CN108690851B

CN108690851B - 一种丁二烯生产菌及其生产丁二烯的方法

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Publication number: CN108690851B
Application number: CN201810542064.2A
Authority: CN
Inventors: 杨松; 杨靖; 张长太; 莫旭华; 朱丽萍
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2020-11-06
Anticipated expiration: 2038-05-30
Also published as: CN108690851A

Abstract

本发明涉及一种以甲醇为原料的丁二烯生产菌及其生产丁二烯的方法，属于工程菌构建技术领域。本发明提供的丁二烯生产菌属于甲基杆菌属，所述生产菌属于甲基杆菌属，所述生产菌由甲基杆菌经表达以下几种酶的外源基因导入修饰表达获得：丁二烯合成酶MTS或ISPS；巴豆醇单磷酸酯激酶IPK；巴豆醇激酶THK或MK或TK；以及辅酶A还原酶FAR或BLD‑BDH或ADHE2；所述甲基杆菌含有丝氨酸循环途径和乙酰丙二酰辅酶A途径。本发明提供的丁二烯生产菌能够以甲醇作为原料生产丁二烯，能够充分利用具有竞争力价格和供应充足的原料甲醇，通过微生物代谢，直接合成丁二烯产品，成本大大降低，有利于实现由甲醇合成丁二烯的工业化生产。

Description

一种丁二烯生产菌及其生产丁二烯的方法

技术领域

本发明涉及工程菌构建技术领域，具体涉及一种以甲醇为原料的丁二烯生产菌及其生产丁二烯的方法。

背景技术

1,3-丁二烯(下文称为丁二烯)是分子式为C₄H₆的有机化合物，由两个乙烯基构成，它是最简单的共轭二烯烃(图1)。它是一种容易液化的无色气体，有特殊气味。稍溶于水，溶于乙醇、甲醇，易溶于丙酮、乙醚和氯仿等。(https://en.wikipedia.org/wiki/1,3-Butadiene)丁二烯是一种重要的平台化合物，是用于生产合成橡胶(包括苯乙烯-丁二烯橡胶(SBR)、聚丁二烯(PB)、苯乙烯-丁二烯胶乳(SBL)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂(ABS)、丁腈橡胶和己二腈)的重要单体，其也用在制造Nylon-66(WHITE W C.Butadiene productionprocess overview[J].Chemico-biological interactions,2007,166(1-3):10-4)。

随着我国高性能轮胎、绿色轮胎日益增多，对于橡胶，尤其是高性能稀土聚丁二烯橡胶的需求量将日益增加。此外，随着国内电器电子行业的迅速发展，ABS树脂和HIPS对聚丁二烯橡胶的需求量也将进一步增加。近年来，我国丁二烯橡胶的表观消费量一直呈现递增的发展态势。预计到2020年对丁二烯的需求量将达到约320万t，依然有着较大的需求量，而其最直接的影响因素是供给少需求多(崔小明.国内外聚丁二烯橡胶市场分析[J].中国石油和化工经济分析,2014(07):48-51)。由于自然条件的限制，我国的天然橡胶资源一直处于供不应求的状态，进口依赖度较高，在2016年我国丁二烯橡胶的进口量为27.33万t，进口金额约3亿美元，进口金额消费较高(谭捷,刘博超等.国内聚丁二烯橡胶生产技术进展及市场分析[J].弹性体,2018,28(01):80-6)。

丁二烯的生产方法包括从通过石脑油裂解的C4馏分的提取方法、正丁烷和正丁烯的脱氢(Houdry方法)和正丁烯的氧化脱氢(O-X-D方法)。石脑油裂解的C4馏分的提取方法，通常作为蒸汽裂化过程的副产品产生，蒸馏成粗制丁二烯流，并经萃取蒸馏纯化。目前，工业上丁二烯的主要生产方法是石脑油裂解的C4馏分的提取方法，该方法受石油资源的限制，超过95％的丁二烯采用石化路线制备，这种生产方式不可持续，环境危害大。随着原油价格的剧烈波动，丁二烯的市场价格波动巨大，其供应存在不稳定性(WHITEW C.Butadieneproduction process overview[J].Chemico-biological interactions,2007,166(1-3):10-4)。此外，通过正丁烷和正丁烯的脱氢和正丁烯的氧化脱氢的生产方法不但在热力学上不利，而且，作为吸热反应，需要高温和低压的条件来生产高产率丁二烯，并且因此不适合生产丁二烯的工业化过程。

