷酸序列，编码除pPDHE1α亚基头50-70个氨基酸以外所有的氨基酸。选出克隆232D14T7(D14)用于测序。该克隆的DNA序列包含SEQ ID NO：3，而推定的氨基酸序列包含SEQ IDNO：4(见图2和序列表)。
拟南芥EST克隆163C12T7(R2996；E1β-1)和169K3T7(R64987；E1β-1)显示与紫菜PDH的E1β亚基显著程度的同源性。这两个克隆和对应的拟南芥mtPDH相关，但不相同。选出克隆163C12T7(C12)来测序。克隆C12看来编码pPDH的E1β亚基几乎所有的编码区。该克隆的序列包含SEQ ID NO：5而推定的氨基酸序列包含SEQ ID NO：6(见图3和序列表)。通过检索GenBank中拟南芥基因组序列，发现了第二个E1β亚基基因(E1β-2)。仔细分析显示，数据库中的基因组序列与E1β-1的cDNA序列是不同的。因此，从拟南芥生物学资源储藏中心(Ohio State University，Columbus，OH)获得了所有的cDNA EST克隆，并测序。E1β-1和E1β-2的cDNA序列几乎相同。
如下分离了编码拟南芥pPDH的E3亚基的基因。用氰细菌集胞蓝细菌(Synechocystis)PCC6803的E3基因搜索拟南芥EST数据库(Engels等，微生物学143：3543-3553(1997))。从拟南芥生物资源储藏中心获得了两个部分cDNA克隆。用该序列作为探针来筛选cDNA文库。分离了几乎全长的克隆。体外翻译并转录该基因，来证实该基因是与线粒体相对的质体基因。将翻译的蛋白质掺入分离的叶绿体中，并加工成成熟形式。
拟南芥E1βpPDH的cDNA序列和红藻pPDH的蛋白质序列，以及拟南芥mtPDH蛋白质序列的MACAW排列对比显示，拟南芥pPDH与红藻pPDH有68％相同性，与拟南芥mtPDH有37％的相同性。
实施例4
该实施例描述抗叶绿体PDH的E1α和E1β亚基的多克隆抗体的产生。
设计引物，使实施例3的D14和C12编码区掺入大肠杆菌表达载体pET24-a中。这两个表达构建体装配完成后，将一表达盒(由载体启动子、C12编码序列和载体终止子)从C12表达质体上切下，并掺入D14表达质体中，得到能同时表达pPDH两个亚基的串联表达质体。在大肠杆菌中作为不溶性包含体表达这些重组pPDH。将这些包含体纯化到几乎均一。将得到的蛋白质送到Biotechnology Instrumentation Facility of Iowa State University，在兔中产生多克隆抗体。通过免疫印迹试验测试兔的免疫前和免疫血清对原始抗原重组蛋白质的特异性和滴度。
实施例5
该实施例描述了克隆拟南芥ACL的A和B亚基的cDNA。
通过拟南芥EST(表达的序列标记)数据库的序列相似性检索，鉴定出cDNA克隆pACL-A1和pACL-B1。鉴定了EST cDNA pACL-A1(克隆ID TASG097，GenBank登录#Z18045)，因为其5’末端序列与人ATP-柠檬酸裂合酶的5’末端序列相似。鉴定了EST cDNA pACL-B1(克隆ID VBVYC01，GenBank登录#Z33810)，因为其5’末端序列与人ATP-柠檬酸裂合酶近中部的序列相似。从拟南芥生物资源中心(Ohio State University)获得了这两个克隆。在Iowa State University DNASequencing Facility，用ABI自动测序仪对两个克隆的二链进行了测序。
用BLAST序列检索公众可得的Arabidopsis GenomeInitiative(http：//genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/agi.html)产生的数据鉴定出ACL-A2序列。ACL-A2是拟南芥基因，其是ACL-A1cDNA的共生同源基因。即ACL-A2基因编码与ACL-A1cDNA编码的相同蛋白质，但由于这两条序列5’-和3’-非翻译区不同的事实，这两条序列代表ATP-柠檬酸裂合酶基因家族的不同成员。
通过在载体λgt10中用放射性标记的ACL-B1cDNA如Sambrook等(1989)见上所述，筛选从发育中的拟南芥长角果中分离的聚腺苷酸化RNA制备的拟南芥cDNA文库，鉴定出ACL-B2序列。简单说，使约200,000个该文库的重组噬菌体在有盖培养皿上生长，并复制到硝基纤维素膜上。将复制子滤膜在杂交溶液(5×SSC，1×Denhardt’s溶液，0.2％(w/v)SDS，10mM EDTA，0.1mg/ml鲑鱼精DNA，10％(w/v)葡聚糖硫酸酯，50mM Tris-HCl，pH8.0)中和32P-标记的探针一起65℃培育12小时。杂交后，65℃用2×SSC、0.5％(w/v)SDS、和依次用0.1×SSC和0.1％(w/v)SDS洗涤滤膜。噬斑纯化与探针杂交的重组噬斑，将cDNA插入物亚克隆入质体载体pBSK，供测序。得到的序列被称为ACL-B2，它是全长cDNA克隆，编码ACL-B亚基，并由ACL-B1的分离基因编码。ACL-B1和ACL-B2的核苷酸序列有约80％的相同性，并编码95％以上相同的两个多肽。
