KR101774400B1 - 1,3-부탄다이올 생산 유기체 - Google Patents

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Abstract

비-천연 미생물 유기체는 1,3-부탄다이올(1,3-BDO)을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 1,3-BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 갖는 1,3-BDO 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함한다. 상기 경로는 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제(thiolase), AKP 데하이드로게나제(dehydrogenase), 2-아미노-4-하이드록시펜타노에이트 아미노트랜스퍼라제(aminotransferase), 2-아미노-4-하이드록시펜타노에이트 옥시도리덕타제(oxidoreductase)(탈아민화), 2-옥소-4-하이드록시펜타노에이트 데카복실라제(decarboxylase), 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제(reductase), AKP 아미노트랜스퍼라제, AKP 옥시도리덕타제(탈아민화), 2,4-다이옥소펜타노에이트 데카복실라제, 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(케톤 환원), 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(알데하이드 환원), 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제, AKP 데카복실라제, 4-아미노부탄-2-온 아미노트랜스퍼라제, 4-아미노부탄-2-온 옥시도리덕타제(탈아민화), 4-아미노부탄-2-온 암모니아-라이아제(lyase), 부텐온 하이드라타제(hydratase), AKP 암모니아-라이아제, 아세틸아크릴레이트 데카복실라제, 아세토아세틸-CoA 리덕타제(CoA-의존성, 알데하이드 형성), 아세토아세틸-CoA 리덕타제(CoA-의존성, 알콜 형성), 아세토아세틸-CoA 리덕타제(케톤 환원), 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제(dehydratase), 및 크로토나제(crotonase)로 이루어진 군 중에서 선택된 효소를 포함한다. 1,3-BDO의 생산 방법은 1,3-BDO를 생산하기에 충분한 기간 동안 조건 하에서 상기와 같은 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함한다.

Description

1,3-부탄다이올 생산 유기체{ORGANISMS FOR THE PRODUCTION OF 1,3-BUTANEDIOL}
본원은 2009년 4월 30일자로 출원된 미국 가 출원 제 61/174,473 호를 우선권 주장하고, 상기 출원은 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
본 발명은 일반적으로, 유기 화합물을 생산할 수 있는 생합성 방법 및 유기체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 범용 소재 화학물질인 1,3-부탄다이올을 생산할 수 있는 비-천연 유기체에 관한 것이다.
1,3-부탄다이올(1,3-BDO)은 전통적으로 아세틸렌으로부터 그의 수화를 통해 생성되는 4 탄소 다이올이다. 이어서 상기 생성되는 아세트알데하이드는 3-하이드록시부티르알데하이드로 전환되고, 이는 후속적으로 환원되어 1,3-BDO를 형성한다. 보다 최근 수년간, 아세틸렌은 아세트알데하이드의 공급원으로서 덜 비싼 에틸렌에 의해 대체되어 왔다. 1,3-BDO는 식품 풍미제용 유기 용매로서 흔히 사용된다. 상기 화합물은 또한 폴리유레탄 및 폴리에스터 수지용 공-단량체로서 사용되며 혈당강하제로서 널리 사용된다. 광학적으로 활성인 1,3-BDO는 생물학적 활성 화합물 및 액정의 합성에 유용한 출발 물질이다. 1,3-부탄다이올의 실질적인 상업적 용도는 후속 탈수되어, 합성 고무(예를 들어 타이어), 라텍스 및 수지의 제조에 연간 250억 lb가 사용되는 1,3-부타다이엔을 제공하는 것이다(Ichikawa et al., J. of Molecular Catalysis A-Chemical, 256:106-112(2006); Ichikawa et al., J. of Molecular Catalyst A-Chemical, 231:181-189(2005)). 아세틸렌이나 에틸렌의 석유 기재 원료유에 대한 의존성은 1,3-부탄다이올 및 부타다이엔으로의 재생 가능한 원료유 기재 경로의 개발을 정당화한다.
따라서, 1,3-BDO의 생산을 위한 미생물 및 그의 사용 방법을 개발할 필요가 있다. 본 발명은 상기 필요성을 만족시키며 또한 관련된 이점을 제공한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 1,3-부탄다이올(1,3-BDO)을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 1,3-BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 갖는 1,3-BDO 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체에 관한 것이다. 상기 1,3-BDO 경로는 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제(thiolase), AKP 데하이드로게나제(dehydrogenase), 2-아미노-4-하이드록시펜타노에이트 아미노트랜스퍼라제(aminotransferase), 2-아미노-4-하이드록시펜타노에이트 옥시도리덕타제(oxidoreductase)(탈아민화), 2-옥소-4-하이드록시펜타노에이트 데카복실라제(decarboxylase), 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제(reductase), AKP 아미노트랜스퍼라제, AKP 옥시도리덕타제(탈아민화), 2,4-다이옥소펜타노에이트 데카복실라제, 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(케톤 환원), 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(알데하이드 환원), 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제, AKP 데카복실라제, 4-아미노부탄-2-온 아미노트랜스퍼라제, 4-아미노부탄-2-온 옥시도리덕타제(탈아민화), 4-아미노부탄-2-온 암모니아-라이아제(lyase), 부텐온 하이드라타제(hydratase), AKP 암모니아-라이아제, 아세틸아크릴레이트 데카복실라제, 아세토아세틸-CoA 리덕타제(CoA-의존성, 알데하이드 형성), 아세토아세틸-CoA 리덕타제(CoA-의존성, 알콜 형성), 아세토아세틸-CoA 리덕타제(케톤 환원), 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제(dehydratase), 및 크로토나제(crotonase)로 이루어진 군 중에서 선택된 효소를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 1,3-BDO를 생산하기에 충분한 기간 동안 조건 하에서 상기와 같은 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는, 1,3-BDO의 생산 방법에 관한 것이다.
도 1은 알라닌으로부터 1,3-BDO로의 경로를 도시한다. 효소는 A) AKP 티올라제, B) AKP 아미노트랜스퍼라제 또는 AKP 옥시도리덕타제(탈아민화), C) 2,4-다이옥소펜타노에이트 데카복실라제, D) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(알데하이드 환원), E) AKP 데카복실라제, F) 4-아미노부탄-2-온 암모니아-라이아제, G) 부텐온 하이드라타제, H) 4-하이드록시,2-부탄온 리덕타제, I) AKP 암모니아-라이아제, J) 아세틸아크릴레이트 데카복실라제, K) 4-아미노부탄-2-온 아미노트랜스퍼라제 또는 4-아미노부탄-2-온 옥시도리덕타제(탈아민화), L) AKP 데하이드로게나제, M) 2-아미노-4-하이드록시펜타노에이트 아미노트랜스퍼라제 또는 2-아미노-4-하이드록시펜타노에이트 옥시도리덕타제(탈아민화), N) 2-옥소-4-하이드록시펜타노에이트 데카복실라제, O) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(케톤 환원), 및 P) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제이다.
도 2는 아세토아세틸-CoA로부터 1,3-부탄다이올로의 경로를 도시한다. 효소는 A) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(CoA-의존성, 알데하이드 형성), B) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(케톤 환원), C) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제, D) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(CoA-의존성, 알콜 형성), E) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(알데하이드 환원), F) 4-하이드록시,2-부탄온 리덕타제, G) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(케톤 환원), H) 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), 및 I) 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성)이다.
도 3은 4-하이드록시부티릴-CoA로부터 1,3-부탄다이올로의 경로를 도시한다. 효소는 A) 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제, B) 크로토나제, C) 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), D) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제, 및 E) 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성)이다.
도 4는 3-하이드록시부티릴-CoA에 대해 현저한 활성을 나타내는 알데하이드 데하이드로게나제를 도시한다.
도 5는 투석 전후에 3-하이드록시부티릴-CoA에 대한 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)으로부터의 bld의 비-활성(specific activity)을 도시한다.
도 6은 3-하이드록시부티르알데하이드를 기질로서 첨가했을 경우 및 기질이 없는 대조용 샘플 중의 1,3-BDO 농도를 도시한다. 알콜 데하이드로게나제에 대한 GI 번호를 도시한다.
도 7은 3-하이드록시부티릴-CoA를 기질로서 첨가했을 경우 및 기질이 없는 대조용 샘플 중의 1,3-BDO 농도를 도시한다. 알콜 데하이드로게나제에 대한 GI 번호를 도시한다. 함께 시험된 알데하이드 데하이드로게나제에 대한 GI 번호는 163762382이다.
본 발명은 부분적으로 1,3-부탄다이올(1,3-BDO) 생산을 촉진하는 효소를 암호화하는 유전자를 발현하는 비-천연 미생물에 관한 것이다. 본 발명에 개시된 1,3-부탄다이올의 생산을 위한 경로는 3 개의 전구체를 기본으로 한다: (i) D-알라닌, (ii) 아세토아세틸-CoA, 및 (iii) 4-하이드록시부티릴-CoA. 이들 경로의 성공적인 공학은 충분한 활성 및 특이성을 갖는 적합한 세트의 효소를 동정하고, 이의 상응하는 유전자를 생산 숙주 내로 클로닝하고, 발효 조건을 최적화하고, 발효에 따른 생성물 형성을 분석함을 수반한다.
알라닌의 1,3-BDO로의 전환은 도 1에 도시된 바와 같이 대략 5 개의 효소 단계에서 다수의 경로들에 의해 수행될 수 있다. 모든 경로의 첫 번째 단계(단계 A)에서, 알라닌 및 아세틸-CoA가 고도의 선택성 효소인 2-아미노-4-케토펜타노에이트 티올라제에 의해 결합된다. 이어서 상기 반응의 생성물인 2-아미노-4-옥소펜타노에이트(AKP)는 도 1에 도시된 바와 같이 트랜스아민화되거나, 환원되거나, 탈카복실화되거나 또는 탈아민화될 수 있다. 상기 1,3-BDO의 생산에 대한 추가의 합성 단계들은 하기에 상세히 논의된다. 상기 각 경로들로부터의 1,3-BDO의 이론적인 수율은 소비된 글루코스 몰당 약 1.09 몰인 것으로 계산된다.
도 2는 아세토아세틸-CoA로부터 1,3-BDO를 생산하는 다수의 경로들을 개략한다. 아세토아세틸-CoA로부터 1,3-BDO로의 이들 경로들은 각각 3 개의 환원 당량을 사용하며 소비된 글루코스 몰당 1 몰의 1,3-BDO의 이론적인 수율을 제공한다. 합성가스(syngas)와 같은 다른 탄소 기질들을 또한 아세토아세틸-CoA의 생산에 사용할 수 있다. 글루코스를 기체화하여 합성가스를 형성한 결과 소비된 글루코스 몰당 최대 1.09 몰의 1,3-BDO의 이론적 수율이 생성될 것이며, 이는 글루코스로부터 6 몰의 CO와 6 몰의 H2가 수득되는 것으로 추정된다.
6 CO + 6 H2 → 1.091 C4H10O2 + 1.636 CO2 + 0.545 H2
4-하이드록시부티릴-CoA는 도 3에 도시된 바와 같이 1,3-BDO를 포함하여, 다수의 산업적으로 유용한 화합물들이 제조될 수 있는 중요한 출발 대사 산물이다. 4-하이드록시부티릴-CoA가 대단히 통상적인 중심 대사 산물은 아니지만, 4-하이드록시부티릴-CoA를 합성하는 균주를 조작하는 방법은 앞서 미국 특허 출원 제 2009/0075351 호에서 출원인들에 의해 개시되었다. 상기 4-하이드록시부티릴-CoA에서 1,3-부탄다이올로의 경로는 글루코스를 탄수화물 공급원료로서 가정할 때 생성물 몰 수율당 1.09 몰의 이론적인 수율을 갖는다.
본 발명은 또한 부분적으로 상기 비-천연 미생물 유기체의 배양을 통해 1,3-BDO를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 개시된 유기체 및 방법에 의해 생산된 1,3-BDO의 탈수는 소규모의 최종 용도 설비에서 재생 가능한 부타다이엔을 생성시켜 상기 인화성이고 반응성인 화학물질을 운반할 필요를 미연에 방지할 기회를 제공한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "비-천연"이란 용어는 본 발명의 미생물 유기체 또는 미생물과 관련하여 사용될 때 상기 미생물 유기체가 기준 종의 야생형 균주를 포함하여, 상기 기준 종의 천연 균주에서 통상적으로 발견되지 않는 하나 이상의 유전자 변경을 가짐을 의미한다. 유전자 변경은 예를 들어 대사 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 가능한 핵산 도입, 다른 핵산 첨가, 핵산 결실 및/또는 상기 미생물 유전 물질의 다른 작용성 파괴의 변형들을 포함한다. 상기와 같은 변형들은 예를 들어 상기 기준 종들에 대한 이종, 동종, 또는 이종 및 동종 모두의 폴리펩타이드에 대한 암호화 부위 및 그의 작용성 단편을 포함한다. 추가적인 변형은 예를 들어 상기 변형이 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비-암호화 조절 부위를 포함한다. 예시적인 대사 폴리펩타이드는 1,3-부탄다이올 생합성 경로 내의 효소 또는 단백질을 포함한다.
대사 변형은 천연 상태로부터 변경되는 생화학적 반응을 지칭한다. 따라서, 비-천연 미생물은 대사 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 그의 작용성 단편에 대한 유전자 변형을 가질 수 있다. 예시적인 대사 변형은 본 발명에 개시된다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "단리된"이란 용어는 미생물 유기체와 관련하여 사용 시, 기준 미생물 유기체가 자연에서 발견될 때 하나 이상의 성분이 실질적으로 없는 유기체를 의미한다. 상기 용어는 자연 환경에서 발견될 때 일부 또는 전체 성분이 제거된 미생물 유기체를 포함한다. 상기 용어는 상기 미생물 유기체가 비-천연 환경에서 발견될 때 일부 또는 전체 성분이 제거된 미생물 유기체를 또한 포함한다. 따라서, 단리된 미생물 유기체는 자연에서 발견되거나 또는 비-천연 환경에서 생육, 저장 또는 연명될 때 다른 물질들과 부분적으로 또는 완전히 분리된다. 단리된 미생물 유기체의 구체적인 예는 부분적으로 순수한 미생물, 실질적으로 순수한 미생물 및 비-천연 배지에서 배양된 미생물을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "미생물의", "미생물 유기체" 또는 "미생물"이란 용어는 고세균, 세균 또는 진핵생물 영역 내에 포함되는 미시적인 세포로서 존재하는 임의의 유기체를 의미한다. 따라서, 상기 용어는 미시적인 크기를 갖는 원핵생물 또는 진핵생물 세포 또는 유기체를 포함함을 의미하고 효모 및 진균과 같은 진핵 미생물뿐만 아니라 모든 종의 세균, 고세균 및 진정세균을 포함한다. 상기 용어는 또한 생화학적 생산을 위해 배양될 수 있는 임의의 종의 세포 배양물을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "CoA" 또는 "조효소 A"란 용어는 활성 효소 시스템을 형성하기 위해 다수의 효소(주효소) 활성에 필요한 유기 보조인자 또는 보결분자단(효소의 비-단백질 부분)을 의미한다. 조효소 A는 몇몇 축합 효소에서 작용하고, 아세틸 또는 다른 아실 기 전달 및 지방산 합성 및 산화, 피루베이트 산화 및 다른 아세틸화에 작용한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "실질적으로 혐기성"이란 용어는 배양 또는 생육 조건과 관련하여 사용될 때, 산소의 양이 액체 배지 중의 용존 산소 포화의 약 10% 미만임을 의미한다. 상기 용어는 또한 약 1% 미만의 산소 분위기에서 유지되는 액체 또는 고체 배지의 밀폐된 챔버를 포함함을 의미 한다.
"외래"는 본 발명에서 사용 시 기준 분자 또는 기준 활성이 숙주 미생물 유기체 내에 도입됨을 의미한다. 상기 분자는 예를 들어 암호화 핵산의 숙주 유전 물질 내로의 도입에 의해, 예를 들어 숙주 염색체 내로의 통합 또는 비-염색체 유전 물질, 예를 들어 플라스미드로서의 통합에 의해 도입될 수 있다. 따라서, 상기 용어는 암호화 핵산의 발현과 관련하여 사용될 때 상기 암호화 핵산이 발현 가능한 형태로 미생물 유기체 내에 도입됨을 지칭한다. 생합성 활성과 관련하여 사용될 때, 상기 용어는 상기 숙주 기준 유기체 내로 도입되는 활성을 지칭한다. 상기 공급원은 예를 들어 상기 숙주 미생물 유기체 내로의 도입에 이어서 상기 기준 활성을 발현하는 동종 또는 이종 암호화 핵산일 수 있다. 따라서, "내생적인"이란 용어는 상기 숙주 중에 존재하는 기준 분자 또는 활성을 지칭한다. 유사하게, 상기 용어는 암호화 핵산의 발현과 관련하여 사용될 때 상기 미생물 유기체 내에 함유된 암호화 핵산의 발현을 지칭한다. "이종"이란 용어는 상기 기준 종 이외의 공급원으로부터 유래하는 분자 또는 활성을 지칭하는 반면, "동종"은 상기 숙주 미생물 유기체로부터 유래하는 분자 또는 활성을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 암호화 핵산의 외래 발현은 이종 또는 동종 암호화 핵산 중 어느 하나 또는 이둘 모두를 사용할 수 있다.
본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 안정한 유전자 변경을 함유할 수 있으며, 이는 상기 변경의 상실 없이 5 세대를 초과하여 배양될 수 있는 미생물에 적용된다. 일반적으로, 안정한 유전자 변경은 10 세대를 초과하여 지속하는 변형을 포함하며, 특히 안정한 변형은 약 25 세대를 초과하여 지속할 것이고, 보다 특히 안정한 유전자 변형은 무한을 포함하여, 50 세대를 초과할 것이다.
당해 분야의 숙련가들은 본 발명에 예시된 대사 변형을 포함하여, 유전자 변경을 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)와 같은 적합한 숙주 유기체 및 그의 상응하는 대사 반응 또는 목적하는 유전 물질에 적합한 공급원 유기체, 예를 들어 목적하는 대사 경로에 대한 유전자들에 관하여 개시한다. 그러나, 광범위하게 다양한 유기체의 완전한 게놈 서열화 및 상기 유전체학 분야의 높은 기술 수준의 제공으로, 당해 분야의 숙련가들은 본 발명에 제공된 교시 및 지침을 필수적으로 모든 다른 유기체들에 쉽게 적용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명에 예시된 에스케리키아 콜라이 대사 변경을, 상기 기준 종 이외의 종들로부터 동일하거나 유사한 암호화 핵산을 통합시킴으로써 다른 종들에 쉽게 적용할 수 있다. 상기와 같은 유전자 변경은 예를 들어 일반적으로 종 상동 기관의 유전자 변경, 및 특히 이종 상동체, 상동체 또는 비-이종 상동성 유전자 치환을 포함한다.
이종 상동체(ortholog)는 수직 혈통에 의해 관계되고 상이한 유기체에서 실질적으로 동일한 작용들을 맡고 있는 유전자 또는 유전자들이다. 예를 들어, 마우스 에폭사이드 하이드롤라제 및 인간 에폭사이드 하이드롤라제를 에폭사이드의 가수분해의 생물학적 작용에 대해 이종 상동체인 것으로 간주할 수 있다. 유전자들은 예를 들어 이들이 동종임을 가리키기에 충분한 양의 서열 유사성을 공유하거나 공통 조상으로부터의 진화에 의해 관계되는 경우 수직 혈통에 의해 관계된다. 유전자들을 또한 이들이 3 차원 구조는 공유하지만 이들이 1 차 서열 유사성을 식별할 수 없을 정도로, 공통 조상으로부터 진화했음을 가리키기에 충분한 양의 서열 유사성을 반드시 갖지는 않는 경우 이종 상동체인 것으로 간주할 수 있다. 이종 상동성인 유전자는 약 25% 내지 100% 아미노산 서열 일치성의 서열 유사성을 갖는 단백질들을 암호화한다. 25% 미만의 아미노산 유사성을 공유하는 단백질들을 암호화하는 유전자를 또한 이들의 3 차원 구조가 또한 유사성을 보이는 경우 수직 혈통에 의해 발생한 것으로 간주할 수 있다. 조직 플라스미노겐 활성화제 및 엘라스타제를 포함한 효소들의 세린 프로테아제 패밀리의 구성원들은 공통 조상으로부터 수직 혈통에 의해 발생한 것으로 간주된다.
이종 상동체는 예를 들어 진화를 통해 구조 또는 전체 활성이 갈라진 유전자 또는 그의 암호화된 유전자 산물을 포함한다. 예를 들어, 하나의 종이 2 개의 작용을 나타내는 유전자 산물을 암호화하고 상기와 같은 작용들이 두 번째 종에서 별도의 유전자로 분리된 경우, 상기 3 개의 유전자 및 이들의 상응하는 산물은 이종 상동체인 것으로 간주된다. 생화학적 생성물의 제조를 위해서, 당해 분야의 숙련가들은 비-천연 미생물의 제작을 위해 도입하거나 파괴하려는 대사 활성을 갖는 이종 상동성 유전자를 선택해야 함을 알 것이다. 분리 가능한 활성들을 나타내는 이종 상동체의 예는 별개의 활성들이 2 개 이상의 종 사이에서 또는 단일 종 내에서 별도의 유전자 산물들로 분리된 경우이다. 구체적인 예는 세린 프로테아제 활성의 2 가지 유형인 엘라스타제 단백질 분해 및 플라스미노겐 단백질 분해의, 플라스미노겐 활성화제 및 엘라스타제로서의 별개의 분자들로의 분리이다. 두 번째 예는 마이코플라스마 5'-3' 엑소뉴클레아제와 드로소필라 DNA 폴리머라제 III 활성의 분리이다. 상기 첫 번째 종으로부터의 DNA 폴리머라제를 두 번째 종으로부터의 엑소뉴클레아제 또는 폴리머라제 중 어느 하나 또는 이들 모두에 대한 이종 상동체인 것으로, 또 이와 역으로 간주할 수 있다.
대조적으로, 상동체(paralog)는 예를 들어 복제에 이은 진화적 분기에 의해 관계된 동족체이며 유사하거나 공통의, 그러나 동일하지는 않은 작용들을 갖는다. 상동체는 예를 들어 동일한 종으로부터 또는 상이한 종으로부터 기원하거나 유래할 수 있다. 예를 들어, 미생물 에폭사이드 하이드롤라제(에폭사이드 하이드롤라제 I) 및 용해성 에폭사이드 하이드롤라제(에폭사이드 하이드롤라제 II)는 이들이 별개의 반응들을 촉진하고 동일한 종에서 별개의 작용을 갖는, 공통의 조상으로부터 함께 진화한 2 개의 별개의 효소를 나타내므로 상동체로서 간주될 수 있다. 상동체는 서로 상당한 서열 유사성을 갖는 동일한 종으로부터의 단백질이며, 이는 이들이 동종이거나 또는 공통의 조상으로부터 공 진화를 통해 관계됨을 암시한다. 상동성 단백질 패밀리의 군은 HipA 동족체, 루시페라제 유전자, 펩티다제 등을 포함한다.
비-이종 상동성(nonorthologous) 유전자 치환은 상이한 종들에서 기준 유전자 작용을 대체할 수 있는 하나의 종으로부터의 비-이종 상동성 유전자이다. 치환은 예를 들어 상이한 종들에서의 기준 작용에 비해 기원 종들에서 실질적으로 동일하거나 유사한 작용을 수행할 수 있음을 포함한다. 일반적으로 비-이종 상동성 유전자 치환을 상기 기준 작용을 암호화하는 기지 유전자와 구조적으로 관련된 것으로서 식별하겠지만, 구조적으로는 덜 관련되었지만 작용상 유사한 유전자들 및 그들의 상응하는 유전자 산물들은 그럼에도 불구하고 여전히 본 발명에 사용되는 상기 용어의 의미 내에 있을 것이다. 작용 유사성은 예를 들어 치환하고자 하는 작용을 암호화하는 유전자에 비해 비-이종 상동성 유전자 산물의 활성 부위 또는 결합 부위에서 적어도 일부의 구조 유사성을 필요로 한다. 따라서, 비-이종 상동성 유전자는 예를 들어 상동체 또는 관련되지 않은 유전자를 포함한다.
따라서, 1,3-BDO 생합성 능력을 갖는 본 발명의 비-천연 미생물 유기체의 동정 및 제작에 있어서, 당해 분야의 숙련가들은 대사 변형의 확인이 이종 상동체의 동정 및 포함 또는 불활성화를 포함할 수 있도록 본 발명에 제공된 교시 및 지침을 특정 종들에 적용함을 이해할 것이다. 당해 분야의 숙련가들은 또한 상동체 및/또는 비-이종 상동성 유전자 치환이 유사하거나 또는 실질적으로 유사한 대사 반응을 촉진하는 효소를 암호화하는 기준 미생물 중에 존재하는 만큼, 이들 진화에 의해 관계된 유전자들을 사용할 수 있다.
이종 상동체, 상동체 및 비-이종 상동성 유전자 치환을 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 2 개의 폴리펩타이드에 대한 핵산 또는 아미노산 서열의 검사는 상기 두 비교된 서열들 간의 서열 일치성 및 유사성을 밝힐 것이다. 상기와 같은 유사성을 근거로, 당해 분야의 숙련가는 상기 유사성이 상기 단백질들이 공통 조상으로부터 진화를 통해 관계됨을 가리킬 만큼 충분히 높은지를 결정할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 연산, 예를 들어 Align, BLAST, Clustal W 등은 원 서열 유사성 또는 일치성을 비교하고 측정하며, 중량 또는 점수를 지정할 수 있는 상기 서열 중 틈의 존재 또는 유의수준을 또한 측정할 수 있다. 상기와 같은 연산은 또한 당해 분야에 공지되어 있으며 뉴클레오타이드 서열 유사성 또는 일치성의 측정에 유사하게 적용될 수 있다. 관련성을 결정하기에 충분한 유사성에 대한 매개변수들을, 통계학적 유사성을 계산하기 위해 널리 공지된 방법, 또는 랜덤 폴리펩타이드에서 유사한 합치를 발견할 기회, 및 상기 측정된 합치의 유의수준을 근거로 측정한다. 2 개 이상 서열들의 컴퓨터 비교를 또한 경우에 따라 당해 분야의 숙련가들에 의해 가시적으로 최적화할 수 있다. 관련된 유전자 산물들 또는 단백질들은 높은 유사성, 예를 들어 25% 내지 100% 서열 일치성을 가질 것으로 예상될 수 있다. 관련되지 않은 단백질들은, 충분한 크기의 데이터베이스를 스캐닝하는 경우(약 5%), 우연히 발생할 것으로 예상되는 바와 같이 필수적으로 동일한 일치성을 가질 수 있다. 5% 내지 24%의 서열은, 비교된 서열들이 관련 있다는 결론을 내릴 만큼 충분한 상동성을 나타낼 수도, 나타내지 않을 수도 있다. 상기 데이터 세트의 크기가 제공된, 상기와 같은 합치의 유의수준을 측정하기 위한 추가적인 통계학적 분석을 이들 서열의 관련성을 측정하기 위해 수행할 수 있다.
예를 들어 BLAST 연산을 사용하는 2 개 이상 서열의 관련성을 측정하기 위한 예시적인 매개변수들을 하기에 열거할 수 있다. 간단히, 아미노산 서열 정렬을 BLASTP 버전 2.0.8(1999년 1월 5일) 및 하기의 매개변수들을 사용하여 수행할 수 있다: 행렬: 0 BLOSUM62; 간격 개방(gap open): 11; 간격 연장(gap extension): 1; x_드롭오프: 50; 예상: 10.0; 워드크기: 3; 필터: 온. 핵산 서열 정렬을 BLASTN 버전 2.0.6(1998년 9월 16일) 및 하기의 매개변수들을 사용하여 수행할 수 있다: 합치: 1; 불합치: -2; 간격 개방: 5; 간격 연장: 2; x_드롭오프: 50; 예상: 10.0; 워드크기: 11; 필터: 오프. 당해 분야의 숙련가들은 상기 매개변수들에 대해 예를 들어 상기 비교의 엄격성을 증가시키거나 감소시키고 2 개 이상 서열의 관련성을 측정하기 위해 변형을 수행할 수 있음을 알 것이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 1,3-부탄다이올(1,3-BDO)을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 갖는 1,3-BDO 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 제공한다. 상기 1,3-BDO 경로는 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제, AKP 데하이드로게나제, 2-아미노-4-하이드록시펜타노에이트 아미노트랜스퍼라제, 2-아미노-4-하이드록시펜타노에이트 옥시도리덕타제(탈아민화), 2-옥소-4-하이드록시펜타노에이트 데카복실라제, 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제, AKP 아미노트랜스퍼라제, AKP 옥시도리덕타제(탈아민화), 2,4-다이옥소펜타노에이트 데카복실라제, 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(케톤 환원), 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(알데하이드 환원), 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제, AKP 데카복실라제, 4-아미노부탄-2-온 아미노트랜스퍼라제, 4-아미노부탄-2-온 옥시도리덕타제(탈아민화), 4-아미노부탄-2-온 암모니아-라이아제, 부텐온 하이드라타제, AKP 암모니아-라이아제, 아세틸아크릴레이트 데카복실라제, 아세토아세틸-CoA 리덕타제(CoA-의존성, 알데하이드 형성), 아세토아세틸-CoA 리덕타제(CoA-의존성, 알콜 형성), 아세토아세틸-CoA 리덕타제(케톤 환원), 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제, 및 크로토나제로 이루어진 군 중에서 선택된 효소를 포함한다.
상기 언급한 효소들 중 임의의 조합 및 임의의 수를 도 1 내지 3에 예시된 바와 같이, 숙주 미생물 유기체에 도입시켜 1,3-BDO 경로를 완성할 수 있다. 예를 들어, 상기 비-천연 미생물 유기체는 1,3-BDO 경로 중의 1, 2, 3, 4, 5, 전체 이하의 핵산을 포함할 수 있으며, 각각의 핵산은 1,3-BDO 경로 효소를 암호화한다. 상기와 같은 핵산은 하기에 추가로 설명하는 바와 같이, 이종 핵산, 기존 유전자의 추가적인 사본, 및 유전자 조절 요소를 포함할 수 있다. 본 발명의 비-천연 미생물 유기체의 경로를 또한 실질적으로 혐기성인 배양 배지에서 배양되도록 적합하게 조작한다.
일부 실시태양에서, 상기 1,3-BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체는 일련의 1,3-BDO 경로 효소를 포함한다. 일련의 1,3-BDO 경로 효소는 도 1 내지 3에 도시된 바와 같이, 알라닌, 아세토아세틸-CoA, 또는 4-하이드록시부티릴-CoA를 1,3-BDO로 전환시킬 수 있는 효소들의 군을 나타낸다. 도 1에 따른, 알라닌을 1,3-BDO로 전환시키는 1,3-BDO 경로 효소의 예시적인 조합은 (a) (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 데하이드로게나제; (3) 2-아미노-4-하이드록시펜타노에이트 아미노트랜스퍼라제 또는 옥시도리덕타제(탈아민화); (4) 2-옥소-4-하이드록시펜타노에이트 데카복실라제; 및 (5) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제; (b) (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 아미노트랜스퍼라제 또는 옥시도리덕타제(탈아민화); (3) 2,4-다이옥소펜타노에이트 데카복실라제; (4) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(케톤 환원); 및 (5) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제; (c) (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 아미노트랜스퍼라제 또는 옥시도리덕타제(탈아민화); (3) 2,4-다이옥소펜타노에이트 데카복실라제; (4) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(알데하이드 환원); 및 (5) 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제; (d) (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 데카복실라제; (3) 4-아미노부탄-2-온 아미노트랜스퍼라제 또는 옥시도리덕타제(탈아민화); (4) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(케톤 환원); 및 (5) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제; (e) (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 데카복실라제; (3) 4-아미노부탄-2-온 아미노트랜스퍼라제 또는 옥시도리덕타제(탈아민화); (4) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(알데하이드 환원); 및 (5) 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제; (f) (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 데카복실라제; (3) 4-아미노부탄-2-온 암모니아-라이아제; (4) 부텐온 하이드라타제; 및 (5) 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제; 및 (g) (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 암모니아-라이아제; (3) 아세틸아크릴레이트 데카복실라제; (4) 부텐온 하이드라타제; 및 (5) 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제를 포함한다.
도 2에 따른, 아세토아세틸-CoA를 1,3-BDO로 전환시키는 1,3-BDO 경로 효소의 예시적인 조합은 (h) (1) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(CoA-의존성, 알데하이드 형성); (2) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(케톤 환원); 및 (3) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제; (i) (1) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(CoA-의존성, 알콜 형성) 및 (2) 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제; (j) (1) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(CoA-의존성, 알데하이드 형성); (2) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(알데하이드 환원); 및 (3) 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제; (k) (1) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(케톤 환원) 및 (2) 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 및 (l) (1) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(케톤 환원); (2) 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알데하이드 형성); 및 (3) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제를 포함한다.
도 3에 따른, 4-하이드록시부티릴-CoA를 1,3-BDO로 전환시키는 1,3-BDO 경로 효소의 예시적인 조합은 (m) (1) 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제; (2) 크로토나제; 및 (3) 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성); 및 (n) (1) 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제; (2) 크로토나제; (3) 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알데하이드 형성); 및 (4) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제를 포함한다.
알라닌의 1,3-BDO로의 전환을 도 1에 도시된 바와 같이 대략 5 개의 효소 단계를 수반하는 다수의 경로들에 의해 수행할 수 있다. 모든 경로의 첫 번째 단계(단계 A)에서, 알라닌 및 아세틸-CoA가 고도의 선택성 효소인 2-아미노-4-케토펜타노에이트 티올라제에 의해 결합된다. 이어서 상기 반응의 생성물인 2-아미노-4-옥소펜타노에이트(AKP)는 도 1에 도시된 바와 같이 트랜스아민화되거나, 환원되거나, 탈카복실화되거나 또는 탈아민화될 수 있다.
하나의 경로에서, AKP는 아미노트랜스퍼라제 또는 탈아민화 옥시도리덕타제에 의해서, 알파-케토글루타레이트와 구조가 유사한 2-케토산, 2,4-다이옥소펜타노에이트로 전환된다(단계 B). 이어서 2,4-다이옥소펜타노에이트는 2-케토산 데카복실라제에 의해 3-옥소부티르알데하이드로 전환된다(단계 C). 상기 케톤 및 알데하이드 기의 그들의 상응하는 알콜로의 환원은 1,3-부탄다이올을 제공한다. 이들 환원은 중간체 3-하이드록시부티르알데하이드를 형성하거나(단계 O 및 P) 또는 4-하이드록시,2-부탄온을 형성하는(단계 D 및 H) 어느 한 순서로 일어날 수 있다.
또 다른 경로에서, AKP의 4-옥소 기는 먼저 AKP 데하이드로게나제에 의해 2차 알콜로 환원된다(단계 L). 이어서 생성물, 2-아미노-4-하이드록시펜타노에이트는 2-옥소-4-하이드록시펜타노에이트로 전환된다(단계 M). 상기 생성되는 2-케토산은 3-하이드록시부티르알데하이드로 탈카복실화된다(단계 N). 상기 경로의 최종 단계에서, 3-하이드록시부티르알데하이드의 알데하이드는 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제에 의해 1차 알콜로 환원되어 1,3-부탄다이올을 형성한다(단계 P).
더욱 또 다른 경로는 아미노산 데카복실라제에 의한 AKP의 탈카복실화를 수반한다(단계 E). 상기 탈카복실화 생성물, 4-아미노부탄-2-온은 3-옥소부티르알데하이드로 트랜스아민화되거나 산화적으로 탈아민화되거나(단계 K) 또는 부텐온으로 탈아민화될 수 있다(단계 F). 3-옥소부티르알데하이드가 형성되는 경우, 앞서 개시된 바와 같이, 2 개의 알콜-형성 환원 단계를 사용하여 1,3-부탄다이올을 형성한다(단계 O 및 P, 또는 단계 D 및 H). 이어서 상기 탈아민화 생성물, 부텐온은 4-하이드록시,2-부탄온으로 가수분해되고(단계 G), 이는 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제에 의해 1,3-부탄다이올로 환원된다(단계 H).