在追求更加可持续的化学品生产工艺过程中，利用微生物从可再生原料来生产丁二烯将会是一个重大的进步。目前为止，微生物合成高附加值产品主要依赖六碳糖等作为碳源，然而由于大规模化生产存在与人畜争粮争地的原料瓶颈问题，以及纤维素转化成糖类技术瓶颈，利用微生物合成丁二烯仍成本过高，目前并没有一种成本低的高效合成丁二烯的生产方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种丁二烯生产菌及其生产丁二烯的方法。本发明提供的丁二烯生产菌能够以甲醇作为原料生产丁二烯，能够充分利用具有竞争力价格和供应充足的原料甲醇，通过微生物代谢，直接合成丁二烯产品，成本大大降低，有利于实现由甲醇合成丁二烯的工业化生产。

本发明提供了一种丁二烯生产菌，所述生产菌属于甲基杆菌属，所述生产菌由甲基杆菌经表达以下几种酶的外源基因导入修饰表达获得：丁二烯合成酶MTS或ISPS；巴豆醇单磷酸酯激酶IPK；巴豆醇激酶THK或MK或TK；以及辅酶A还原酶FAR或BLD-BDH或ADHE2；所述BLD-BDH为BLD和BDH两种酶同时表达；

所述甲基杆菌含有丝氨酸循环途径和乙酰丙二酰辅酶A途径。

优选的是，所述生产菌由甲基杆菌经表达以下几种酶的外源基因导入修饰表达获得：丁二烯合成酶MTS；巴豆醇单磷酸酯激酶IPK；巴豆醇激酶THK和辅酶A还原酶FAR。

优选的是，所述甲基杆菌包括扭脱甲基杆菌AM1、扭脱甲基杆菌PA1或耐辐射甲基杆菌。

优选的是，所述辅酶A还原酶FAR来自Marinobacter manganoxydans或Hahellachejuensis。

优选的是，所述丁二烯合成酶MTS的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述丁二烯合成酶ISPS的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的是，所述巴豆醇单磷酸酯激酶IPK的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的是，所述巴豆醇激酶THK的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述巴豆醇激酶MK的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述巴豆醇激酶TK的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

优选的是，所述巴豆醇激酶THK的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

优选的是，来自Marinobacter manganoxydans的辅酶A还原酶FAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；来自Hahella chejuensis的辅酶A还原酶FAR的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示的序列；BLD的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；BDH的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；ADHE2的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的序列。

本发明还提供了一种基于上述技术方案所述丁二烯生产菌的丁二烯生产方法，包括以下步骤：以甲醇为原料对所述丁二烯生产菌进行培养。

本发明提供了一种丁二烯生产菌，所述生产菌使用甲基杆菌，能够代谢甲醇并产生巴豆酰辅酶A这一中间产物，辅酶A还原酶FAR或辅酶A还原酶丁醛脱氢酶-丁醇脱氢酶BLD-BDH或辅酶A还原酶醛醇脱氢酶ADHE2将巴豆酰辅酶A还原成巴豆醇，巴豆醇被巴豆醇激酶磷酸化成巴豆醇单磷酸酯、巴豆醇单磷酸酯激酶催化巴豆醇单磷酸酯磷酸化生成巴豆醇焦磷酸酯，丁二烯合成酶催化巴豆醇焦磷酸酯生成丁二烯。本发明提供的丁二烯生产菌能够以甲醇作为原料生产丁二烯，能够充分利用具有竞争力价格和供应充足的原料甲醇，通过微生物代谢，直接合成丁二烯产品，成本大大降低，有利于实现由甲醇合成丁二烯的工业化生产。