ACL-A1、ACL-A2、ACL-B1和ACL-B2与大鼠和人ACL具有高度的序列相同性。人ACL mRNA长度为4.3kb，编码1100残基的蛋白质。ACL-a1mRNA长度为1.5kb，编码423残基的蛋白质，具有与人ACL的N-末端50％的相同性。ACL-A2基因编码ACL-A1mRNA的共生同源mRNA；它们各编码98％以上相同的两个蛋白质，虽然它们的核苷酸序列仅约80％相同而其5’-和3’-非翻译区不同。ACL-A2基因包含12个外显子和13个内含子。部分ACL-B1cDNA长度为1.03kb，编码272个残基的多肽与人ACL的C-末端具有50％的相同性。全长ACL-B1mRNA长度是2.2kb。
推定的ACL-A和ACL-B多肽没有可识别的靶向序列，如大鼠和人ACL多肽，它们是细胞质多肽。
检索了许多序列数据库是否有其它ACL-A和ACL-B多肽的直向同源物。在酿酒酵母整个基因组中，未鉴定到直向同源物，这与该物种中缺少ACL活性相一致，(Kohlhaw和Tan-Wilson，细菌学杂志，129：1159-1161(1977))。然而，在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中已鉴定到ACL-A和ACL-B的直向同源物。ACL-A的直向同源物是一个基因的克隆，其位于粟酒裂殖酵母的染色体1上，其氨基酸与拟南芥ACL-A有60％以上的相同。粟酒裂殖酵母的ACL-B直向同源物是部分cDNA克隆，其氨基酸序列与拟南芥ACL-B具有60％相同性。两种粟酒裂殖酵母的直向同源物由于与动物ACL的高度序列相同性，都已被鉴定为ATP柠檬酸裂合酶。
ACL-B和ACL-A mRNA转录自两种不同基因。该结论的证据来自一系列实验。首先，用Xba I、Sac I、Hin dIII、Eco RI和Bam HI消化拟南芥DNA，并将ACL-A1 cDNA和ACL-B cDNA用作探针进行DNA印迹杂交。拟南芥DNA分别探测两种cDNA的杂交分析揭示，各cDNA与一组非重叠限制性片段杂交。第二，用pACL-B和pACL-B筛选基于λ的拟南芥基因组文库，导致分离得到分别与两种cDNA之一杂交的两组非重叠基因组克隆。对12个与pACL-A杂交的基因组克隆进行限制性消化和DNA印迹分析使这些克隆进一步被分成两组，这与基因组DNA印迹得到的，表明ACL-A mRNA是由小基因家族编码的数据相一致。基于类似分析，将8个pACL-B杂交基因组克隆被亚分类成3组，这与基因组DNA印迹得到的，表明ACL-B mRNA是由小基因家族编码的数据一致。第三，含有ACL-A基因(ACL-A1)之一的BAC克隆的序列表明，ACL-B基因不在ACL-A1基因的10kb之内。ACL-A1基因位于拟南芥的染色体1上，其基因序列被11个内含子所间断。
实施例6
该实施例描述了抗ACL的A和B亚基的多克隆抗体的产生。
在大肠杆菌中，使用pET30表达载体(Novagen，Madison，WI)表达了ACL-A和ACL-B序列。然后用制备级SDS-PAGE纯化表达的蛋白质，并用来免疫兔，得到抗血清。
用这些抗血清来探测拟南芥幼苗抽提物的蛋白质印迹。抗-ACL-A检测到一条45-kDa的多肽，其与由pACL-A(其编码423残基的多肽)序列预测的分子量十分接近。抗-ACL-B抗体检测到一条约70kDa的多肽，其与根据ACL-BmRNA(2.2kb)的大小推测的十分接近。
实施例7
该实施例描述了如何用编码酿酒酵母ACH的cDNA从植物中分离mtACH基因。
通过检索拟南芥EST(表达的序列标记)数据库(Arabidopsis GenomeInitiative(http：//genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/agi.html))与酵母ACHcDNA的序列相似性鉴定了编码植物mtACH的一个cDNA克隆。然后可从ABRC(Ohio State Resource Center)获得阳性克隆。然后可对该阳性克隆的两条链进行测序，例如通过使用ABI自动测序仪。
鉴于最近从该数据库鉴定mtACH EST的努力未获得任何阳性克隆(这可能由于Arabidopsis Genome Initiave仅含有约20％的基因组)，可通过现存酿酒酵母突变物的互补性从拟南芥克隆植物mtACH基因(Lee等(1990)见上)。可用质粒中文库表达的拟南芥cDNA(该质粒将在酵母中复制和表达那些基因)转化该突变物(Minet等，植物杂志2：417-422(1992))。然后可选择与酵母突变物互补，并恢复(如野生型)生长能力的克隆。然后可通过PCR拷贝ACH的拟南芥cDNA，并将此DNA片段克隆入pBS用于测序。
另外，可产生对该酵母ACH的抗血清，并用来分离的植物mtACH。然后可完整或部分测定分离的mtACH的氨基酸序列。可用该序列产生核酸探针，来筛选cDNA文库或基因组文库，以分离植物mtACH。然后可对植物的mtACH基因进行测序。
如需要，可用针对分离的植物mtACH的抗血清筛选表达mtACH的表达文库。可在兔中，用大肠杆菌转基因表达的蛋白质产生抗血清。例如，可将ACH的拟南芥cDNA作为翻译性融合物克隆入pET24表达载体。然后可将该质粒转化入大肠杆菌，在其中表达该蛋白质。然后可通过离心和SDS-凝胶电泳纯化作为包含体在细菌中积聚的蛋白质。将该蛋白质交给Iowa State University的Biotechnology Instrumentation Facility，在兔中产生多克隆抗体。通过免疫印迹试验测试兔的免疫前和免疫血清对原始抗原重组蛋白质的特异性和滴度。
实施例8
该实施例描述了克隆拟南芥ALDH cDNA。