더욱 또 다른 경로는 AKP의 아세틸아크릴레이트로의 탈아민화를 수반한다(단계 I). 아세틸아크릴레이트는 부텐온으로 탈카복실화되고(단계 J), 이는 이어서 부텐온 하이드라타제(단계 G) 및 4-하이드록시,2-부탄온 리덕타제(단계 H)에 의해 1,3-부탄다이올로 전환된다.
알라닌으로부터 1,3-BDO의 생성에 대해 상술한 경로들을 근거로, 일부 실시태양에서, 상기 비-천연 미생물 유기체는 (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 데하이드로게나제; (3) 2-아미노-4-하이드록시펜타노에이트 아미노트랜스퍼라제 또는 옥시도리덕타제(탈아민화); (4) 2-옥소-4-하이드록시펜타노에이트 데카복실라제; 및 (5) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제를 포함하는 일련의 1,3-BDO 경로 효소들을 갖는다. 이들 효소를 암호화하는 1, 2, 3, 4, 전체 5 이하의 핵산을 포함하여, 상기 효소들을 암호화하는 임의의 수의 핵산을 숙주 미생물 유기체에 도입시킬 수 있다. 1, 2, 3 또는 4 개의 외래 핵산을 도입시키는 경우, 상기와 같은 핵산은 상기 5 개 핵산들의 임의의 순열일 수 있다.
다른 실시태양에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 아미노트랜스퍼라제 또는 옥시도리덕타제(탈아민화); (3) 2,4-다이옥소펜타노에이트 데카복실라제; (4) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(케톤 환원); 및 (5) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제를 포함하는 일련의 1,3-BDO 경로 효소들을 갖는다. 이들 효소를 암호화하는 1, 2, 3, 4, 전체 5 이하의 핵산을 포함하여, 상기 효소들을 암호화하는 임의의 수의 핵산을 숙주 미생물 유기체에 도입시킬 수 있다. 1, 2, 3 또는 4 개의 외래 핵산을 도입시키는 경우, 상기와 같은 핵산은 상기 5 개 핵산들의 임의의 순열일 수 있다.
더욱 다른 실시태양에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 아미노트랜스퍼라제 또는 옥시도리덕타제(탈아민화); (3) 2,4-다이옥소펜타노에이트 데카복실라제; (4) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(알데하이드 환원); 및 (5) 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제를 포함하는 일련의 1,3-BDO 경로 효소들을 갖는다. 이들 효소를 암호화하는 1, 2, 3, 4, 전체 5 이하의 핵산을 포함하여, 상기 효소들을 암호화하는 임의의 수의 핵산을 숙주 미생물 유기체에 도입시킬 수 있다. 1, 2, 3 또는 4 개의 외래 핵산을 도입시키는 경우, 상기와 같은 핵산은 상기 5 개 핵산들의 임의의 순열일 수 있다.
더욱 추가의 실시태양에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 데카복실라제; (3) 4-아미노부탄-2-온 아미노트랜스퍼라제 또는 옥시도리덕타제(탈아민화); (4) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(케톤 환원); 및 (5) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제를 포함하는 일련의 1,3-BDO 경로 효소들을 갖는다. 이들 효소를 암호화하는 1, 2, 3, 4, 전체 5 이하의 핵산을 포함하여, 상기 효소들을 암호화하는 임의의 수의 핵산을 숙주 미생물 유기체에 도입시킬 수 있다. 1, 2, 3 또는 4 개의 외래 핵산을 도입시키는 경우, 상기와 같은 핵산은 상기 5 개 핵산들의 임의의 순열일 수 있다.
더욱 더 추가의 실시태양에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 데카복실라제; (3) 4-아미노부탄-2-온 아미노트랜스퍼라제 또는 옥시도리덕타제(탈아민화); (4) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(알데하이드 환원); 및 (5) 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제를 포함하는 일련의 1,3-BDO 경로 효소들을 갖는다. 이들 효소를 암호화하는 1, 2, 3, 4, 전체 5 이하의 핵산을 포함하여, 상기 효소들을 암호화하는 임의의 수의 핵산을 숙주 미생물 유기체에 도입시킬 수 있다. 1, 2, 3 또는 4 개의 외래 핵산을 도입시키는 경우, 상기와 같은 핵산은 상기 5 개 핵산들의 임의의 순열일 수 있다.
더욱 추가의 실시태양에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 데카복실라제; (3) 4-아미노부탄-2-온 암모니아-라이아제; (4) 부텐온 하이드라타제; 및 (5) 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제를 포함하는 일련의 1,3-BDO 경로 효소들을 갖는다. 이들 효소를 암호화하는 1, 2, 3, 4, 전체 5 이하의 핵산을 포함하여, 상기 효소들을 암호화하는 임의의 수의 핵산을 숙주 미생물 유기체에 도입시킬 수 있다. 1, 2, 3 또는 4 개의 외래 핵산을 도입시키는 경우, 상기와 같은 핵산은 상기 5 개 핵산들의 임의의 순열일 수 있다.
더욱 더 추가의 실시태양에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 암모니아-라이아제; (3) 아세틸아크릴레이트 데카복실라제; (4) 부텐온 하이드라타제; 및 (5) 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제를 포함하는 일련의 1,3-BDO 경로 효소들을 갖는다. 이들 효소를 암호화하는 1, 2, 3, 4, 전체 5 이하의 핵산을 포함하여, 상기 효소들을 암호화하는 임의의 수의 핵산을 숙주 미생물 유기체에 도입시킬 수 있다. 1, 2, 3 또는 4 개의 외래 핵산을 도입시키는 경우, 상기와 같은 핵산은 상기 5 개 핵산들의 임의의 순열일 수 있다.
도 2는 아세토아세틸-CoA로부터 1,3-부탄다이올을 생성시키기 위한 다수의 경로들을 개략한다. 단계 A, B 및 C를 통한 하나의 경로는 (i) 아세토아세틸-CoA를 3-옥소부티르알데하이드로 전환시키는 아세토아세틸-CoA 리덕타제(도 2, 단계 A); (ii) 3-옥소부티르알데하이드를 3-하이드록시부티르알데하이드로 환원시키는 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(도 2, 단계 B); 및 (iii) 최종적으로, 1,3-부탄다이올을 형성하는 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제(도 2, 단계 C)를 사용한다.
한편으로, 아세토아세틸-CoA를 알데하이드 형성 아세토아세틸-CoA 리덕타제를 통해 환원시켜 4-하이드록시,2-부탄온을 형성시킬 수 있다(도 2, 단계 D). 4-하이드록시,2-부탄온을 또한 알데하이드 환원 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제에 의한 3-옥소부티르알데하이드의 환원에 의해 형성시킬 수 있다(도 2, 단계 E). 결국, 4-하이드록시,2-부탄온을 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제에 의해 환원시켜 1,3-BDO를 형성시킬 수 있다(도 2, 단계 F).
더욱 또 다른 일련의 1,3-BDO 형성 경로는 케톤 환원 아세토아세틸-CoA 리덕타제에 의한 아세토아세틸-CoA의 3-하이드록시부티릴-CoA로의 환원에 의존한다(도 2, 단계 G). 상기 효소는 아세토아세틸-CoA 중의 케톤 작용기를 하이드록실 기로 환원시킨다. 3-하이드록시부티릴-CoA를 이작용성 알콜-형성 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제에 의해 환원시켜 1,3-부탄다이올을 형성시킬 수 있다(도 2, 단계 I). 한편으로, 3-하이드록시부티릴-CoA를 먼저 상기 알데하이드 형성 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제를 통해 3-하이드록시부티르알데하이드로 환원시키고(단계 H) 이어서 3-하이드록시부티르알데하이드를 단계 C에 나타낸 바와 같이 환원시킬 수 있다.
아세토아세틸-CoA로부터 1,3-BDO를 생성시키기 위한 상술한 경로들을 근거로, 일부 실시태양에서, 상기 비-천연 미생물 유기체는 (1) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(CoA-의존성, 알데하이드 형성); (2) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(케톤 환원) 및 (3) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제를 포함하는 일련의 1,3-BDO 경로 효소들을 갖는다. 이들 효소를 암호화하는 1, 2, 전체 3 이하의 핵산을 포함하여, 상기 효소들을 암호화하는 임의의 수의 핵산을 숙주 미생물 유기체에 도입시킬 수 있다. 1 또는 2 개의 외래 핵산을 도입시키는 경우, 상기와 같은 핵산은 상기 3 개 핵산들의 임의의 순열일 수 있다.
다른 실시태양에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 (1) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(CoA-의존성, 알콜 형성) 및 (2) 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제를 포함하는 일련의 1,3-BDO 경로 효소들을 갖는다. 이들 효소를 암호화하는 하나 또는 둘 모두의 핵산을 포함하여, 상기 효소들을 암호화하는 임의의 수의 핵산을 숙주 미생물 유기체에 도입시킬 수 있다. 하나의 외래 핵산을 도입시키는 경우, 상기와 같은 핵산은 상기 두 핵산 중 어느 하나일 수 있다.
추가의 실시태양에서, 상기 비-천연 미생물 유기체는 (1) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(CoA-의존성, 알데하이드 형성); (2) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(알데하이드 환원); 및 (3) 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제를 포함하는 일련의 1,3-BDO 경로 효소들을 갖는다. 이들 효소를 암호화하는 1, 2, 전체 3 이하의 핵산을 포함하여, 상기 효소들을 암호화하는 임의의 수의 핵산을 숙주 미생물 유기체에 도입시킬 수 있다. 1 또는 2 개의 외래 핵산을 도입시키는 경우, 상기와 같은 핵산은 상기 3 개 핵산들의 임의의 순열일 수 있다.
더욱 추가의 실시태양에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 (1) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(케톤 환원) 및 (2) 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성)를 포함하는 일련의 1,3-BDO 경로 효소들을 갖는다. 이들 효소를 암호화하는 하나 또는 둘 모두의 핵산을 포함하여, 상기 효소들을 암호화하는 임의의 수의 핵산을 숙주 미생물 유기체에 도입시킬 수 있다. 하나의 외래 핵산을 도입시키는 경우, 상기와 같은 핵산은 상기 두 핵산 중 어느 하나일 수 있다.
더욱 추가의 실시태양에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 (1) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(케톤 환원); (2) 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알데하이드 형성); 및 (3) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제를 포함하는 일련의 1,3-BDO 경로 효소들을 갖는다. 이들 효소를 암호화하는 1, 2, 전체 3 이하의 핵산을 포함하여, 상기 효소들을 암호화하는 임의의 수의 핵산을 숙주 미생물 유기체에 도입시킬 수 있다. 1 또는 2 개의 외래 핵산을 도입시키는 경우, 상기와 같은 핵산은 상기 3 개 핵산들의 임의의 순열일 수 있다.
4-하이드록시부티릴-CoA는 다수의 산업적으로 유용한 화합물들을 제조할 수 있는 중요한 출발 대사 산물이다. 4-하이드록시부티릴-CoA가 대단히 통상적인 중심 대사 산물은 아니지만, 4-하이드록시부티릴-CoA를 합성하는 균주를 조작하는 방법들이 버크(Burk) 등(US 20090075351)에 의해 개시되었다. 예시적인 방법은 숙신산 세미알데하이드 데하이드로게나제(CoA-의존성), 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제, 4-하이드록시부티레이트 키나제, 및 포스포트랜스부티릴라제 활성을 암호화하는 유전자들을 사용함으로써 숙시닐-CoA로부터 4-하이드록시부티릴-CoA를 합성함을 수반한다.
상기 경로의 첫 번째 단계는 4-하이드록시부티릴-CoA의 탈수(단계 A, 도 3)에 이은 크로토닐-CoA의 탈수에 의해 3-하이드록시부티릴-CoA를 형성함(단계 B)을 수반한다. 이어서 3-하이드록시부티릴-CoA는 상기 두 효소 중 어느 하나에 의해(단계 C 및 D) 또는 단일의 이중-작용 효소에 의해(단계 E) 수행된 2 개의 환원 단계를 겪어 1,3-부탄다이올을 형성한다.
따라서, 일부 실시태양에서, 상기 비-천연 미생물 유기체는 (1) 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제; (2) 크로토나제; 및 (3) 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성)를 포함하는 일련의 1,3-BDO 경로 효소들을 갖는다. 이들 효소를 암호화하는 1, 2, 전체 3 이하의 핵산을 포함하여, 상기 효소들을 암호화하는 임의의 수의 핵산을 숙주 미생물 유기체에 도입시킬 수 있다. 1 또는 2 개의 외래 핵산을 도입시키는 경우, 상기와 같은 핵산은 상기 3 개 핵산들의 임의의 순열일 수 있다.
다른 실시태양에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 (1) 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제; (2) 크로토나제; (3) 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알데하이드 형성); 및 (4) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제를 포함하는 일련의 1,3-BDO 경로 효소들을 갖는다. 이들 효소를 암호화하는 1, 2, 3, 전체 4 이하의 핵산을 포함하여, 상기 효소들을 암호화하는 임의의 수의 핵산을 숙주 미생물 유기체에 도입시킬 수 있다. 1, 2 또는 3 개의 외래 핵산을 도입시키는 경우, 상기와 같은 핵산은 상기 4 개 핵산들의 임의의 순열일 수 있다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 1,3-BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 여기에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 알라닌을 2-아미노-4-옥소펜타노에이트로, 2-아미노-4-옥소펜타노에이트를 2-아미노-4-하이드록시펜타노에이트로, 2-아미노-4-하이드록시펜타노에이트를 2-옥소-4-하이드록시펜타노에이트로, 2-옥소-4-하이드록시펜타노에이트를 3-하이드록시부티르알데하이드로, 및 3-하이드록시부티르알데하이드를 1,3-BDO로 전환시키는 것들로 이루어진 군 중에서 선택된, 기질을 생성물로 전환시키는 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 1,3-BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 여기에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 알라닌을 2-아미노-4-옥소펜타노에이트로, 2-아미노-4-옥소펜타노에이트를 2,4-다이옥소펜타노에이트로, 2,4-다이옥소펜타노에이트를 3-옥소부티르알데하이드로, 3-옥소부티르알데하이드를 3-하이드록시부티르알데하이드로, 및 3-하이드록시부티르알데하이드를 1,3-BDO로 전환시키는 것들로 이루어진 군 중에서 선택된, 기질을 생성물로 전환시키는 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 1,3-BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 여기에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 알라닌을 2-아미노-4-옥소펜타노에이트로, 2-아미노-4-옥소펜타노에이트를 2,4-다이옥소펜타노에이트로, 2,4-다이옥소펜타노에이트를 3-옥소부티르알데하이드로, 3-옥소부티르알데하이드를 4-하이드록시-2-부탄온으로, 및 4-하이드록시-2-부탄온을 1,3-BDO로 전환시키는 것들로 이루어진 군 중에서 선택된, 기질을 생성물로 전환시키는 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 1,3-BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 여기에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 알라닌을 2-아미노-4-옥소펜타노에이트로, 2-아미노-4-옥소펜타노에이트를 4-아미노부탄-2-온으로, 4-아미노부탄-2-온을 3-옥소부티르알데하이드로, 3-옥소부티르알데하이드를 3-하이드록시부티르알데하이드로, 및 3-하이드록시부티르알데하이드를 1,3-BDO로 전환시키는 것들로 이루어진 군 중에서 선택된, 기질을 생성물로 전환시키는 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 1,3-BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 여기에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 알라닌을 2-아미노-4-옥소펜타노에이트로, 2-아미노-4-옥소펜타노에이트를 4-아미노부탄-2-온으로, 4-아미노부탄-2-온을 3-옥소부티르알데하이드로, 3-옥소부티르알데하이드를 4-하이드록시-2-부탄온으로, 및 4-하이드록시-2-부탄온을 1,3-BDO로 전환시키는 것들로 이루어진 군 중에서 선택된, 기질을 생성물로 전환시키는 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 1,3-BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 여기에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 알라닌을 2-아미노-4-옥소펜타노에이트로, 2-아미노-4-옥소펜타노에이트를 4-아미노부탄-2-온으로, 4-아미노부탄-2-온을 부텐온으로, 부텐온을 4-하이드록시-2-부탄온으로, 및 4-하이드록시-2-부탄온을 1,3-BDO로 전환시키는 것들로 이루어진 군 중에서 선택된, 기질을 생성물로 전환시키는 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 1,3-BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 여기에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 알라닌을 2-아미노-4-옥소펜타노에이트로, 2-아미노-4-옥소펜타노에이트를 아세틸아크릴레이트로, 아세틸아크릴레이트를 부텐온으로, 부텐온을 4-하이드록시-2-부탄온으로, 및 4-하이드록시-2-부탄온을 1,3-BDO로 전환시키는 것들로 이루어진 군 중에서 선택된, 기질을 생성물로 전환시키는 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함한다.
따라서, 본 발명은 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 함유하는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 효소 또는 단백질은 도 1에 도시된 경로들에 의해 예시된 바와 같이, 알라닌을 1,3-BDO로 전환시키는 1,3-BDO 경로의 기질 및 생성물을 전환시킨다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 1,3-BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 여기에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 아세토아세틸-CoA를 4-하이드록시-2-부탄온으로, 및 4-하이드록시-2-부탄온을 1,3-BDO로 전환시키는 것들로 이루어진 군 중에서 선택된, 기질을 생성물로 전환시키는 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 1,3-BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 여기에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 아세토아세틸-CoA를 3-옥소부티르알데하이드로, 3-옥소부티르알데하이드를 4-하이드록시-2-부탄온으로, 및 4-하이드록시-2-부탄온을 1,3-BDO로 전환시키는 것들로 이루어진 군 중에서 선택된, 기질을 생성물로 전환시키는 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 1,3-BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 여기에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 아세토아세틸-CoA를 3-옥소부티르알데하이드로, 3-옥소부티르알데하이드를 3-하이드록시부티르알데하이드로, 및 3-하이드록시부티르알데하이드를 1,3-BDO로 전환시키는 것들로 이루어진 군 중에서 선택된, 기질을 생성물로 전환시키는 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 1,3-BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 여기에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시부티릴-CoA로, 3-하이드록시부티릴-CoA를 3-하이드록시부티르알데하이드로, 및 3-하이드록시부티르알데하이드를 1,3-BDO로 전환시키는 것들로 이루어진 군 중에서 선택된, 기질을 생성물로 전환시키는 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 1,3-BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 여기에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시부티릴-CoA로, 및 3-하이드록시부티릴-CoA를 1,3-BDO로 전환시키는 것들로 이루어진 군 중에서 선택된, 기질을 생성물로 전환시키는 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함한다.
따라서, 본 발명은 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 함유하는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 효소 또는 단백질은 도 2에 도시된 경로들에 의해 예시된 바와 같이, 아세토아세틸-CoA를 1,3-BDO로 전환시키는 1,3-BDO 경로의 기질 및 생성물을 전환시킨다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 1,3-BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 여기에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 4-하이드록시부티릴-CoA를 크로토닐-CoA로, 크로토닐-CoA를 3-하이드록시부티릴-CoA로, 3-하이드록시부티릴-CoA를 3-하이드록시부티르알데하이드로, 및 3-하이드록시부티르알데하이드를 1,3-BDO로 전환시키는 것들로 이루어진 군 중에서 선택된, 기질을 생성물로 전환시키는 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 1,3-BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 여기에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 4-하이드록시부티릴-CoA를 크로토닐 CoA로, 크로토닐-CoA를 3-하이드록시부티릴-CoA로, 및 3-하이드록시부티릴-CoA를 1,3-BDO로 전환시키는 것들로 이루어진 군 중에서 선택된, 기질을 생성물로 전환시키는 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함한다.
따라서, 본 발명은 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 함유하는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 효소 또는 단백질은 도 3에 도시된 경로들에 의해 예시된 바와 같이, 4-하이드록시부티릴-CoA를 1,3-BDO로 전환시키는 1,3-BDO 경로의 기질 및 생성물을 전환시킨다.
상기 경로들 중 임의의 경로의 성공적인 조작은 충분한 활성 및 특이성을 갖는 적합한 효소 조합을 동정하고, 이들의 상응하는 유전자를 생산 숙주에 클로닝하고, 발효 조건을 최적화하고, 발효에 따른 생성물 형성을 분석함을 수반한다. 상기 언급한 생성물들 중 임의의 생성물의 생산을 위해 생산 숙주를 조작하기 위해서, 하나 이상의 외래 DNA 서열(들)을 미생물에서 발현시킬 수 있다. 또한, 상기 미생물은 작용적으로 결실된 내생 유전자(들)를 가질 수 있다. 상기 변형은 재생 가능한 공급원료를 사용하여 1,3-BDO의 생산을 가능하게 할 것이다.
하기에서, 우리는 도 1, 2 및 3에 도시된 각각의 단계들을 촉진하는 효소들을 암호화할 수 있는 다수의 생화학적으로 특성화된 유전자를 개시한다. 우리는 상기 방법을 에스케리키아 콜라이에 대해 개시하지만, 당해 분야의 숙련가는 이들 교시를 필수적으로 임의의 다른 유기체에 적용할 수 있다. 구체적으로, 적합하게 클로닝 및 발현 시 적합한 형질전환을 촉진하기 위해 적용될 수 있는 다른 유기체들 중의 유전자 이외에, 에스케리키아 콜라이에 고유한 유전자들을 나열한다.
본 발명을 대사 반응, 반응물 또는 그의 생성물을 일반적으로 언급하거나, 또는 상기 언급된 대사 반응, 반응물 또는 생성물과 관련되거나 이를 촉진하는 효소 또는 이와 관련된 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 또는 유전자를 구체적으로 언급하여 본 발명에서 개시한다. 달리 본 발명에 명확히 나타내지 않는 한, 당해 분야의 숙련가들은 반응에 대한 언급이 또한 상기 반응의 반응물 및 생성물에 대한 언급을 구성함을 알 것이다. 유사하게, 본 발명에서 명확히 나타내지 않는 한, 반응물 또는 생성물에 대한 언급은 또한 상기 반응을 언급하며, 이들 대사 구성성분들 중 임의의 구성성분에 대한 언급은 상기 언급한 반응, 반응물 또는 생성물을 촉진하는 효소 또는 상기 중에 수반되는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 유전자들을 또한 언급한다. 마찬가지로, 대사 생화학, 효소학 및 유전체학의 널리 공지된 분야에 제공된 바와 같이, 본 발명에서 유전자 또는 핵산 암호화에 대한 언급은 상응하는 암호화된 효소 및 상기 효소가 촉진하는 반응 또는 상기 반응과 관련된 단백질뿐만 아니라 상기 반응의 반응물 및 생성물에 대한 언급을 또한 구성한다.
도 1 내지 3에 도시된 모든 형질전환들은 표 1에 나타낸 형질전환의 8 개의 일반적인 범주 내에 있다. 하기에는 각 범주 중의 다수의 생화학적으로 특성화된 유전자들이 개시되어 있다. 적합하게 클로닝되고 발현시 도 1 내지 3에서 적합한 형질전환을 촉진하기 위해 적용될 수 있는 유전자들을 구체적으로 나열한다. 도 1 내지 3의 각 단계들에 대한 예시적인 유전자들을 하기 표 35 내지 37에 추가로 제공한다.
표 1은 통상적인 중심 대사 중간체를 1,3-부탄다이올로 전환시키기에 유용한 효소 유형들을 나타낸다. 각 표지의 처음 3 개 숫자는 기질 특이성과 무관하게 일반적인 형질전환 유형을 나타내는 상기 처음 3 개 효소 위원회 번호 숫자에 상응한다.
표지 작용
1.1.1.a 옥시도리덕타제(케톤에서 하이드록실로 또는 알데하이드에서 알콜로)
1.1.1.c 옥시도리덕타제(2 단계, 아실-CoA에서 알콜로)
1.2.1.b 옥시도리덕타제(아실-CoA에서 알데하이드로)
1.4.1.a 옥시도리덕타제(탈아민화)
2.3.1.b 아실트랜스퍼라제
2.6.1.a 아미노트랜스퍼라제
4.1.1.a 카복시-라이아제
4.2.1.a 하이드로-라이아제
4.3.1.a 암모니아-라이아제
도 1, 2 및 3에서 다수의 형질전환은 알데하이드를 알콜로 환원시키는 옥시도리덕타제의 범주 내에 있다. 예를 들어, 각각 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(알데하이드 환원) 및 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제에 의해 촉진되는 도 1의 단계 D 및 P가 상기 범주 내에 있다. 유사하게, 각각 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제 및 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(알데하이드 환원)에 의해 촉진되는 도 2의 단계 C 및 E가 또한 알데하이드 작용기를 알콜로 전환시키는 옥시도리덕타제이다. 도 3의 경로들은 단계 D에서 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제와 같은 옥시도리덕타제들을 수반한다.
알데하이드의 알콜로의 전환을 촉진하는 효소(즉 알콜 데하이드로게나제 또는 동등하게 알데하이드 리덕타제)를 암호화하는 예시적인 유전자는 C2-C14의 경우 중간-쇄 알콜 데하이드로게나제를 암호화하는 alrA(Tani et al., Appl. Environ. Microbiol., 66:5231-5235(2000)), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 ADH2(Atsumi et al., Nature, 451:86-89(2008)), C3보다 긴 분자를 선호하는 에스케리키아 콜라이로부터의 yqhD(Sulzenbacher et al., J. of Molecular Biology, 342:489-502(2004)), 및 부티르알데하이드를 부탄올로 전환시키는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)으로부터의 bdhI 및 bdhII(Walter et al., J. of Bacteriology, 174:7149-7158(1992))를 포함한다. yqhD의 유전자 산물은 보조 인자로서 NADPH를 사용하는 아세트알데하이드, 말론다이알데하이드, 프로피온알데하이드, 부티르알데하이드, 및 아크롤레인의 환원을 촉진한다(Perez et al., J. Biol. Chem., 283:7346-7353(2008)). 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)로부터의 adhA 유전자 산물은 폼알데하이드, 아세트알데하이드, 프로피온알데하이드, 부티르알데하이드, 및 아크롤레인을 포함한 다수의 알데하이드에 대해 활성을 갖는 것으로 입증되었다(Kinoshita et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 22:249-254(1985)). 추가의 알데하이드 리덕타제 후보들은 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)의 bdh 및 클로스트리듐 베이제링키이(Clostridium beijerinckii)의 Cbei_1722, Cbei_2181 및 Cbei_2421에 의해 암호화된다.
이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 2에 나타낸 진뱅크(GenBank) 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
alrA BAB12273.1 9967138 애시네토박터 스페시즈 M-1
ADH2 NP_014032.1 6323961 사카로마이세스 세레비지아에
yqhD NP_417484.1 16130909 에스케리키아 콜라이
bdh I NP_349892.1 15896543 클로스트리듐 아세토부틸리쿰
bdh II NP_349891.1 15896542 클로스트리듐 아세토부틸리쿰
adhA YP_162971.1 56552132 자이모모나스 모빌리스
bdh BAF45463.1 124221917 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰
Cbei_1722 YP_001308850 150016596 클로스트리듐 베이제링키이
Cbei_2181 YP_001309304 150017050 클로스트리듐 베이제링키이
Cbei_2421 YP_001309535 150017281 클로스트리듐 베이제링키이
3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제 활성을 나타내는 효소들(EC 1.1.1.61)이 또한 상기 범주 내에 있다. 상기와 같은 효소들은 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)(Bravo et al., J. Forensic Sci., 49:379-387(2004)), 클로스트리듐 클루이베리(kluyveri)(Wolff et al., Protein Expr. Purif., 6:206-212(1995)) 및 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(Breitkreuz et al., J. Biol. Chem., 278:41552-41556(2003))에서 특성화되었다. 더욱 또 다른 유전자는 제오바실러스 써모글루코시다시우스(Geobacillus thermoglucosidasius)로부터의 알콜 데하이드로게나제 adhI(Jeon et al., J. Biotechnol., 135:127-133(2008))이다. 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 3에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
4hbd YP_726053.1 113867564 랄스토니아 유트로파 H16
4hbd L21902.1 146348486 클로스트리듐 클루이베리 DSM 555
4hbd Q94B07 75249805 아라비도프시스 탈리아나
adhI AAR91477.1 40795502 제오바실러스 써모글루코시다시우스 M10EXG
또 다른 예시적인 효소는 3-하이드록시아이소부티레이트의 메틸말로네이트 세미알데하이드로의 가역적인 산화를 촉진하는 3-하이드록시아이소부티레이트 데하이드로게나제이다. 상기 효소는 발린, 류신 및 아이소류신 분해에 관여하며 세균, 진핵생물 및 포유동물에서 동정되었다. 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus) HB8로부터 P84067에 의해 암호화된 효소가 구조적으로 특성화되었다(Lokanath et al., J. Mol. Biol., 352:905-917(2005)). 상기 인간 3-하이드록시아이소부티레이트 데하이드로게나제의 가역성을 동위원소 표지된 기질을 사용하여 입증하였다(Manning et al., Biochem J., 231:481-484(1985)). 상기 효소를 암호화하는 추가의 유전자들은 호모 사피엔스(Homo sapiens)(Hawes et al., Methods Enzymol, 324:218-228(2000)) 및 오릭토라구스 쿠니큘러스(Oryctolagus cuniculus)(상기 Hawes et al.; Chowdhury et al., Biosci. Biotechnol Biochem., 60:2043-2047(1996)) 중의 3hidh, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 중의 mmsB(Liao et al., 미국 특허 제 20050221466 호), 및 슈도모나스 푸티다 중의 dhat(Aberhart et al., J. Chem. Soc., 6:1404-1406(1979); 상기 Chowdhury et al.; Chowdhury et al., Biosci. Biotechnol Biochem., 67:438-441(2003))를 포함한다. 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 4에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
P84067 P84067 75345323 써무스 써모필루스
3hidh P31937.2 12643395 호모 사피엔스
3hidh P32185.1 416872 오릭토라구스 쿠니큘러스
mmsB P28811.1 127211 슈도모나스 아에루기노사
mmsB NP_746775.1 26991350 슈도모나스 푸티다
dhat Q59477.1 2842618 슈도모나스 푸티다
케톤 작용기를 상응하는 하이드록실 기로 전환시키는 옥시도리덕타제가 또한 상기 개시된 경로들에서 합성 단계이다. 현저하게는, AKP 데하이드로게나제, 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(케톤 환원), 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제 각각에 의해 촉진되는 도 1의 반응 L, O 및 H가 상기 범주의 형질전환들이다. 상기 나중 2 개의 형질전환은 도 2의 단계 B 및 F 각각에서 조우한다. 같은 방침 아래, 도 2의 단계 G의 아세토아세틸-CoA 리덕타제는 아세틸-CoA를 3-하이드록시부티릴-CoA로 환원시킨다.
데하이드로게나제에 의한 2-아미노-4-옥소펜타노에이트(AKP)의 4-옥소 기의 환원은 2-아미노-4-하이드록시펜타노에이트를 제공한다(도 1, 단계 L). 상기 반응은 호모세린 데하이드로게나제(EC 1.1.13)에 의해 촉진된 아스파테이트 세미알데하이드의 호모세린으로의 NAD(P)H-의존성 환원과 매우 유사하다. 에스케리키아 콜라이를 포함한 다수의 유기체들에서, 호모세린 데하이드로게나제는 아스파테이트의 아스파틸-4-포스페이트로의 ATP-의존성 전환을 또한 촉진하는 이작용성 효소이다(Starnes et al., Biochemistry, 11:677-687(1973)). 상기 작용성 도메인 촉매적으로 독립적이고 링커 부위에 의해 연결되며(Sibilli et al., J. Biol. Chem., 256:10228-10230(1981)) 상기 두 도메인은 모두 쓰레오닌에 의해 알로스테릭 억제되기 쉽다. thrA에 의해 암호화된, 상기 에스케리키아 콜라이 효소의 호모세린 데하이드로게나제 도메인이 상기 아스파테이트 키나제 도메인으로부터 분리되었고, 특성화되었으며, 높은 촉매 활성 및 감소된 쓰레오닌에 의한 억제를 나타내는 것으로 밝혀졌다(James et al., Biochemistry, 41:3720-3725(2002)). 이를 다른 이작용성 쓰레오닌 키나제, 예를 들어 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 hom1(Cahyanto et al., Microbiology, 152:205-112(2006)) 및 아라비도프시스 탈리아나의 hom1에 적용할 수 있다. 사카로마이세스 세레비지아에 중의 hom6(Jacques et al., Biochem. Biophys. Acta, 1544:28-41(2001)) 및 락토바실러스 플란타룸 중의 hom2(상기 Cahyanto et al.)에 의해 암호화된 일작용성 호모세린 데하이드로게나제가 에스케리키아 콜라이에서 작용적으로 발현되고 특성화되었다. 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 5에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
thrA AAC73113.1 1786183 에스케리키아 콜라이 K12
akthr2 O81852 75100442 아라비도프시스 탈리아나
hom6 CAA89671 1015880 사카로마이세스 세레비지아에
hom1 CAD64819 28271914 락토바실러스 플란타룸
hom2 CAD63186 28270285 락토바실러스 플란타룸
아세토아세틸-CoA의 3-하이드록시부티릴-CoA로의 환원을 촉진하는 아세토아세틸-CoA 리덕타제(단계 G, 도 2)는 몇몇 클로스티리듐 종들에서 부티레이트로의 아세틸-CoA 발효 경로에 관여하며 상세히 연구되었다(Jones et al., Microbiol. Rev., 50:484-524(1986)). hbd에 의해 암호화된, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰으로부터의 효소가 클로닝되었고 에스케리키아 콜라이에서 작용적으로 발현되었다(Youngleson et al., J. Bacteriol., 171:6800-6807(1989)). 또한, fadB 및 fadJ에 의해 암호화된, 에스케리키아 콜라이 중의 2 개 지방산 산화 복합체의 서브유닛들은 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제로서 작용한다(Binstock et al., Methods Enzymol., 71C:403-411(1981)). 아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시부티릴-CoA로 환원시키는 것으로 입증된 더욱 다른 유전자들은 주글로에아 라미게라(Zoogloea ramigera)로부터의 phbB(Ploux et al., Eur. J. Biochem., 174:177-182(1988)) 및 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides)로부터의 phaB(Alber et al., Mol. Microbiol., 61:297-309(2006))이다. 상기 앞의 유전자는 NADPH-의존성이며, 그의 뉴클레오타이드 서열이 결정되었고(Peoples et al., Mol. Microbiol. 3:349-357(1989)) 상기 유전자는 에스케리키아 콜라이에서 발현되었다. 상기 유전자에 대한 기질 특이성 연구는 상기 유전자가 아세토아세틸-CoA 이외에 기질로서 3-옥소프로피오닐-CoA를 수용할 수 있다는 결론을 도출하였다(상기 Ploux et al.). 추가적인 유전자는 클로스트리듐 클루이베리 중의 Hbd1(C-말단 도메인) 및 Hbd2(N-말단 도메인)(Hillmer and Gottschalk, Biochim. Biophys. Acta 3334:12-23(1974)) 및 보스 타우루스(Bos taurus) 중의 HSD17B10(Wakil et al., J. Biol. Chem., 207:631-638(1954))을 포함한다. 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 6에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
fadB P21177.2 119811 에스케리키아 콜라이
fadJ P77399.1 3334437 에스케리키아 콜라이
Hbd2 EDK34807.1 146348271 클로스트리듐 클루이베리
Hbd1 EDK32512.1 146345976 클로스트리듐 클루이베리
hbd P52041.2 클로스트리듐 아세토부틸리쿰
HSD17B10 O02691.3 3183024 보스 타우루스
phbB P23238.1 130017 주글로에아 라미게라
phaB YP_353825.1 77464321 로도박터 스파에로이데스
다수의 유사한 효소들이 표 7에 나타낸 바와 같이 클로스트리듐 및 메탈로스파에라 세둘라(Metallosphaera sedula)의 다른 종들에서 발견되었다(Berg et al., Archaea. Science, 318:1782-1786(2007)).