附图说明

图1为丁二烯的结构式及分子模型图；

图2为本发明提供的丁二烯合成途径示意图；

图3为本发明提供的高通量筛选方法图；

图4为本发明提供的同源建模分析突变酶催化效力提高机制图；

图5为本发明提供的IPK酶活检测级联反应图；

图6为本发明提供的测定丁二烯含量的标准曲线。

具体实施方式

所述甲基杆菌含有丝氨酸循环途径和乙酰丙二酰辅酶A途径。

在本发明中，所述生产菌有优选由甲基杆菌经外源基因导入修饰表达：丁二烯合成酶MTS；巴豆醇单磷酸酯激酶IPK；巴豆醇激酶THK和辅酶A还原酶FAR。

本发明所述甲基杆菌能够代谢甲醇并产生巴豆酰辅酶A这一中间产物，甲基杆菌代谢甲醇经过一碳化合物的氧化模块将甲醇催化氧化为甲醛，然后甲醛从周质空间进入细胞质中，经过一碳中间代谢物(甲醛)的异化模块产生甲酸，甲酸一部分在甲酸脱氢酶的作用下被氧化成CO₂，产生用于细胞生长的能量和NADH，另一部分甲酸转化成次亚甲基-四氢叶酸，经三个催化反应(FtfL，Fch和MtdA)生成亚甲基-四氢叶酸，然后进入一碳中间物(甲醛或甲酸)的同化模块，经丝氨酸循环生成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A经乙酰丙二酰辅酶A途径(EMCP)在三个酶连续催化作用下生成巴豆酰辅酶A，将巴豆酰辅酶A作为前体物异源构建丁二烯生产途径。

本发明所述丁二烯合成途径包括4步反应(如图2所示)：以巴豆酰辅酶A为前体物，本发明辅酶A还原酶(辅酶A还原酶FAR或丁醛脱氢酶-丁醇脱氢酶BLD-BDH或醛醇脱氢酶ADHE2)将巴豆酰辅酶A还原成巴豆醇；巴豆醇被巴豆醇激酶(THK或MK或TK)磷酸化成巴豆醇单磷酸酯；巴豆醇单磷酸酯激酶IPK催化巴豆醇单磷酸酯磷酸化生成巴豆醇焦磷酸酯；丁二烯合成酶MTS或ISPS催化巴豆醇焦磷酸酯生成丁二烯。

本发明通过将辅酶A还原酶FAR或丁醛脱氢酶-丁醇脱氢酶BLD-BDH或醛醇脱氢酶ADHE2，以及丁二烯合成酶、巴豆醇单磷酸酯激酶和巴豆醇激酶相应的基因转入甲基杆菌，实现丁二烯生产菌的构建，所述丁二烯生产菌能够以甲醇作为生产原料，实现丁二烯的工业化生产。本发明对上述酶对应的外源基因(如far、thim、ipk或mts)的转化导入方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的基因转化方法进行转化即可。在本发明中，上述技术方案所述酶对应的外源基因包括far(辅酶A还原酶FAR)、bld(丁醛脱氢酶BLD)、bdh(丁醇脱氢酶BDH)、adhe2(醛醇脱氢酶ADHE2)、ipk(巴豆醇单磷酸酯激酶IPK)、mts(丁二烯合成酶MTS)、isps(丁二烯合成酶ISPS)、thim(巴豆醇激酶THK)、erg12(巴豆醇激酶MK)、thik(巴豆醇激酶TK)。

在本发明中，所述甲基杆菌优选包括扭脱甲基杆菌AM1、扭脱甲基杆菌PA1或耐辐射甲基杆菌。本发明对所述扭脱甲基杆菌AM1、扭脱甲基杆菌PA1或耐辐射甲基杆菌的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的相应菌种市售机构进行购买即可。在本发明中，所述扭脱甲基杆菌AM1优选来源于青岛农业大学，杨松课题组，所述扭脱甲基杆菌PA1(Methylobacterium extorquens PA1)和耐辐射甲基杆菌(Methylobacteriumradiotolerans)优选从德国微生物和菌种保藏中心(DSMZ)(http://www.dsmz.de/)购买。