用rf2基因编码的，推定的玉米线粒体ALDH氨基酸序列(Cui等，科学272：1334：1336(1996))，使用程序BLAST搜索dbEST数据库(National Library ofMedicine，National Institute of Health，Bethesda，Maryland)。这使得鉴定了7种拟南芥EST cDNA克隆(GenBank登录号R83958、Z26417、N96630、T13678、R86795、AA041030、AA395226)，它们获自Ohio State University的Arabidopsis Research Center(ABRC)，被各自测序。所有7种克隆是部分cDNA。使用这些EST cDNA作为探针，如实施例5中所述筛选拟南芥cDNA文库。结果分离得到对应于4种基因产物ALDH1、ALDH2、ALDH3、ALDH4的全长cDNA克隆。给出了拟南芥ALDH1(图12)、ALDH2(图13)、ALDH3(图14)、ALDH4(图15)的核苷酸序列和推定的氨基酸序列。由Arabidopsis Genome Initiative产生的，公众可得到的数据(http：//genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/agi.html)，使用ALDH1、ALDH2、ALDH3、ALDH4核苷酸序列进行的BLAST序列检索，确认了这些cDNA是4种不同基因的产物。这些基因分别存在于拟南芥染色体3，3，1和4上。在这些序列中，ALDH1和ALDH3编码最相似的两个蛋白质(它们之间有85％的序列相似性)，而ALDH1和ALDH3之间的相似性较低(66％)，ALDH1和ALDH4之间的相似性甚至更低(40％)。
实施例9
该实施例描述了克隆拟南芥PDC cDNA。
用两种拟南芥PDC基因的核苷酸序列(PDC1，GenBank登录#U71122、和PDC2，GenBank登录#U71122)，使用程序BLAST搜索dbEST数据库(NationalLibrary of Medicine，National Institute of Health，Bethesda，Maryland)。结果鉴定了6种拟南芥EST cDNA克隆，它们获自Ohio State University的Arabidopsis Research Center(ABRC)，并被测序。所有6种克隆是部分cDNA克隆，其中三种(GenBank登录#F14476、T04727和F14475)与PDC1基因序列匹配，而另三种(GenBank登录#N97215、Z35007和AA597828)与PDC2基因序列匹配。使用这些EST cDNA作为探针，如实施例5中所述筛选拟南芥cDNA文库。这导致分离得到对应于PDC1和PDC2基因的全长cDNA克隆。给出了拟南芥PDC1(图10)、PDC2(图11)的核苷酸序列和推定的氨基酸序列。PDC1和PDC2cDNA具有75％序列相同性，它们编码的蛋白质有82％的序列相同性或87％序列相似性。由Arabidopsis Genome Initiative产生的，公众可得到的数据(http：//genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/agi.html)，使用PDC1和PDC2核苷酸序列进行的BLAST序列检索确认了这些cDNA是两种不同基因的产物。这些基因分别存在于拟南芥染色体4和5中。
实施例10
该实施例描述了通过RNA印迹分析确认了在植物发育阶段ACL-A、ACL-B、PDH和ACS mRNA的积聚。
如前所述，从拟南芥叶、芽、花和长角果中抽提RNA(Weaver等，植物生理学110：1021(1995))。通过体外转录分别从pBSK克隆中获得了放射活性的ACL-A和ACL-B RNA。从280纳米和260纳米处的吸光度测定了RNA浓度。
用在含甲醛的琼脂糖凝胶中电泳组分分离了来自各组织样品的10微克RNA。将RNA转移到尼龙膜上后，在含有50％甲酰胺的缓冲液中，用32P-标记的RNA探针65℃杂交12-16小时。室温下用2×SSC，2％SDS漂洗杂交膜两次，每次各10分钟，然后65℃用0.1×SSC，0.1％SDS洗涤两次，每次各20分钟。将膜在磷荧光屏(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)下暴露4小时，用Storm840PhosphorImager(Molecular Dynamics)定量测各条带的放射性。
ACL-A和ACL-B mRNA的积聚图样在这些技术提供的分辨水平下是相同的。在长角果发育过程中，ACL-A和ACL-B mRNA在花芽和开花1-4天后长角果发育中积聚达最高水平。然而，ACL-A和ACL-B水平在开花8日后的长角果中逐渐减少，开花15天后的长角果中几乎检测不到。
在发育所有阶段的长角果中，PDH E1β亚基mRNA积聚的绝对水平(每总RNA)比ACS mRNA的要高。PDH E1β亚基mRNA积聚在含有经历快速油积聚(开花后5-7天)种子的长角果中非常高。
实施例11
该实施例描述了由原位杂交测定的，pPDH、ACS和ACL表达的时空模式。
收集拟南芥长角果(开花后1-13天)和花芽，切成3-4毫米的长条。固定组织，脱水，包埋并切片，如前所述(Wang等，美国植物学杂志82：1083(1995)；和Ke等，植物生理学113：357(1997))。
从含有ACL-A、ACL-B、E1βpPDH或ACS cDNA(克隆入pBluescript SK)的载体转录35S-标记的探针。如Ke等(1997)，见上所述，将标记探针与组织切片杂交。