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
Hbd NP_349314.1 NP_349314.1 클로스트리듐 아세토부틸리쿰
Hbd AAM14586.1 AAM14586.1 클로스트리듐 베이제링키이
Msed_1423 YP_001191505 YP_001191505 메탈로스파에라 세둘라
Msed_0399 YP_001190500 YP_001190500 메탈로스파에라 세둘라
Msed_0389 YP_001190490 YP_001190490 메탈로스파에라 세둘라
Mesd_1993 YP_001192057 YP_001192057 메탈로스파에라 세둘라
케톤을 하이드록실 기로 전환시키는 예시적인 알콜 데하이드로게나제는 클로스트리듐 베이제링키이(Ismaiel et al., J. Bacteriol., 175:5097-5105(1993)) 및 써모아나에로박터 브록키이(Thermoanaerobacter brockii)(Lamed et al., Biochem. J., 195:183-190(1981); Peretz et al., Biochemistry, 28:6549-6555(1989))에서 아세톤을 아이소프로판올로 전환시키는 것으로 입증된 2차 알콜 데하이드로게나제이다. 파이로코커스 퓨리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터의 adhA의 유전자 산물(2-펜탄올 및 피루브알데하이드에 대해 최대 활성을 나타낸다)은 아이소프로판올 및 아세톤을 포함하여 매우 광범위한 특이성을 갖는 것으로 입증되었다(Van der et al., Eur. J. Biochem., 268:3062-3068(2001)). 아이소프로판올 및 아세톤에 대해 활성을 갖는 더욱 또 다른 2차 알콜 데하이드로게나제는 로도코커스 루버(Rhodococcus ruber)로부터의 adh-A(Edegger et al., Chem. Commun. (Camb), 2402-2404(2006); Kosjek et al., Biotechnol. Bioeng., 86:55-62(2004))의 유전자 산물에 의해 암호화된다. 이들 유전자를 다른 것들과 함께 하기 표 8에 나타낸다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
adh AAA23199.2 60592974 클로스트리듐 베이제링키이 NRRL B593
adh P14941.1 113443 써모아나에로박터 브록키이 HTD4
adhA AAC25556 3288810 파이로코커스 퓨리오수스
adh-A CAD36475 21615553 로도코커스 루버
한편으로, 케톤을 하이드록실 작용기로 전환시키는 여러 개의 예시적인 알콜 데하이드로게나제가 존재한다. 에스케리키아 콜라이로부터의 2 개의 상기와 같은 효소들은 말레이트 데하이드로게나제(mdh) 및 락테이트 데하이드로게나제(ldhA)에 의해 암화회된다. 또한, 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)로부터의 락테이트 데하이드로게나제는 다양한 쇄 길이의 기질들, 예를 들어 락테이트, 2-옥소부티레이트, 2-옥소펜타노에이트 및 2-옥소글루타레이트에 대해 높은 활성을 나타내는 것으로 입증되었다(Steinbuchel et al., Eur. J. Biochem. 130:329-334(1983)). 상기 옥소 작용기의 하이드록실 기로의 전환은 또한 래트 및 인간 태반에서 발견되는 것으로 보고된 효소인 2-케토1,3-부탄다이올 리덕타제에 의해 촉진될 수 있다(Suda et al., Arch. Biochem. Biophys., 176:610-620(1976); Suda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 77:586-591(1977)). 이들 효소는 모두 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제 및 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제를 제공할 수 있다. 이들 단계에 추가적인 효소는 인간 심장으로부터의 미토콘드리아 3-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제(bdh)(클로닝되고 특성화되었다)이다(Marks et al., J. Biol. Chem. 267:15459-15463(1992)). 상기 효소는 3-하이드록시산 상에서 작용하는 데하이드로게나제이다. 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 9에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
mdh AAC76268.1 1789632 에스케리키아 콜라이
ldhA NP_415898.1 16129341 에스케리키아 콜라이
ldh YP_725182.1 113866693 랄스토니아 유트로파
bdh AAA58352.1 177198 호모 사피엔스
다수의 유기체들, 예를 들어 특히 문헌[Matsuyama et al.(1995)]에 개시된 바와 같이, 바실러스, 브레비박테리움, 칸디다 및 클렙시엘라 속에 속하는 것들이 4-하이드록시-2-부탄온의 1,3-부탄다이올로의 환원을 촉진할 수 있다.
도 2 및 3의 몇몇 형질전환들은 아실-CoA에서 상응하는 알콜로의 2-단계 환원에 의존한다. 예를 들어, 아세토아세틸-CoA 리덕타제(CoA-의존성, 알콜 형성) 및 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성)를 수반하는, 도 2의 단계 D 및 I, 및 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성)를 수반하는 도 3의 단계 E가 상기와 같은 형질전환을 나타낸다.
아실-CoA를 알콜로 전환시키는 예시적인 2-단계 옥시도리덕타제는 기질을 형질전환시키는 것들, 예를 들어 아세틸-CoA를 에탄올로(예를 들어 에스케리키아 콜라이로부터 adhE(Kessler et al., FEBS. Lett., 281-59-63(1991)) 및 부티릴-CoA를 부탄올로(예를 들어 클로스트리듐 아세토부틸리쿰으로부터 adhE2(Fontaine et al., J. Bacteriol., 184:821-830(2002))로 형질전환시키는 것들을 포함한다. 아세틸-CoA를 에탄올로 환원시키는 것 이외에, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 중의 adhE에 의해 암호화되는 효소는 분지 쇄 화합물 아이소부티르알데하이드를 아이소부티릴-CoA로 산화시키는 것으로 입증되었다(Kazahaya et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 18:43-55(1972); Koo et al.,, Biotechnol. Lett., 27:505-510(2005)). 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 10에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
adhE NP_415757.1 16129202 에스케리키아 콜라이
adhE2 AAK09379.1 12958626 클로스트리듐 아세토부틸리쿰
adhE AAV66076.1 55818563 류코노스톡 메센테로이데스
또 다른 예시적인 효소는 말로닐-CoA를 3-HP로 전환시킬 수 있다. 상기 활성을 갖는 NADPH-의존성 효소는 클로로플렉수스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)에서 특성화되었으며, 여기에서 3-하이드록시프로피오네이트 주기에 관여한다(Hugler et al., J. Bacteriol., 184:2404-2410(2002); Strauss et al., Eur. J. Biochem., 215:633-643(1993)). 상기 효소는 300 kDa의 질량을 가지며, 매우 기질-특이성이고, 다른 공지된 옥시도리덕타제들과 서열 유사성을 거의 나타내지 않는다(상기 Hugler et al.). 다른 유기체들 중에서 상기 특이적인 반응을 촉진하는 것으로 입증된 효소들은 없으나; 다른 유기체들이 유사한 경로를 가질 수 있다는 생물정보학적 증거가 존재한다(Klatt et al., Environ. Microbiol., 9:2067-2078(2007)). 로세이플렉수스 카스텐홀지이(Roseiflexus castenholzii), 에리쓰로박터(Erythrobacter) 스페시즈 NAP1 및 해양 감마 프로테오박테리움 HTCC2080을 포함한 다른 유기체들 중의 효소들이 서열 유사성에 의해 추리될 수 있다. 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 11에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
mcr AAS20429.1 42561982 클로로플렉수스 아우란티아쿠스
Rcas_2929 YP_001433009.1 156742880 로세이플렉수스 카스텐홀지이
NAP1_02720 ZP_01039179.1 85708113 에리쓰로박터 스페시즈 NAP1
MGP2080_00535 ZP_01626393.1 119504313 해양 감마 프로테오박테리움 HTCC2080
보다 장쇄 아실-CoA 분자들이 알콜-형성 지방 아실-CoA 리덕타제를 암호화하는 호호바(심몬드시아 키넨시스(Simmondsia chinensis)) FAR과 같은 효소들에 의해 환원될 수 있다. 에스케리키아 콜라이에서의 그의 과발현은 FAR 활성 및 지방 알콜의 축적을 생성시켰다(Metz et al., Plant Physiology, 122:635-644(2000))(FAR, AAD38039.1, 5020215, Simmondsia chinensis).
본 발명에 개시된 경로들은 아실-CoA를 알데하이드로 전환시키는 다수의 옥시도리덕타제-유형 형질전환들을 수반한다. 구체적으로, 아세토아세틸-CoA 리덕타제(알데하이드 형성) 및 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알데하이드 형성)에 의해 촉진되는 도 2의 단계 A 및 H, 및 도 3의 단계 C가 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제에 의해 촉진되는 형질전환을 나타낸다.
몇몇 아실-CoA 데하이드로게나제들이 아실-CoA를 그의 상응하는 알데하이드로 환원시킬 수 있다. 상기와 같은 효소를 암호화하는 예시적인 유전자는 지방산-CoA 리덕타제를 암호화하는 애시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) acr1(Reiser et al., J. of Bacteriology, 179:2969-2975(1997)), 애시네토박터 스페시즈 M-1 지방 아실-CoA 리덕타제(Ishige et al., Appl. Environ. Microbiol., 68:1192-1195(2002)) 및 클로스트리듐 클루이베리 중의 sucD 유전자에 의해 암호화되는 CoA- 및 NADP-의존성 숙시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(Sohling et al., J. Bacteriol., 178:871-880(1996))를 포함한다. 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)의 SucD는 또 다른 숙시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제이다(Takahashi et al., J. Bacteriol., 182:4704-4710(2000)). bphG에 의해 암호화되는, 슈도모나스 스페시즈 중의 아세트알데하이드 데하이드로게나제를 아실화하는 효소는 아세트알데하이드, 프로피온알데하이드, 부티르알데하이드, 아이소부티르알데하이드 및 폼알데하이드를 산화하고 아실화하는 것으로 입증된 더욱 또 다른 효소이다(Powlowski et al., J. Bacteriol., 175:377-385(1993)). 아세틸-CoA의 에탄올로의 환원 이외에, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 중의 adhE에 의해 암호화되는 효소가 분지 쇄 화합물 아이소부티르알데하이드를 아이소부티릴-CoA로 산화시키는 것으로 입증되었다(상기 Kazahaya et al.; 상기 Koo et al.). 부티르알데하이드 데하이드로게나제는 유사한 반응, 즉 부탄올 생산(solventogenic) 유기체, 예를 들어 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰에서의 부티릴-CoA의 부티르알데하이드로의 전환을 촉진한다(Kosaka et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 71:58-61(2007)). 추가의 알데하이드 데하이드로게나제 효소 후보들이 데술파티바실룸 알케니보란스(Desulfatibacillum alkenivorans), 시트로박터 코제리(Citrobacter koseri), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 및 바실러스 셀레니티레듀센스(Bacillus selenitireducens)에서 발견된다. 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 12에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
acrl YP_047869.1 50086359 애시네토박터 칼코아세티쿠스
acrl AAC45217 1684886 애시네토박터 배이리이
acrl BAB85476.1 18857901 애시네토박터 스페시즈 균주 M-1
sucD P38947.1 172046062 클로스트리듐 클루이베리
sucD NP_904963.1 34540484 포르피로모나스 진지발리스
bphG BAA03892.1 425213 슈도모나스 스페시즈
adhE AAV66076.1 55818563 류코노스톡 메센테로이데스
bld AAP42563.1 31075383 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰
ald ACL06658.1 218764192 데술파티바실룸 알케니보란스 AK-01
ald YP_001452373 157145054 시트로박터 코제리 ATCC BAA-895
pduP NP_460996.1 16765381 살모넬라 엔테리카 티피무리움
pduP ABJ64680.1 116099531 락토바실러스 브레비스 ATCC 367
BselDRAFT_1651 ZP_02169447 163762382 바실러스 셀레니티레듀센스 MLS10
아실-CoA를 그의 상응하는 알데하이드로 전환시키는 추가의 효소 유형은 말로닐-CoA를 말로닉 세미알데하이드로 형질전환시키는 말로닐-CoA 리덕타제이다. 말로닐-CoA 리덕타제는 호열호산성 고세균에서 3-하이드록시프로피오네이트 주기를 통한 독립영양성 탄소 고정에 핵심 효소이다(상기 Berg et al.; Thauer, R.K., Science, 318:1732-1733(2007)). 상기 효소는 보조인자로서 NADPH를 이용하며 메탈로스파에라(Metallosphaera) 및 설포로부스 스페시즈(Sulfolobus spp)에서 특성화되었다(Alber et al., J. Bacteriol., 188:8551-8559(2006); 상기 Hugler et al.). 상기 효소는 메탈로스파에라 세둘라(sedula)에서 Msed_0709에 의해 암호화된다(상기 Alber et al.; 상기 Berg et al.). 설포로부스 토코다이이(tokodaii)로부터의 말로닐-CoA 리덕타제를 암호화하는 유전자가 클로닝되었으며 에스케리키아 콜라이에서 이종 발현되었다(상기 Alber et al.). 상기 효소는 또한 메틸말로닐-CoA의 그의 상응하는 알데하이드로의 전환을 촉진하는 것으로 입증되었다(2007). 이들 효소의 알데하이드 데하이드로게나제 작용성이 클로로플렉수스 아우란티아쿠스로부터의 이작용성 데하이드로게나제와 유사하지만, 서열 유사성은 거의 없다. 상기 두 말로닐-CoA 리덕타제 효소들은 모두 아스파틸-4-포스페이트의 아스파테이트 세미알데하이드로의 환원 및 동시적인 탈인산화를 촉진하는 효소인 아스파테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제와 높은 서열 유사성을 갖는다. 추가적인 유전자들을 설포로부스 솔파타리쿠스(solfataricus) 및 설포로부스 애시도칼다리우스(acidocaldarius)를 포함한 다른 유기체들 중의 단백질들에 대한 서열 상동성에 의해 발견할 수 있으며 이들은 하기에 나열되었다. CoA-아실화 알데하이드 데하이드로게나제에 대한 더욱 또 다른 효소는 클로스트리듐 베이제링키이로부터의 ald 유전자이다(Toth et al., Appl. Environ. Microbiol., 65:4973-4980(1999)). 상기 효소는 아세틸-CoA 및 부티릴-CoA를 그들의 상응하는 알데하이드로 환원시키는 것으로 보고되었다. 상기 유전자는 살모넬라 티피뮤리움(typhimurium) 및 에스케리키아 콜라이의 아세트알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 eutE와 매우 유사하다(상기 Toth et al.). 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 13에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
MSED_0709 YP_001190808.1 146303492 메탈로스파에라 세둘라
mcr NP_378167.1 15922498 설포로부스 토코다이이
asd-2 NP_343563.1 15898958 설포로부스 솔파타리쿠스
Saci_2370 YP_256941.1 70608071 설포로부스 애시도칼다리우스
Ald AAT66436 9473535 클로스트리듐 베이제링키이
eutE AAA80209 687645 살모넬라 티피뮤리움
eutE P77445 2498347 에스케리키아 콜라이
상기 아미노 기의 그의 상응하는 옥소 기로의 산화적인 탈아민화는 EC 부류 1.4.1의 탈아민화 옥시도리덕타제에 의해 촉진된다. 상기와 같은 효소는 수용체로서 NAD+, NADP+ 또는 FAD+를 사용한다. 상기 부류의 효소들은 2-아미노-4-옥소펜타노에이트를 2,4-다이옥소펜타노에이트로(도 1, 단계 B), 2-아미노-4-하이드록시펜타노에이트를 2-옥소-4-하이드록시펜타노에이트로(도 1, 단계 M) 및 4-아미노부탄-2-온을 3-옥소부티르알데하이드로(도 1, 단계 K) 전환시킬 수 있다. 유사한 기질 상에서 작용하는 예시적인 옥시도리덕타제는 gdhA에 의해 암호화되는 글루타메이트 데하이드로게나제(탈아민화), ldh에 의해 암호화되는 류신 데하이드로게나제(탈아민화), 및 nadX에 의해 암호화되는 아스파테이트 데하이드로게나제(탈아민화)를 포함한다. 에스케리키아 콜라이로부터의 상기 gdhA 유전자 산물(McPherson et al., Nucleic. Acids Res. 11:5257-5266(1983); Korber et al., J. Mol. Biol. 234:1270-1273(1993), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)로부터의 gdh(Kort et al., Extremophiles 1:52-60(1997); Lebbink et al., J. Mol. Biol. 280:287-296(1998); Lebbink et al, J. Mol. Biol. 289:357-369(1999)), 및 할로박테리움 살리나룸(Halobacterium salinarum)으로부터의 gdhA1(Ingoldsby et al, Gene. 349:237-244(2005))은, 각각 NADP(H), NAD(H), 또는 이둘 모두를 촉진하면서, 글루타메이트의 2-옥소글루타레이트 및 암모니아로의 가역적인 상호전환을 촉진한다. 추가적인 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자 후보들이 바실러스 서브틸리스(subtilis)(Khan et al., Biosci. Biotechnol Biochem. 69:1861-1870(2005)), 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)(Purnell et al., Planta 222:167-180(2005)), 오리자 사티바(Oryza sativa)(Abiko et al., Plant Cell Physiol 46:1724-1734(2005)), 할로페락스 메디테라네이(Haloferax mediterranei)(Diaz et al., Extremophiles. 10:105-115(2006)), 할로박테리움 살리나룸(salinarum)(Hayden et al., FEMS Microbiol Lett. 211:37-41(2002)) 및 효모(Roca et al., Appl Environ. Microbiol 69:4732-4736(2003))에서 발견된다. 상기 니코티아나 타바쿰 효소는 gdh1 및 gdh2에 의해 암호화되는 알파 및 베타 서브유닛들로 구성된다(Purnell et al., Planta 222:167-180(2005)). 바실러스 세레우스(cereus)의 ldh 유전자는 류신, 아이소류신, 발린 및 2-아미노부타노에이트를 포함한 광범위한 기질을 수용하는 LeuDH 단백질을 암호화한다(Stoyan et al., J. Biotechnol 54:77-80(1997); Ansorge et al., Biotechnol Bioeng. 68:557-562(2000)). 상기 아스파테이트 데하이드로게나제를 암호화하는 써모토가 마리티마로부터의 nadX 유전자는 NAD의 생합성에 관련된다(Yang et al., J. Biol. Chem. 278:8804-8808(2003)). 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 14에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
gdhA p00370 118547 에스케리키아 콜라이
gdh P96110.4 6226595 써모토가 마리티마
gdhA1 NP_279651.1 15789827 할로박테리움 살리나룸
rocG NP_391659.1 16080831 바실러스 서브틸리스
gdh1 AAR11534.1 38146335 니코티아나 타바쿰
gdh2 AAR11535.1 38146337 니코티아나 타바쿰
GDH Q852M0 75243660 오리자 사티바
GDH Q977U6 74499858 할로페락스 메디테라네이
GDH P29051 118549 할로박테리움 살리나룸
GDH2 NP_010066.1 6319986 사카로마이세스 세레비지아에
ldh P0A393 61222614 바실러스 세레우스
nadX NP_229443.1 15644391 써모토가 마리티마
4-아미노부탄-2-온 옥시도리덕타제(탈아민화) 활성을 갖는 효소는 4-아미노부탄-2-온을 그의 상응하는 알데하이드로 전환시키는데 필요하다(도 1, 단계 K). 예시적인 후보는 3,5-다이아미노헥사노에이트 데하이드로게나제(EC 1.4.1.11) 및 리신 6-데하이드로게나제(EC 1.4.1.18)를 포함한다. 3,5-다이아미노헥사노에이트 데하이드로게나제는 3-아미노산과 3-옥소산을 상호전환시키며, 리신을 발효시키는 유기체에서 특성화되었다. 3,5-다이아미노헥사노에이트 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자, kdd가 최근에 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)에서 동정되었다(Kreimeyer et al., J Biol. Chem. 282:7191-7197(2007)). 상기 효소는 정제되었으며 다른 유기체들에서 특성화되었으나(Baker et al., J Biol. Chem. 247:7724-7734(1972); Baker et al., Biochemistry 13:292-299(1974)) 이들 효소와 관련된 유전자들은 공지되어 있지 않다. 다른 서열화된 유기체들 중의 후보는 서열 상동성에 의해 추리될 수 있다. lysDH 유전자에 의해 암호화되는 리신 6-데하이드로게나제는 1차 아민의 그의 상응하는 알데하이드로의 전환을 촉진한다. 상기 효소는 L-리신의 6-아미노 기의 가역적인 산화적 탈아민화를 자연적으로 촉진하여 2-아미노아디페이트-6-세미알데하이드를 형성한다(Misono et al., J Bacteriol. 150:398-401(1982)). 예시적인 효소들은 제오바실러스 스테아로써모필루스(Geobacillus stearothermophilus)(Heydari et al., Appl Environ. Microbiol 70:937-942(2004)), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)(Hashimoto et al., J Biochem. 106:76-80(1989); Misono and Nagasaki, J Bacteriol. 150:398-401(1982)), 및 아크로모박터 데니트리피칸스(Achromobacter denitrificans)(Ruldeekulthamrong et al., BMB. Rep. 41:790-795(2008))에서 발견된다. 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 15에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
kdd AAL93966.1 19713113 푸소박테리움 뉴클레아툼
lysDH BAB39707 13429872 제오바실러스 스테아로써모필루스
lysDH NP_353966 15888285 아그로박테리움 튜메파시엔스
lysDH AAZ94428 74026644 아크로모박터 데니트리피칸스
2-아미노-4-옥소펜타노에이트(AKP) 티올라제 또는 AKP 티올라제(AKPT)(단계 1, 도 1)는 클로스트리듐 스티클란디이(Clostridium sticklandii)에서 오르니틴 분해에 관여하는 피리독살 포스페이트-의존성 효소이다(Jeng et al., A. Biochemistry, 13:2898-2903(1974); Kenklies et al., Microbiology, 145:819-826(1999)). AKPT의 알파 및 베타 서브유닛(or-2(ortA) 및 or-3(ortB))을 암호화하는 유전자 클러스터가 최근에 동정되었으며 상기 효소의 생화학적 성질들이 특성화되었다(Fonknechten et al., J. Bacteriol., In Press(2009)). 상기 효소는 양쪽 방향 모두로 작용할 수 있으며 알라닌의 D-이성체와 반응한다. 기질로서 L-알라닌과의 작용을 최적화하기 위해서 효소 공학을 수행할 수 있다. 클로스트리듐 스티클란디이로부터 AKPT가 특성화되었으나 그의 단백질 서열은 아직 공개되지 않았다. 높은 서열 상동성을 갖는 효소들이 클로스트리듐 디피실레(difficile), 알칼리필루스 메탈리레디제네스(Alkaliphilus metalliredigenes) QYF, 써모아나에로박터 스페시즈(Thermoanaerobacter sp .) X514, 및 써모아나에로박터 텡콘젠시스(tengcongensis) MB4에서 발견된다(상기 Fonknechten et al.). 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 16에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
ortA (A) YP_001086914.1 126698017 클로스트리듐 디피실레 630
ortB (β) YP_001086915.1 126698018 클로스트리듐 디피실레 630
Amet_2368 (α) YP_001320181.1 150390132 알칼리필루스 메탈리레디제네스 QYF
Amet_2369 (β) YP_001320182.1 150390133 알칼리필루스 메탈리레디제네스 QYF
Teth514_1478 (α) YP_001663101.1 167040116 써모아나에로박터 스페시즈 X514
Teth514_1479 (β) YP_001663102.1 167040117 써모아나에로박터 스페시즈 X514
TTE1235 (α) NP_622858.1 20807687 써모아나에로박터 텡콘젠시스 MB4
thrC (β) NP_622859.1 20807688 써모아나에로박터 텡콘젠시스 MB4
2-아미노-4-옥소펜타노에이트(AKP)의 2,4-다이옥소펜타노에이트로의 전환(단계 B, 도 1)이 2-아미노-4-옥소펜타노에이트 아미노트랜스퍼라제 또는 옥시도리덕타제(탈아민화)에 의해 수행된다. 상기 형질전환에 적합한 효소의 선택은 상기 기질의 입체화학에 의존한다. 예를 들어, 상기 기질이 D-입체배치인 경우, D-아미노산 아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1.21)를 이용할 수 있는 반면, 상기 L-입체이성체는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1.1)와 같은 L-아미노트랜스퍼라제를 이용할 수 있다.
아스파테이트 아미노트랜스퍼라제는 아미노 기를 아스파테이트로부터 알파-케토글루타레이트로 운반하여 글루타메이트 및 옥살로아세테이트를 형성시킨다. 아스파테이트는 구조상 2-아미노-4-옥소펜타노에이트와 유사하다. 상기 전환은 예를 들어 에스케리키아 콜라이로부터의 aspC(Yagi et al., FEBS Lett., 100:81-84(1979); Yagi et al., Methods Enzymol., 133:83-89(1985)), 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 AAT2(Yagi et al., J. Biochem., 92:35-43(1982)), 및 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 ASP5(Kwok et al., J. Exp. Bot., 55:595-604(2004); De la et al., Plant J. 46:414-425(2006); Wilkie et al., Protein Expr. Purif., 12:381-389(1998))의 유전자 산물들에 의해 촉진된다. 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)로부터의 효소는 또 다른 기질, 예를 들어 2-아미노헥산다이오산 및 2,4-다이아미노부티르산을 트랜스아민화하는 것으로 입증되었다(Recasens et al., Biochemistry, 19:4583-4589(1980)). 다른 아미노산 유형 기질 상에서 작용하는 아미노트랜스퍼라제들이 또한 상기 형질전한을 촉진할 수 있다. 발린 아미노트랜스퍼라제는 발린 및 피루베이트의 2-케토아이소발레레이트 및 알라닌으로의 전환을 촉진한다. 에스케리키아 콜라이 유전자 avtA는 하나의 상기와 같은 효소를 암호화한다(Whalen et al., J. Bacteriol., 150:739-746(1982)). 상기 유전자 산물은 또한 α-케토부티레이트의 아민화를 촉진하여 α-아미노부티레이트를 생성시키지만, 상기 반응에서 아민 공여체는 동정되지 않았다(Whalen et al., J. Bacteriol., 158:571-574(1984)). 추가의 후보는 일부 유기체에서 리신 생합성 및 분해에 관여하는 효소인 알파-아미노아디페이트 트랜스아미나제(EC 2.6.1.39)이다. lysN에 의해 암호화되는, 써무스 써모필루스로부터의 상기 효소는 옥살로아세테이트, 2-옥소아이소카프로에이트, 2-옥소아이소발레레이트, 및 2-옥소-3-메틸발레레이트를 포함한 몇몇 또 다른 기질들에 대해 활성이다(Miyazaki et al., Microbiol. 150:2327-2334(2004)). 호모 사피엔스로부터의 유사한 효소가 특성화되었다(Okuno et al., Enz. Prot. 47:136-148(1993)). 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 17에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
aspC NP_415448.1 16128895 에스케리키아 콜라이
AAT2 P23542.3 1703040 사카로마이세스 세레비지아에
ASP5 P46248.2 20532373 아라비도프시스 탈리아나
got2 P00507 112987 라투스 노르베기쿠스
avtA YP_026231.1 49176374 에스케리키아 콜라이
lysN BAC76939.1 31096548 써무스 써모필루스
AadAT-II Q8N5Z0.2 46395904 호모 사피엔스
기질이 D-입체이성체로서 존재하는 경우, 트랜스아민화는 D-아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1.21)(또한 D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 및 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제(DAAT)로서 공지됨)에 의해 촉진될 수 있다. 상기 부류의 효소들은 그의 광범위한 기질 특이성(이는 종-특이성이다)으로 유명하다. dat에 의해 암호화되는, 바실러스 종 YM-1으로부터의 D-아미노트랜스퍼라제가 클로닝되고 서열화되었으며(Tanizawa et al., J. Biol. Chem., 264:2450-2454(1989)), 결정 구조가 풀렸다(Peisach et al., Biochemistry, 37:4958-4967(1998)). 상기 효소는 또한 기질 특이성을 변경시키기 위한 단백질 공학 연구의 주제였다(Gutierrez et al., Eur. J. Biochem, 267:7218-7223(2000); Gutierrez et al., Protein Eng., 11:53-58(1998)). 추가의 유전자들이 바실러스 리케니포르미스(licheniformis) ATCC 10716(Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta., 1350:38-40(1997)), 스타필로코커스 하에모리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus)(Pucci et al., J. Bacteriol., 177:336-342(1995)) 및 바실러스 서브틸리스(Martinez-Carrion et al., J. Biol. Chem., 240:3538-3546(1965))에서 발견된다. 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 18에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
dat P19938 118222 바실러스 스페시즈 YM-1
dat P54692 1706292 바실러스 리케니포르미스 ATCC 10716
dat P54694 1706294 스타필로코커스 하에모리티쿠스
dat O07597.1 3121979 바실러스 서브틸리스
도 1의 반응 K에서, 4-아미노부탄-2-온은 트랜스아민화되어 3-옥소부탄알을 형성한다. 상기 형질전환은 말단 아민 및 알데하이드를 상호전환시키는 아미노트랜스퍼라제에 의해 촉진될 수 있는 듯하다. 예시적인 후보 효소는 베타-알라닌/알파-케토글루타레이트 아미노트랜스퍼라제, GABA 아미노트랜스퍼라제, 3-아미노-2-메틸프로피오네이트 트랜스아미나제, 리신-6-아미노트랜스퍼라제, 2,4-다이아미노부타노에이트 트랜스아미나제, 푸트레신 아미노트랜스퍼라제 및 다이아민 아미노트랜스퍼라제이다.
카길(Cargill)은 말로닐-세미알데하이드를 통해 베타-알라닌으로부터 3-HP를 생산하는 베타-알라닌/알파-케토글루타레이트 아미노트랜스퍼라제를 개발하고 특허를 얻었다(Chandra et al., ARch. Microbiol., 176:443-451(2001)). 사카로마이세스 클루이베리 중의 SkPYD4의 유전자 산물이 또한 아미노 기 공여체로서 베타-알라닌을 우선적으로 사용하는 것으로서 입증되었다(Aberhart et al., J. Chem. Soc. 6:1404-1406(1979)). SkUGA1은 사카로마이세스 세레비지아에 GABA 아미노트랜스퍼라제의 동족체인 UGA1(Ichikawa et al., J. Mol. Catalysis A-Chem., 256:106-112(2006))를 암호화하는 반면, SkPYD4는 β-알라닌 및 GABA 트랜스아민화 모두에 관련된 효소를 암호화한다(상기 Aberthart et al.). 3-아미노-2-메틸프로피오네이트 트랜스아미나제는 메틸말로네이트 세미알데하이드로부터 3-아미노-2-메틸프로피오네이트로의 형질전환을 촉진한다. 상기 효소는 라투스 노르베기쿠스 및 수스 스크로파(Sus scrofa)에서 특성화되었으며 Abat에 의해 암호화된다(Chopra et al., Protein Expr. Purif., 25:533-540(2002), Kuznetsova et al., FEMS Microbiol. Rev., 29:263-279(2005)). 3-아미노-2-메틸프로피오네이트 트랜스아미나제에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 다른 유기체 중의 효소 후보들은 카에노라브디티스 엘레간스(Caenorbabditis elegans) 중의 Gta-1 및 바실러스 서브틸루스 중의 gabT를 포함한다. 또한, 유전자 gabT에 의해 암호화되는, 에스케리키아 콜라이 중의 고유 GABA 아미노트랜스퍼라제들 중 하나는 광범위한 기질 특이성을 갖는 것으로 나타났다(Fontaine et al., J. Bacteriol., 184:821-830(2002), Kanamasa et al., Appl. Microbiol Biotechnol., 80:223-229(2008)). 유전자 puuE는 에스케리키아 콜라이 중의 다른 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제를 암호화한다(Drummond et al., J. Biol. Chem., 235:318-325(1960)).
리신-6-아미노트랜스퍼라제는 리신을 알파-아미노아디페이트 세미알데하이드로 전환시킨다. 후보 효소들이 칸디다 유틸리스(Candida utilis)(Hammer et al., J Basic Microbiol 32:21-27(1992)), 플라보박테리움 루테센스(Flavobacterium lutescens)(Fujii et al., J Biochem. 128:391-397(2000)) 및 스트렙토마이세스 클라불리제누스(Streptomyces clavuligenus)(Romero et al., J Ind. Microbiol Biotechnol 18:241-246(1997))에서 특성화되었다. 스트렙토마이세스 클라불리제누스(Streptomyces clavuligenus)로부터의 재조합 리신-6-아미노트랜스퍼라제는 에스케리키아 콜라이에서 작용적으로 발현되었다(Tobin et al., J Bacteriol. 173:6223-6229(1991)). 상기 플라보박테리움 루테센스 효소는 아미노 수용체로서 알파-케토글루타레이트에 특이적이다(Soda et al., Biochemistry 7:4110-4119(1968)). 다이아미노부타노에이트 트랜스아미나제 활성을 갖는 효소는 애시네토박터 바우마니이(baumanii) 중의 dat 유전자 산물에 의해 암호화된다(Ikai et al., J Bacteriol. 179:5118-5125(1997)). DAT는 그의 천연 기질인 2,4-다이아미노부티레이트 이외에 리신의 말단 아민, 4-아미노부티레이트 및 오르니틴을 트랜스아민화한다. 후보 푸트레신 아미노트랜스퍼라제 효소는 에스케리키아 콜라이 중의 ygjG 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 spuC에 의해 암호화된다(Lu et al., J Bacteriol. 184:3765-3773(2002)). 상기 ygiG 유전자 산물은 또 다른 기질인 카다베린, 스페르미딘 및 1,7-다이아미노헵타노에이트와 반응한다(Samsonova et al., BMC. Microbiol 3:2(2003); Kim, J Biol. Chem. 239:783-786(1964)).