在本发明中，所述丁二烯合成酶MTS的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述丁二烯合成酶ISPS的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明中，所述巴豆醇单磷酸酯激酶IPK的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明中，所述巴豆醇激酶THK的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述巴豆醇激酶MK的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述巴豆醇激酶TK的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。在本发明中，所述巴豆醇激酶THK优选进行基因突变，突变后的巴豆醇激酶的氨基酸序列更优选如SEQ ID NO.12所示。

在本发明中，所述辅酶A还原酶FAR来自Marinobacter manganoxydans或Hahellachejuensis。在本发明中，来自Marinobactermanganoxydans的辅酶A还原酶FAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；来自Hahella chejuensis的辅酶A还原酶(FAR)的氨基酸序列如SEQID NO.8所示的序列；丁醛脱氢酶BLD的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；丁醇脱氢酶BDH的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；醛醇脱氢酶ADHE2的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的序列。

本发明还提供了一种基于上述技术方案所述丁二烯生产菌的丁二烯生产方法，包括以下步骤：以甲醇为原料对上述技术方案所述丁二烯生产菌进行培养。本发明对所述丁二烯生产菌的培养条件没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规甲基杆菌属培养条件即可，如25～40℃，培养40～120小时收集得到丁二烯。本发明对所述培养基没有特殊的限定，优选采用Hypho培养基或NB培养基，所述NB培养基包括蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L和氯化钠5g/L。在本发明中，所述Hypho培养基的配制方法优选如下：大量元素(2X)：大量元素A：5.06g/LK₂HPO₄，5.17g/LNaH₂PO₄；大量元素B：0.4095g/LMgSO₄·7H₂O，1g/L(NH₄)₂SO₄；若配制固体培养基，则在大量元素B中，加入琼脂30g/L。单独灭菌，使用时按照1：1比例混匀。微量元素：微量元素A和微量元素B分开储存，配置100mL 1000X微量元素。微量元素A：1gNa₂EDTA，0.1g FeSO₄·7H₂0，用1MNaOH调pH至4；微量元素B：0.14g CaCl₂·2H₂O，0.1gMnCl₂·4H₂O，0.02g Na₂MoO₄·2H₂O，0.03g CuSO₄·5H₂O，0.32g CoCl₂·6H₂O，0.44gZnSO₄·7H₂O，用HCl调pH到1-2。微量元素需要过滤除菌，不能高压灭菌，配好之后放在4℃保存，最长可使用两周。使用时加入1X的微量元素A和微量元素B，甲醇的最终浓度为125mM。本发明优选采用固相微萃取纤维(SPME fiber)对菌体培养液顶空的丁二烯气体进行萃取取样。

本发明利用甲醇为碳源的甲基杆菌作为研究对象，利用代谢工程、合成生物学等手段，在其中外源引入丁二烯合成途径，可以实现由甲醇合成丁二烯的工业化构想。本发明直接以甲醇为碳源，由于甲醇的生物毒性，在发酵生产的前期，降低了除菌操作的成本，在运行过程中，能够大大地降低了培养基染菌的风险，保证产品质量，减少倒罐、停产的发生，对于工业发酵具有极大的经济价值。此外，在后期的分离环节中，由于甲基杆菌培养所使用的培养基是加入甲醇的非糖基培养基，相比于成分复杂的糖基培养基，分离成本大大降低。本发明利用具有竞争力的价格和供应充足的原料甲醇，通过微生物代谢，直接合成丁二烯产品，并且整个生产过程条件温和、污染小，发酵中不易染菌。

本发明在生产菌构建生产过程中，涉及对各中间产物和丁二烯的浓度的检测，通过所述检测能够实现高产菌的筛选。本发明对所述中间产物和丁二烯浓度的检测方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的检测方法即可。具体地：