重复原位杂交三次，使用两组已各自加工过的植物材料，都得到了相似结果。将含有长角果切片的对照载玻片与从上述载体转录得到的有义RNA探针杂交，实际上在这些玻片上未检测到信号。
使用RNA原位杂交，测定了pPDH、ACS、ACL-A和ACL-B表达的时空模式。并发现PDH mRNA的积聚在鱼雷式分段(torpedo-staged)和步行分段的胚胎中非常高，其中在油积聚阶段是最高的。该模式与异侧的乙酰辅酶A脱羧酶(ACC)的模式几乎相同。这些结果意味着pPDH可作为乙酰辅酶A质粒库的来源。与pPDH E1β亚基mRNA相反，编码ACS的mRNA在拟南芥胚胎中积聚水平非常低，最大的积聚发生在髓心部阶段的胚胎中，其后积聚降低。另外，ACS mRNA的积聚在吸收1-4日后种子胚根的根尖中，在花药丝(尤其靠近花丝和花药的接缝处)中，和在种子整个发育过程的珠柄中水平最高。ACS在花丝中的极高表达与该器官中质体乙酰辅酶A的某些作用一致。虽然ACS看来对提供乙酰辅酶A，用于油的脂肪酸合成并不重要，但pPDH的时空表达和该酶一致，与产生乙酰辅酶A，供发育种子中油的生物合成相关。ACL-A和ACL-B mRNA的时空模式在这些技术提供的分辨水平上是相同的。ACL-A和ACL-B mRNA在种皮(种子外壳)沉积前一天在胚珠内珠被中；在生长器官的表皮细胞中；在花药的绒毡层细胞中；和在幼叶的表皮和表皮毛状物中积聚至高水平。ACL-A和ACL-B与细胞质ACC的共积聚表明ACL产生了乙酰辅酶A细胞质库。表皮中mRNA更高水平的积聚可能与角质层蜡形成相关。ACL-A、ACL-B和ACC mRNA在种皮沉积前一天在内珠被中的共积聚可能和类黄酮多聚物栎鞣红的沉积相关(Stafford，“酚醛塑料的代谢与调节：我们知识中的缺口”植物化学物质和健康，D.L.Gustine和H.E.Flores，编辑.Amer.Soc.Plant Physiol.(1995))。
实施例12
该实施例描述了拟南芥抽提物ACL-A和ACL-B多肽的免疫沉淀对ACL活性的作用。
可用实施例6的抗体来测定免疫沉淀对拟南芥抽提物中的ACL活性的作用。将等份的拟南芥抽提物和递增量的各抗血清或和对照免疫前血清混合。冰上培育后，将抗原-抗体复合物与蛋白A-琼脂糖珠结合，离心沉降该琼脂糖珠。测试上清液的ACL活性。
可采取最初为动物开发(Takeda等，酶学方法27：153-160(1969))，并已用于确定豌豆(Kaethner和ap Rees，Planta 163：290-294(1985))和芸苔(Ratledge等，脂类32：7-12(1997))抽提物中ACL的分光光度试验来测定ACL酶活性。该试验将草酰乙酸产物的出现速率与用苹果酸脱氢酶氧化NADH结合起来，得到340纳米处可测量的吸光度改变。
实施例13
该实施例描述了植物中乙酰辅酶A水平如何通过增加参与乙酰辅酶A产生的一种或多种基因的拷贝数而提高。
可通过提高一种或多种与乙酰辅酶A产生有关的酶的积聚而增加植物细胞中产生的乙酰辅酶A水平。这可通过将该一种或多种基因的额外拷贝引入该生物体的基因组而实现。将各种产生乙酰辅酶A的基因克隆入合适的转化载体(可选择的标记基因)，并将该载体转化入所选的生物体中。根据该标记基因选择转化物。通过DNA印迹分析推定转化物的DNA，确认转化物。在某些情况下，该单转化事件将引入多个拷贝的产生乙酰辅酶A的基因。另外，将多个产生乙酰辅酶A基因的拷贝克隆入转化载体中。另外，将产生乙酰辅酶A的基因克隆入携带有不同的可选择标记基因的转化载体中，并进行多重转化，来引入乙酰辅酶A产生基因的多个拷贝。在某些情况下，需要引入乙酰辅酶A产生基因的组合。这可通过将乙酰辅酶A产生基因的组合克隆入同一转化载体，或克隆入不同转化载体(其携带有不同的可选择标记基因)而实现。
实施例14
该实施例描述了如何通过提高一个或多个参与乙酰辅酶A产生的基因的表达，来增加植物中乙酰辅酶A的水平。
可通过增加一种或多种产生乙酰辅酶A的酶的积聚，来提高植物细胞中产生的乙酰辅酶A的水平。这可通过在生物体的基因组中引入数拷贝的一种或多种产生乙酰辅酶A的基因，或引入与新的表达调控序列(其以比正常水平更高的表达产生乙酰辅酶A的基因)融合的cDNA。可将产生乙酰辅酶A的基因或cDNA的一个拷贝与转录或翻译调控序列的上游(5’)和/或下游(3’)融合，并将该嵌合基因克隆到合适的，携带有可选择的标记基因的转化载体中去，将该载体转化入所选的生物体。根据该标记基因选择转化体。通过DNA印迹分析来自推定转化体的DNA，确认了转化体。可将每个新的乙酰辅酶A产生基因的多个拷贝，或新的乙酰辅酶A产生的基因的组合引入实施例12所述的生物体的基因组中。
实施例15
该实施例描述了通过使用反义技术，如何降低植物中乙酰辅酶A的水平。
通过减少参与乙酰辅酶A产生的一种或多种酶的积聚，可降低植物细胞中产生的乙酰辅酶A的水平。这可通过将表达参与乙酰辅酶A产生的一种或多种酶的反义RNA的转基因，引入基因组来实现。该反义RNA基因包含：编码产生乙酰辅酶A的酶的cDNA，其与转录或翻译调控序列的上游(5’)和/或下游(3’)融合，该cDNA与正常朝向相反。将该反义基因克隆入合适的转化载体，并转化入实施例14所述的基因组中。可将该反义基因的多个拷贝引入如实施例14所述的基因组。可将乙酰辅酶A产生酶的组合的反义基因引入实施例14所述的基因组。
实施例16
该实施例描述了如何用核酶降低植物中乙酰辅酶A的水平。