이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 19에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
SkyPYD4 ABF58893.1 98626772 사카로마이세스 클루이베리
SkUGAl ABF58894.1 98626792 사카로마이세스 클루이베리
UGAl NP_011533.1 6321456 사카로마이세스 세레비지아에
Abat P50554.3 122065191 라투스 노르베기쿠스
Abat P80147.2 120968 수스 스크로파
Gta-1 Q21217.1 6016091 카에노라브디티스 엘레간스
gabT P94427.1 6016090 바실러스 서브틸리스
gabT P22256.1 16130576 에스케리키아 콜라이 K12
puuE NP_415818.1 16129263 에스케리키아 콜라이 K12
lat BAB13756.1 10336502 플라보박테리움 루테센스
lat AAA26777.1 153343 스트렙토마이세스 클라불리제누스
dat P56744.1 6685373 애시네토박터 바우마니이
ygjG NP_417544 145698310 에스케리키아 콜라이
spuC AAG03688 9946143 슈도모나스 아에루기노사
도 1, 단계 C에서, 2,4-다이옥사펜타노에이트는 2,4-다이옥소펜타노에이트 데카복실라제에 의해 탈카복실화되어 3-옥소부티르알데하이드를 형성한다. 2,4-다이옥소펜타노에이트는 피루베이트 데카복실라제(EC 4.1.1.1) 및 벤조일포메이트 데카복실라제(EC 4.1.1.7)의 고유 기질들과 유사하다. 피루베이트 데카복실라제(PDC)(또한 케토산 데카복실라제로 지칭됨)는 알콜 발효에 핵심 효소이며, 피루베이트의 아세트알데하이드로의 탈카복실화를 촉진한다. 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 효소는 2-케토부티레이트, 2-케토발레레이트, 3-하이드록시피루베이트 및 2-페닐피루베이트를 포함한 지방족 2-케토산에 대해 광범위한 기질 범위를 갖는다(Li et al., Biochemistry, 38:10004-10012(1999)). 상기 효소는 광범위하게 연구되어 왔으며, 변경된 활성에 대해 조작되었고, 에스케리키아 콜라이에서 작용적으로 발현되었다(Killenberg-Jabs et al., Eur. J. Biochem., 268:1698-1704(2001); 상기 Li et al.; Schure et al., Appl. Environ. Microbiol., 64:1303-1307(1998)). pdc에 의해 암호화되는, 자이모모나스 모빌루스(Zymomonas mobilus)로부타의 PDC는 또한 광범위한 기질 범위를 가지며 상이한 기질들에 대한 친화성 변경에 지정된 공학 연구의 주제였다(Siegert et al., Protein Eng. Des. Sel., 18:345-357(2005)). 상기 효소의 결정 구조를 입수할 수 있다(상기 Killenberg-Jabs). 다른 잘-특성화된 PDC 효소는 아세토박터 파스퇴리안스(Acetobacter pasteurians)(Chandra et al., Arch. Microbiol. 176:443-451(2001)) 및 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)(Krieger et al., Eur. J. Biochem., 269:3256-3263(2002))로부터의 효소들을 포함한다. 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 20에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
pdc P06672.1 118391 자이모모나스 모빌리스
pdcl P06169 30923172 사카로마이세스 세레비지아에
pdc Q8L388 20385191 아세토박터 파스퇴리안스
pdcl Q12629 52788279 클루이베로마이세스 락티스
PDC처럼, 벤조일포메이트 데카복실라제(EC 4.1.1.7)는 광범위한 기질 범위를 가지며 효소 공학 연구의 표적이었다. 슈도모나스 푸티다로부터의 효소가 광범위하게 연구되어 왔으며 상기 효소의 결정 구조를 입수할 수 있다(Polovnikova et al., Biochemistry 42:1820-1830(2003); Hasson et al., Biochemistry, 37:9918-9930(1998)). 상기 슈도모나스 푸티다 효소의 활성 부위 중 2 개 잔사의 부위-지정된 돌연변이는 천연 기질 및 비-천연 기질에 대한 친화성(Km)을 변경시켰다(상기 Siegert et al.). 상기 효소의 성질들은 지정된 공학에 의해 추가로 개질되었다(Lingen et al., Chemobiochem., 4:721-726(2003); Lingen et al., Protein Eng., 15:585-593(2002)). mdlC에 의해 암호화되는, 슈도모나스 아에루기노사로부터의 효소가 또한 실험적으로 특성화되었다(Barrowman et al., FEMS Microbiology Letters, 34:57-60(1986)). 슈도모나스 스투트제리(슈도모나스 stutzeri), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 및 다른 유기체들로부터의 추가의 유전자들이 서열 상동성에 의해 추리되거나 또는 슈도모나스 푸티다에서 개발된 생육 선택 시스템을 사용하여 동정될 수 있다(Henning et al., Appl. Environ. Microbiol., 72:7510-7512(2006)). 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 21에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
mdlC P20906.2 3915757 슈도모나스 푸티다
mdlC Q9HUR2.1 81539678 슈도모나스 아에루기노사
dpgB ABN80423.1 126202187 슈도모나스 스투트제리
ilvB-1 YP_260581.1 70730840 슈도모나스 플루오레센스
2-옥소산을 탈카복실화할 수 있는 세 번째 효소는 알파-케토글루타레이트 데카복실라제(KGD)이다. 상기 부류 효소의 기질 범위는 지금까지 연구되지 않았다. 마이코박테리움 투베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)로부터의 KDC(Tian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:10670-10675(2005))가 제노마티카(Genomatica)에서 클로닝되었고 에스케리키아 콜라이에서 작용적으로 발현되었다. KDC 효소 활성은 브라디리조븀 자포니쿰(Bradyrhizobium japonicum) 및 메소리조븀 로티(Mesorhizobium loti)를 포함한 리조비아의 몇몇 종들에서 검출되었다(Green et al., J. Bacteriol., 182:2838-2844(2000)). 상기 KDC-암호화 유전자(들)가 이들 유기체에서 단리되지 않았지만, 게놈 서열을 입수할 수 있으며 각 게놈 중의 여러 유전자들이 추정적인 KDC로서 주석이 달린다. 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)로부터의 KDC가 또한 특성화되었으나 상기 활성과 관련된 유전자는 지금까지 동정되지 않았다(Shigeoka et al., Arch. Biochem. Biophys., 288:22-28(1991)). 상기 N-말단으로부터 시작하여 처음 20 개 아미노산이 서열화되었다 MTYKAPVKDVKFLLDKVFKV(상기 Shigeoka et al.). 상기 유전자는 KDC 활성에 대해 상기 N-말단 서열을 함유하는 유전자들을 시험함으로써 동정될 수 있다. 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 22에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
kgd O50463.4 160395583 마이코박테리움 투베르큘로시스
kgd NP_767092.1 27375563 브라디리조븀 자포니쿰 USDA110
kgd NP_105204.1 13473636 메소리조븀 로티
상기 단계를 촉진하기 위한 네 번째 효소는 분지 쇄 알파-케토산 데카복실라제(BCKA)이다. 상기 부류의 효소들은 쇄 길이가 탄소수 3 내지 6으로 변하는 다양한 화합물들 상에서 작용하는 것으로 입증되었다(Oku et al., J. Biol. Chem., 263:18386-18396(1988); Smit et al., Appl. Environ. Microbiol., 71:303-311(2005)). 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 중의 효소가 2-옥소부타노에이트, 2-옥소헥사노에이트, 2-옥소펜타노에이트, 3-메틸-2-옥소부타노에이트, 4-메틸-2-옥소부타노에이트 및 아이소카프로에이트를 포함한 다양한 분지 및 선형 기질들 상에서 특성화되었다(상기 Smit et al.). 상기 효소는 구조적으로 특성화되었다(Berthold et al., D. Biol. Crystallogr., 63:1217-1224(2007)). 상기 락토코커스 락티스 효소와 자이모모나스 모빌루스의 피루베이트 데카복실라제 간의 서열 정렬은 상기 촉매 및 기질 인식 잔기가 거의 동일함을 가리키며(상기 Siegert et al.), 따라서 상기 효소는 쉽게 지정된 공학에 따를 수 있다. 추가의 BCKA 유전자들이 상기 락토코커스 락티스 단백질 서열에 대한 상동성에 의해 동정될 수 있다(kdcA, AAS49166.1, 44921617, 락토코커스 락티스). 상기 효소에 대한 고 득점 BLASTp 적중 중 다수는 인돌피루베이트 데카복실라제(EC 4.1.1.74)로서 주석이 달린다. 인돌피루베이트 데카복실라제(IPDA)는 식물 및 식물 세균에서 인돌피루베이트의 인돌아세트알데하이드로의 탈카복실화를 촉진하는 효소이다.
2-아미노-4-케토펜타노에이트는 도 1의 단계 E에서 AKP 데카복실라제에 의해 탈카복실화되어 4-아미노부탄-2-온을 형성한다. 상기 형질전환은 아미노산 데카복실라제에 의해 촉진될 수 있다. 적합한 데카복실라제의 선택은 4-아미노-4-옥소펜타노에이트의 입체화학적 입체배치에 따른다. 상기 화합물이 D-입체배치인 경우, D-아미노산 데카복실라제가 사용될 수 있다. 하나의 상기와 같은 D-아미노산 데카복실라제는 다이아미노피멜레이트 데카복실라제(DDC, EC 4.1.1.20)이다. 상기 효소는 메소-다이아미노피멜레이트의 D-입체중심을 탈카복실화하여, 리신 생합성의 최종 단계를 촉진한다. DDC는 에스케리키아 콜라이(Momany et al., D. Biol. Crystallogr., 58:549-552(2002)), 마이코박테리움 투베르큘로시스(Kefala et al., Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun., 61:782-784(2005); Gokulan et al., J. Biol. Chem., 278:18588-18596(2003); Andersen et al., Gene, 124:105-109(1993)), 메틸로필루스 메틸로트로푸스(Methylophilus methylotrophus)(Tsujimoto et al., J. Biotechnol, 124:327-337(2006)), 및 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)(Hu et al., J. Biol. Chem., 283:21284-21293(2008))를 포함한 다수의 유기체들에서 연구되었다. 한편으로, 호모 사피엔스로부터의 오르니틴 데카복실라제(EC 4.1.1.17)는 오르니틴의 D-이성체에 대해 약한 활성을 가지며(Qu et al., Biochem. J., 375:465-470(2003); Fitzgerald et al., DNA, 8:623-634(1989)) 단계 E에서 탈카복실화에 사용될 수 있다. 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 23에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
lysA NP_417315.1 16130742 에스케리키아 콜라이
lysA AAA25361.1 149964 마이코박테리움 투베르큘로시스
lysA BAC92756.1 37196770 메틸로필루스 메틸로트로푸스
lysA ABW70801.1 158523325 헬리코박터 파이로리
odcl AA59969.1 386989 호모 사피엔스
2-아미노-4-케토펜타노에이트가 L-입체화학을 나타내는 경우, 아미노산 데카복실라제, 예를 들어 아스파테이트 데카복실라제(EC 4.1.1.11), 오르니틴 데카복실라제(EC 4.1.1.17) 또는 리신 데카복실라제(EC 4.1.1.18)를 사용할 수 있다. 예시적인 효소는 아스파테이트 데카복실라제(EC 4.1.1.11)이다. 2-아미노-4-케토펜타노에이트는 상기 효소의 고유 기질인 아스파테이트와 구조 유사성을 갖는다. 아스파테이트 데카복실라제는 판토테네이트 생합성에 관여하며 에스케리키아 콜라이에서 panD에 의해 암호화된다(Dusch et al., Appl. Environ. Microbiol., 65:1530-1539(1999); Ramjee et al., Biochem. J., 323:661-669(1997); Merkel et al., FEMS Microbiol. Lett., 143:247-252(1996); Schmitzberger et al., EMBO J., 22:6193-6204(2003)). 마이코박테리움 투베르큘로시스(Chopra et al., Protein Expr. Purif., 25:533-540(2002)) 및 코리네박테리움 글루타니쿰(Corynebacterium glutanicum)(상기 Dusch et al.)으로부터의 효소들이 에스케리키아 콜라이에서 발현되고 특성화되었다. 리신 데카복실라제 효소는 유전자 cadA 및 ldcC에 의해 에스케리키아 콜라이 게놈에서 암호화된다. CadA와 유사한 리신 데카복실라제가 최근에 비브리오 파라하에모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)에서 동정되었다(Tanaka et al., J. Appl. Microbiol. 104:1283-1293(2008)). ldc에 의해 암호화되는, 셀레노모나스 루미난튬(Selenomonas ruminantium)으로부터의 리신 데카복실라제는 진핵 오르니틴 데카복실라제와 서열 유사성을 가지며, 기질로서 L-리신 및 L-오르니틴 모두를 수용한다(Takatsuka et al., Biosci. Biotechnol Biochem. 63:1843-1846(1999)). 오르니틴 데카복실라제 효소 후보는 니코티아나 글루티노사(Nicotiana glutinosa)(Lee et al., Biochem. J. 360:657-665(2001)), 락토바실러스 스페시즈 30a(Guirard et al., J Biol. Chem. 255:5960-5964(1980)) 및 비브리오 불니피쿠스(vulnificus)에서 발견된다(Lee et al., J Biol. Chem. 282:27115-27125(2007)). 비브리오 불니피쿠스 기질 특이성과 관련된 잔기들이 밝혀졌다(상기 Lee et al.)
이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 24에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
panD P0A790 67470411 에스케리키아 콜라이
panD Q9X4N0 18203593 코리네박테리움 글루타니쿰
panD P65660.1 54041701 마이코박테리움 투베르큘로시스
cadA AAA23536. 145458 에스케리키아 콜라이
ldcC AAC73297.1 1786384 에스케리키아 콜라이
ldc O50657.1 13124043 셀레노모나스 루미난튬
cadA AB124819.1 44886078 비브리오 파라하에모리티쿠스
AF323910.1:1..1299 AAG45222.1 12007488 니코티아나 글루티노사
odcl P43099.2 1169251 락토바실러스 스페시즈 30a
VV2_1235 NP_763142.1 27367615 비브리오 불니피쿠스
반응 J(도 1)에서, 아세틸아크릴레이트는 아세토아크릴레이트 데카복실라제에 의해 2-옥소부텐으로 탈카복실화된다. 상기 형질전환을 촉진하는 효소는 지금까지 동정되지 않았으나, 유사한 반응들이 아코니테이트 데카복실라제, 4-옥살로크로토네이트 데카복실라제 및 신나메이트 데카복실라제 효소들에 의해 촉진된다.
아코니테이트 데카복실라제는 칸디다 균주 및 또한 섬유상 진균 아스퍼질러스 테레우스(terreus)에서 이타코네이트 생합성의 최종 단계를 촉진한다(Bonnarme et al., J. Bacteriol., 177:3573-3578(1995); Willke et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 56:289-295(2001)). ATEG_09971에 의해 암호화되는, 시스-아코니테이트 데카복실라제(CAD)(EC 4.1.16)가 동정되었으며 아스퍼질러스 테레우스 및 다른 관련된 진균들에서 광범위하게 연구되었다. 최근에, 상기 유전자가 클로닝되고 작용적으로 특성화되었다(Kanamasa et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 80:223-229(2008) 및 WO/2009/014437).
4-옥살로크로네이트 데카복실라제가 다수의 유기체들로부터 단리되고 특성화되었다. 상기 효소를 암호화하는 유전자는 슈도모나스 스페시즈(균주 600) 중의 dmpH 및 dmpE(Shingler et al., J. Bacteriol., 174:711-724(1992)), 슈도모나스 푸티다 중의 xylII 및 xylIII(Kato et al., Arch. Microbiol., 168:457-463(1997); Stanley et al., Biochemistry, 39:3514(2000); Lian et al., J. Am. Chem. Soc., 116:10403-10411(1994)) 및 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) JMP 134로부터 Reut_B5691 및 Reut_B5692(Hughes et al., J. Bacteriol., 158:79-83(1984))를 포함한다. 슈도모나스 스페시즈(균주 600)로부터의 효소를 암호화하는 유전자가 클로닝되고 에스케리키아 콜라이에서 발현되었다(상기 Shingler et al.). 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 25에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
dmpH CAA43228.1 45685 슈도모나스 스페시즈 CF600
dmpE CAA43225.1 45682 슈도모나스 스페시즈 CF600
xylII YP_709328.1 111116444 슈도모나스 푸티다
xylIII YP_709353.1 111116469 슈도모나스 푸티다
Reut_B5691 YP_299880.1 73539513 랄스토니아 유트로파 JMP134
Reut_B5692 YP_299881.1 73539514 랄스토니아 유트로파 JMP134
ATEG_09971 EAU29420.1 114187720 아스퍼질러스 테레우스
신나메이트(페닐아크릴레이트) 및 치환된 신나메이트 유도체의 상응하는 스타이렌 유도체로의 전환을 촉진하는 추가 부류의 데카복실라제들이 특성화되었다. 이들 효소는 다양한 유기체들에 공통이며, 클로닝되고 에스케리키아 콜라이에서 발현된 이들 효소를 암호화하는 특정 유전자들은 하기와 같다: 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 pad 1(Clausen et al., Gene, 142:107-112(1994)), 락토바실러스 플란타룸으로부터의 pdc(Barthelmebs et al., Appl. Environ. Microbiol., 67:1063-1069(2001); Rodriguez et al., J. Agric. Food Chem., 56:3068-3072(2008); Qi et al., Biochem. J., 375:465-470(2007)), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 페디코커스 펜토사세우스(Pedicoccus pentosaceus)(상기 Barthelmebs et al.)로부터의 pofK(pad)(Uchiyama et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 72:116-123(2008); Hashidoko et al., Biosci. Biotech. Biochem., 58:217-218(1994)), 및 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 퓨밀루스(pumilus)로부터의 padC(Cavin et al., Appl. Environ. Microbiol., 64:1466-1471(1998)). 슈도모나스 플루오레센스로부터의 페룰산 데카복실라제가 또한 정제되고 특성화되었다(Huang et al., J. Bacteriol., 176:5912-5918(1994)). 중요하게, 상기 부류의 효소들은 안정한 것으로 입증되었으며 외래 또는 내부적으로 결합된 보조 인자들을 필요로 하지 않고, 따라서 이는 이들 효소를 생물 형질전환에 이상적으로 적합하게 만든다(Sariaslani, F.S., Annu. Rev. Microbiol., 61:51-69(2007)). 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 26에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
padl AAB64980.1 1165293 사카로마이세스 세레비지아에
pdc AAC45282.1 1762616 락토바실러스 플란타룸
pad BAF65031.1 149941608 클렙시엘라 옥시토카
padC NP_391320.1 16080493 바실러스 서브틸리스
pad YP_804027.1 116492292 페디코커스 펜토사세우스
pad CAC18719.1 11691810 바실러스 퓨밀루스
데카복실화를 위한 추가의 효소는, 아세토아세테이트를 아세톤으로 탈카복실화하고 따라서 세균 용매발생에서의 그의 역할에 대해 연구된 효소인 아세토아세테이트 데카복실라제(EC 4.1.1.4)이다. 예시적인 세균 효소들이 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(acetobutylicum)(Benner et al., J. Am. Chem. So. 103:993-994(1981); HIghbarger et al., Biochemistry 35:41-46(1996); Petersen et al., Appl. Environ. Microbiol. 56:3491-3498(1990); Rozzel et al. J. Am. Chem. Soc. 106:4937-4941(1984)), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Kosaka, et al., Biosci. Biotechnol Biochem. 71:58-68(2007)) 및 클로스티리듐 베이제링키이(Ravagnani et al. Mol. Microbiol. 37:1172-1185(2000))으로부터 특성화되었다. 아세토아세테이트 데카복실라제 활성이 또한 슈도모나스 푸티다 및 바실러스 폴리믹사(polymyxa)에서 입증되었으나 유전자들은 지금까지 상기 활성과 관련되지 않았다(Matiasek et al., Curr. Microbiol. 42:276-281(2001)). 다른 유기체, 예를 들어 클로스트리듐 보툴리눔(botulinum) 및 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(amyloliquefaciens) 중의 세균 유전자들이 서열 상동성에 의해 동정될 수 있다. 인간 및 다른 포유동물에서, 아세토아세테이트 데카복실라제는 케톤-체 경로의 최종 단계를 촉진하나(Kalapos, Biochim. Biophys. Acta 1621:122-139(2003)), 상기 활성과 관련된 유전자들은 지금까지 동정되지 않았다. 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 27에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
adc NP_149328.1 15004868 클로스트리듐 아세토부틸리쿰
adc AAP42566.1 31075386 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰
cbei_3835 YP_001310906.1 150018652 클로스트리듐 베이제링키이
CLL_A2135 YP_001886324.1 187933144 클로스트리듐 보툴리눔
RBAM_030030 YP_001422565.1 154687404 바실러스 아밀로리퀘파시엔스
모든 상기 언급한 유전자 후보들을 또한 도 1의 단계 N에서 2-옥소-4-하이드록시펜타노에이트의 3-하이드록시부티르알데하이드로의 탈카복실화를 촉진하는데 사용할 수 있다.
부텐온 하이드라타제(단계 G, 도 1), 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제(단계 A, 도 3) 및 크로토나제(단계 A, 도 3)는 하이드롤라제-유형 형질전환들이다. 구체적으로, 4-하이드록시-2-부탄온으로의 부텐온의 수화(단계 G, 도 1)를 상기 하이드라타제 패밀리 효소들 중 한 효소에 의해 수행할 수 있다. 상기 형질전환을 수행할 수 있는 효소는 퓨마레이트 하이드라타제(EC 4.2.1.2), 2-(하이드록시메틸)글루타레이트 데하이드라타제(EC 4.2.1.-), 다이메틸말리에이트 하이드라타제(EC 4.2.1.85) 및 시트라말레이트 하이드롤리아제(EC 4.2.1.34)를 포함한다.
퓨마레이트 하이드라타제 효소는 퓨마레이트의 말레이트로의 가역적인 수화를 자연적으로 촉진한다. 기질로서 부탄온과 반응하는 퓨마레이트 하이드라타제의 능력이 문헌에 개시되지 않았지만, 상기 효소에 대한 구조 정보를 다량으로 입수할 수 있으며 다른 연구자들은 상기 효소를 활성, 억제 및 국소화가 변경되도록 성공적으로 조작하였다(Weaver, T., B. Biol. Crystallogr., 61:1395-1401(2005)). 에스케리키아 콜라이는 3 개의 퓨마라제, 즉 생육 조건에 의해 조절되는 FumA, FumB 및 FumC를 갖는다. FumB는 산소 감수성이고 오직 혐기성 조건 하에서만 활성이다. FumA는 미세혐기성 조건 하에서 활성이며, FumC는 호기성 생육하는 유일한 활성 효소이다(Tseng et al., J. Bacteriol., 183:461-467(2001); Woods et al., Biochem. Biophys. Acta., 954:14-26(1988); Guest et al., J. Gen. Microbiol., 131:2971-2984(1985)). 추가의 효소들이 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)(Smith et al., Int. J. Biochem. Cell Biol., 31:961-975(1999)), 써무스 써모필루스(Mizobata et al., Arch. Biochem. Biophys., 355:49-55(1998)) 및 라투스 노르베기쿠스(Kobayashi et al., J. Biochem., 89:1923-1931(1981))에서 발견된다. 높은 서열 상동성을 갖는 유사한 효소들은 아라비도프시스 탈리아나로부터의 fum1 및 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 fumC를 포함한다. 펠로토마쿨룸 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum)으로부터의 MmcBC는 2 개의 서브유닛을 갖는 또 다른 부류의 퓨마라제이다(Shimoyama et al., FEMS Microbiol. Lett., 270:207-213(2007)). 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 28에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
fumA NP_416129.1 16129570 에스케리키아 콜라이
fumB NP_418546.1 16131948 에스케리키아 콜라이
fumC NP_416128.1 16129569 에스케리키아 콜라이
fumC O69294 9789756 캄필로박터 제주니
fumC P84127 75427690 써모스 써모필루스
fumH P14408 120605 라투스 노르베기쿠스
fuml P93033 39931311 아라비도프시스 탈리아나
fumC Q8NRN8 39931596 코리네박테리움 글루타미쿰
MmcB YP_001211906 147677691 펠로토마쿨룸 써모프로피오니쿰
MmcC YP_001211907 147677692 펠로토마쿨룸 써모프로피오니쿰
2 개의 추가적인 하이드라타제 효소는 2-(하이드록시메틸)글루타레이트 데하이드라타제 및 다이메틸말리에이트 하이드라타제이며, 이들 효소는 유박테리움 발케리(Eubacterium barkeri)(이전에는 클로스트리듐 발케리)에서 니콘티네이트 이화작용에서의 그들의 역할에 대해 연구되었다(Alhapel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:12341-12346(2006)). 2-(하이드록시메틸)글루타레이트 데하이드라타제는 2-(하이드록시메틸)글루타레이트를 2-메틸렌-글루타레이트로 탈수시키는 [4Fe-4S]-함유 효소이다. 상기 효소는 유박테리움 발케리 중의 hmd에 의해 암호화된다(상기 Alhapel et al.). 높은 서열 상동성을 갖는 유사한 효소들이 박테로이데스 카필로수스(Bacteroides capillosus), 아나에로트렁쿠스 콜리호미니스(Anaerotruncus colihominis), 및 나트라나에로비우스 써모필리우스(Natranaerobius thermophilius)에서 발견된다. 이들 효소는 [4Fe-4S]-함유 세균성 세린 데하이드라타제의 알파 및 베타 서브유닛과 상동성이다(예를 들어 tdcG, sdhB 및 sdaA에 의해 암호화되는 에스케리키아 콜라이 효소). 다이메틸말리에이트 하이드라타제(EC 4.2.1.85)는 다이메틸말리에이트를 수화시켜 (2R,3S)-2,3-다이메틸말레이트를 형성하는 아코니타제 패밀리의 가역적인 Fe2+-의존성이고 산소-감수성인 효소이다. 상기 효소는 유박테리움 발케리에서 dmdAB에 의해 암호화된다(상기 Alhapel, et al.; Kollmann-Koch et al., Physiol. Chem., 365:847-857(1984)). 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 29에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
hmd ABC88407.1 86278275 유박테리움 발케리
BACCAP_02294 ZP_02036683.1 154498305 박테로이데스 카필로수스 ATCC 29799
ANACOL_02527 ZP_02443222.1 167771169 아나에로트렁쿠스 콜리호미니스 DSM 17241
NtherDRAFT_2368 ZP_02852366.1 169192667 나트라나에로비우스 써모필루스 JW/NM-WN-LF
dmdA ABC88408 86278276 유박테리움 발케리
dmdB ABC88409.1 86278277 유박테리움 발케리
추가적인 효소는 시트라말레이트로부터 물의 알파, 베타 제거를 촉진하여 메사코네이트를 형성시키는 가역적인 하이드롤리아제인 2-메틸말레이트 데하이드라타제(또한 시트라말레이트 하이드롤리아제로 지칭됨)이다. 상기 효소가 정제되었고 클로스트리듐 테타노몰품(tetanomorphum)에서 특성화되었다(Wang et al., J. Biol. Chem., 244:2516-2526(1969)). 상기 효소의 활성이 또한 글루타메이트 분해 VI 경로와 관련하여 시트로박터(Citrobacter) 및 모르가넬라(Morganella) 속의 여러 세균에서 검출되었다(상기 Kato et al.). 상기 효소를 암호화하는 유전자는 지금까지 어떠한 유기체에서도 동정되지 않았다.
3-하이드록시부티릴-CoA를 형성하는 크로토닐-CoA의 수화(단계 B, 도 3)는 크로토나제(EC 4.2.1.55)에 의해 촉진된다. 상기 효소는 일부 유기체, 예를 들어 클로스트리듐 종에서 n-부탄올 형성에 필요하며, 또한 설포로부스, 애시디아누스, 및 메탈로스파에라 속의 호열호산성 고세균의 3-하이드록시프로피오네이트/4-하이드록시부티레이트 주기의 한 단계를 포함한다. 크로토나제 효소를 암호화하는 예시적인 유전자들을 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Boynton et al., J. Bacteriol., 178:3015-3024(1996)), 클로스트리듐 클루이베리(Hillmer et al., FEBS Lett., 21:351-354(1972)), 및 메탈로스파에라 세둘라(상기 Berg et al.)에서 발견할 수 있다. 지방산 베타-산화 및/또는 다양한 아미노산들의 대사에 관련된 에노일-CoA 하이드라타제들이 또한 크로노닐-CoA의 수화를 촉진하여 3-하이드록시부티릴-CoA를 형성시킬 수 있다(Roberts et al., Arch. Microbiol., 117:99-108(1978); Agnihotri et al., Bioorg. Med. Chem., 11:9-20(2003); Conrad et al., J. Bacteriol. 118:103-111(1974)). 예시적인 에노일-CoA 하이드라타제는 슈도모나스 푸티다로부터의 ech의 유전자 산물이다(상기 Roberts et al.). 상기 슈도모나스 푸티다의 에노일-CoA 하이드라타제, phaA 및 phaB는 페닐아세테이트 이화 작용 중에 이중 결합의 하이드록실화를 수행함을 보였다(Olivera et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 95:6419-6424(1998)). 슈도모나스 플루오레센스로부터의 paaA 및 paaB는 유사한 형질전환을 촉진한다(상기 Olivera et al.). 마지막으로, 다수의 에스케리키아 콜라이 유전자들이 maoC(Park et al., J. Bacteriol., 185:5391-5398(2003)), paaF(Ismail et al., Eur. J. Biochem., 270:3047-3054(2003); Park et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 113-116:335-346(2004); Park et al., Biotechnol Bioeng., 86:681-686(2004)) 및 paaG(상기 Ismail et al.; 상기 Park et al.; 상기 Park et al.)를 포함한 에노일-CoA 하이드라타제 작용기들을 나타내는 것으로 입증되었다. 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 30에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
crt NP349318.1 15895969 클로스트리듐 아세토부틸리쿰
crtl YP_001393856 153953091 클로스트리듐 클루이베리 DSM 555
ech NP_745498.1 26990073 슈도모나스 푸티다
phaA ABF82233.1 26990002 슈도모나스 푸티다
phaB ABF82234.1 26990001 슈도모나스 푸티다
paaA NP_745427.1 106636093 슈도모나스 플루오레센스
paaB NP_745426.1 106636094 슈도모나스 플루오레센스
maoC NP_415905.1 16129348 에스케리키아 콜라이
paaF NP_415911.1 16129354 에스케리키아 콜라이
paaG NP_415912.1 16129355 에스케리키아 콜라이
한편으로, fadA 및 fadB의 에스케리키아 콜라이 유전자 산물들이 에노일-CoA 하이드라타제 활성을 나타내는 지방산 산화에 관여하는 다중효소 복합체를 암호화한다(Haller et al., Biochemistry 39:4622-4629(2000); Martinez-Carrion et al., J. Biol. Chem. 240:3538-3546(1965); Matthies et al., Appl. Environ. Microbiol. 58:1435-1439(1992)). fadR에 의해 암호화되는 음성 조절 인자의 녹 아웃을 사용하여 상기 fadB 유전자 산물을 활성화시킬 수 있다(Jeng et al., A. Biochemistry 13:2898-2903(1974)). 상기 fadI 및 fadJ 유전자는 유사한 작용들을 암호화하며 혐기성 조건 하에서 자연적으로 발현된다(Atsumi et al., Nature451:86-89(2008)). 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 31에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
fadA YP_026272.1 49176430 에스케리키아 콜라이
fadB NP_418288.1 16131692 에스케리키아 콜라이
fadI NP_416844.1 16130275 에스케리키아 콜라이
fadJ NP_416843.1 16130274 에스케리키아 콜라이
fadR NP_415705.1 16129150 에스케리키아 콜라이
4-하이드록시부티릴-CoA의 크로토닐-CoA로의 가역적인 축합(단계 A, 도 3)은 이작용성 효소 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제/비닐아세틸-CoA Δ-아이소머라제에 의해 촉진된다. 상기 효소는 먼저 4-하이드록시부티릴-CoA를 비닐아세틸-CoA로 탈수시키고, 이는 후속적으로 재배열되어 크로토닐-CoA를 형성한다. 클로스트리듐 클루이베리 및 클로스트리듐 아미노부티리움으로부터의 효소들이 정제되고, 특성화되고, N-말단 도메인에서 서열화되었다(Scherf et al., Eur. J. Biochem., 215:421-429(1993); Scherf et al., Arch. Microbiol., 161:239-245(1994)). 클로스트리듐 아미노부티리움(Clostiridium aminobutyrium) 및 클로스트리듐 클루이베리로부터의 abfD 유전자는 상기 N-말단 아미노산 서열과 정확히 합치하며, 4-하이드록시부티룰-CoA 데하이드라타제/비닐아세틸-CoA Δ-아이소머라제 활성을 암호화하는 것으로 나타났다. 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)로부터의 abfD 및 메탈로스파에라 세둘라로부터의 Msed_1220을 포함한 유사한 유전자들이 게놈 프로젝트로부터 상동성을 통해 동정된다. 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 32에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
abfD YP_001396399.1 153955634 클로스트리듐 클루이베리
abfD P55792 84028213 클로스트리듐 아미노부티리쿰
abfD YP_001928843 188994591 포르피로모나스 진지발리스
Msed_1220 YP_001191305.1 146303989 메탈로스파에라 세둘라
2-아미노-4-케토펜타노에이트(도 1, 반응 I) 및 4-아미노부탄-2-온(단계 F, 도 1)의 탈아민화를 각각 AKP 암모니아-라이아제 및 4-아미노부탄-2-온 암모니아-라이아제에 의해 수행할 수 있다. 이들 탈아민화는 아스파타제에 의한 아스파테이트에서 퓨마레이트로의 탈아민화와 매우 유사하다. 상기 효소는 광범위하게 연구되었으며 몇몇 결정 구조들을 입수할 수 있다. 상기 에스케리키아 콜라이 효소는 또 다른 기질, 예를 들어 아스파테이트페닐메틸에스터, 아스파라진, 벤질-아스파테이트 및 말레이트와 반응하는 것으로 나타났다(Ma et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 672:60-65(1992)). 별도의 연구에서, 기질 특이성을 변경시키기 위해 상기 효소에 대해 방향 진화(directed evolution)가 실행되었다(Asano et al., Biomol. Eng., 22:95-101(2005)). 아스파테이트 작용기를 갖는 효소들이 또한 하에모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae)(Sjostrom et al., Biochem. Biophys. Acta., 1324:182-190(1997)), 슈도모나스 플루오레센스(Takagi et al., J. Biochem., 96:545-552(1984)), 바실러스 서브틸리스(상기 Sjostrom et al.) 및 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)(Takagi et al., J. Bacteriol., 161:1-6(1985))에서 특성화되었다. 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 33에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
aspA NP_418562 90111690 에스케리키아 콜라이
aspA P44324.1 1168534 하에모필루스 인플루엔자
aspA P07346.1 114273 슈도모나스 플루오레센스
ansB P26899.1 251757243 바실러스 서브틸루스
aspA P33109.1 416661 세라티아 마르세센스
유사한 암모니아 라이아제 반응이 메사코네이트를 통해 글루타메이트 발효 경로에 관여하는 효소인 메틸아스파타제(EC 4.3.1.2)에 의해 촉진된다. 상기 효소(또한 베타-메틸아스파타제로서 공지됨) 및 3-메틸아스파테이트 암모니아-라이아제는 쓰레오-3-메틸아스파테이트의 메사코네이트로의 탈아민화를 자연적으로 촉진한다. 클로스트리듐 테타노몰품으로부터 3-메틸아스파타제가 클로닝되었으며, 에스케리키아 콜라이에서 작용적으로 발현되고 결정화되었다(Asuncion et al., 57:731-733(2001); Asuncion et al., J Biol Chem. 277:8306-8311(2002); Botting et al., 27:2953-2955(1988); Goda et al., 31:10747-10756(1992)). 시트로박터 아말로나티쿠스(Citrobacter amalonaticus)에서, 상기 효소는 BAA28709에 의해 암호화된다(Kato et al., Arch. Microbiol 168:457-463(1997)). 3-메틸아스파타제가 또한 에스케리키아 콜라이 YG1002에서 결정화되었지만(Asano et al., FEMS Microbiol Lett. 118-255-258(1994)) 상기 단백질 서열은 진뱅크와 같이 공개된 데이터베이스에 실려있지 않다. 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 서열과 관련된 데이터를 하기 표 34에 나타낸 진뱅크 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
mal AAB2407.1 259429 클로스트리듐 테타노몰품
BAA28709 BAA28709.1 318437 시트로박터 아말로나티쿠스
일부 실시태양에서, 상기 아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제는 ortA(α), ortB(β), Amet_2368(α), Amet_2369(β), Teth514_1478(α), Teth514_1479(β), TTE1235(α) 및 thrC(β)로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되었다.