可通过减少一种或多种产生乙酰辅酶A的酶的积聚，来降低植物细胞中产生的乙酰辅酶A的水平。这可通过在基因组中引入表达针对编码乙酰辅酶A产生酶的mRNA的核酶的转基因来实现。该含有核酶的基因包含全长或部分的cDNA，它们编码与正常朝向相反的乙酰辅酶A产生酶，其中插入了核酶序列。将该含有核酶的cDNA与转录或翻译调控序列的上游(5’)和/或下游(3’)融合。将含有核酶的该基因克隆入合适的转化载体，并转化入实施例14所述的基因组中。可将多个拷贝的含有核酶的基因引入实施例14所述的基因组中。可将含有针对乙酰辅酶A产生酶的组合的核酶的基因，引入实施例14所述的基因组中。
实施例17
该实施例描述了使用基因替换，如何提高或降低植物中乙酰辅酶A水平。
可通过改变一种或多种产生乙酰辅酶A的酶的活性，来改变植物细胞中产生的乙酰辅酶A的水平。这可用一种基因替换方法，通过同源重组来实现。在该方法中，内源性乙酰辅酶A产生基因被诱变的乙酰辅酶A产生基因所替换。该诱变的乙酰辅酶A产生基因编码一种产生乙酰辅酶A的酶，该酶催化效率比内源性、被替换的基因编码的酶高或低。该乙酰辅酶A产生基因由于一个或多个核苷酸缺失、插入、重复或替换而被诱变。将该诱变的基因与可选择标记基因融合，并引入细胞中。根据该可选择标记基因，选择可导致基因替换的同源重组。用DNA印迹分析或PCR和DNA测序确认基因替换。
实施例18
该实施例描述了如何使用共抑制降低植物中乙酰辅酶A水平。
可通过减少一种或多种产生乙酰辅酶A的酶的积聚，来降低植物细胞中产生的乙酰辅酶A的水平。这可用共抑制来实现。例如将编码乙酰辅酶A产生酶的cDNA与转录或翻译调控序列的上游(5’)和/或下游(3’)融合，并将该嵌合基因克隆入合适的转化载体中，该载体携带有可选择标记基因，将该载体转化入所选的生物体中。根据该可选择标记基因，选择转化体。用DNA印迹分析推定转化体的DNA，确认转化体。大部分从这些实验衍生而得的转基因生物体将表达该转基因。然而，在一些情况下，该转基因将共抑制内源性乙酰辅酶A产生基因的表达。为了鉴定这些共抑制植物，将分析至少100株转基因植物的抽提物有无乙酰辅酶A产生酶的酶促活性。
实施例19
该实施例描述了如何通过在模型生物(即拟南芥)中过度表达一种产生乙酰辅酶A的酶(如ACS)，来增加乙酰辅酶A的水平。
将全长ACS cDNA克隆入一种植物表达载体，如pBI101，花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(CaMV，35S启动子)的下游。将得到的重组载体转化入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。用得到的菌株通过真空过滤方案来转化拟南芥植物。即将拟南芥的花芽浸在根癌农杆菌菌株培养液中1-5分钟。使植物产生种子，并收集。
使种子在含有50-100微克/毫升卡那霉素的琼脂培养板上发芽，将在该培养基上生长的带抗性、转化的幼苗转移到土壤中。收集10到50株分别转化的幼苗，并使其开花并结籽。种子的T2子代和转基因是纯合的。从得到的T2代幼苗中抽提DNA，并用ACS cDNA和CaMV 35S启动子作为探针进行DNA印迹分析，确认了该种子的转基因性质。
测试了转基因植物的ACS转基因的表达，提高的ACS活性和增加的乙酰辅酶A积聚。
通过分析ACS mRNA和多肽的积聚进行ACS转基因的表达。可通过与ACScDNA进行RNA杂交，或通过用ACS转基因特异性探针的RNase保护试验来检测ACS mRNA。
可通过蛋白质印迹分析经SDS-PAGE分离的总蛋白质，并用ACS特异性抗体探测，来检测ACS多肽。通过与标记乙酸在辅酶A和ATP存在下培育抽提物，来测定ACS活性，并监测标记的乙酰辅酶A的产生。通过用10％三氯乙酸抽提幼苗来监测乙酰辅酶A的积聚。
用C-18反相柱对得到的抽提物进行高效液相层析。洗脱液是KH2PO4，pH5.5，溶于乙腈。通过与真乙酰辅酶A共洗脱鉴定乙酰辅酶A的洗脱。基于254纳米的吸光度测定了乙酰辅酶A的浓度。
实施例20
该实施例描述了如何通过在模型生物(即拟南芥)中表达产生乙酰辅酶A的酶(如ACS)的反义RNA，降低乙酰辅酶A的水平。
将全长(或部分片段)ACS cDNA克隆入一种植物表达载体，如pBI101，花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(CaMV，35S启动子)的下游，但朝向与正常相反。将得到的重组载体转化入根癌农杆菌。用得到的菌株通过真空过滤方案来转化拟南芥植物。即将拟南芥的花芽浸在根癌农杆菌菌株培养液中1分钟。使植物产生种子，并收集。
使种子在含有50-100微克/毫升卡那霉素的琼脂培养板上发芽，将在该培养基上生长的带抗性、转化的幼苗转移到土壤中。收集L0到50株分别转化的幼苗，并使其开花并结籽。种子的T2子代和转基因是纯合的。从得到的T2代幼苗中抽提DNA，并用ACS cDNA和CaMV 35S启动子作为探针进行DNA印迹分析，确认了种子的转基因性质。
测试了转基因植物的反义ACS转基因的表达，降低的ACS多肽积聚，降低的ACS活性和减少的乙酰辅酶A积聚。
通过分析ACS反义RNA的积聚进行反义ACS转基因的表达。从转基因幼苗中抽提RNA，用RNA杂交或用ACS有义链核糖探针进行RNase保护试验，来检测ACS反义RNA。
可通过蛋白质印迹分析经SDS-PAGE分离的总蛋白质，并用ACS特异性抗体探测，来检测ACS多肽。通过与标记乙酸在辅酶A和ATP存在下培育抽提物，来测定ACS活性，并监测标记的乙酰辅酶A的产生。
通过用10％三氯乙酸抽提幼苗来监测乙酰辅酶A的积聚。用C-18反相柱对得到的抽提物进行高效液相层析。洗脱液是KH2PO4，pH5.5，溶于乙腈。通过与真乙酰辅酶A共洗脱鉴定乙酰辅酶A的洗脱。根据254纳米的吸光度测定了乙酰辅酶A的浓度。
实施例21
该实施例描述了用有义和反义核酸改变植物中ACS的浓度。
将全长的ACS cDNA克隆入称为pCB200的植物表达载体，该表达载体衍生自载体pBI121(Clontech)，通过用大肠杆菌BAR基因替换卡那霉素抗性(kan-r)基因，来产生对除草剂Liberty的抗性(Becker等，植物分子生物学20：1195-1197(1992))。将全长ACS cDNA克隆入pCB200，CaMV 35S启动子的下游，对于有义和反义表达，分别是正常或相反朝向，使用标准技术(Sambrook，分子克隆：实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory New York(1989))。根据厂商建议的方案使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶(Gibco BRL，Grand Island，NY)。将得到的载体分别转化入根癌农杆菌。用得到的菌株通过真空过滤方案，根据Bechtold等所述方案转化拟南芥(生态型Columbia)植物(分子生物学方法82：259-266(1993))。简单说，将拟南芥的花芽浸在根癌农杆菌菌株培养液中1分钟。使植物产生种子，并收集。
通过将种子播在无菌土壤中选择转基因植物。14天后，用0.5％草丁膦(w/v)(除草剂Liberty的活性组分)喷撒在幼苗上。非转基因植物在约7日内死亡，而转基因植物存活，并长到成熟，收集种子。
将独立转化的植物的各转基因种系看作独立的转化事件。在下面的子代中，从独立的转基因种系收集种子，并进一步测试对除草剂Liberty的抗性。考虑当仅有一个转基因拷贝掺入其基因组，而且所有测试的子代幼苗(50以上)对除草剂Liberty有抗性时，认为该转基因种系是纯合的。
产生了两种ACS反义植物的转基因种系。通过T3代分析了第一种系的特性，观察到低至野生型20％的ACS酶活性水平。通过T2代分析了第二种系的特性，观察到低至野生型11％的ACS酶活性水平。
产生了20种ACS有义植物的转基因种系。通过T3代分析了一个种系的特性，而通过T2代分析了所有其它种系的特性。观察到高至野生型166％到219％的ACS酶活性水平。
因此，这些数据显示产生乙酰辅酶A的ACS的表达可被提高或降低。
实施例22
该实施例描述了用反义核酸改变植物中pPDH的水平。
使用实施例21的方法，将全长pPDH E1α或pPDH E1β的cDNA克隆入称为pCB200的植物表达载体，CaMV 35S启动子的下游，对于反义RNA表达，朝向与正常相反。产生了两种pPDHE1α反义植物的转基因种系，和三种pPDHE1β反义植物的转基因种系，通过T1代培养它们。将根据实施例21的方法分析这些植物。
实施例23
该实施例描述了用有义和反义核酸改变植物中ALDH的水平。
使用实施例21的方法，将全长ALDH cDNA克隆入植物表达载体，对于有义和反义表达，朝向分别是正常和相反：
pCGN8641，napin启动子，kan-r基因(2有义；1反义)
pCGN8643，napin启动子，kan-r基因(2反义；1有义)
pCGN8640，CaMV 35S启动子，植物抗性基因bar(Liberty除草剂)(2反义；1有义)
pCGN8644，CaMV 35S启动子，bar基因(2有义；1反义)
pKMB(Mylne和Botella，植物分子生物学报道16：257-262(1998))，CaMV35S启动子，bar基因(3有义)
pSMB(Mylne和Botella(1998)，见上)，CaMV 35S启动子，bar基因(3反义)。
从pCGN1558构建了用于植物转化的二分载体，pCGN5139(McBride和Summerfelt，植物分子生物学14：269-276(1990))。用含有独特限制性内切核酸酶位点，AscI、PacI、XbaI、SwaI、BamHI和NotI的多接头替换作为HindIII/Asp718片段的pCGN1558的多接头。在pCGN5139中保留了Asp718和HiddIII限制性内切酶位点。
构建一系列超二分载体，来迅速将DNA序列克隆入含有转录起始区(启动子)和转录终止区的二分载体中。
通过将寡核苷酸5′-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCT G C AGG-3′[SEQ ID NO：31]和5’-TCGACCTGCAGGAAGCTTGC GGCCGCGGATCC-3′[SEQ ID NO：32]连接入用Sal I/Xho I消化的pCGN7770中，构建了质体pCGN8618。通过Asp718I消化从pCGN8618上切下含有napin启动子、多接头和napin 3′区的片段；用Klenow片段填充5′突出端将该片段两端补成平头，然后连接入已用Asp718I和Hin dIII消化的pCGN5139，用Klenow片段填充5′突出端将两端补成平头。质体所含插入物的朝向使napin启动子和pCGN5139的平端Asp18I位点最接近，和使napin 3′和平端Hin dIII位点最接近。对该质体进行序列分析，确认两种插入物朝向和克隆接头的完整性。得到的质体被称为pCGN8622。