일부 실시태양에서, 상기 AKP 데하이드로게나제는 thrA, akthr2, hom6, hom1, hom2, fadB, fadJ, Hbd2, Hbd1, hbd, HSD17B10, phbB, phaB, Msed_1423, Msed_0399, Msed_0389, Msed_1993, adh, adhA, adh-A, mdh, ldhA, ldh 및 bdh로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 2-아미노-4-하이드록시펜타노에이트 아미노트랜스퍼라제는 aspC, AAT2, ASP5, got2, avtA, lysN, AadAT-II, dat, lat, ygjG, spuC, SkyPYD4, SkUGA1, UGA1, Abat, Abat, Gta-1, gabT, 및 puuE로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 2-아미노-4-하이드록시펜타노에이트 옥시도리덕타제(탈아민화)는 gdhA, gdh, gdhA1, rocG, gdh1, gdh2, GDH, GDH2, ldh 및 nadX로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 2-옥소-4-하이드록시펜타노에이트 데카복실라제는 pdc, pdc1, mdlC, dpgB, ilvB-1, kgd, kdcA, lysA, panD, cadA, ldc, ldcC, AF323910.1:1...1299, odc1, VV2_1235, dmpH, dmpE, xylII, xylIII, Reut_B5691, Reut_B5692, CAD, pad1, pofK(pad), padC, pad, adc, cbei_3835, CLL_A2135, RBAM_030030으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제는 alrA, ADH2, yqhD, bdhI, bdhII, adhA, 4hbd, adhI, P84067, mmsb, dhat 및 3hidh로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 AKP 아미노트랜스퍼라제는 aspC, AAT2, ASP5, got2, avtA, lysN, AadAt-II, dat, lat, ygjG, spuC, SkyPYD4, SkUGA1, UGA1, Abat, Gta-1, gabT 및 puuE로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 AKP 옥시도리덕타제(탈아민화)는 gdhA, gdh, gdhA1, rocG, gdh1, gdh2, GDH, GDH2, ldh 및 nadX로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다. 일부 실시태양에서, 상기 2,4-다이옥소펜타노에이트 데카복실라제는 pdc, pdc1, mdlC, dpgB, ilvB-1, kgd, kdcA, lysA, panD, cadA, ldc, ldcC, AF323910.1:1...1299, odc1, VV2_1235, dmpH, dmpE, xylII, xylIII, Reut_B5691, Reut_B5692, CAD, pad1, pofK(pad), padC, pad, adc, cbei_3835, CLL_A2135, RBAM_030030으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(케톤 환원)는 thrA, akthr2, hom6, hom1, hom2, fadB, fadJ, Hbd2, Hbd1, hbd, HSD17B10, phbB, phaB, Msed_1423, Msed_0399, Msed_0389, Msed_1993, adh, adhA, adh-A, mdh, ldhA, ldh 및 bdh로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(알데하이드 환원)는 alrA, ADH2, yqhD, bdhI, bdhII, adhA, 4hbd, adhI, P84067, mmsb, dhat 및 3hidh로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제는 thrA, akthr2, hom6, hom1, hom2, fadB, fadJ, Hbd2, Hbd1, hbd, HSD17B10, phbB, phaB, Msed_1423, Msed_0399, Msed_0389, Msed_1993, adh, adhA, adh-A, mdh, ldhA, ldh 및 bdh로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 AKP 데카복실라제는 pdc, pdc1, mdlC, dpgB, ilvB-1, kgd, kdcA, lysA, panD, cadA, ldc, ldcC, AF323910.1:1...1299, odc1, VV2_1235, dmpH, dmpE, xylII, xylIII, Reut_B5691, Reut_B5692, CAD, pad1, pofK(pad), padC, pad로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 4-아미노부탄-2-온 아미노트랜스퍼라제는 aspC, AAT2, ASP5, got2, avtA, lysN, AadAt-II, dat, lat, ygjG, spuC, SkyPYD4, SkUGA1, UGA1, Abat, Gta-1, gabT 및 puuE로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 4-아미노부탄-2-온 옥시도리덕타제(탈아민화)는 gdhA, gdh, gdhA1, rocG, gdh1, gdh2, GDH, GDH2, ldh, nadX, kdd 및 lysDH로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 4-아미노부탄-2-온 암모니아-라이아제는 aspA, ansB, mal 및 BAA28709로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 부텐온 하이드라타제는 fumA, fumB, fumC, fumH, fum1, MmcB, MmcC, hmd, BACCAP_02294, ANACOL_02527, NtherDRAFT_2368, dmdA, dmdB, crt, crt1, ech paaA, paaB, phaA, phaB, maoC, paaF, paaG, abfD, Msed_1220, fadA, fadB, fadI, fadJ, 및 fadR로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 AKP 암모니아-라이아제는 aspA, ansB, mal 및 BAA28709로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 아세틸아크릴레이트 데카복실라제는 pdc, pdc1, mdlC, dpgB, ilvB-1, kgd, kdcA, lysA, panD, cadA, ldc, ldcC, AF323910.1:1...1299, odc1, VV2_1235, dmpH, dmpE, xylII, xylIII, Reut_B5691, Reut_B5692, CAD, pad1, pofK(pad), padC, pad, adc, cbei_3835, CLL_A2135, RBAM_030030으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 아세토아세틸-CoA 리덕타제(CoA-의존성, 알데하이드 형성)는 acrl, sucD, bphG, bld, adhE, Msed_0709, mcr, asd-2, Saci_2370, Ald 및 eutE로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 아세토아세틸-CoA 리덕타제(CoA-의존성, 알콜 형성)는 adhE, adhE2, mcr, Rcas_2929, NAP1_02720, MGP2080_00535, 및 FAR로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 아세토아세틸-CoA 리덕타제(케톤 환원)는 thrA, akthr2, hom6, hom1, hom2, fadB, fadJ, Hbd2, Hbd1, hbd, HSD17B10, phbB, phaB, Msed_1423, Msed_0399, Msed_0389, Msed_1993, adh, adhA, adh-A, mdh, ldhA, ldh 및 bdh로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알데하이드 형성)는 acr1, sucD, bphG, bld, adhE, Msed_0709, mcr, asd-2, Saci_2370, Ald 및 eutE로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성)는 adhE, adhE2, mcr, Rcas_2929, NAP1_02720, MGP2080_00535, 및 FAR로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제는 fumA, fumB, fumC, fumH, fum1, MmcB, MmcC, hmd, BACCAP_02294, ANACOL_02527, NtherDRAFT_2368, dmdA, dmdB, crt, crt1, ech paaA, paaB, phaA, phaB, maoC, paaF, paaG, abfD, Msed_1220, fadA, fadB, fadI, fadJ, 및 fadR로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시태양에서, 상기 크로토나제는 fumA, fumB, fumC, fumH, fum1, MmcB, MmcC, hmd, BACCAP_02294, ANACOL_02527, NtherDRAFT_2368, dmdA, dmdB, crt, crt1, ech paaA, paaB, phaA, phaB, maoC, paaF, paaG, abfD, Msed_1220, fadA, fadB, fadI, fadJ, 및 fadR로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된다.
본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 하나 이상의 1,3-부탄다이올 생합성 경로에 관여하는 효소 또는 단백질 중 하나 이상을 암호화하는 발현 가능한 핵산을 도입시킴으로써 생성시킬 수 있다. 생합성에 대해 선택된 숙주 미생물 유기체에 따라, 특정 1,3-부탄다이올 생합성 경로 중 일부 또는 전부에 대한 핵산을 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 선택된 숙주가 목적하는 생합성 경로에 대해 하나 이상의 효소 또는 단백질이 결핍된 경우, 상기 결핍된 효소(들) 또는 단백질(들)에 대해 발현 가능한 핵산을 후속의 외래 발현을 위해 상기 숙주에 도입시킨다. 한편으로, 상기 선택된 숙주가 일부 경로 유전자들의 내생적인 발현을 나타내지만 다른 것들은 결핍된 경우, 1,3-부탄다이올 생합성을 달성하기 위해 상기 결핍 효소(들) 또는 단백질(들)에 대해 암호화 핵산이 필요하다. 따라서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체를, 목적하는 생합성 경로를 획득하기 위해 외래 효소 또는 단백질 활성을 도입시킴으로써 생성시키거나, 또는 하나 이상의 내생적인 효소 또는 단백질과 함께 목적하는 생성물, 예를 들어 1,3-부탄다이올을 생산하는 하나 이상의 외래 효소 또는 단백질 활성을 도입시킴으로써 목적하는 생합성 경로를 획득할 수 있다.
선택된 숙주 미생물 유기체의 1,3-부탄다이올 생합성 경로 구성성분들에 따라, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 하나 이상의 외부적으로 발현된 1,3-부탄다이올 경로-암호화 핵산 내지 하나 이상의 1,3-부탄다이올 생합성 경로에 대한 암호화 핵산 전부를 포함할 것이다. 예를 들어, 1,3-부탄다이올 생합성을, 상응하는 암호화 핵산의 외부 발현을 통해 경로 효소 또는 단백질이 결핍된 숙주에 확립시킬 수 있다. 1,3-부탄다이올 경로의 모든 효소 또는 단백질이 결핍된 숙주에서, 상기 경로 중의 모든 효소 또는 단백질의 외부 발현을 포함할 수 있지만, 상기 숙주가 경로 효소 또는 단백질 중 하나 이상을 함유한다 하더라도 상기 경로의 모든 효소 또는 단백질이 발현될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 1,3-부탄다이올의 생산 경로 중의 모든 효소 또는 단백질의 외부 발현을 포함할 수 있다.
본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 발현 가능한 형태로 도입되는 암호화 핵산의 수가 적어도 상기 선택된 숙주 미생물 유기체의 1,3-부탄다이올 경로 결핍에 필적할 것임을 알 것이다. 따라서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 본 발명에 개시된 1,3-부탄다이올 생합성 경로를 구성하는 효소 또는 단백질을 암호화하는 1, 2, 3, 4, 5, 전체 이하 핵산을 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 비-천연 미생물 유기체는 1,3-부탄다이올 생합성을 촉진 또는 최적화하거나, 또는 상기 숙주 미생물 유기체에 다른 유용한 작용들을 부여하는 다른 유전자 변형을 또한 포함할 수 있다. 하나의 상기와 같은 다른 작용성은 예를 들어 1,3-부탄다이올 경로 전구체, 예를 들어 아세틸-CoA 중 하나 이상의 합성의 증대를 포함할 수 있다.
일반적으로, 숙주 미생물 유기체는 상기 유기체가 1,3-부탄다이올 경로의 전구체를, 자연적으로 생성된 분자로서 또는 목적하는 전구체의 드 노보 생산을 제공하거나 또는 상기 숙주 미생물 유기체에 의해 자연적으로 생산된 전구체의 증가된 생산을 제공하도록 조작된 생성물로서 생산하도록 선택된다. 예를 들어, 아세틸-CoA는 에스케리키아 콜라이와 같은 숙주 유기체에서 자연적으로 생산된다. 숙주 유기체를 본 발명에 개시된 바와 같이, 전구체의 생산을 증가하도록 조작할 수 있다. 또한, 목적하는 전구체를 생산하도록 조작된 미생물 유기체를 숙주 유기체로서 사용하고 1,3-부탄다이올 경로의 효소 또는 단백질을 발현하도록 추가로 조작할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 1,3-부탄다이올을 합성하는 효소적 능력을 함유하는 숙주로부터 생성된다. 상기 특정한 실시태양에서, 예를 들어 1,3-부탄다이올 경로 반응이 1,3-부탄다이올 생산을 향하도록 구동하여 1,3-부탄다이올 경로 생성물의 합성 또는 축적을 증가시키는 것이 유용할 수 있다. 증가된 합성 또는 축적을 예를 들어 상술한 1,3-부탄다이올 경로 효소 또는 단백질 중 하나 이상을 암호화하는 핵산의 과발현에 의해 수행할 수 있다. 상기 1,3-부탄다이올 경로의 효소 또는 효소들 및/또는 단백질 또는 단백질들의 과발현은 예를 들어 내생적인 유전자 또는 유전자들의 외부 발현을 통해서, 또는 이종 유전자 또는 유전자들의 외부 발현을 통해서 일어날 수 있다. 따라서, 천연 유기체를, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체, 예를 들어 1,3-부탄다이올 생합성 경로 효소 또는 단백질을 암호화하는 1, 2, 3, 4, 5, 즉 전체 이하의 핵산의 과발현을 통해 1,3-부탄다이올을 생산하는 유기체가 되도록 쉽게 생성시킬 수 있다. 또한, 비-천연 유기체를 상기 1,3-부탄다이올 생합성 경로 효소의 활성을 증가시키는 내생 유전자의 돌연변이에 의해 생성시킬 수 있다.
특히 유용한 실시태양에서, 상기 암호화 핵산의 외부 발현을 사용한다. 외부 발현은 상기 발현 및/또는 조절 요소를 상기 숙주 및 용도의 주문에 맞추어 사용자에 의해 조절되는 목적하는 발현 수준을 달성하는 능력을 부여한다. 그러나, 내생적인 발현은 또한 예를 들어 유도 프로모터 또는 다른 조절 요소에 결합 시 상기 유전자의 프로모터의 음의 조절 효과기 또는 유도를 제거함으로써 다른 실시태양들에도 사용될 수 있다. 따라서, 천연 유도 프로모터를 갖는 내생 유전자를 적합한 유도체의 제공에 의해 상향 조절하거나, 또는 내생 유전자의 조절 부위를 유도 조절 요소를 통합하도록 조작할 수 있으며, 이에 의해 목적하는 시기에 내생 유전자의 증가된 발현의 조절을 허용할 수 있다. 유사하게, 유도 프로모터를 비-천연 미생물 유기체 내에 도입된 외래 유전자에 대한 조절 요소로서 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 하나 이상의 외래 핵산 중 어느 것이든 미생물 유기체에 도입시켜 본 발명의 비-천연 미생물 유기체를 생산시킬 수 있는 것으로 생각된다. 상기 핵산을 예를 들어 상기 미생물 유기체에 1,3-부탄다이올 생합성 경로가 부여되도록 도입시킬 수 있다. 한편으로, 암호화 핵산을 1,3-부탄다이올 생합성 능력을 부여하도록 상기 필요한 반응들 중 일부를 촉진하는 생합성 능력을 갖는 중간 미생물 유기체를 생산하도록 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 1,3-부탄다이올 생합성 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체는 목적하는 효소 또는 단백질을 암호화하는 2 개 이상의 외래 핵산을 포함할 수 있다. 따라서 생합성 경로의 2 개 이상의 효소 또는 단백질의 임의의 조합을 본 발명의 비-천연 미생물 유기체에 포함시킬 수 있는 것으로 생각된다. 유사하게, 경우에 따라, 목적하는 생합성 경로의 효소 및/또는 단백질의 조합이 상응하는 목적하는 생성물을 생성시키는 한, 생합성 경로의 3 개 이상의 효소 또는 단백질의 임의의 조합을 본 발명의 비-천연 미생물 유기체 등에 포함시킬 수 있는 것으로 생각된다. 유사하게, 경우에 따라, 목적하는 생합성 경로의 효소 및/또는 단백질의 조합이 상응하는 목적하는 생성물을 생성시키는 한, 본 발명에 개시된 바와 같은 생합성 경로의 4 개 이상의 효소 또는 단백질의 임의의 조합을 본 발명의 비-천연 미생물 유기체에 포함시킬 수 있다.
본 발명에 개시된 바와 같은 1,3-부탄다이올의 생합성 이외에, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체 및 방법을 또한 서로 및 다른 경로들에 의해 생성물 생합성을 달성하기 위해 당해 분야에 널리 공지된 다른 미생물 유기체 및 방법들과 다양한 조합으로 사용할 수 있다. 예를 들어 상기 1,3-부탄다이올 생산자의 사용 이외에 1,3-부탄다이올을 생산하는 한 가지 대안은 1,3-부탄다이올 경로 중간체를 1,3-부탄다이올로 전환시킬 수 있는 또 다른 미생물 유기체의 첨가를 통해서이다. 한 가지 상기와 같은 과정은 예를 들어 1,3-부탄다이올 경로 중간체를 생산하는 미생물 유기체의 발효를 포함한다. 이어서 상기 1,3-부탄다이올 경로 중간체를, 상기 1,3-부탄다이올 경로 중간체를 1,3-부탄다이올로 전환시키는 두 번째 미생물 유기체에 대한 기질로서 사용할 수 있다. 상기 1,3-부탄다이올 경로 중간체를 상기 두 번째 유기체의 또 다른 배양물에 직접 가하거나 또는 상기 1,3-부탄다이올 경로 중간체 생산자의 원래 배양물을 예를 들어 세포 분리에 의해 상기 미생물 유기체에서 고갈시킬 수 있으며, 이어서 상기 두 번째 유기체의 발효 브로쓰에의 후속 첨가를 사용하여 중간 정제 단계 없이 최종 생성물을 생성시킬 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체 및 방법을 광범위하게 다양한 하위 경로들로 조립하여 예를 들어 1,3-부탄다이올의 생합성을 달성할 수 있다. 이들 실시태양에서, 본 발명의 목적하는 생성물에 대한 생합성 경로들을 상이한 미생물 유기체들로 분리할 수 있으며, 상기 상이한 미생물 유기체들을 함께 배양하여 최종 생성물을 생산할 수 있다. 상기와 같은 생합성 설계에서, 한 미생물 유기체의 생성물은 상기 최종 생성물이 합성될 때까지 두 번째 미생물 유기체에 대한 기질이다. 예를 들어, 1,3-부탄다이올의 생합성을, 하나의 경로 중간체의 또 다른 경로 중간체 또는 생성물로의 전환에 대한 생합성 경로를 함유하는 미생물 유기체를 제작함으로써 수행할 수 있다. 한편으로, 1,3-부탄다이올을 또한 동일한 용기에서 2 개의 유기체를 사용하여 공동 배양 또는 공동 발효를 통해 미생물 유기체들로부터 생합성적으로 생산할 수 있으며, 이때 첫 번째 미생물 유기체는 1,3-부탄다이올 중간체를 생산하고 두 번째 미생물 유기체는 상기 중간체를 1,3-부탄다이올로 전환시킨다.
본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 본 발명의 비-천연 미생물 유기체 및 방법들에 대해서, 다른 미생물 유기체, 하위 경로들을 갖는 다른 비-천연 미생물 유기체들의 공동 배양, 및 1,3-부탄다이올을 생성시키는 것으로 당해 분야에 널리 공지된 다른 화학적 및/또는 생화학적 과정들의 조합과 함께 광범위하게 다양한 조합 및 순열들이 존재함을 알 것이다.
1,3-부탄다이올 경로 효소 또는 단백질에 대한 암호화 핵산의 공급원은 예를 들어 상기 암호화된 유전자 산물이 기준 반응을 촉진할 수 있는 임의의 종들을 포함할 수 있다. 상기와 같은 종들은 원핵 및 진핵 유기체 모두, 예를 들어 비-제한적으로 고세균 및 진정세균을 포함한 세균, 및 효모, 식물, 곤충, 동물, 및 인간을 포함한 포유동물을 포함한 진핵생물 유기체를 포함한다. 상기와 같은 공급원에 대한 예시적인 종은 예를 들어 에스케리키아 콜라이뿐만 아니라 본 발명에 개시되거나 상응하는 유전자에 대한 공급원 유기체로서 입수할 수 있는 다른 예시적인 종들을 포함한다. 그러나, 395 개 미생물 게놈 및 다양한 효모, 진균, 식물 및 포유동물 게놈을 포함하여, 현재 550 초과의 종들(이들 중 절반 이상을 NCBI와 같은 공개적인 데이터베이스 상에서 입수할 수 있다)에 대해 입수할 수 있는 완전한 게놈 서열과 함께, 관련된 또는 떨어진 종들 중의 하나 이상의 유전자들에 대한 필수적인 1,3-부탄다이올 생합성 활성을 암호화하는 유전자들의 동정, 예를 들어 공지된 유전자들의 상동 기관, 이종 상동체, 상동체 및 비-이종 상동성 유전자 치환, 및 유기체들 간의 유전자 변경의 교환은 통상적이며 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 에스케리키아 콜라이와 같은 특정 유기체에 관하여 본 발명에 개시된 1,3-부탄다이올의 생합성을 가능하게 하는 대사적 변경을 다른 미생물들, 예를 들어 원핵생물 및 진핵생물 유기체에도 마찬가지로 쉽게 적용할 수 있다. 본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 하나의 유기체에서 예시된 대사적 변경을 다른 유기체에도 동등하게 적용할 수 있음을 알 것이다.
일부 예에서, 예를 들어 대안적인 1,3-부탄다이올 생합성 경로가 관련없는 종들에서 존재하는 경우, 1,3-부탄다이올 생합성을, 예를 들어 유사하지만, 동일하지는 않은 대사 반응을 촉진하는 상기 관련없는 종들로부터의 상동체 또는 상동체들의 외부 발현에 의해 숙주 종에 부여하여 상기 기준 반응을 대체할 수 있다. 대사 네트워크들 간에 어떤 차이가 상이한 유기체들 간에 존재하므로, 당해 분야의 숙련가들은 상이한 유기체들 간의 실제 유전자 사용이 상이할 수 있음을 알 것이다. 그러나, 본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 또한 본 발명의 교시 및 방법을 본 발명에 예시된 것들과 동족의 대사 변경을 사용하는 모든 미생물 유기체들에 적용하여 1,3-부탄다이올을 합성하는 관심 종의 미생물 유기체를 제작할 수 있다.
숙주 미생물 유기체를 예를 들어 세균, 효모, 진균 또는 발효 공정에 적용할 수 있는 임의의 다양한 다른 미생물들 중에서 선택할 수 있으며 상기 비-천연 미생물 유기체를 이들 중에서 생성시킬 수 있다. 예시적인 세균은 에스케리키아 콜라이, 클렙시엘라 옥시토카, 아나에로비오스피릴룸 숙시니시프로듀센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens), 액티노바실러스 숙시노제네스(Actinobacillus succinogenes), 만헤이미아 숙시니시프로듀센스, 리조븀 에틀리(etli), 바실러스 서브틸리스, 코리네박테리움 글루타미쿰, 글루코노박터 옥시단스, 자이모모나스 모빌리스, 락토코커스 락티스, 락토바실러스 플란타룸, 스트렙토마이세스 코엘리콜로르(coelicolor), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰, 슈도모나스 플루오레센스, 및 슈도모나스 푸티다 중에서 선택된 종을 포함한다. 예시적인 효모 또는 진균은 사카로마이세스 세레비지아에, 시조사카로마이세스 폼베, 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스(marxianus), 아스퍼질러스 테레우스(terreus), 아스퍼질러스 니거 및 피키아 파스토리스 중에서 선택된 종을 포함한다. 에스케리키아 콜라이가 특히 유용한 숙주 유기체인데, 그 이유는 유전 공학에 적합한 널리 특성화된 미생물 유기체이기 때문이다. 다른 특히 유용한 유기체는 효모, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에를 포함한다.
비-천연 1,3-부탄다이올-생산 숙주의 발현 수준을 구성하고 시험하기 위한 방법을 예를 들어 당해 분야에 널리 공지된 재조합체 및 검출 방법에 의해 수행할 수 있다. 상기와 같은 방법들은 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York(2001)] 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD(1999)]에 개시되어 있다.
1,3-부탄다이올의 생산을 위한 경로에 관여하는 외부 핵산 서열들을 당해 분야에 널리 공지된 기법들, 예를 들어 비-제한적으로 접합, 일렉트로포레이션, 화학적 변환, 형질도입, 형질감염, 및 초음파 변환을 사용하여 숙주 세포에 안정하게 또는 일시적으로 도입시킬 수 있다. 에스케리키아 콜라이 또는 다른 원핵 세포에서의 외부 발현을 위해서, 상기 유전자의 일부 핵산 서열 또는 진핵생물 핵산의 cDNA는 표적화 신호, 예를 들어 N-말단 미토콘드리아 또는 다른 표적화 신호를 암호화할 수 있으며, 상기 신호를 경우에 따라 원핵생물 숙주 세포로의 형질전환 전에 제거할 수 있다. 예를 들어, 미토콘드리아 리더 서열의 제거로 에스케리키아 콜라이에서의 발현이 증가되었다(Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280:4329-4338(2005)). 효모 또는 다른 진핵생물 세포에서의 외부 발현을 위해서, 유전자를 리더 서열의 첨가 없이 시토솔에서 발현시키거나, 또는 미토콘드리온 또는 다른 세포 소기관에 표적화하거나, 또는 적합한 표적화 서열, 예를 들어 미토콘드리아 표적화 또는 상기 숙주 세포에 적합한 분비 신호의 첨가에 의해 분비에 대해 표적화할 수 있다. 따라서, 표적화 서열의 제거 또는 포함을 위한 핵산 서열에 대한 적합한 변형을 외래 핵산 서열에 결합시켜 바람직한 성질들을 부여할 수 있을 것으로 생각된다. 더욱 또한, 유전자에 대해 당해 분야에 널리 공지된 기법으로 코돈 최적화를 수행하여 상기 단백질의 최적화된 발현을 달성할 수 있다.
숙주 유기체 중에서 작용성인 발현 조절 서열에 작동적으로 결합된, 본 발명에 예시된 바와 같은 핵산을 암호화하는 하나 이상의 1,3-부탄다이올 생합성 경로를 포함하는 발현 벡터 또는 벡터들을 제작할 수 있다. 본 발명의 미생물 숙주 유기체에 사용하기에 적용 가능한 발현 벡터는 예를 들어 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 인공 염색체, 예를 들어 숙주 염색체 내로의 안정한 통합을 위해 작동 가능한 벡터 및 선택 서열 또는 마커를 포함한다. 또한, 상기 발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커 유전자 및 적합한 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 항생제 또는 독소에 대한 내성, 상보성 영양요구성 결핍, 또는 배양 배지 중에 없는 결정적인 영양소를 제공하는 선택성 마커 유전자가 또한 포함될 수 있다. 발현 조절 서열은 당해 분야에 널리 공지된 구성 및 유도 프로모터, 전사 증진인자, 전사 종결자 등을 포함할 수 있다. 2 개 이상의 외래 암호화 핵산을 공동 발현시켜야 하는 경우, 상기 두 핵산을 모두 예를 들어 단일 발현 벡터 또는 별도의 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 단일 벡터 발현의 경우, 상기 암호화 핵산을 하나의 공통 발현 조절 서열에 작동적으로 결합시키거나 또는 상이한 발현 조절 서열, 예를 들어 하나의 유도 프로모터 및 하나의 구성 프로모터에 결합시킬 수 있다. 대사 또는 합성 경로에 관여하는 외래 핵산 서열의 형질전환을 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 상기와 같은 방법은 예를 들어 핵산 분석, 예를 들어 mRNA의 노던 블럿 또는 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 증폭, 또는 유전자 산물의 발현에 대한 면역블럿팅, 또는 도입된 핵산 서열 또는 그의 상응하는 유전자 산물의 발현을 시험하기 위한 다른 적합한 분석 방법을 포함한다. 당해 분야의 숙련가들은 상기 외래 핵산이 목적하는 생성물을 생산하기에 충분한 양으로 발현됨을 알 것이며, 발현 수준을 당해 분야에 널리 공지되고 본 발명에 개시된 바와 같은 방법을 사용하여 충분한 발현이 획득되도록 최적화할 수 있음을 또한 알 것이다.
본 발명은 1,3-BDO의 생산에 충분한 시간 및 조건 하에서 1,3-BDO 경로를 완성하는 효소를 암호화하는 1, 2, 3, 4, 5, 전체 이하의 외래 핵산을 포함하는 유기체를 포함한, 본 발명에 개시된 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는 1,3-BDO의 생산 방법을 제공한다. 상기 1,3-BDO 경로는 일련의 1,3-BDO 경로 효소를 포함하며, 이때 상기 일련의 1,3-BDO 경로 효소들은 상기와 같이 동정된다, 즉: (a) (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 데하이드로게나제; (3) 2-아미노-4-하이드록시펜타노에이트 아미노트랜스퍼라제 또는 옥시도리덕타제(탈아민화); (4) 2-옥소-4-하이드록시펜타노에이트 데카복실라제; 및 (5) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제; (b) (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 아미노트랜스퍼라제 또는 옥시도리덕타제(탈아민화); (3) 2,4-다이옥소펜타노에이트 데카복실라제; (4) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(케톤 환원); 및 (5) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제; (c) (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 아미노트랜스퍼라제 또는 옥시도리덕타제(탈아민화); (3) 2,4-다이옥소펜타노에이트 데카복실라제; (4) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(알데하이드 환원); 및 (5) 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제; (d) (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 데카복실라제; (3) 4-아미노부탄-2-온 아미노트랜스퍼라제 또는 옥시도리덕타제(탈아민화); (4) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(케톤 환원); 및 (5) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제; (e) (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 데카복실라제; (3) 4-아미노부탄-2-온 아미노트랜스퍼라제 또는 옥시도리덕타제(탈아민화); (4) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(알데하이드 환원); 및 (5) 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제; (f) (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 데카복실라제; (3) 4-아미노부탄-2-온 암모니아-라이아제; (4) 부텐온 하이드라타제; 및 (5) 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제; 및 (g) (1) 2-아미노-4-케토펜타노에이트(AKP) 티올라제; (2) AKP 암모니아-라이아제; (3) 아세틸아크릴레이트 데카복실라제; (4) 부텐온 하이드라타제; 및 (5) 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제; (h) (1) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(CoA-의존성, 알데하이드 형성); (2) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(케톤 환원); 및 (3) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제; (i) (1) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(CoA-의존성, 알콜 형성) 및 (2) 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제; (j) (1) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(CoA-의존성, 알데하이드 형성); (2) 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(알데하이드 환원); 및 (3) 4-하이드록시-2-부탄온 리덕타제; (k) (1) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(케톤 환원) 및 (2) 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 및 (l) (1) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(케톤 환원); (2) 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알데하이드 형성); 및 (3) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제; (m) (1) 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제; (2) 크로토나제; 및 (3) 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성); 및 (n) (1) 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제; (2) 크로토나제; (3) 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알데하이드 형성); 및 (4) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제.
상기 1,3-부탄다이올의 생산을 시험하기에 적합한 정제 및/또는 분석을 널리 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 3중 배양물과 같은 적합한 복제물을 시험되는 각각의 조작된 균주에 대해 생육시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 조작된 생산 숙주 중의 생성물 및 부산물 형성을 모니터할 수 있다. 최종 생성물 및 중간체, 및 다른 유기 화합물들을 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피), GC-MS(기체 크로마토그래피-질량 분광학) 및 LC-MS(액체 크로마토그래피-질량 분광학) 또는 당해 분야에 널리 공지된 통상적인 과정을 사용하는 다른 적합한 분석 방법에 의해 분석할 수 있다. 발효 브로쓰 중의 생성물의 방출을 또한 배양 상등액을 사용하여 시험할 수 있다. 부산물 및 잔류 글루코스를 예를 들어 글루코스 및 알콜의 경우 굴절률 검출기, 및 유기산의 경우 UV 검출기(Lin et al., Biotechnol. Bioeng. 90:775-779(2005))를 사용하는 HPLC, 또는 당해 분야에 널리 공지된 다른 적합한 분석 및 검출 방법에 의해 정량분석할 수 있다. 상기 외래 DNA 서열로부터의 개별적인 효소 또는 단백질 활성을 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 분석할 수 있다(예를 들어 WO/2008/115840 및 문헌[Hanai et al., Appl. Environ. Microbiol. 73:7814-7818(2007)]을 참조하시오).
상기 1,3-부탄다이올을 당해 분야에 널리 공지된 다양한 방법을 사용하여 상기 배양물 중의 다른 성분들로부터 분리시킬 수 있다. 상기와 같은 분리 방법은 예를 들어 추출 과정뿐만 아니라 연속적인 액체-액체 추출, 투석 증발, 막 여과, 막 분리, 역삼투, 전기투석, 증류, 결정화, 원심분리, 추출 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 및 한외여과를 포함한다. 상기 방법들은 모두 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명에 개시된 비-천연 미생물 유기체들 중 어느 것이든 본 발명의 생합성 산물을 생성 및/또는 분리하도록 배양할 수 있다. 예를 들어, 상기 1,3-부탄다이올 생산자를 1,3-부탄다이올의 생합성 생산을 위해 배양할 수 있다.
1,3-부탄다이올의 생산을 위해서, 상기 재조합 균주를 탄소원 및 다른 필수 영양소를 갖는 배지에서 배양한다. 전체 공정의 비용을 줄이기 위해서 상기 발효기 중에 혐기성 조건을 유지시키는 것이 매우 바람직하다. 상기와 같은 조건은 예를 들어 먼저 상기 배지를 질소로 살포하고 이어서 상기 플라스크를 격막 및 크림프(crimp)-뚜껑으로 밀봉하여 획득할 수 있다. 생육이 혐기성 조건 하에서 관찰되지 않는 균주의 경우, 상기 격막에 제한된 통기를 위한 작은 구멍을 뚫어 미세 호기성 조건을 적용시킬 수 있다. 예시적인 혐기성 조건은 앞서 개시되었으며 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예시적인 호기성 및 혐기성 조건들은 예를 들어 2007년 8월 10일자로 출원된, 미국 공보 제 US-2009-0047719 호에 개시되어 있다. 발효를 본 발명에 개시된 바와 같이 배치, 유가 또는 연속 방식으로 수행할 수 있다.
경우에 따라, 상기 배지의 pH를 필요에 따라 목적하는 pH에서 유지시키기 위해 염기, 예를 들어 NaOH 또는 다른 염기, 또는 산의 첨가에 의해 목적하는 pH, 특히 중성 pH, 예를 들어 대략 7의 pH에서 유지시킬 수 있다. 생육률을 분광광도계(600 ㎚)를 사용하여 광학 밀도를 측정함으로써 측정할 수 있고 글루코스 흡수율을 시간에 따른 탄소원 고갈을 모니터함으로써 측정할 수 있다.
상기 예시된 바와 같은 재생 가능한 공급 원료 이외에, 본 발명의 1,3-부탄다이올 미생물 유기체를 그의 탄소 원으로서 합성 가스상에서의 생육을 위해 변형시킬 수 있다. 상기 특정 실시태양에서, 하나 이상의 단백질 또는 효소를 1,3-부탄다이올 생산 유기체 중에서 발현시켜 합성 가스 또는 다른 기상 탄소 원의 사용을 위한 대사 경로를 제공한다.
본 발명의 유기체들은 예를 들어 상기 비-천연 미생물에 탄소 원을 공급할 수 있는 임의의 탄수화물 공급원을 이용할 수 있다. 상기와 같은 공급원은 예를 들어 당, 예를 들어 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노오스, 프럭토스 및 전분을 포함한다. 탄수화물의 다른 공급원으로는 예를 들어 재생 가능한 공급원료 및 바이오매스가 있다. 본 발명의 방법에 공급원료로서 사용될 수 있는 예시적인 유형의 바이오매스는 셀룰로스 바이오매스, 헤미셀룰로스 바이오매스 및 리그닌 공급원료 또는 공급원료의 부분들을 포함한다. 상기와 같은 바이오매스 공급원료는 예를 들어 탄소 원으로서 유용한 탄수화물 기질, 예를 들어 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노오스, 프럭토스 및 전분을 포함한다. 본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 상기 예시된 것들 이외의 재생 가능한 공급원료 및 바이오매스를 또한 1,3-부탄다이올의 생산을 위한 본 발명의 미생물 유기체의 발현에 사용할 수 있음을 알 것이다.
따라서, 본 발명의 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 탄소 원, 예를 들어 합성 가스, CO 및/또는 CO2 상에서 생육 시 본 발명의 생합성된 화합물을 분비하는 비-천연 미생물 유기체를 생성시킬 수 있음을 알 것이다. 상기와 같은 화합물은 예를 들어 1,3-부탄다이올 및 상기 1,3-부탄다이올 경로의 중간 대사산물들 중 어느 것이든 포함한다. 필요한 것은 상기 필요한 효소 또는 단백질 활성들 중 하나 이상에서 상기 목적하는 화합물 또는 중간체의 생합성을 달성하도록, 예를 들어 상기 1,3-부탄다이올 생합성 경로 중 일부 또는 전부를 포함하도록 조작하는 것이다. 따라서, 본 발명은 탄수화물 또는 다른 탄소 원 상에서 생육 시 1,3-부탄다이올을 생산 및/또는 분비하고 탄수화물 또는 다른 탄소 원 상에서 생육 시 상기 1,3-부탄다이올 경로 중에 나타난 중간 대사 산물들 중 임의의 것을 생산 및/또는 분비하는 비-천연 미생물 유기체를 제공한다. 본 발명의 1,3-부탄다이올 생산 미생물 유기체는 중간체, 예를 들어 아세틸-CoA로부터의 합성을 개시시킬 수 있다.