通过将寡核苷酸5′-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGG ATCC-3′[SEQ ID NO：33]和5′-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAG CTTCCTGCAGG-3′[SEQ ID NO：34]连接入用Sal I/Xho I消化的pCGN7770中，构建了质体pCGN8619。通过Asp718I消化，从pCGN8619上取出含有napin启动子、多接头和napin 3′区的片段；用Klenow片段填充5′突出端将该片段两端补成平头，然后连接入已用Asp718I和Hin dIII消化的pCGN5139，用Klenow片段填充5′突出端将两端补成平头。质体所含插入物的朝向使napin启动子和pCGN5139的平端Asp18I位点最接近，和使napin 3′和平端Hin dIII位点最接近。对该质体进行序列分析，确认两种插入物朝向和克隆接头的完整性。得到的质体被称为pCGN8623。
通过将寡核苷酸5′-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGGAGCT-3′[SEQ ID NO：35]和5′-CCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3′[SEQ ID NO：36]连接入用Sal I/Sac I消化的pCGN7787中，构建了质体pCGN8620。通过Asp718I完全消化和NotI部分消化，从pCGN8620上取出含有d35S启动子、多接头和tml3′区的片段。用Klenow片段填充5′突出端将该片段两端补成平头，然后连接入用Asp718I和Hin dIII消化的pCGN5139，用Klenow片段填充5′突出端将两端补成平头。质体所含插入物的朝向使d35S启动子和pCGN5139的平端Asp18I位点最接近，和使tml 3′和平端Hin dIII位点最接近。对该质体进行序列分析，确认两种插入物朝向和克隆接头的完整性。得到的质体被称为pCGN8624。
pCGN8640是pCGN8624的修饰体。用Rfu聚合酶将从转座子Tn7分离的，编码细菌壮观霉素和链霉素抗性，一种大肠杆菌和农杆菌选择的决定簇的938bp PstI片段(Fling等，核酸研究13(19)：7095-7106(1985))平端补齐。将该平端片段连接入已用SpeI消化的pCGN8624中，并用Pfu聚合酶补齐平端。对含有PstI片段的区域进行测序，来确认插入物朝向和克隆的完整性。
 如下，将壮观霉素抗性标记引入pCGN8622和pCGN8623。将来自pCGN8640的7.7Kbp的AvrII-SnaBI片段与来自pCGN8623或pCGN8622的10.9Kbp的AvrII-SnaBI片段连接。得到的质体分别是pCGN8641和pCGN8643。
通过将寡核苷酸5’-GATCACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCCAATGCA-3’[SEQ ID NO：37]和5’-TTGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGGT-3’[SEQ ID NO：38]连接入用Bam HI-PstI消化的pCGN8640，构建了质体pCGN8644。
根据实施例21的方法产生并分析了转基因植物，除了根据卡那霉素抗性选出用载体pCGN8641和pCGN8643产生的转基因植物外。对于该选择，通过将种子在50％(v/v)常用漂白剂(5.25％次氯酸钠)和0.02％Triton X-100中培育7分钟，然后用无菌水漂洗三次，来对种子进行表面灭菌。将种子播种在含有MS选择培养基(50μg/ml卡那霉素，1x Murashige和Skoog′s盐(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)，1％蔗糖，1x Gamborg′s维生素(Sigma)，0.5g/1MES，pH 5.7，和0.8％纯化琼脂(Becton Dickinson，Cockeysville，MD))的Petri平板上。播种后约10到14日，将卡那霉素抗性的幼苗转移到无菌土壤上(Sunshine Mix，SunGro Horticulture，Bellevue，WA)。23℃在连续光照或16小时光照然后是8小时黑暗的光周期下，使植物生长。每周用Nutriculture soluble fertilizer special blend21-8-18(Plant Marvel Laboratory，Chicago Heights，IL)给植物浇水一次。
将独立转化植物的各转基因种系看作是独立的转化事件。在下面的子代中，从独立的转基因种系收集种子，并进一步在MS选择培养基上培养，调查卡那霉素抗性性状的分离。对于卡那霉素抗性分离的各次试验，使用了30颗以上的种子。当仅有一个转基因拷贝掺入其基因组，而且所有测试的子代幼苗(50以上)是卡那霉素抗性时，才认为转基因种系是纯合的。
实施例24
该实施例描述了用有义和反义核酸改变植物中的PDC水平。
使用实施例21的方法，将全长PDC cDNA克隆入植物表达载体，对于有义和反义表达，朝向分别是正常和相反，见下：
pCGN8641，napin启动子，kan-r基因(1有义；1反义)
pCGN8643，napin启动子，kan-r基因(1有义)
pCGN8640，CaMV 35S启动子，bar基因(1有义)
pCGN8644，CaMV 35S启动子，bar基因(1有义)
pKMB，CaMV 35S启动子bar基因(1反义)
pSMB，CaMV 35S启动子，bar基因(1反义)。
根据实施例21和23的方法产生和分析了转基因植物。
实施例25
该实施例描述了用有义和反义核酸改变植物ACL水平。
使用实施例21的方法，将全长ACL-A1或ACL-B2cDNA克隆入植物表达载体，对于有义和反义表达，朝向分别是正常和相反，见下：
pBI121衍生质体，CaMV 35S启动子，kan-r基因(1 ACL-A1有义；1 ACL-B2有义；1 ACL-A1反义；1 ACL-B2反义)
pBI121衍生质体，缺失CAC1启动子(CAC1启动子的核苷酸-529到+32，其中核苷酸编号相对于ATG翻译起始密码子的腺嘌呤核苷(它是+1)，kan-r基因(1 ACL-A1有义；1 ACL-B2有义)
pBI121衍生质体，CaMV 35S启动子，kan-r基因(1 ACL-A1(与质体靶序列融合)有义)。
如实施例23所述，根据卡那霉素抗性选出了所有转基因植物。
产生了含有缺失CAC1启动子控制下的有义ACL-A1的转基因植物，并已通过T2子代进行了培育。这些植物显示叶子非常大的改变的表型。
产生了含有在CaMV 35S启动子控制下的反义ACL-A1的转基因植物，并已通过T2子代培育。这些植物显示两种表型。一种表型包括：缩小了很多的植物体，更短和更细的开花茎，更小的花或不开花，缩小或偶尔提前枯萎的花瓣，定时或开裂机制有明显问题的花粉囊，如存在长角果，是缩小的，部分装有种子，或是空的，在长角果中有小而干燥的种子，有种子的长角果中提前成熟开裂，而且叶子大大缩小，显示花青素产生。
另一种表型包括：更小的植株，具有前一种表型特征的较温和变体，更细，卷曲的长角果，具有更易于鉴别的外部种子轮廓，其中常含有萎缩、干燥的种子，而且开裂延迟。
根据实施例21和23的方法产生并分析了其它转基因植物。
所有在本文中引用的文献，包括专利、专利申请和出版物，在此全文引入以供参考。
虽然本发明已着重于优选例进行了描述，但本领域普通技术人员显然将明白，可在优选例中制备和使用各种变化，而且除了本文中特别描述的以外，可用其它方式实施本发明。本发明将包括这些变化和其它实施方式。因此，本发明包括在本发明权利要求中所确定的精神和范围内的所有变化。

Claims (14)

1.一种分离和纯化的核酸分子，其特征在于，该核酸分子编码SEQ ID NO：22的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，该核酸分子是SEQ ID NO：IDNO：21。
3.一种分离和纯化的核酸分子，其特征在于，该核酸分子编码SEQ ID NO：26的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，该核酸分子是SEQ ID NO：IDNO：25。
5.一种载体，其特征在于，该载体包含权利要求1或2任一项所述的核酸分子。
6.一种载体，其特征在于，该载体包含或编码编码SEQ ID NO：22或SEQID NO：26的植物醛脱氢酶的RNA分子的反义序列。
7.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞包含权利要求5或6所述的载体。
8.一种多肽，其特征在于，该多肽具有SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：26的氨基酸序列。
9.编码SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：26的植物醛脱氢酶的RNA分子的反义分子。
10.具有SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：26的植物醛脱氢酶的RNA分子的用途，其特征在于，该RNA分子用于被核酶切割。
11.一种改变植物细胞、植物组织、植物器官或植物中醛脱氢酶水平的方法，其特征在于，该方法包括：使植物细胞、植物组织、植物器官或植物与包含以下核酸分子的载体接触，这些核酸分子选自(i)一种基因，该基因编码酶，或如果酶由亚基构成，则编码该酶的亚基，这些酶是醛脱氢酶，所述醛脱氢酶是由权利要求1所述的核酸分子编码的；(ii)一种核酸分子，是(i)的基因转录而得的RNA分子的反义序列，和(iii)一种核酸分子，它包含或编码针对从(i)的基因转录而得的RNA分子的核酶，其中包含核酸分子(i)的所述载体能提高或降低所述植物细胞、植物组织、植物器官或植物中的所述酶水平，而包含(ii)或(iii)的核酸分子的所述载体能降低所述植物细胞、植物组织、植物器官或植物中的所述醛脱氢酶水平。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述醛脱氢酶水平的改变导致所述植物细胞、植物组织、植物器官或植物中乙酰辅酶A水平的改变。
13.一种植物细胞或植物组织，其特征在于，按照权利要求11所述的方法，改变了其中醛脱氢酶的水平。
14.一种植物细胞或植物组织，其特征在于，已按照权利要求12所述的方法改变了其中乙酰辅酶A的水平。
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