본 발명의 비-천연 미생물 유기체를, 1,3-부탄다이올을 생성시키기에 충분한 양의 1,3-부탄다이올 경로 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 외부적으로 발현하도록 본 발명에 예시된 바와 같이 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 제작한다. 본 발명의 미생물을 1,3-부탄다이올을 생산하기에 충분한 조건 하에서 배양함이 이해된다. 본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 약 0.1 내지 2000 mM 이상의 세포 내 농도를 생성시키는 1,3-부탄다이올의 생합성을 달성할 수 있다. 일반적으로, 1,3-부탄다이올의 세포 내 농도는 약 3 내지 1800 mM, 특히 약 5 내지 1700 mM 및 보다 특히 약 8 내지 1600 mM, 예를 들어 약 100 mM, 200 mM, 500 mM, 800 mM 또는 그 이상이다. 이들 예시적인 범위 사이 및 그 이상의 세포 내 농도도 또한 본 발명의 비-천연 미생물 유기체로부터 달성될 수 있다.
일부 실시태양에서, 배양 조건은 혐기성 또는 실질적으로 혐기성인 생육 또는 유지 조건을 포함한다. 예시적인 혐기성 조건들은 앞서 개시되었으며 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 발효 공정에 예시적인 혐기성 조건은 본 발명에 개시되어 있으며, 예를 들어 2007년 8월 10일자로 출원된 미국 특허 출원 제 2009/0047719 호에 개시되어 있다. 이들 조건 중 어느 것이든 상기 비-천연 미생물 유기체뿐만 아니라 당해 분야에 널리 공지된 다른 혐기성 조건들과 함께 사용될 수 있다. 상기와 같은 혐기성 조건 하에서, 상기 1,3-부탄다이올 생산자는 1,3-부탄다이올을 5 내지 10 mM 이상의 세포 내 농도뿐만 아니라 본 발명에 예시된 다른 농도들로 합성할 수 있다. 비록 상기 설명이 세포 내 농도를 지칭하지만, 1,3-부탄다이올 생산 미생물 유기체가 1,3-부탄다이올을 세포 내적으로 및/또는 상기 생성물을 배양 배지 내로 분비할 수 있음이 이해된다.
상기 배양 조건은 예를 들어 액체 배양 과정뿐만 아니라 발효 및 다른 대규모 배양 과정을 포함할 수 있다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 본 발명의 생합성 생성물의 특히 유용한 수율을 혐기성 또는 실질적으로 혐기성 배양 조건 하에서 획득할 수 있다.
본 발명에 개시된 바와 같이, 1,3-부탄다이올의 생합성을 달성하기 위한 하나의 예시적인 생육 조건은 혐기성 배양 또는 발효 조건을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체를 혐기성 또는 실질적으로 혐기성인 조건 하에서 지속시키거나, 배양하거나 발효시킬 수 있다. 간단히, 혐기성 조건은 산소가 없는 환경을 지칭한다. 실질적으로 혐기성 조건은 예를 들어 배지 중에 용해된 산소 농도가 0 내지 10%의 포화율로 남아 있도록 하는 배양, 배치 발효 또는 연속 발효를 포함한다. 실질적으로 혐기성 조건은 또한 1% 미만의 산소 분위기로 유지된 밀폐된 챔버 내부의 액체 배지 중에서 또는 고체 아가 상에서의 세포의 생육 또는 휴지를 포함한다. 상기 산소의 퍼센트를 예를 들어 상기 배양물에 N2/CO2 혼합물 또는 다른 적합한 비-산소 기체 또는 기체들을 살포함으로써 유지시킬 수 있다.
본 발명에 개시된 배양 조건을 1,3-부탄다이올의 제조를 위해 규모 확대하고 연속적으로 키울 수 있다. 예시적인 생육 과정은 예를 들어 유가 발효(fed-batch) 및 배치 분리; 유가 발효 및 연속 분리, 또는 연속 발효 및 연속 분리를 포함한다. 이들 과정은 모두 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 발효 과정은 상업적인 양의 1,3-부탄다이올의 생합성적 생산에 특히 유용하다. 일반적으로, 및 비-연속 배양 과정의 경우에서와 같이, 1,3-부탄다이올의 연속 및/또는 거의 연속 생산은 본 발명의 비-천연 1,3-부탄다이올 생산 유기체를, 생육을 지수 생육기에서 유지 및/또는 거의 유지시키기에 충분한 양분 및 배지에서 배양함을 포함할 것이다. 상기와 같은 조건 하에서 연속 배양은 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 또한, 연속 배양은 1, 2, 3, 4 또는 5 주 또는 그 이상 수 개월 이하를 포함할 수 있다. 한편으로, 본 발명의 유기체를 특정 용도에 적합한 경우, 수 시간 동안 배양할 수 있다. 상기 연속 및/또는 거의 연속 배양 조건이 이들 예시적인 기간들 사이의 모든 시간 간격들을 포함할 수 있음은 물론이다. 본 발명의 미생물 유기체의 배양 시간은 원하는 목적을 위해 충분한 양의 생성물을 생산하기에 충분한 기간 동안인 것으로 또한 여겨진다.
발효 과정은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 간단히, 1,3-부탄다이올의 생합성적 생산을 위한 발효를 예를 들어 유가 발효 및 배치 분리; 유가 발효 및 연속 분리, 또는 연속 발효 및 연속 분리에 사용할 수 있다. 배치 및 연속 발효 과정의 예들은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
상당량의 1,3-부탄다이올의 연속 생산을 위해 본 발명의 1,3-부탄다이올 과정을 사용하는 상기 발효 과정 이외에, 상기 1,3-부탄다이올 생산자에 또한 상기 생성물을 다른 화합물로 전환시키는 화학적 합성 과정을 동시에 가하거나, 또는 상기 생성물을 상기 발효 배양물로부터 분리시키고 경우에 따라 상기 생성물을 다른 화합물로 전환시키는 화학적 전환을 연속해서 가할 수 있다.
일부 실시태양에서, 합성가스가 탄소 공급원료로서 사용될 수 있다. 합성가스 발효에 중요한 공정 고려사항은 높은 바이오매스 농도 및 양호한 기체-액체 물질 이동이다(Bredwell et al., Biotechnol Prog., 15:834-844(1999)). 물에 대한 CO의 용해도는 산소의 경우보다 다소 작다. 연속적인 기체-살포식 발효를 질량 분광측정 및 주기적인 액체 샘플링에 의한 일정한 오프-가스 분석 및 GC 및 HPLC에 의한 분석과 함께 조절된 발효기에서 수행할 수 있다. 상기 액체 상은 배치식으로 작용할 수 있다. 알콜, 유기산, 및 잔류 메탄올과 함께 잔류 글루코스와 같은 발효 산물들을 HPLC(시마주(Shimadzu), 미국 메릴랜드주 콜럼비아 소재)에 의해, 예를 들어 HPLC 컬럼의 애미넥스(Aminex)(등록상표) 시리즈(예를 들어 HPX-87 시리즈)(바이오래드(BioRad), 미국 캘리포니아주 헤르쿨레스 소재)를 사용하여, 글루코스 및 알콜의 경우 굴절률 검출기, 및 유기산의 경우 UV 검출기를 사용하여 정량화한다. 상기 생육률을 분광광도계(600 ㎚)를 사용하여 광학 밀도를 측정함으로써 측정할 수 있다. 이들 시스템의 모든 배관은 혐기성 조건을 유지시키기 위해 유리 또는 금속이다. 상기 기체 살포를 기포 크기를 감소시키고 물질 이동을 개선시키기 위해 유리 프릿을 사용하여 수행한다. 약 0.1 내지 1 vvm(증기 부피/분) 범위의 다양한 살포율을 시험한다. 기체 흡수율을 정확히 측정하기 위해서, 상기 기체 흐름을 일시적으로 중단시키는 주기적인 도전을 수행하며, 상기 기상 조성을 시간의 함수로서 모니터한다.
전체적인 목표 생산성을 달성하기 위해서, 세포 체류 또는 재순환 방법을 사용한다. 상기 미생물 농도를 증가시키는 한 가지 방법은 세포를 부 스트림으로부터 접선 흐름 막을 통해 재순환시키는 것이다. 앞서 무어렐라(Moorella)에 의한 아세테이트의 생산에 대해 개시된 바와 같이(Sakai et al, J Biosci.Bioeng, 99:252-258(2005)), 반복된 배치 배양을 또한 사용할 수 있다. 다양한 다른 방법들을 또한 사용할 수 있다(Bredwell et al., Biotechnol Prog., 15:834-844(1999); Datar et al., Biotechnol Bioeng, 86:587-594(2004)). 추가적인 최적화, 예를 들어 물질 이동을 개선시키기 위한 1.5 atm의 과도한 압력을 시험할 수 있다(Najafpour et al., Enzyme and Microbial Technology, 38[1-2], 223-228(2006)).
공급물로서 순수한 H2/CO를 사용하여 일단 만족할만한 실행이 달성되면, 상업적인 합성가스 중에 존재하는 듯한 억제제를 함유하는 합성 가스 혼합물이 생성된다. 예를 들어, 전형적인 불순물 프로파일은 4.5% CH4, 0.1% C2H2, 0.35% C2H6, 1.4% C2H4 및 150 ppm 산화 질소이다(Datar et al., Biotechnol Bioeng, 86:587-594(2004)). 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠, p-자일렌, o-자일렌, 및 나프탈렌 등의 화합물로 대표되는 타르를 ppm 수준으로 가하여 생산 시 임의의 영향에 대해 시험한다. 예를 들어, 40 ppm NO는 클로스트리듐 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans)에 대해 억제성인 것으로 나타났다(Ahmed et al., Biotechnol Bioeng, 97:1080-1086(2007)). 배양물을 발효기로 이동하기 전에 진탕-플라스크 배양물 중에서 시험한다. 또한, 상이한 수준의 이들 잠재적인 억제성 화합물들을 시험하여 이들 화합물이 세포 생육에 미치는 영향을 정량분석한다. 상기 지식을 사용하여 합성가스 순도에 대한 명세서를 개발하고, 이를 규모 확대 연구 및 생산에 이용한다. 임의의 특정 성분이 규모확대에 사용되는 합성가스로부터 감소 또는 제거하기 어려운 것으로 밝혀지면, 적합한 점진적인 변화 과정을 사용하여 세포를 하나 이상의 불순물에 견디도록 순응시킨다.
단백질 공학 분야의 진보는 효소들에 대해 자연적인 것으로 공지되지 않은 기질 상에서 효율적으로 작용하도록 본 발명에 개시된 효소들 중 어느 것이든 변경할 수 있게 한다. 다양한 관심 부류들로부터의 광범위한-특이 효소들의 몇몇 예 및 상기와 같은 효소들이 비-천연 기질 상에서 작용하도록 점진적으로 변화시키는데 사용된 방법들이 하기에 있다.
본 발명에 개시된 경로들 중 한 가지 부류의 효소는 케톤 또는 알데하이드를 알콜로 상호전환시키는 옥시도리덕타제(1.1.1)이다. 상기 부류의 효소들은 광범위한 기질 상에서 작용할 수 있다. 토양 세균 브레비박테리움(Brevibacterium) sp KU 1309로부터 정제된 알콜 데하이드로게나제(1.1.1.1)(Hirano et al., J. Biosci. Bioeng. 100:318-322(2005))는 과잉의 지방족뿐만 아니라 방향족 알콜 상에서 고 활성으로 작용하는 것으로 입증되었다. 표 35는 상기 효소의 활성 및 상이한 알콜 상에서의 그의 Km을 나타낸다. 상기 효소는 가역적이며 표 36에 나타낸 바와 같이 여러 알데하이드 상에서 매우 높은 활성을 갖는다.
기질 상대 활성(%) KM(MM)
2-페닐에탄올 100 0.025
(S)-2-페닐프로판올 156 0.157
(R)-2-페닐프로판올 63 0.020
벤질 알콜 199 0.012
3-페닐프로판올 135 0.033
에탄올 76
1-부탄올 111
1-옥탄올 101
1-도데칸올 68
1-페닐에탄올 46
2-프로판올 54
상기 표에서, 2-페닐에탄올의 활성(19.2 U/㎎에 상응한다)을 100%로서 간주하였다.
기질 상대 활성(%) KM(MM)
페닐아세트알데하이드 100 0.261
2-페닐프로피온알데하이드 188 0.864
1-옥틸알데하이드 87
아세토페논 0
랄스토니아 유트로파로부터의 락테이트 데하이드로게나제(1.1.1.27)는 여러 2-옥소산, 예를 들어 2-옥소부티레이트, 2-옥소펜타노에이트 및 2-옥소글루타레이트(2-옥소아디페이트와 유사한 C5 화합물)에 대해 높은 활성을 갖는 것으로 입증된 또 다른 효소이다(상기 Steinbuchel et al.). 표 37의 컬럼 2는 랄스토니아 유트로파(이전에는 알칼리제네스 유트로푸스(Alcaligenes eutrophus))로부터의 ldhA의 상이한 기질들에 대한 활성을 나타낸다(상기 Steinbuchel et al.).
기질 활성
L(+)- L(+)- D(-)-
알칼리제네스 유트로푸스(Alcaligenes eutrophus)로부터의 락테이트 데하이드로게나제 토끼 근육으로부터의 락테이트 데하이드로게나제 락토바실러스 레이슈마니이(Lactobacillis leischmanii)로부터의 락테이트 데하이드로게나제
%
글리옥실레이트 8.7 23.9 5.0
피루베이트 100.0 100.0 100.0
2-옥소부티레이트 107.0 18.6 1.1
2-옥소발레레이트 125.0 0.7 0.0
3-메틸-2-옥소부티레이트 28.5 0.0 0.0
3-메틸-2-옥소발레레이트 5.3 0.0 0.0
4-메틸-2-옥소펜타노에이트 39.0 1.4 1.1
옥살로아세테이트 0.0 33.1 23.1
2-옥소글루타레이트 79.6 0.0 0.0
3-플루오로피루베이트 33.6 74.3 40.0
2-옥소산을 그의 아실-CoA 대응물로 전환시킬 수 있는 옥시도리덕타제(1.2.1)가 또한 다수의 기질들을 수용하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 분지 쇄 2-케토산 데하이드로게나제 복합체(BCKAD)(또한 2-옥소아이소발레레이트 데하이드로게나제(1.2.1.25)로서 공지됨)는 분지 쇄 아미노산 분해 경로에 관여하여, 발린, 류신 및 아이소류신의 2-케토산 유도체를 그들의 아실-CoA 유도체와 CO2로 전환시킨다. 라투스 노르베기쿠스(Paxton et al., Biochem. J. 234:295-303(1986)) 및 사카로마이세스 세레비지아에(Sinclair et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 31:911-922(1993))를 포함한 일부 유기체들에서, 상기 복합체는 상기 분지 쇄 아미노산 전구체들 이외에, 선형 옥소-산, 예를 들어 2-옥소부타노에이트 및 알파-케토글루타레이트를 포함한 광범위한 기질 범위를 갖는 것으로 나타났다.
더욱 또 다른 부류의 효소들의 구성원, 즉 아미노트랜스퍼라제(2.6.1)가 다수의 기질 상에서 작용하는 것으로 보고되었다. 파이로코커스 푸르셔스(Pyrococcus fursious)로부터의 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(aspAT)가 동정되었으며, 에스케리키아 콜라이에서 발현되었고, 재조합 단백질은 상기 효소가 아스파테이트 및 알파-케토글루타레이트에 대해 가장 높은 활성을 갖지만, 알라닌, 글루타메이트 및 방향족 아미노산들에 대해서는 더 낮은, 그러나 유의수준의 활성을 가짐을 나타내는 것으로 특성화되었다(Ward et al., Archaea. 1:133-141(2002)). 또 다른 경우에, 레이슈마니아 멕시카나(Leishmania mexicana)로부터 동정되고 에스케리키아 콜라이에서 발현된 아미노트랜스퍼라제(Vernal et al., FEMS Microbiol. Lett. 229:217-222(2003))는 각각 타이로신(활성이 타이로신에 대해 100%로 간주되었다), 페닐알라닌(90%), 트립토판(85%), 아스파테이트(30%), 류신(25%) 및 메티오닌(25%)에 대해 광범위한 기질 특이성을 갖는 것으로 보고되었다(Vernal et al., Mol. Biochem. Parasitol. 96:83-92(1998)). 유사한 광범위한 특이성이 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)로부터 타이로신 아미노트랜스퍼라제에 대해 보고되었지만, 이들 두 효소 모두 단지 6%의 서열 상동성을 갖는다. 상기 나중의 효소가 효율적인 아미노 공여체로서 류신, 메티오닌뿐만 아니라 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 알라닌을 수용할 수 있음에 주목한다(Nowicki et al., Biochim. Biophys. Acta 1546:268-281(2001)).
상기 효소가 자연적으로 광범위한 기질 특이성을 갖는 상기 예와 대조적으로, 다수의 효소들을 비-천연 기질에 대한 그들의 특이성을 확장시키는 방향 진화를 사용하여 변형시켰다. 한편으로, 효소의 기질 선호를 또한 방향 진화를 사용하여 변화시켰다. 예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사로부터의 리파제의 거울상 선택성이 현저하게 개선된 것으로 보고되었다. 상기 효소는 p-나이트로페닐 2-메틸데카노에이트를 (S)-산의 편에서 단지 2%의 거울상이성체 과잉(ee)으로 가수분해하였다. 그러나, 4 회의 연속적인 라운드의 실수유발 돌연변이 및 선별 후에, 상기 필수 반응을 81% ee로 촉진한 변이체가 생성되었다(Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 36:2830-2832(1997)).
방향 진화 방법은 비-천연 기질들의 배열상에서 작용하도록 효소의 변형을 가능하게 하였다. 슈도모나스 아에루기노사 중의 리파제의 기질 특이성은 활성 부위 부근의 아미노산 잔기의 랜덤화에 의해 확대되었다. 이는 상기 효소에 의한 알파-치환된 카복실산 에스터의 수용을 허용하였다(Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 44:4192-4196(2005)). 또 다른 성공적인 시도에서, DNA 셔플링을 사용하여 β-분지된 기질(야생형 효소에 의해서는 불충분하게 수용되었다)을 수용한 에스케리키아 콜라이 아미노트랜스퍼라제를 생성시켰다(Yano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:5511-5515(1998)). 구체적으로, 4 라운드의 셔플링의 끝에서, 발린 및 2-옥소발린에 대한 아스파테이트 아미노트랜스러파제의 활성이 5 이하 정도의 크기까지 증가한 반면, 천연 기질인 아스파테이트에 대한 활성은 30 배 이하까지 감소하였다. 최근에, 연산방식을 사용하여, 비-천연 및 비-생물 기질, 4-하이드록시-4-(6-메톡시-2-나프틸)-2-부탄온 중의 탄소-탄소 결합 절단을 촉진하는데 사용될 수 있는 레트로-알돌라제를 디자인하였다. 상기 연산방식은 4 개의 상이한 촉매 동기들의 상이한 조합을 사용하여 새로운 효소들을 디자인하였으며, 상기 실험 특성화를 위해 선택된 디자인들 중 20 개는 촉진되지 않은 반응에 대해 4 배 개선된 비율을 가졌다(Jiang et al., Science 319:1387-1391(2008)). 따라서, 이들 공학적 접근법은 효소가 작용할 수 있는 기질들의 배열을 확장시킬 수 있을 뿐만 아니라 매우 효율적인 효소들의 디자인 및 제작을 허용한다. 예를 들어, DNA 셔플링 방법(일시적인 주형 상의 랜덤한 키메라 발생 또는 RACHITT)은 비-천연 기질의 20 배 더 빠른 전환뿐만 아니라 복합체 기질 상에서의 개선된 탈황 속도를 갖는 조작된 모노옥시게나제를 유도하는 것으로 보고되었다(Coco et al. Nat. Biotechnol. 19:354-359(2001)). 유사하게, 느린 돌연변이체 트라이오스포스페이트 아이소머라제 효소의 비-활성이 1.3배에서 19배까지 개선되었다(Hermes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 87:696-700(1990)). 이러한 비-활성의 향상은 상기 단백질의 전체 길이에 걸쳐 랜덤 돌연변이를 사용함으로써 달성되었으며 상기 개선은 6 개 아미노산 잔기 중의 돌연변이에 대해 역 추적될 수 있었다.
목적하는 기질에 대한 효소의 기질 특이성을 변경시키기 위한 단백질 공학 접근법의 유효성이 또한 입증되었다. 써무스 써모필루스로부터의 아이소프로필말레이트 데하이드로게나제를, 상기 활성 부위에 가까운 잔기들을 이들 잔기가 기질로서 말레이트 및 D-락테이트 상에서 작용할 수 있도록 변화시킴으로써 변형시켰다(Fujita et al., Biosci. Biotechnol Biochem. 65:2695-2700(2001)). 이 연구에서뿐만 아니라 다른 연구들에서, 하나 또는 몇 개의 잔기들을 상기 기질 특이성의 변경을 위해 변형시킬 수 있음이 지적되었다. 적절한 예는 단일 아미노산을, 다이하이드로카엠페롤을 우선적으로 환원시킬 수 있는 추정된 기질-결합 부위에서 변화시킨 다이하이드로플라보놀 4-리덕타제이다(Johnson et al., Plant J. 25:325-333(2001)). 에스케리키아 콜라이로부터의 매우 특이적인 아이소시트레이트 데하이드록시게나제의 기질 특이성을, 상기 활성 부위 중의 하나의 잔기를 변화시킴으로써 아시소시트레이트에서 아이소프로필말레이트로 변화시켰다(Doyle et al., Biochemistry 40:4234-4241(2001)). 유사한 정맥에서, NAD+-의존성 1,5-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제의 보조인자 특이성을 상기 N-말단 단부 부근의 몇 개의 잔기를 변화시킴으로써 NAPD+로 변경시켰다(Cho et al., Arch. Biochem. Biophys. 419:139-146(2003)). 서열 분석 및 분자 모델링 분석을 사용하여 변형을 위한 핵심 잔기를 동정하고, 이를 부위 지정 돌연변이에 의해 추가로 연구하였다.
푸코시다제는 DNA 셔플링 및 선별에 의해 에스케리키아 콜라이 중의 갈락토시다제로부터 진화되었다(Zhang et al., Proc natl Acad Sci U.S.A 94:4504-4509(1997)). 유사하게, 에스케리키아 콜라이로부터의 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제를 상동성 모델링 및 부위 지정 돌연변이를 사용하여 타이로신 아미노트랜스퍼라제로 전환시켰다(Onuffer et al., Protein Sci. 4:1750-1757(1995)). 슈도모나스 푸티다로부터의 벤조일포메이트 데카복실라제의 활성 부위 중의 2 개 잔사의 부위 지정 돌연변이는 전하는 바에 따르면, 천연 기질 및 비-천연 기질에 대한 친화성(Km)을 변경시켰다(Siegert et al., Protein Eng Des Sel 18:345-357(2005)). 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 시토크롬 c 퍼옥시다제(CCP)에 지정된 분자 진화를 가하여 전통적인 퍼옥시다제 기질 구아이아콜에 대한 증가된 활성을 갖는 돌연변이체를 생성시켜, 상기 CCP의 기질 특이성을 단백질 시토크롬 c로부터 작은 유기 분자로 변화시켰다. 3 라운드의 DNA 셔플링 및 선별 후에, 구아이아콜에 대해 300 배 증가된 활성 및 상기 천연 기질에 대한 경우에 비해 상기 기질에 대해 1000 배까지 증가한 특이성을 갖는 돌연변이체를 단리하였다(Iffland et al., Biochemistry 39:10790-10798(2000)).
일부의 경우에, 상기 2 개의 모 효소와 상이한 기질 선호를 갖는 효소들이 획득되었다. 예를 들어, 다중 염소화된 바이페닐의 바이페닐-다이옥시게나제-매개된 분해는 2 개의 세균, 슈도모나스 슈도알칼리젠스(pseudoalcaligens) 및 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia)로부터 유전자들을 셔플링함으로써 개선되었다(Kumamaru et al., Nat. Biotechnol 16, 663-666(1998)). 상기 생성되는 키메릭 바이페닐 옥시게나제는 상기 2 개의 모 효소와 상이한 기질 선호를 나타내었으며, 관련된 바이페닐 화합물 및 단일 방향족 고리 탄화수소, 예를 들어 톨루엔 및 벤젠(원래는 상기 효소에 대해 불량한 기질이었다)에 대한 분해 활성을 향상시켰다.
상기 효소 특이성을 변화시키는 것뿐만 아니라 상기 효소가 천연적으로 낮은 활성을 갖는 기질들에 대한 활성을 향상시키는 것 또한 가능하다. 하나의 연구는 광범위한 기질 특이성(다른 것들 중에서도 리신, 아르기닌, 알라닌, 세린, 메티오닌, 시스테인, 류신 및 히스티딘에 대한)을 갖지만 트립토판에 대한 활성은 낮은, 슈도모나스 푸티다로부터의 아미노산 라세마제가 랜덤 돌연변이에 의해 현저하게 개선될 수 있음을 입증하였다(Kino et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 73:1299-1305(2007)). 유사하게, 소 BCKAD의 활성 부위를, 또 다른 기질인 아세틸-CoA에 유리하도록 조작하였다(Meng et al. Biochemistry 33:12879-12885(1994)). 이러한 접근법에 대해 흥미로운 면은 랜덤한 방법을 적용하여 유효한 활성을 갖는 돌연변이된 효소들을 생성시켰을 때조차, 활성에 개선을 부여하는 정확한 돌연변이 또는 구조적 변화를 확인할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 상기 언급한 연구에서, 트립토판에 대한 개선된 활성을 촉진한 돌연변이를 2 개의 상이한 위치에 대해 역추적할 수 있었다.
방향 진화를 또한 발현시키기 어려운 단백질들의 발현에 사용하였다. 예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제에 랜덤한 돌연변이를 가하고 유전자 재조합에 의해, 야생형보다 14 배 더 큰 활성을 갖는 돌연변이체를 추출할 수 있었다(Lin et al., Biotechnol. Prog. 15:467-471(1999)).
방향 진화의 최종 예는 일련의 목적하는 작용들을 달성하도록 효소에 가할 수 있는 광범위한 변형들을 나타낸다. 바실러스 스테아로써모필루스로부터의 효소, 락테이트 데하이드로게나제에 부위-지정된 돌연변이를 가하고, 지정된 부위에서 3 개의 아미노산 치환을 수행하여 상이한 하이드록시산들에 대한 특이성을 측정하였다(Clarke et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 148:15-23(1987)). 이러한 돌연변이 후에, 피루베이트보다 옥살로아세테이트에 대한 특이성이, 옥살로아세테이트보다 1000의 피루베이트에 대한 촉매 특이성을 갖는 야생형 효소와 대조적으로 500까지 증가하였다. 상기 효소를 분지 쇄 치환된 피루베이트에 대한 활성을 갖도록 부위 지정 돌연변이를 사용하여 추가로 조작하였다(Wilks et al., Biochemistry 29:8587-8591(1990)). 구체적으로, 상기 효소는 알파-케토아이소카프로에이트에 대한 Kcat가 55 배 개선되었다. 3 개의 구조적 변형들이 동일한 효소에서 수행되어 그의 기질 특이성이 락테이트에서부터 말레이트로 변하였다. 상기 효소는 말레이트에 대해 매우 활성이고 특이적이었다(Wilks et al., Science 242:1541-1544(1988)). 바실러스 스테아로써모필루스로부터의 동일한 효소를, 양으로 하전된 측쇄를 갖는 알파-케토산, 예를 들어 암모늄 기를 갖는 것들에 대해 높은 촉매 활성을 갖도록 후속적으로 조작하였다(Hogan et al., Biochemistry 34:4225-4230(1995)). 상기 효소의 102번 위치에 산성 아미노산이 도입된 돌연변이체들은 상기와 같은 측쇄 암모늄 기의 결합을 촉진하였다. 상기 획득된 결과는 상기 돌연변이체가 오메가-아미노-알파-케토산 기질에 대한 Kcat/Km 값을 25배까지 개선시킴을 입증하였다. 상기 효소를 또한 락테이트 데하이드로게나제 대신에 페닐아세테이트 데하이드로게나제로서 작용하도록 구조적으로 변형시켰다(Wilks et al., Biochemistry 31:7802-7806(1992)). 제한 부위들을 상기 효소에 대한 유전자에 도입시켜 상기 유전자의 부위가 절제되도록 하였다. 상기 부위는 벌크 용매로부터 활성 부위 액포를 통상적으로 밀봉하고 기질 특이성의 주요 결정인자인 폴리펩타이드의 이동성 표면 고리(잔기 98 내지 110)를 암호화하였다. 상기 가변적인 길이 및 서열 고리를 상기 절단 유전자에 삽입하여 변경된 기질 특이성을 갖는 하이드록시산 데하이드로게나제를 합성하는데 사용하였다. 하나의 보다 긴 고리 제작과 함께, 피루베이트에 대한 활성이 100 만배 감소되었으나 페닐피루베이트에 대한 활성은 대체로 변경되지 않았다. 390,000 배의 특이성 변환(Kcat/Km)이 달성되었다. 피루베이트에 비해 페닐피루베이트에 대한 상기 효소의 1700:1 선택성은 페닐락테이트 데하이드로게나제에 필요한 것이다.
상기 가리킨 바와 같이, 방향 진화는 효소의 성질들을 개선 및/또는 변경시키기 위해서 특정 유전자에 표적화된 돌연변이의 도입을 수반하는 강력한 접근법이다. 개선 및/또는 변경된 효소를 다수의 효소 변이체들(예를 들어 >104)의 자동화된 선별을 허용하는 민감한 고속 대량 선별 분석의 개발 및 실행을 통해 확인할 수 있다. 반복되는 라운드의 돌연변이 및 선별을 전형적으로 수행하여 최적화된 성질을 갖는 효소를 제공한다. 돌연변이에 대한 유전자 영역을 확인하는데 일조할 수 있는 컴퓨터 연산방식이 또한 개발되었으며 이는 생성 및 선별에 필요한 효소 변이체의 수를 현저하게 줄일 수 있다.
다양한 변이체 라이브러리를 생성시키는데 유효한 다수의 방향 진화 기술들이 개발되었으며(Hibbert, E.G., F. Baganz, H.C. Hailes, J.M. Ward, G.J. Lye, J.M. Woodley and P.A. Dalby, 2005, Directed evolution of biocatalytic processes. Biomol. Eng 22:11-19; Huisman, G.W. and J.J. Lalonde, 2007, Enzyme evolution for chemical process applications, p. 717-742. In R.N. Patel(ed.), Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries. CRC Press; Otten, L.G. and W.J. Quax. 2005. Directed evolution: selecting today's biocatalysts. Biomol.Eng 22:1-9; and Sen, S., D. Venkata, V, and B. Mandal, 2007, Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223), 이들 방법은 다수의 효소 부류들에 걸쳐 광범위한 성질들의 개발에 성공적으로 적용되었다.
방향 진화 기술에 의해 개선되고/되거나 변경된 효소 특징들은 예를 들어 비-천연 기질 전환의 경우 선택성/특이성; 확고한 고온 처리의 경우 온도 안정성; 보다 낮거나 보다 높은 pH 조건 하에서 생물처리의 경우 pH 안정성; 높은 생성물 역가를 달성할 수 있도록 하기 위한 기질 또는 생성물 허용성; 비-천연 기질을 포함하도록 기질 결합을 확장시키는 결합(Km); 생성물, 기질 또는 핵심 중간체에 의한 억제를 제거하기 위한 억제(Ki); 목적하는 유출을 달성하기 위해 효소 반응 속도를 증가시키는 활성(kcat); 단백질 수율 및 전체 경로 유출을 증가시키는 발현 수준; 호기성 조건 하에서 공기 민감성 효소의 작용을 위한 산소 안정성; 및 산소의 부재 하에서 호기성 효소의 작용을 위한 혐기성 활성을 포함한다.
하기의 예시적인 방법들이 특정 효소들의 목적하는 성질들을 표적화하기 위한 유전자들의 돌연변이 및 변형을 위해 개발되었다. 이들 중 어느 것이든 사용하여 데카복실라제 효소의 활성을 변경/최적화할 수 있다.
EpPCR(Pritchard, L., D. Corne, D.Kell, J. Rowland, and M. Winson, 2005, A general model of error-prone PCR. J Theor. Biol 234:497-509)은 Mn2 + 이온의 첨가에 의해 PCR 반응에서 DNA 폴리머라제의 충실도를 감소시키거나, dNTP 농도를 치우치게 하거나, 또는 다른 조건 변화에 의해 랜덤한 점 돌연변이를 도입시킨다. 돌연변이를 관심 표적 유전자에 국한하기 위한 5 단계 클로닝 공정은 1) 상기 관심 유전자의 실수유발 PCR 증폭; 2) 제한 효소 절단; 3) 목적하는 DNA 단편의 젤 정제; 4) 벡터 내로의 연결; 5) 유전자 변이체의 적합한 숙주 내로의 형질전환 및 개선된 실행을 위한 상기 라이브러리의 선별을 수반한다. 상기 방법은 단일 유전자에서 다수의 돌연변이를 동시에 발생시킬 수 있으며, 이는 유용할 수 있다. 다수의 돌연변이체가 EpPCR에 의해 생성될 수 있으며, 따라서 고속 대량 선별 분석 또는 선택 방법(특히 로봇공학 사용)은 바람직한 특성들을 갖는 것들을 확인하는데 유용하다.
실수유발 회전 환 증폭(epRCA)(Fujii, R., M. Kitaoka, and K. Hayashi, 2004, One-step random mutagenesis by error-prone rolling circle amplification. Nucleic Acids Res 32:e145; and Fujii, P.,M. Kitaoka, and K. Hayashi, 2006, Error-prone rolling circle amplification: the simplest random mutagenesis protocol. Nat.Protoc. 1:2493-2497)은, 전체 환상 플라스미드가 주형으로서 사용되고 마지막 2 개의 뉴클레오타이드 상에 엑소뉴클레아제 내성 티오포스페이트 결합을 갖는 랜덤한 6-머들을 사용하여 상기 플라스미드를 증폭시킨 다음 세포 내로 형질전환시키고, 여기에서 상기 플라스미드를 직렬 반복부에서 다시 환화시킴을 제외하고, epPCR과 동일한 다수의 요소들을 갖는다. 상기 Mn2 + 농도를 조절하는 것은 상기 돌연변이율을 다소 변화시킬 수 있다. 상기 기법은 단순한 실수 유발, 단일 단계 방법을 사용하여 3 내지 4 개 돌연변이/kbp를 갖는 플라스미드의 전체 사본을 생성시킨다. 제한효소 절단이나 특정 프라이머들을 필요로 하지 않는다. 또한, 상기 방법을 전형적으로는 키트로서 입수할 수 있다.
DNA 또는 패밀리 셔플링(Stemmer, W.P. 1994, DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci U.S.A 91:10747-10751; and Stemmer, W.P. 1994. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature 370:389-391)은 전형적으로는 Dnase I 또는 EndoV와 같은 뉴클레아제들로 2 개 이상의 변이체 유전자를 절단하여 DNA 폴리머라제의 존재 하에서 어닐링 및 연장의 주기에 의해 재조립되어 키메릭 유전자들의 라이브러리를 생성시키는 랜덤한 단편들의 풀을 생성시킴을 수반한다. 단편들은 서로 점화(prime)시키며 하나의 사본이 또 다른 사본을 점화(prime)할 때(주형 스위치) 재조합이 발생한다. 상기 방법을 >1 kbp DNA 서열과 함께 사용할 수 있다. 단편 재조립에 의해 생성된 돌연변이 재조합체 이외에, 상기 방법은 연장 단계에서 실수유발 PCR과 유사한 비율로 점 돌연변이를 도입시킨다. 상기 방법을, 항원성을 부여할 수도 있는 유해한 랜덤 중성 돌연변이를 제거하는데 사용할 수 있다.
엇갈린 연장(StEP)(Zhao, H., L. Giver, Z. Shao, J.A. Affholter, and F.H. Arnold, 1998, Molecular evolution by staggered extension process(StEP) in vitro recombination. Nat. Biotechnol 16:258-261)은 주형 점화에 이어서 변성 및 어닐링/연장의 매우 짧은 지속(5초 정도로 짧은)의 반복된 주기의 2 단계 PCR을 수반한다. 성장하는 단편들이 상이한 주형에 어닐링하고 추가로 연장되며, 이는 충분한 길이의 서열이 만들어질 때까지 반복된다. 주형 스위칭은 대부분의 생성 단편들이 다수의 어버이를 가짐을 의미한다. 저 충실도 폴리머라제들의 조합(Taq 및 뮤타자임)은 정반대의 돌연변이 스펙트럼으로 인해 실수유발 치우침을 감소시킨다.
랜덤 프라이밍 재조합(RPR)에서 랜덤 서열 프라이머를 사용하여 상기 주형의 상이한 분절들에 상보성인 다수의 짧은 DNA 단편들을 생성시킨다(Shao, Z., H. Zhao, L. Giver, and F.H. Arnold, 1998, Random-priming in vitro recombination: an effective tool for directed evolution. Nucleic Acids Res 26:681-683). epPCR을 통한 염기 오결합(misincorporation) 및 오점화(mispriming)는 점 돌연변이를 제공한다. 짧은 DNA 단편들은 상동성을 근거로 서로 점화하고 재조합되며 반복된 열순환에 의해 완전한 길이로 재조립된다. 상기 단계에 앞서 주형의 제거는 낮은 어버이 재조합을 보장한다. 상기 방법은 대부분의 다른 방법들처럼 수 회의 반복에 걸쳐 수행되어 독특한 성질들을 진화시킬 수 있다. 이러한 기술은 서열 치우침을 피하며, 유전자 길이와 무관하고, 상기 용도를 위해 매우 적은 어버이 DNA를 필요로 한다.
이형 이중 가닥 재조합에서 선형화된 플라스미드 DNA를 사용하여 이형 이중 가닥을 형성시키며, 이는 불일치 수복에 의해 수복된다(Volkov, A.A., Z. Shao, and F.H. Arnold. 1999. Recombination and chimeragenesis by in vitro heteroduplex formation and in vivo repair. Nucleic Acids Res 27:e18; and Volkov, A.A., Z. Shao, and F.H. Arnold. 2000. Random chimeragenesis by heteroduplex recombination. Methods Enzymol. 328:456-463). 상기 불일치 수복 단계는 적어도 어느 정도 돌연변이 유발성이다. 이형 이중 가닥은 선형의 동형 이중 가닥보다 더 효율적으로 형질전환된다. 상기 방법은 큰 유전자 및 전체 오페론에 적합하다.
일시적인 주형 상의 랜덤 키메라 발생(RACHITT)(Coco, W.M., W.E. Levinson, M.J. Crist, H.J. Hektor, A. Darzins, P.T. Pienkos, C.H. Squires, and D.J. Monticello, 2001, DNA shuffling method for generating highly recombined genes and evolved enzymes. Nat. Biotechnol 19:354-359)은 Dnase I 단편화 및 ssDNA의 크기 분류를 사용한다. 동종 단편을 폴리머라제의 부재 하에서 상보성 ssDNA 골격에 하이브리드화한다. 임의의 중복되는 하이브리드화되지 않은 단편 단부들을 엑소뉴클레아제에 의해 다듬는다. 단편들 간의 틈을 채우고, 이어서 연결시켜 상기 골격(증폭을 방해하는 U를 함유한다)에 하이브리드화된 완전한 길이의 다양한 가닥들의 풀을 제공한다. 이어서 상기 골격을 파괴하고 PCR 증폭에 의해 상기 다양한 가닥에 상보성인 새로운 가닥으로 대체한다. 상기 방법은 오직 하나의 어버이로부터 나온 하나의 가닥(골격)을 수반하는 반면 상기 점화 단편들은 다른 유전자들로부터 유래하며; 상기 어버이 골격은 대비되게 선택된다. 따라서, 어버이 단편들과의 재 어닐링은 발생하지 않는다. 중복되는 단편들을 엑소뉴클레아제로 다듬는다. 그렇지 않으면, 이는 DNA 셔플링 및 StEP와 개념상 유사하다. 따라서, 자매 세포가 없고, 불활성이 거의 없으며, 셔플링되지 않은 어버이가 없어야 한다. 이러한 기법은 어버이 유전자가 거의 또는 전혀 생성되지 않으며 표준 DNA 셔플링에 비해 다수의 보다 많은 교차들이 생성될 수 있다는 점에서 이점을 갖는다.
절두된 주형 상에서의 재조합 연장(RETT)은 주형의 풀로서 사용된 단일방향 ssDNA 단편들의 존재 하에서 프라이머들로부터 단일방향으로 성장하는 가닥들의 주형 스위칭을 수반한다(Lee, S.H., E.J. Ryu, M.J. Kang, E.-S. Wang, Z.C.Y. Piao, K.J.J. Jung and Y. Shin, 2003, A new approach to directed gene evolution by recombined extension on truncated template(RETT). J. Molec. Catalysis 26:119-129). DNA 엔도뉴클레아제는 사용되지 않는다. 단일방향 ssDNA는 랜덤 프라이머와 DNA 폴리머라제에 의해 또는 엑소뉴클레아제에 의한 일련의 결실에 의해 제조된다. 단일 방향 ssDNA는 단지 주형이며 프라이머가 아니다. 랜덤 점화 및 엑소뉴클레아제는 DNA 셔플링/RACHITT의 효소 절단의 사실로서 서열 치우침을 도입하지 않는다. RETT는 매우 짧은 연장 대신에 통상적인 PCR 조건을 사용하므로 StEP보다 최적화가 더 용이할 수 있다. 재조합은 상기 PCR 단계의 성분으로서 발생한다(직접 셔플링이 없다). 상기 방법은 또한 중단의 부재로 인해 StEP보다 더 랜덤할 수 있다.
퇴화된 올리고뉴클레오타이드 유전자 셔플링(DOGS)에서 퇴화된 프라이머를 사용하여 분자들 간의 재조합을 조절한다(Bergquist, P.L. and M.D. Gibbs, 2007, Degenerate oligonucleotide gene shuffling. Methods Mol. Biol 352:191-204; Bergquist, P.L., R.A. Reeves, and M.D. Gibbs, 2005, Degenerate oligonucleotide gene shuffling(DOGS) and random drift mutagenesis(RNDM): two complementary techniques for enzyme evolution. Biomol.Eng 22:63-72; Gibbs, M.D., K.M. Nevalainen, and P.L. Bergquist, 2001, Degenerate oligonucleotide gene shuffling(DOGS): a method for enhancing the frequence of recombination with family shuffling. Gene 271:13-20). 이를 사용하여 어버이 유전자를 재생시키는 DNA 셔플링과 같은 다른 방법의 의도를 억제할 수 있다. 이 방법을 선택된 유전자 분절의 랜덤 돌연변이(epPCR)와 병행할 수 있다. 이는 어버이 서열의 재형성을 차단하는 좋은 방법일 수 있다. 엔도뉴클레아제는 필요하지 않다. 제조된 분절들의 투입 농도를 조절함으로써, 목적하는 주쇄를 향해 기울일 수 있다. 상기 방법은 제한 효소 절단 없이 관련되지 않은 어버이로부터 DNA 셔플링을 허용하며 랜덤한 돌연변이 방법의 선택을 허용한다.
하이브리드 효소의 생성을 위한 점증적인 절두(ITCHY)는 관심 유전자 또는 유전자 단편의 1 개 염기쌍 결실과의 조합적인 라이브러리를 생성시킨다(Ostermeier et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96:3562-3567(1999); Ostermeier et al, 1999 Nat. Biotechnol. 17:1205-1209(1999)). 절두를 2 개의 상이한 유전자 조각 상에서 반대 방향으로 도입시킨다. 이들을 함께 연결하고 융합물을 클로닝한다. 상기 기법은 상기 두 어버이 유전자들 간에 상동성을 필요로 하지 않는다. ITCHY를 DNA 셔플링과 병행하는 경우, 상기 시스템을 SCRATCHY라 칭한다(하기 참조). 상기 둘의 주요 이점은 어버이 유전자들 간에 상동성이 필요하지 않다는 것이다; 예를 들어 에스케리키아 콜라이와 인간 유전자 간의 작용성 융합물이 ITCHY를 통해 생성되었다. ITCHY 라이브러리가 제조되면, 모든 가능한 교차가 포착된다.
상기 하이브리드 효소의 생산을 위한 티오-증분 절두(THIO-ITCHY)는, 포스포티올레이트 dNTP를 사용하여 절두를 생성시킴을 제외하고 ITCHY와 거의 동일하다(Lutz, S., M. Ostermeier, and S.J. Benkovic, 2001, Rapid generation of incremental truncation libraries for protein engineering using alpha-phosphothiolate nucleotides. Nucleic Acids Res 29:E16). ITCHY에 비해, THIO-ITCHY는 최적화하기에 보다 용이하고 보다 많은 재현성과 조절성을 제공할 수 있다.
SCRATCH - DNA 셔플링과 병행된 ITCHY는 DNA 셔플링과 ITCHY와의 조합이다; 따라서 다수의 교차를 허용한다(Lutz et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98:11248-11253(2001)). SCRATCHY는 ITCHY와 DNA 셔플링의 최상의 특징들을 겸비한다. 수치적인 예견을 최적화에 사용할 수 있다. 서열 일치성이 80% 이하인 경우 SCRATCHY가 DNA 셔플링보다 더 유효하다.
랜덤 표류 돌연변이(RNDM)에서 돌연변이는 epPCR에 이어서 유용한 활성을 보유하는 것들에 대한 선별/선택을 통해 이루어졌다(Bergquist et al., Biomol. Eng. 22:63-72(2005)). 이어서, 이들을 DOGS에 사용하여 다수의 활성 돌연변이체들 사이 또는 활성 돌연변이체와 일부 다른 바람직한 어버이 사이의 융합을 갖는 재조합체를 생성시킨다. 중립 돌연변이의 단리를 촉진하도록 디자인하는 목적은 보유된 촉매 활성이 원래의 유전자에서보다 더 높든 더 낮든 간에 상기 활성을 선별하는 것이다. RNDM은 선별이 배경 이상의 활성을 검출할 수 있는 경우 고속 대량 분석에 사용 가능하다. RNDM을 다양성의 발생에 있어서 DOGS에 대한 전단(front end)으로서 사용하였다. 상기 기법은 셔플링 또는 다른 후속 단계들에 앞서 활성에 대한 요구를 부과하며; 중립 표류 라이브러리는 보다 작은 라이브러리로부터 보다 높고/신속한 개선을 생성시키는 것으로 나타났다. epPCR을 사용함이 공개되었다 하더라도, 상기를 다른 대규모 돌연변이 방법들에 적용할 수 있다.
서열 포화 돌연변이(SeSaM)는 1) 포스포티오에이트 뉴클레오타이드의 랜덤한 통합 및 절단을 사용하여 랜덤한 길이의 단편들의 풀을 생성시키고; 상기 풀을 주형으로서 사용하여 2) 이노신과 같은 "보편적인" 염기의 존재 하에서 연장시키고; 3) 이노신-함유 보체의 복제가 랜덤한 염기 통합 및 결과적으로 돌연변이를 제공하는 랜덤한 돌연변이 방법이다(Wong et al., Biotechnol J. 3:74-82(2008); Wong Nucleic Acids Res 32:e26; Wong et al., Anal.Biochem. 341:187-189(2005)). 상기 기법을 사용하는 경우, 간단한 방법을 사용하여 2 내지 3일 이내에 돌연변이체의 큰 라이브러리를 생성시키는 것이 가능할 수 있다. 이는 DNA 폴리머라제의 돌연변이 치우침에 비해 매우 비-방향성이다. 상기 접근법의 차이는 상기 기법을 epPCR에 대해 상보성(또는 대안적)으로 만든다.
합성 셔플링에서, 중복되는 올리고뉴클레오타이드는 "표적 중의 모든 유전자 다양성"을 암호화하도록 디자인되며 상기 셔플링된 자손에 대해 매우 높은 다양성을 허용한다(Ness, et al, Nat. Biotechnol 20:1251-1255(2002)). 상기 기법에서, 상기 단편이 셔플링되도록 디자인할 수 있다. 이는 상기 생성되는 자손의 다양성을 증가시키는데 일조한다. 보다 멀리 관련된 서열들을 보다 밀접하게 관련된 서열들에 접근하는 비율로 재조합하기 위해서 서열/코돈 치우침을 디자인할 수 있으며 이는 상기 주형 유전자들을 물리적으로 소유할 것을 요구하지 않는다.
뉴클레오타이드 교환 및 절제 기술 NexT는 dUTP 통합에 이은 유라실 DNA 글리코실라제 및 이어서 피페리딘에 의한 처리의 조합을 활용하여 종점 DNA 단편화를 수행한다(Muller et al., Nucleic Acids Res 33:e117(2005)). 상기 유전자를 교정 폴리머라제와 함께 내부 PCR 프라이머 연장을 사용하여 재조립한다. 상기 셔플링의 크기는 변하는 dUPT::dTTP 비를 사용하여 직접 조절할 수 있다. 이는 간단한 유라실 통합 및 절단 방법을 사용하는 종점 반응이다. 상기 방법에 다른 뉴클레오타이드 동족체, 예를 들어 8-옥소-구아닌을 사용할 수 있다. 또한, 상기 기법은 매우 짧은 단편(86 pb)으로 잘 작용하며 낮은 오류율을 갖는다. DNA의 화학적 절단은 매우 적은 셔플링되지 않은 클론들을 의미한다.
서열 상동성-독립적인 단백질 재조합(SHIPREC)에서 링커를 사용하여 2 개의 먼/관련되지 않은 유전자들 간의 융합을 촉진하며; 뉴클레아제 처리를 사용하여 상기 둘 사이에 일련의 키메라들을 생성시킨다. 그 결과 이들 융합물의 단일 교차 라이브러리가 생성된다(Sieber, V., C.A. Martinez, and F.H. Arnold. 2001. Libraries of hybrid proteins from distantly related sequences. Nat.Biotechnol 19:456-460). 이는 제한된 유형의 셔플링을 생성시키며; 돌연변이는 별도의 공정이다. 상기 기법은 2 개의 관련되지 않은 어버이 유전자들 각각의 변하는 분획들을 갖는 키라메의 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 상동성은 필요하지 않다. SHIPREC를 포유동물 CP450의 N-말단 부위에 융합된 세균 CP450의 헴-결합 도메인으로 시험하였으며; 이는 보다 용해성인 효소에서 포유동물 활성을 생성시켰다.
유전자 부위 포화 돌연변이(GSSM)에서 출발 물질은 삽입물이 있는 초나선(supercoiled) dsDNA 플라스미드이며 2 개의 프라이머가 목적하는 돌연변이 부위에서 퇴화된다(Kretz, K.A., T.H. Richardson, K.A. Gray, D.E. Robertson, X. Tan, and J.M. Short, 2004, Gene site saturation mutagenesis: a comprehensive mutagenesis approach. Methods Enzymol. 388:3-11). 프라이머는 관심 돌연변이를 지니며 DNA의 반대 가닥 상의 동일한 서열에 어닐링하고; 상기 프라이머의 가운데에 돌연변이 및 양쪽의 측면에 정확한 서열의 약 20 뉴클레오타이드. 상기 프라이머 중의 서열은 NNN 또는 NNK(암호화) 및 MNN(비 암호화)(N = 모두 4 개, K = G,T, M = A,C)이다. 연장 후에, DpnI를 사용하여 댐-메틸화된 DNA를 절단하여 야생형 주형을 제거한다. 상기 기법은 주어진 유전자 좌(즉 하나의 코돈)에서 모든 가능한 아미노산 치환들을 조사한다. 상기 기법은 넌센스 코돈 및 대부분의 가능한 대립유전자들의 동일하거나 거의 동일한 표시 없이 하나의 부위에서 모든 가능한 치환의 발생을 촉진한다. 상기 표적 효소의 구조, 기전, 또는 도메인에 대한 선행 지식은 필요하지 않다. 셔플링 또는 유전자 재조립이 이어지는 경우, 상기 기술은 단일 부위 상향 돌연변이의 모든 가능한 조합들을 함유하는 다양한 재조합체 라이브러리를 생성시킨다. 상기 기술 조합의 유용성은 50 개 이상의 상이한 효소들의 성공적인 진화, 및 또한 주어진 효소에서의 하나보다 많은 성질에 대해 입증되었다.
조합적인 카세트 돌연변이(CCM)는 한정된 부위들을 다수의 가능한 아미노산 서열 변경으로 대체하는 짧은 올리고뉴클레오타이드 카세트의 사용을 포함한다(Reidhaar-Olson, J.F., J.U. Bowie, R.M. Breyer, J.C. Hu, K.L. Knight, W.A. Lim, M.C. Mossing, D.A. Parsell, K.R. Shoemaker, and R.T. Sauer, 1991, Random mutagenesis of protein sequences using oligonucleotide cassette. Methods Enzymol. 208:564-586; and Reidhaar-Olson, J.F. and R.T. Sauer, 1988, Combinatorial cassette mutagenesis as a probe of the informational content of protein sequences. Science 241:53-57). 2 또는 3 개 부위들에서의 동시 치환이 상기 기법을 사용하여 가능하다. 또한, 상기 방법은 제한된 범위의 부위들에서 대다수의 가능한 서열 변화들을 시험한다. 이는 람다 억제인자 DNA-결합 도메인의 정보 내용을 탐구하는데 사용되었다.
조합적인 복합 카세트 돌연변이(CMCM)는 보다 큰 프로그램의 일부로서 사용됨을 제외하고 CCM과 본질적으로 유사하다, 즉 1) 높은 돌연변이율 내지 2) ID 다발점 및 다발 영역에서 epPCR의 사용 및 이어서 3) CMCM에 의한 연장으로 단백질 서열 공간의 한정된 부위를 포함한다(Reetz, M.T., S. Wilensek, D.Zha, and K.E. Jaeger, 2001, Directed Evolution of an Enantioselective Enzyme through Combinatorial Multiple-Cassette Mutagenesis. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 40:3589-3591). CCM과 같이, 상기 방법은 표적 부위에 걸쳐 사실상 모든 가능한 변경들을 시험할 수 있다. 랜덤 돌연변이 및 셔플링된 유전자를 생성시키는 방법들과 함께 사용되는 경우, 다양한, 셔플링된 단백질을 탁월한 생성 수단을 제공한다. 상기 접근법은 효소의 거울상 선택성을 51배까지 성공적으로 증가시켰다.
돌연변이 유발 균주 기법에서 조합적인 ts 돌연변이유발 플라스미드는 선택 중에 랜덤한 천연 돌연변이 빈도의 20- 내지 4000-X의 증가를 허용하고 선택이 필요하지 않은 경우 유해 돌연변이의 축적을 방지한다(Selifonova, O., F. Valle, and V. Schellenberger, 2001, Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl Environ Microbiol 67:3645-3649). 상기 기술은 플라스미드-유래된 mutD5 유전자를 기본으로 하며, 상기 유전자는 DNA 폴리머라제 III의 돌연변이 서브유닛을 암호화한다. 상기 서브유닛은 내생적인 DNA 폴리머라제 III에 결합하고 상기 플라스미드를 갖고 있는 균주들 중 임의의 균주에서 폴리머라제 III의 교정 능력을 절충한다. 광범위한 염기 치환 및 프레임이동 돌연변이가 발생한다. 유효한 사용을 위해서, 일단 목적하는 표현형이 달성되면 상기 돌연변이 유발 플라스미드를 제거해야 하며; 이는 온도 민감성 복제 기원을 통해 수행되고, 이는 41 ℃에서 플라스미드 경화를 허용한다. 돌연변이 유발 균주가 상당한 기간 동안 탐구되었음을 알아야 한다(Winter and coworkers, 1996, J. Mol. Biol. 260, 359-3680). 상기 기법에서 매우 높은 자발적인 돌연변이율이 관찰된다. 상기 조건적인 성질은 목적하지 않는 배경 돌연변이를 최소화한다. 이러한 기술을 적응 진화와 병행하여 돌연변이 발생률을 증대시키고 목적하는 표현형들을 보다 신속하게 달성할 수 있었다.
"룩-스루(Look-Through) 돌연변이(LTM)는 선택된 아미노산들의 조합적인 돌연변이들을 평가하고 최적화하는 다차원적 돌연변이 방법이다"(Rajpal, A., N. Beyaz, L. Haber, G. Cappuccilli, H. Yee, R.R. Bhatt, T. Takeuchi, R.A. Lerner, and R. Crea, 2005, A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries. Proc Natl Acad Sci U.S.A 102:8466-8471). 각 부위를 모든 가능한 아미노산 변화들로 포화시키는 것보다 오히려, 아미노산 R-기 화학의 범위를 포함하도록 9 개의 세트를 선택한다. 부위당 더 적은 변화는 다수의 부위가 상기 유형의 돌연변이를 쉽게 일으키게 한다. 낮은 나노몰에서부터 피코몰까지의 항체의 결합 친화성의 >800 배 증가가 상기 방법을 통해 달성되었다. 이는 랜덤한 조합의 수를 최소화하는데 합리적인 접근법이며 선별할 클론들의 수를 크게 감소시킴으로써 개선된 특성을 찾는 능력을 증가시킬 것이다. 이를 항체 공학, 구체적으로 결합 친화성을 증가시키고/시키거나 해리를 감소시키는데 적용하였다. 상기 기법을 선별 또는 선택과 병행할 수 있다.
유전자 재조립은 한번에 다수의 유전자에 적용되거나 또는 단일 유전자의 큰 키메라 라이브러리(다수의 돌연변이)를 생성시키는데 적용될 수 있는 DNA 셔플링 방법이다(www.verenium.com/Pages/Technology/EnzymeTech/TechEnzyTGR.html). 전형적으로 상기 기술을, 상기 나타낸 서열 공간을 목적하는 개선에 대해 질문하기 위해 초고속 대량 선별과 함께 사용한다. 상기 기법은 상동성과 무관하게 다수의 유전자 재조합을 허용한다. 교차 사건들의 정확한 수 및 위치를 생물정보 분석을 통해 디자인된 단편들을 사용하여 미리 측정할 수 있다. 상기 기술은 실질적으로 어버이 유전자 재형성 없이 낮은 수준의 불활성 유전자와 함께 매우 높은 수준의 다양성을 도출시킨다. GSSM과 병행 시, 큰 범위의 돌연변이들을 개선된 활성에 대해 시험할 수 있다. 상기 방법은 DNA 셔플링의 "블렌딩" 및 "미세 조정"을 허용한다, 예를 들어 코돈 사용을 최적화할 수 있다.
인 실리코(In silico) 단백질 디자인 자동화 PDA는 특정한 주름을 갖는 구조적으로 한정된 단백질 주쇄를 고정시키고 상기 주름 및 전체 단백질 에너지학을 안정화할 수 있는 아미노산 치환을 위한 서열 공간을 탐색하는 최적화 연산방식이다(Hayes, R.J., J. Bentzien, M.L. Ary, M.Y. Hwang, J.M. Jacinto, J. Vielmetter, A. Kundu, and B.I. Dahiyat, 2002, Combining computational and experimental screening for rapid optimization of protein properties. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 99:15926-15931). 상기 기술은 단백질 아미노산 변이에 대한 구조적 허용성을 탐색하기 위해서 인 실리코 구조 기재 엔트로피 예견을 허용한다. 통계 역학을 각 위치에서의 커플링 상호작용을 계산하는데 적용한다, 즉 아미노산 치환에 대한 구조 허용성이 커플링의 척도이다. 최종적으로, 상기 기술은 구조 특징들의 완전성을 유지하면서 단백질 성질의 목적하는 변형들을 제공하도록 디자인된다. 상기 방법은 매우 큰 수의 가능한 서열 변형들(1050)의 필터링을 계산적으로 평가하고 허용한다. 시험하기 위한 서열 변형의 선택은 가장 유리한 열역학에 근거한 예견과 관련되며 외면상 오직 안정성 또는 안정성과 연결된 성질들만이 상기 기술에 의해 유효하게 다루어질 수 있다. 상기 방법은 일부 치료학적 단백질들, 특히 공학용 면역글로불린에 성공적으로 사용되었다. 인 실리코 예견은 대단히 많은 수의 잠재적인 변형들을 시험하는 것을 피한다. 기존 3차원 구조에 근거한 예견이 가설적인 구조에 근거한 예견보다 더 성공할 듯하다. 상기 기술은 다수의 동시적인 돌연변이들, 급격한 수의 증가로 인해 순수하게 실험적인 기술들로는 가능하지 않은 것들의 표적화된 선별을 쉽게 예견할 수 있으며 이를 허용한다.
반복하는 포화 돌연변이(ISM)는 1) 효소 개선에 가능한 부위를 선택하기 위한 구조/작용 지식의 사용, 2) 스트라타진 퀵체인지(Stratagene QuikChange)(또는 다른 적합한 수단들)를 사용하는 선택된 부위에서의 포화 돌연변이, 3) 목적하는 성질에 대한 선별/선택, 4) 개선된 클론(들)과 함께, 또 다른 부위에서의 다시 시작 및 연속적인 반복을 수반한다(Reetz, M.T. and J.D. Carballeira, 2007, Iterative saturation mutagenesis(ISM) for rapid directed evolution of functional enzymes. Nat. Protoc. 2:281-903; and Reetz, M.T., J.D. Carballeira, and A. Vogel, 2006, Iterative saturation mutagenesis on the basis of B factors as a strategy for increasing protein thermostability. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 45:7745-7751). 이는 주어진 위치에서 모든 가능한 치환들이 선별/선택에 대해 수행됨을 보장하는 입증된 방법이다.
상기 언급한 돌연변이 방법들 중 임의의 방법을 단독으로 사용하거나 병행할 수 있다. 또한, 상기 방향 진화 방법들 중 어느 하나 또는 조합을 적응 진화 기법들과 함께 사용할 수 있다.
더 양호한 생산자를 생성시키기 위해서, 대사 모델링을 생육 조건의 최적화에 사용할 수 있다. 모델링을 또한 상기 경로의 사용을 추가로 최적화하는 유전자 녹아웃의 디자인에 사용할 수 있다(예를 들어 제 US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 및 US 2004/0009466 호, 및 미국 특허 제 7,127,379 호를 참조하시오). 모델링 분석은 상기 대사가 1,3-부탄다이올의 보다 효율적인 생산을 향해 이동하는 세포 생육에 대한 영향들의 신뢰성 있는 예견을 허용한다.
목적하는 생성물의 생합성에 유리한 대사 변경들을 확인하고 디자인하기 위한 한 가지 계산적인 방법은 OptKnock 계산 체계이다(Burgard et al., Biotechnol. Bioeng. 84:647-657(2003)). OptKnock은 표적 생성물을 과생산하는 유전적으로 안정한 미생물을 생성시키는 유전자 결실 전략을 제시하는 대사 모델링 및 시뮬레이션 프로그램이다. 구체적으로, 상기 체계는 목적하는 생화학을 강제로 세포 생육의 필수적인 부산물로 되게 하는 유전자 조작을 제시하기 위해서 미생물의 완전한 대사 및/또는 생화학적 네트워크를 검사한다. 전략적으로 배치된 유전자 결실 또는 다른 작용성 유전자 파괴를 통해 생화학적 생산과 세포 생육을 결합시킴으로써, 생물반응기에서 보다 긴 시간 후에 상기 조작된 균주에 부과된 생육 선택 압력은 강제적인 생육-결합된 생화학적 생산의 결과로서 실행의 개선을 도출시킨다. 마지막으로, 유전자 결실을 제작하는 경우에, OptKnock에 의해 선택된 유전자들이 상기 게놈으로부터 완전히 제거되기 때문에 상기 디자인된 균주가 그의 야생형 상태로 되돌아가는 가능성은 무시할만하다. 따라서, 상기 계산적인 방법을, 목적하는 생성물의 생합성을 도출하는 대안 경로를 확인하거나 또는 목적하는 생성물의 생합성을 추가로 최적화하기 위해 비-천연 미생물 유기체와 함께 사용할 수 있다.
간단히, OptKnock는 본 발명에서 세포 대사를 모델링하기 위한 계산 방법 및 시스템을 지칭하는데 사용되는 용어이다. 상기 OptKnock 프로그램은 특정한 구속을 유출 균형 분석(FBA) 모델에 통합시키는 방법 및 모델 체계와 관련된다. 이들 구속은 예를 들어 정량적인 동역학 정보, 정량적인 조절 정보, 및/또는 DNA 미세배열 실험 데이터를 포함한다. OptKnock는 또한 예를 들어 유출 균형 모델로부터 유도된 유출 경계를 엄격히 하고 후속적으로 유전자 첨가 또는 결실의 존재 하에서 대사 네트워크의 실행 한계를 탐침함으로써 다양한 대사 문제들에 대한 해법을 계산한다. OptKnock 계산 체계는 상기 대사 네트워크의 실행 한계의 유효 질문을 가능하게 하는 모델 제형의 제작을 허용하며 상기 생성되는 혼합-정수 선형 프로그래밍 문제를 해결하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 OptKnock로서 지칭되는 대사 모델링 및 시뮬레이션 방법들이 예를 들어 US 2002/016854, WO 2002/055995, 및 US 2009/0047719에 개시되어 있다.
생성물의 생합성 생산에 유리한 대사 변경을 확인하고 디자인하기 위한 또 다른 계산 방법은 심페니(SimPheny)(등록상표)라 칭하는 대사 모델링 및 시뮬레이션 시스템이다. 상기 계산 방법 및 시스템은 예를 들어 2002년 6월 14일자로 출원된 US 2003/0233218 및 WO 2003/106998에 개시되어 있다. 심페니(등록상표)는 인실리코 네트워크 모델을 생성시키고 생물 시스템의 화학 반응들을 통해 질량, 에너지 또는 충전의 유출을 시뮬레이션하여 상기 시스템 중의 화학 반응들의 임의의 및 모든 가능한 작용기들을 함유하는 해법 공간을 한정하여, 상기 생물 시스템에 대한 일련의 허용되는 활성들을 결정할 수 있는 계산 시스템이다. 이러한 접근법은 상기 해법 공간이 상기 포함된 반응들의 공지된 화학량론 뿐만 아니라 반응 열역학과 같은 구속 및 반응들을 통한 최대 유출과 관련된 용량 구속에 의해 한정되므로 구속-기재 모델링이라 지칭된다. 이들 구속에 의해 한정된 공간은 상기 생물 시스템 또는 그의 생화학적 성분들의 표현형 능력 및 반응을 측정하기 위해 의심될 수 있다.
이러한 계산적 접근법은 생물 시스템들이 가요성이고 많은 상이한 방법들에서 동일한 결과에 도달할 수 있기 때문에 생물학적 실재와 일치한다. 생물 시스템은 모든 살아있는 시스템들이 직면해야 하는 근본적인 구속들에 의해 제한된 진화 기전을 통해 디자인된다. 따라서, 구속 기재 모델링 전략은 이들 일반적인 실재를 포함한다. 더욱이, 구속의 엄격화를 통해 네트워크 모델에 추가의 제한들을 연속적으로 부과하는 능력은 상기 해법 공간의 크기를 감소시키고, 이에 의해 생리학적 실행 또는 표현형을 예견할 수 있는 예견을 향상시킨다.
본 발명의 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 숙주 미생물 유기체에서의 목적하는 화합물의 생합성을 디자인 및 실행하는데 대사 모델링 및 시뮬레이션에 대한 다양한 계산 체계를 적용할 것이다. 상기와 같은 대사 모델링 및 시뮬레이션 방법은 예를 들어 심페니(등록상표) 및 OptKnock로서 상기 예시된 계산 시스템들을 포함한다. 본 발명의 예시를 위해서, 일부 방법들을 모델링 및 시뮬레이션에 대해 상기 OptKnock 계산 체계와 관련하여 본 발명에 개시한다. 당해 분야의 숙련가들은 상기 대사 변경의 확인, 디자인 및 실행을 OptKnock를 사용하여 당해 분야에 널리 공지된 상기와 같은 다른 대사 모델링 및 시뮬레이션 계산 체계 및 방법들에 어떻게 적용하는 지를 알 것이다.
상술한 방법들은 파괴하고자 하는 하나의 대사 반응 세트를 제공할 것이다. 상기 세트 또는 대사 변형 내의 각 반응의 제거 결과 목적하는 생성물이 상기 유기체의 생육 단계 동안 필수적인 산물로서 생성될 수 있다. 상기 반응들은 공지되어 있으므로, 상기 2단 OptKnock 문제에 대한 해법은 또한 상기 반응 세트 내의 각 반응을 촉진하는 하나 이상의 효소를 암호화하는 관련된 유전자 또는 유전자들을 제공할 것이다. 각 반응에 관여하는 효소들을 암호화하는 일련의 반응 및 그의 상응하는 유전자들의 확인은 일반적으로 자동화된 공정이며, 상기 반응과, 효소와 암호화 유전자들 간의 관계를 갖는 반응 데이터베이스와의 상관성을 통해 수행된다.
목적하는 생성물의 생산을 달성하기 위해서 파괴해야 하는 반응 세트를 표적 세포 또는 유기체에서 상기 세트 내의 각 대사 반응을 암호화하는 하나 이상의 유전자의 작용 파괴에 의해 실행한다. 상기 반응의 작용 파괴를 달성하는데 특히 유용한 하나의 수단은 각 암호화 유전자의 결실에 의한 것이다. 그러나, 일부의 경우, 상기 반응을 다른 유전자 이상, 예를 들어 돌연변이, 조절 부위, 예를 들어 프로모터 또는 조절 인자에 대한 시스 결합 부위의 결실에 의해, 또는 임의의 다수의 위치들에서 암호화 서열의 절두에 의해 파괴하는 것이 유리할 수 있다. 상기 후자의 이상(상기 유전자 세트의 전체 미만의 결실을 생성시킨다)은, 예를 들어 생성물의 결합에 대한 신속한 평가를 원하는 경우 또는 격세 유전이 덜 발생할 듯한 경우 유용할 수 있다.
목적하는 생성물의 생육-결합된 생합성을 포함한 생합성을 생성시킬 수 있는 대사 변형 또는 파괴하고자 하는 반응들의 추가의 세트를 도출시키는 상술한 2단 OptKnock 문제에 대한 추가의 생산적인 해법들을 확인하기 위해서, 정수 컷이라 칭하는 최적화 방법을 실행시킬 수 있다. 상기 방법은 상기 예시된 OptKnock 문제를 각 반복부에서 정수 컷이라 지칭되는 추가의 구속의 통합에 의해 반복적으로 해결함으로써 진행된다. 정수 컷 구속은 상기 해결 과정이, 임의의 선행 반복 시 확인된 정확하게 동일한 반응 세트를 선택하는 것(생성물 생합성을 생육과 강제로 결합시킨다)을 유효하게 방지한다. 예를 들어 앞서 확인된 생육-결합된 대사 변형이 파괴를 위한 반응 1, 2 및 3을 명시하는 경우, 하기의 구속은 동일한 반응이 후속 해법에 동시에 고려되는 것을 방지한다. 상기 정수 컷 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 예를 들어 문헌[Burgard et al., Biotechnol. Prog. 17:791-797(2001)]에서 찾을 수 있다. 본 발명에 개시된 모든 방법들을 대사 모델링 및 시뮬레이션에 대한 상기 OptKnock 계산 체계와 함께 이들의 사용에 관하여, 반복적인 계산 분석에서 쓸데없는 반복을 감소시키는 정수 컷 방법을 또한 예를 들어 심페니(등록상표)를 포함하여 당해 분야에 널리 공지된 다른 계산 체계와 함께 적용할 수 있다.
본 발명에 예시된 방법들, 예를 들어 표적 생화학적 생성물의 생산을, 확인된 유전자 변경을 갖도록 조작된 세포 또는 유기체의 생육과 강제로 결합시키는 것은 목적하는 생성물을 생합성적으로 생산하는 세포 및 유기체를 제작할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명에 개시된 계산 방법은 OptKnock 및 심페니(등록상표) 중에서 선택된 인 실리코 방법에 의해 확인되는 대사 변형의 확인 및 실행을 허용한다. 상기 대사 변형의 세트는 예를 들어 하나 이상의 생합성 경로 효소들의 첨가 및/또는 예를 들어 유전자 결실에 의한 파괴를 포함하여 하나 이상의 대사 반응들의 작용 파괴를 포함할 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, OptKnock 방법은 긴 생육 선택 기간이 가해지는 경우, 돌연변이 미생물 네트워크가 그의 계산적으로 예견된 최대-생육 표현형을 향해 진화할 수 있다는 전제 하에 개발되었다. 즉 상기 접근법은 선택성 압력 하에서 유기체의 자기 최적화 능력을 활용한다. 상기 OptKnock 체계는 네트워크 화학량론에 근거하여 생화학적 생산과 세포 생육 사이를 강제로 결부시키는 유전자 결실 조합을 총망라하여 열거한다. 최적의 유전자/반응 녹아웃의 확인은 상기 생성 네트워크에 대한 최적 생육 해법이 관심 생화학을 과생산하도록 활성 반응 세트를 선택하는 2단 최적화 문제의 해법을 필요로 한다(Burgard et al., Biotechnol. Bioeng. 84:647-657(2003)).
에스케리키아 콜라이 대사의 인 실리코 화학량론 모델을 사용하여 앞서 예시되고 예를 들어 제 US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 및 US 2004/0009466 호, 및 미국 특허 제 7,127,379 호에 개시된 바와 같이 대사 경로에 대한 필수 유전자들을 동정할 수 있다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 상기 OptKnock 수학 체계를 정밀한 유전자 결실에 적용하여 목적하는 생성물의 생육-결합된 생산을 도출시킬 수 있다. 더욱이, 상기 2단 OptKnock 문제의 해법은 오직 하나의 결실 세트만을 제공한다. 모든 의미 있는 해법들, 즉 생육-결합된 생산 형성을 도출하는 모든 녹아웃 세트들을 열거하기 위해서, 정수 컷이라 지칭되는 최적화 기법을 실행할 수 있다. 이는 상기 OptKonck 문제를 상기 논의된 바와 같이, 각 반복 시 정수 컷이라 지칭되는 추가의 구속을 결합시켜 반복적으로 해결함을 수반한다.
본 발명의 다양한 실시태양들의 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 변형들이 또한 본 발명에 제공된 본 발명의 정의 내에 있음은 물론이다. 따라서, 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하고자 하는 것이지 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 I
알라닌을 통한 1,3- 부탄다이올 합성
본 실시예는 도 1의 알라닌 경로를 사용하여 단계 A, B, C, D 및 H를 통해 1,3-부탄다이올을 생산할 수 있는 미생물 유기체의 생성을 개시한다.
에스케리키아 콜라이를 표적 유기체로서 사용하여 도 1에 도시된 바와 같이 1,3-부탄다이올 생산 경로를 조작한다. 에스케리키아 콜라이는 1,3-부탄다이올을 생산할 수 있는 비-천연 미생물의 생성에 양호한 숙주를 제공한다. 에스케리키아 콜라이는 유전자 조작이 가능하며 에탄올, 아세트산, 폼산, 락트산 및 숙신산과 같은 다양한 생성물들을 혐기성 또는 미세호기성 조건 하에서 유효하게 생산할 수 있는 것으로 공지되어 있다.
1,3-부탄다이올을 생산하도록 조작된 에스케리키아 콜라이 균주를 생성시키기 위해서, 앞서 개시된 바와 같이 알라닌 경로에 사용된 상기 효소를 암호화하는 핵산들을 널리 공지된 분자 생물학 기법을 사용하여 에스케리키아 콜라이에서 발현시킨다(예를 들어 상기 Sambrook, 2001; 상기 Ausubel, 1999; 상기 Roberts et al., 1989 참조).
특히, 각각 AKP 티올라제, AKP 아미노트랜스퍼라제 및 2,4-다이옥소펜타노에이트 데카복실라제 활성을 암호화하는 ortA(YP_001086914.1), ortB(YP_001086915.1), dat(P19938), 및 pdc(P06672) 유전자를 PA1/lacO 프로모터 하에서 pZE13 벡터(엑스프레시스(Expressys), 독일 룰츠하임 소재) 내로 클로닝한다. 또한, 각각 3-옥소부티르알데하이드 리덕타제(알데하이드 환원) 및 4-하이드록시,2-부탄온 리덕타제를 암호화하는 yqhD(NP_417484.1) 및 adh(AAA23199.2) 유전자를 PA1/lacO 프로모터 하에서 pZA33 벡터(엑스프레시스, 독일 룰츠하임 소재) 내로 클로닝한다. 상기 두 세트의 플라스미드를 에스케리키아 콜라이 균주 MG1655 내로 형질전환시켜 알라닌 경로를 통해 1,3-부탄다이올 합성에 필요한 단백질과 효소를 발현시킨다. 에스케리키아 콜라이가 D-알라닌을 형성하는 능력을 가짐에 주목한다.
생성되는 유전자 조작된 유기체를 당해 분야에 널리 공지된 과정에 따라 글루코스 함유 배지에서 배양한다(예를 들어 상기 Sambrook et al., 2001 참조). 상기 알라닌 경로 유전자의 발현은 폴리펩타이드 발현 또는 효소 활성의 측정에 대해 당해 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 노던 블럿, mRNA의 PCR 증폭, 면역 블럿팅을 사용하여 확인한다. 상기 발현된 효소의 효소 활성을 상기 개별적인 활성에 특이적인 분석들을 사용하여 확인한다. 1,3-부탄다이올을 생산하는 상기 조작된 에스케리키아 콜라이 균주의 능력을 HPLC, 기체 크로마토그래피-질량 분광측정(GCMS) 또는 액체 크로마토그래피-질량 분광측정(LCMS)을 사용하여 확인한다.
작용성 1,3-부탄다이올 합성 경로를 갖도록 조작된 미생물 균주를 상기 경로의 효율적인 이용을 위해 최적화에 의해 더욱 증대시킨다. 간단히, 상기 조작된 균주를 상기 외래 유전자들 중 어느 유전자가 속도 제한 수준으로 발현되는지를 결정하기 위해 평가한다. 발현을 예를 들어 추가적인 유전자 사본수의 도입에 의해, 상기 경로를 통해 유출을 제한할 수 있는 낮은 수준으로 발현된 임의의 효소에 대해 증가시킨다.
더욱 양호한 생산자를 생성시키기 위해서, 대사 모델링을 사용하여 생육 조건을 최적화한다. 모델링을 또한 상기 경로의 이용을 추가로 최적화하는 유전자 녹아웃의 디자인에 사용한다(예를 들어 제 US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 및 US 2004/0009466 호, 및 미국 특허 제 7,127,379 호 참조). 모델링 분석은 상기 대사가 1,3-부탄다이올의 보다 효율적인 생산을 향해 이동하는 세포 생육에 대한 영향들의 신뢰성 있는 예견을 허용한다. 하나의 모델링 방법은 2단 최적화 접근법인 OptKnock(Burgard et al., Biotechnol. Bioengineer. 84:647-657(2003))이며, 이를 집합적으로 1,3-부탄다이올의 보다 양호한 생산을 생성시키는 유전자 녹아웃의 선택에 적용한다. 적응 진화를 또한 사용하여, 예를 들어 알라닌 또는 2-아미노-4-옥소펜타노에이트 중간체 또는 1,3-부탄다이올 생성물의 보다 양호한 생산자를 생성시킬 수 있다. 적응 진화를 수행하여 생육과 생산 특징을 모두 개선시킨다(Fong and Palsson, Nat. Genet. 36:1056-1058(2004); Alper et al., Science 314:1565-1568(2006)). 상기 결과를 근거로, 후속의 모델링, 유전 공학 및 적응 진화 라운드를 상기 1,3-부탄다이올 생산자에 적용시켜 생산을 더욱 증가시킬 수 있다.
1,3-부탄다이올의 대규모 생산을 위해서, 상기 알라닌 경로 함유 유기체를 당해 분야에 공지된 배지를 사용하여 발효기에서 배양시켜 혐기성 조건 하에서 상기 유기체의 생육을 지원한다. 발효를 배치, 유가 또는 연속적인 방식으로 수행한다. 혐기성 조건은 먼저 상기 배지를 질소로 살포하고 이어서 배양 용기를 밀봉하여(예를 들어 플라스크를 격막 및 크림프-뚜껑으로 밀봉시킬 수 있다) 유지시킨다. 미세호기성 조건을 또한, 제한된 통기를 위해 작은 구멍을 제공함으로써 사용할 수 있다. 상기 배지의 pH를 산, 예를 들어 H2SO4의 첨가에 의해 7의 pH에서 유지시킨다. 상기 생육률을, 분광광도계(600 ㎚)를 사용하여 광학 밀도를 측정함으로써 측정하고, 글루코스 흡수율은 시간에 따른 탄소 원 고갈을 모니터함으로써 측정한다. 바람직하지 못한 알콜, 유기산, 및 잔류 글루코스와 같은 부산물들을, 글루코스 및 알콜의 경우 굴절률 검출기 및 유기산의 경우 UV 검출기를 사용하여, HPX-087 컬럼(바이오래드)과 함께 HPLC(시마주)에 의해 정량분석할 수 있다(Lin et al., Biotechnol. Bioeng., 775-779(2005)).
실시예 II
중간체로서 아세토아세틸 - CoA 를 사용하는 1,3- BDO 합성
본 실시예는 전구체로서 아세토아세틸-CoA를 사용하여 1,3-부탄다이올을 생산할 수 있는 미생물 유기체의 생성을 개시한다(도 2의 단계 G, H 및 I).
에스케리키아 콜라이를 도 2에서 단계 G(아세토아세틸-CoA의 3-하이드록시부티릴-CoA로의 전환), H(3-하이드록시부티릴-CoA의 3-하이드록시부티르알데하이드로의 전환) 및 I(3-하이드록시부티르알데하이드의 1,3-부탄다이올로의 전환)를 통해 상기 경로를 조작하기 위해서 표적 유기체로서 사용한다. 에스케리키아 콜라이는 1,3-부탄다이올을 생산할 수 있는 비-천연 미생물의 생성에 양호한 숙주를 제공한다. 에스케리키아 콜라이는 유전자 조작이 가능하며 에탄올, 아세트산, 폼산, 락트산 및 숙신산과 같은 다양한 생성물들을 혐기성 또는 미세호기성 조건 하에서 유효하게 생산할 수 있는 것으로 공지되어 있다.
1,3-부탄다이올을 생산하도록 조작된 에스케리키아 콜라이 균주를 생성시키기 위해서, 앞서 개시된 바와 같이 개시된 경로(단계 G, H 및 I)에 사용된 상기 효소를 암호화하는 핵산들을 널리 공지된 분자 생물학 기법을 사용하여 에스케리키아 콜라이에서 발현시킨다(예를 들어 상기 Sambrook, 2001; 상기 Ausubel, 1999; 상기 Roberts et al., 1989 참조). 에스케리키아 콜라이가 아세틸-CoA의 2 개 분자를 축합시켜 아세토아세틸-CoA를 형성하는 atoB(수납 번호: NP_416728.1)에 의해 암호화된 고유 티올라제를 가짐에 주목한다.
더욱이, 아세토아세틸-CoA 리덕타제(케톤 환원)를 암호화하는 hbd(NP_349314.1)를 PA1/lacO 프로모터 하에서 pZE13 벡터(엑스프레시스, 독일 룰츠하임 소재) 내로 클로닝한다. 상기 플라스미드를 아세토아세틸-CoA를 통한 3-하이드록시부티릴-CoA의 형성에 필요한 효소를 발현시키기 위해서 에스케리키아 콜라이 균주 MG1655 내로 형질전환시킨다. 3-하이드록시부티릴-CoA를 3-하이드록시부티르알데하이드로 전환시키는 알데하이드 데하이드로게나제(하기 표 A 중에서 선택된다), 및 3-하이드록시부티르알데하이드를 1,3-BDO로 추가로 환원시키는 알콜 데하이드로게나제(하기 표 B 중에서 선택된다)를 또한 PA1/lacO 프로모터 하에서 pZE13 벡터 내로 클로닝한다.
생성되는 유전자 조작된 유기체를 당해 분야에 널리 공지된 과정에 따라 글루코스 함유 배지에서 배양한다(예를 들어 상기 Sambrook et al., 2001 참조). 상기 알라닌 경로 유전자의 발현은 폴리펩타이드 발현 또는 효소 활성의 측정에 대해 당해 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 노던 블럿, mRNA의 PCR 증폭, 면역 블럿팅을 사용하여 확인한다. 상기 발현된 효소의 효소 활성을 상기 개별적인 활성에 특이적인 분석들을 사용하여 확인한다. 1,3-부탄다이올을 생산하는 상기 조작된 에스케리키아 콜라이 균주의 능력을 HPLC, 기체 크로마토그래피-질량 분광측정(GCMS) 또는 액체 크로마토그래피-질량 분광측정(LCMS)을 사용하여 확인한다.
작용성 1,3-부탄다이올 합성 경로를 갖도록 조작된 미생물 균주를 상기 경로의 효율적인 이용을 위해 최적화에 의해 더욱 증대시킨다. 간단히, 상기 조작된 균주를 상기 외래 유전자들 중 어느 유전자가 속도 제한 수준으로 발현되는지를 결정하기 위해 평가한다. 발현을 예를 들어 추가적인 유전자 사본수의 도입에 의해, 상기 경로를 통해 유량을 제한할 수 있는 낮은 수준으로 발현된 임의의 효소에 대해 증가시킨다.
더욱 양호한 생산자를 생성시키기 위해서, 대사 모델링을 사용하여 생육 조건을 최적화한다. 모델링을 또한 상기 경로의 이용을 추가로 최적화하는 유전자 녹아웃의 디자인에 사용한다(예를 들어 제 US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 및 US 2004/0009466 호, 및 미국 특허 제 7,127,379 호 참조). 모델링 분석은 상기 대사가 1,3-부탄다이올의 보다 효율적인 생산을 향해 이동하는 세포 생육에 대한 영향들의 신뢰성 있는 예견을 허용한다. 하나의 모델링 방법은 2단 최적화 접근법인 OptKnock(Burgard et al., Biotechnol. Bioengineer. 84:647-657(2003))이며, 이를 집합적으로 1,3-부탄다이올의 보다 양호한 생산을 생성시키는 유전자 녹아웃의 선택에 적용한다. 적응 진화를 또한 사용하여, 예를 들어 아세틸-CoA 중간체 또는 1,3-부탄다이올 생성물의 보다 양호한 생산자를 생성시킬 수 있다. 적응 진화를 수행하여 생육과 생산 특징을 모두 개선시킨다(Fong and Palsson, Nat. Genet. 36:1056-1058(2004); Alper et al., Science 314:1565-1568(2006)). 상기 결과를 근거로, 후속의 모델링, 유전 공학 및 적응 진화 라운드를 상기 1,3-부탄다이올 생산자에 적용시켜 생산을 더욱 증가시킬 수 있다.
1,3-부탄다이올의 대규모 생산을 위해서, 상기 알라닌 경로 함유 유기체를 당해 분야에 공지된 배지를 사용하여 발효기에서 배양시켜 혐기성 조건 하에서 상기 유기체의 생육을 지원한다. 발효를 배치, 유가 또는 연속적인 방식으로 수행한다. 혐기성 조건은 먼저 상기 배지를 질소로 살포하고 이어서 배양 용기를 밀봉하여(예를 들어 플라스크를 격막 및 크림프-뚜껑으로 밀봉시킬 수 있다) 유지시킨다. 미세호기성 조건을 또한, 제한된 통기를 위해 작은 구멍을 제공함으로써 사용할 수 있다. 상기 배지의 pH를 산, 예를 들어 H2SO4의 첨가에 의해 7의 pH에서 유지시킨다. 상기 생육률을, 분광광도계(600 ㎚)를 사용하여 광학 밀도를 측정함으로써 측정하고, 글루코스 흡수율은 시간에 따른 탄소 원 고갈을 모니터함으로써 측정한다. 바람직하지 못한 알콜, 유기산, 및 잔류 글루코스와 같은 부산물들을, 글루코스 및 알콜의 경우 굴절률 검출기 및 유기산의 경우 UV 검출기를 사용하여, HPX-087 컬럼(바이오래드)과 함께 HPLC(시마주)에 의해 정량분석할 수 있다(Lin et al., Biotechnol. Bioeng., 775-779(2005)).
여러 알데하이드 데하이드로게나제를 3-하이드록시부티릴-CoA에 대한 활성에 대해 시험하였다. 세균의 조 용해물들(각각의 균주는 알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 하기 표 38에 나열된 6 개 유전자들 중 하나를 지닌다)을 CoA 부분의 방출을 측정함으로써 3-하이드록시부티릴-CoA에 대한 활성에 대해 시험하였다. 시험되고 3-HBCoA에 대해 현저한 활성을 갖는 것으로 밝혀진 유전자들은 하기의 수납 번호 및 GI 번호를 갖는 단백질들을 암호화한다:
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
bld AAP42563.1 31075383 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰
ald ACL06658.1 218764192 데술파티바실룸 알케니포란스 AK-01
ald YP_001452373 157145054 시트로박터 코제리 ATCC BAA-895
pduP NP_460996.1 16765381 살모넬라 엔테리카 티피뮤리움
pduP ABJ64680.1 116099531 락토바실러스 브레비스 ATCC 367
BselDRAFT_1651 ZP_02169447 163762382 바실러스 셀레니티레듀센스 MLS10
상기 용해물 중의 배경 활성을 보정하기 위해서, 측정된 활성들을 ALD 유전자 없이 음성 대조군(벡터만, "Vo")과 비교하였다. 도 4는 3-하이드록시부티릴-CoA에 대한 상기 시험 유전자들 각각의 비-활성을 나타낸다. 유전자 id를 x-축에 나타낸다.
또한, bld(진뱅크 ID: AAP42563.1, GI 번호: 31075383)를 또한 3-HBCoA에 대한 활성에 대해 시험하였다. 도 5는 투석 전후의 3-하이드록시부티릴-CoA에 대한 상기 유전자의 활성을 나타낸다.
3-하이드록시부티르알데하이드에 대한 활성에 대해 시험되고 현저한 활성을 갖는 것으로 입증된 알콜 데하이드로게나제들을 하기에 열거한다.
단백질 진뱅크 ID GI 번호 유기체
Bdh(Cbei_2181) YP_001309304 150017050 클로스트리듐 베이제링키이
Bdh(Cbei_1722) YP_001309535.1 150016596 클로스트리듐 베이제링키이
Bdh(Cbei_2421) YP_001309535.1 150017281 클로스트리듐 베이제링키이
하기의 프로토콜을 사용하여 알콜 데하이드로게나제 활성(즉 3-하이드록시부티르알데하이드의 1,3-BDO로의 전환) 및 결합된 알데하이드 및 알콜 데하이드로게나제 활성(즉 3-하이드록시부티릴-CoA의 1,3-BDO로의 전환)을 입증하였다.
화학적 수용 세포를 알데하이드 데하이드로게나제 또는 알콜 데하이드로게나제를 함유하는 플라스미드들로 형질전환시켰다(상기 표 38 및 39에 나열됨). 상기 플레이트들로부터의 콜로니를 피킹하고 LB + 100 ug/㎖ 카벤실린에서 밤새 증식시키고, 이어서 0.6 ㎖를 사용하여 각 알콜 데하이드로게나제의 60 ㎖ 배양물을 접종하거나, 1.5 ㎖를 사용하여 각 알데하이드 데하이드로게나제의 500 ㎖ 배양물을 접종하였다. 세포를 37 ℃에서 약 0.7의 O.D.로 증식시키고 IPTG로 유도하였다. 상기 배양물을 4 시간의 단백질 발현 동안 30 ℃에서 배양하였다. 상기 세포 배양물을 30 ㎖ 분액들로 나누고, 원심분리하고 상기 세포 펠릿을 -80 ℃에서 보관하였다. 상기 세포 배양물의 샘플을 사용하여 최종 세포 밀도를 추정하였다.
알콜 데하이드로게나제와 알데하이드 데하이드로게나제의 조합을 기질 + 대조군(기질이 없음)으로서 3-하이드록시부티릴-CoA가 있는 96-웰 플레이트 포맷에서 선별하였다. 한편으로, 알콜 데하이드로게나제 활성을 시험하기 위해서, 오직 상기 알콜 데하이드로게나제만을 기질, 3-하이드록시부티르알데하이드와 함께 및 상기 없이 첨가하였다. 세포 용해물의 제조를 저온실(4 ℃)에서 얼음 상에서 수행하였다. 최종 세포 밀도를 사용하여 각 세포 펠릿에 대한 버그 버스터(Bug Buster) 세포 용해 시약의 양을 계산하였다. 라이소자임(10 ㎕) 및 벤조나제(10 ㎕)를 35 ㎖ 버그버스터에 가하고 서서히 뒤집어 혼합하였다. 먼저, 50 ㎛의 다이티오쓰레이톨(100 mM 모액)을 상기 펠릿에 가하고, 이어서 1.0의 O.D.(600 ㎚)에 대해 상기 버그 버스터 + 효소 혼합물 0.5 ㎖를 상기 세포 펠릿에 가하고 서서히 혼합하여 재현탁시켰다.
각 웰에, 50 ㎕의 1M MOPS(pH = 7.5) 및 25 ㎕의 보조인자 혼합물(4 mM NADH 및 4 mM NADPH), 100 ㎕ 알데하이드 데하이드로게나제 세포 용해물, 150 ㎕ 알콜 데하이드로게나제 세포 용해물 모두 또는 오직 150 ㎕ 알콜 데하이드로게나제 세포 용해물만을 가하고 서서히 혼합하였다. 이어서, 적합한 기질을 상기 웰에 가하였다. 25 ㎎의 3-하이드록시부티릴 CoA를 250 ㎕ 물에 재현탁하고 5 ㎕를 각 웰에 가하여 1.8 mM의 최종 농도에 대해 상기 두 알콜 및 알데하이드 데하이드로게나제 활성 모두를 시험하였다. 오직 상기 알콜 데하이드로게나제만의 활성을 시험하기 위해서, 50 ㎕의 3-하이드록시부티르알데하이드(물 5 ㎖ 중의 0.6 ㎖ 아세트알데하이드 + 촉매 염기(NaOH 1 펠릿)를 혼합하여 제조, Guthrie, J.P.(첨부된 참고문헌))를 각 웰에 가하였다. 각 웰 중의 3-하이드록시부티르알데하이드의 최종 농도는 대략 50 mM이었다. 상기 96-깊은 웰 플레이트를 플라스틱 PCR 봉인으로 밀봉하고 30 ℃에서 밤새 진탕하면서 배양하였다(총 18 시간). 단백질 및 세포 찌꺼기가 상기 배양 기간 동안 침전물을 형성하므로, 상기 플레이트를 4500xg에서 10 분간 원심분리시키고 상등액을 LC-MS 분석 전에 와트만 96-웰 필터 플레이트(0.45 ㎛)를 통해 여과하였다. 샘플을 1,3-부탄다이올 형성에 대해 분석하였다.
도 6은 3-하이드록시부티르알데하이드를 기질로서 첨가한 경우 및 기질 없는 대조용 샘플 중의 1,3-BDO 농도를 도시한다. 상기 알콜 데하이드로게나제에 대한 GI 번호를 나타낸다.
도 7은 3-하이드록시부티릴-CoA를 기질로서 첨가한 경우 및 기질 없는 대조용 샘플 중의 1,3-BDO 농도를 도시한다. 상기 알콜 데하이드로게나제에 대한 GI 번호를 나타낸다. 함께 시험된 알데하이드 데하이드로게나제에 대한 GI 번호는 163762382이다.
실시예 III
중간체로서 4- 하이드록시부티릴 - CoA 를 사용하는 1,3- BDO 합성
본 실시예는 전구체로서 4-하이드록시부티릴-CoA를 사용하여 1,3-부탄다이올을 생산할 수 있는 미생물 유기체의 생성을 개시한다(도 3의 단계 A, B 및 E).
에스케리키아 콜라이를 도 3의 단계 A, B 및 E를 통해 경로를 조작하기 위해서 표적 유기체로서 사용한다. 에스케리키아 콜라이는 1,3-부탄다이올을 생산할 수 있는 비-천연 미생물의 생성에 양호한 숙주를 제공한다. 에스케리키아 콜라이는 유전자 조작이 가능하며 에탄올, 아세트산, 폼산, 락트산 및 숙신산과 같은 다양한 생성물들을 혐기성 또는 미세호기성 조건 하에서 유효하게 생산할 수 있는 것으로 공지되어 있다.
1,3-부탄다이올을 생산하도록 조작된 에스케리키아 콜라이 균주를 생성시키기 위해서, 앞서 개시된 바와 같이 개시된 경로(단계 A, B 및 E)에 사용된 상기 효소를 암호화하는 핵산들을 널리 공지된 분자 생물학 기법을 사용하여 에스케리키아 콜라이에서 발현시킨다(예를 들어 상기 Sambrook, 2001; 상기 Ausubel, 1999; 상기 Roberts et al., 1989 참조). 상당량의 4-하이드록시부티릴-CoA를 생산하도록 조작된 재조합 균주는 앞서 출원인들에 의해 개시되었으며(Burk et al., US 20090075351) 상기 제안된 경로를 1,3-부탄다이올에 삽입하기 위해 사용될 것이다.
더욱이, 각각 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제, 크로토나제 및 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성) 활성을 암호화하는 abfD(YP_3001396399.1), crt(NP_349318.1) 및 adhE2(AAK09379.1) 유전자들을 PA1/lacO 프로모터 하에서 pZE13 벡터(엑스프레시스, 독일 룰츠하임 소재) 내로 클로닝한다. 상기 플라스미드를 상기 대사산물로부터 1,3-부탄다이올 합성에 필요한 단백질 및 효소를 발현하기 위해서 4-하이드록시부티릴-CoA를 생산하는 재조합 에스케리키아 콜라이 균주 내로 형질전환시킨다.
생성되는 유전자 조작된 유기체를 당해 분야에 널리 공지된 과정에 따라 글루코스 함유 배지에서 배양한다(예를 들어 상기 Sambrook et al., 2001 참조). 상기 알라닌 경로 유전자의 발현은 폴리펩타이드 발현 또는 효소 활성의 측정에 대해 당해 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 노던 블럿, mRNA의 PCR 증폭, 면역 블럿팅을 사용하여 확인한다. 상기 발현된 효소의 효소 활성을 상기 개별적인 활성에 특이적인 분석들을 사용하여 확인한다. 1,3-부탄다이올을 생산하는 상기 조작된 에스케리키아 콜라이 균주의 능력을 HPLC, 기체 크로마토그래피-질량 분광측정(GCMS) 또는 액체 크로마토그래피-질량 분광측정(LCMS)을 사용하여 확인한다.
작용성 1,3-부탄다이올 합성 경로를 갖도록 조작된 미생물 균주를 상기 경로의 효율적인 이용을 위해 최적화에 의해 더욱 증대시킨다. 간단히, 상기 조작된 균주를 상기 외래 유전자들 중 어느 유전자가 속도 제한 수준으로 발현되는지를 결정하기 위해 평가한다. 발현을 예를 들어 추가적인 유전자 사본수의 도입에 의해, 상기 경로를 통해 유출을 제한할 수 있는 낮은 수준으로 발현된 임의의 효소에 대해 증가시킨다.
더욱 양호한 생산자를 생성시키기 위해서, 대사 모델링을 사용하여 생육 조건을 최적화한다. 모델링을 또한 상기 경로의 이용을 추가로 최적화하는 유전자 녹아웃의 디자인에 사용한다(예를 들어 제 US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 및 US 2004/0009466 호, 및 미국 특허 제 7,127,379 호 참조). 모델링 분석은 상기 대사가 1,3-부탄다이올의 보다 효율적인 생산을 향해 이동하는 세포 생육에 대한 영향들의 신뢰성 있는 예견을 허용한다. 하나의 모델링 방법은 2단 최적화 접근법인 OptKnock(Burgard et al., Biotechnol. Bioengineer. 84:647-657(2003))이며, 이를 집합적으로 1,3-부탄다이올의 보다 양호한 생산을 생성시키는 유전자 녹아웃의 선택에 적용한다. 적응 진화를 또한 사용하여, 예를 들어 아세틸-CoA 중간체 또는 1,3-부탄다이올 생성물의 보다 양호한 생산자를 생성시킬 수 있다. 적응 진화를 수행하여 생육과 생산 특징을 모두 개선시킨다(Fong and Palsson, Nat. Genet. 36:1056-1058(2004); Alper et al., Science 314:1565-1568(2006)). 상기 결과를 근거로, 후속의 모델링, 유전 공학 및 적응 진화 라운드를 상기 1,3-부탄다이올 생산자에 적용시켜 생산을 더욱 증가시킬 수 있다.
1,3-부탄다이올의 대규모 생산을 위해서, 상기 알라닌 경로 함유 유기체를 당해 분야에 공지된 배지를 사용하여 발효기에서 배양시켜 혐기성 조건 하에서 상기 유기체의 생육을 지원한다. 발효를 배치, 유가 또는 연속적인 방식으로 수행한다. 혐기성 조건은 먼저 상기 배지를 질소로 살포하고 이어서 배양 용기를 밀봉하여(예를 들어 플라스크를 격막 및 크림프-뚜껑으로 밀봉시킬 수 있다) 유지시킨다. 미세호기성 조건을 또한, 제한된 통기를 위해 작은 구멍을 제공함으로써 사용할 수 있다. 상기 배지의 pH를 산, 예를 들어 H2SO4의 첨가에 의해 7의 pH에서 유지시킨다. 상기 생육률을, 분광광도계(600 ㎚)를 사용하여 광학 밀도를 측정함으로써 측정하고, 글루코스 흡수율은 시간에 따른 탄소 원 고갈을 모니터함으로써 측정한다. 바람직하지 못한 알콜, 유기산, 및 잔류 글루코스와 같은 부산물들을, 글루코스 및 알콜의 경우 굴절률 검출기 및 유기산의 경우 UV 검출기를 사용하여, HPX-087 컬럼(바이오래드)과 함께 HPLC(시마주)에 의해 정량분석할 수 있다(Lin et al., Biotechnol. Bioeng., 775-779(2005)).
Figure 112011094766514-pct00001
Figure 112011094766514-pct00002
Figure 112015041832053-pct00026
Figure 112011094766514-pct00004
Figure 112011094766514-pct00005
Figure 112011094766514-pct00006
Figure 112011094766514-pct00007
Figure 112011094766514-pct00008
Figure 112011094766514-pct00009
Figure 112011094766514-pct00010
Figure 112011094766514-pct00011
Figure 112011094766514-pct00012
Figure 112011094766514-pct00013
Figure 112015041832053-pct00027
Figure 112011094766514-pct00015
Figure 112011094766514-pct00016
Figure 112011094766514-pct00017
Figure 112015041832053-pct00028
본 발명을 상기 개시된 실시태양들을 참고로 개시하였지만, 당해 분야의 숙련가들은 상기 상세히 나타낸 특정 실시예 및 연구들이 단지 본 발명을 예시함을 쉽게 알 것이다. 다양한 변형들을 본 발명의 진의로부터 이탈됨 없이 수행할 수 있음은 물론이다. 따라서, 본 발명은 단지 하기의 청구의 범위에 의해서만 제한된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENOMATICA, INC. <120> ORGANISMS FOR THE PRODUCTION OF 1,3-BUTANEDIOL <130> 066662-0297 <140> PCT/US2010/033300 <141> 2010-04-30 <150> 61/174,473 <151> 2009-04-30 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Euglena gracilis <400> 1 Met Thr Tyr Lys Ala Pro Val Lys Asp Val Lys Phe Leu Leu Asp Lys 1 5 10 15 Val Phe Lys Val 20

Claims (56)

1,3-부탄다이올(1,3-BDO)을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 아세토아세틸-CoA 리덕타제(케톤 환원)를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는, 1,3-BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체.
제 1 항에 있어서,
상기 아세토아세틸-CoA 리덕타제(케톤 환원)가 thrA, akthr2, hom6, hom1, hom2, fadB, fadJ, Hbd2, Hbd1, hbd, HSD17B10, phbB, phaB, Msed_1423, Msed_0399, Msed_0389, Msed_1993, adh, adhA, adh-A, mdh, ldhA, ldh 및 bdh로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는, 비-천연 미생물 유기체.
제 1 항에 있어서,
상기 1,3-BDO 경로가 하기 효소들로 이루어진 군 중에서 선택되는 일련의 1,3-BDO 경로 효소들을 포함하는, 비-천연 미생물 유기체:
(a) (1) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(케톤 환원) 및 (2) 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성); 및
(b) (1) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(케톤 환원); (2) 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알데하이드 형성); 및 (3) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제.
제 3 항에 있어서,
상기 일련의 1,3-BDO 경로 효소들이 (1) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(케톤 환원) 및 (2) 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성)를 포함하고, 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성)를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 추가로 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
제 4 항에 있어서,
상기 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성)가 adhE, adhE2, mcr, Rcas_2929, NAP1_02720, MGP2080_00535 및 FAR로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는, 비-천연 미생물 유기체.
제 3 항에 있어서,
상기 일련의 1,3-BDO 경로 효소들이 (1) 아세토아세틸-CoA 리덕타제(케톤 환원); (2) 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알데하이드 형성); 및 (3) 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제를 포함하고, 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알데하이드 형성) 또는 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 추가로 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
제 6 항에 있어서,
3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알데하이드 형성)를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산 및 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는, 비-천연 미생물 유기체.
제 6 항에 있어서,
상기 3-하이드록시부티르알데하이드 리덕타제가 alrA, ADH2, yqhD, bdhI, bdhII, adhA, 4hbd, adhI, P84067, mmsb, dhat 및 3hidh로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는, 비-천연 미생물 유기체.
제 6 항에 있어서,
상기 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알데하이드 형성)가 acr1, sucD, bphG, bld, adhE, Msed_0709, mcr, asd-2, Saci_2370, Ald 및 eutE로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화되는, 비-천연 미생물 유기체.
제 1 항에 있어서,
상기 미생물 유기체가 2, 3, 4 또는 5 개의 외래 핵산을 포함하고, 상기 핵산이 각각 1,3-BDO 경로 효소를 암호화하는, 비-천연 미생물 유기체.
제 1 항에 있어서,
상기 하나 이상의 외래 핵산이 이종 핵산인, 비-천연 미생물 유기체.
제 1 항에 있어서,
상기 비-천연 미생물 유기체가 배양 배지 중에 있고, 상기 배양 배지 중 산소의 양이 용존 산소 포화의 10% 미만인, 비-천연 미생물 유기체.
제 1 항에 있어서,
상기 미생물 유기체가 세균, 효모 또는 진균의 종인, 비-천연 미생물 유기체.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 비-천연 미생물 유기체를 포함하는 배양 배지.
제 14 항의 배양 배지 및 생합성된 1,3-BDO를 포함하는 조성물.
1,3-BDO를 생산하기 위해 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 비-천연 미생물 유기체를 배양하는 것을 포함하는 1,3-BDO의 생산 방법.
제 16 항에 있어서,
배양물 중의 다른 성분으로부터 1,3-BDO를 분리하는 것을 추가로 포함하는, 생산 방법.
제 17 항에 있어서,
상기 분리가 추출, 연속적인 액체-액체 추출, 투석 증발, 막 여과, 막 분리, 역삼투, 전기투석, 증류, 결정화, 원심분리, 추출 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 및 한외여과를 포함하는, 생산 방법.
제 18 항에 있어서,
상기 분리가 증류를 포함하는, 생산 방법.
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