本发明所述巴豆醇浓度检测方法优选包括以下步骤：

样品运用安捷伦5975B/6890N气相质谱检测，色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25um film；Restek,Bellefonte,PA,USA)。使用超高压纯氮作为载气，流速为1mL/min，上样体积为1μL，使安捷伦7890自动进样，无分流模式自动进样。进样口和传输管的温度设为280℃。温度梯度为：60℃保持0.25分钟，以5℃/min速度增加到280℃，保持10min；离子源和四级杆的温度分别设为250℃和150℃。色谱图用安捷伦数据分析软件进行分析。

本发明所述巴豆醇单磷酸酯和巴豆醇焦磷酸酯浓度检测优选包括以下步骤：

(1)质谱条件：液相质谱(LC-QQQ-MS)用于靶向检测中心代谢途径的小分子代谢物，采用多反应监控模式设置母离子和子离子。ESI设置条件为:毛细管电压：4000V，碰撞电压：135V，气体温度300℃，喷雾器35psig，气体流速为10L/min。LC-QExactive-MS仪器用于对未知化合物进行MS/MS检测，设置条件如下：喷雾电压设置为+3.2KV，鞘气压力为35arb，辅助气压力为10arb，毛细管温度为320℃，加热器温度为350℃。

(2)色谱条件：

样品在Advance Bio Glycan色谱柱(150×2.1mm,1.8μm；USA)中分离。流动相A为乙腈/水(5:95v/v)，含20mM醋酸铵和40mM氨水。流动相B由乙腈/水(95:5v/v)组成。洗脱梯度为:0～2分钟，80％B；2–5分钟，80％–60％B；5–6分钟，60％–5％B；6–8分钟，5％B；8–8.01分钟，5％–80％B；8.01–12分钟，80％B，总共的洗脱时间为12分钟，流速为0.3mL/min，上样体积为3μL。数据处理均使用QualitativeAnalysis B.06.00软件

本发明所述丁二烯浓度检测优选包括以下步骤：

(1)丁二烯标准样制备方法

丁二烯标品浓度为2mg/mL，分别上样体积为0，0.02，0.05，0.10，0.14，0.2，0.3μL制得丁二烯标准样

(2)固相微萃取(SPME)纤维萃取取样

由于丁二烯在培养条件下基本完全存在于气相，所以在本文中采用固相微萃取纤维(SPME fiber)对实施例中得到的酶反应液或菌体培养液顶空的丁二烯气体进行萃取取样。具体的方法为:将样品瓶置于37℃培养箱反应后，再将SPME fiber穿破样品瓶的橡胶塞进行萃取取样5min。注意萃取时间对分析结果有较大的影响，所以应该严格控制萃取的时间。

(3)丁二烯浓度检测

用SPME f'iber萃取样品后，应立即将fiber插入气象色谱仪(GC-7900，中国)进样口中进行检测。色谱分析方法为:以氦气作为载气，流速为6.2mL/min；色谱柱采用Rt-AluminaBOND/Na2SO4(50m×0.32mm×5.0μm)，初始柱温40℃，以30℃/min的速度升温至130℃，保持10min，停止检测；FID检测器温度200℃；进样口温度200℃。此色谱条件下丁二烯的保留时间约在8.3-8.6min之间。用上述方法制得的丁二烯标准样品的含量的标准曲线如图6所示。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种丁二烯生产菌及其生产丁二烯的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

丁二烯合成途径包括4步反应(如图2所示)：

1)以巴豆酰辅酶A为前体物，本发明辅酶A还原酶(辅酶A还原酶Far或丁醛脱氢酶-丁醇脱氢酶BLD-BDH或醛醇脱氢酶ADHE2)将巴豆酰辅酶A还原成巴豆醇；

2)巴豆醇被巴豆醇激酶(THK或MK或TK)磷酸化成巴豆醇单磷酸酯；

3)巴豆醇单磷酸酯激酶IPK催化巴豆醇单磷酸酯磷酸化生成巴豆醇焦磷酸酯；

4)丁二烯合成酶MTS或ISPS催化巴豆醇焦磷酸酯生成丁二烯。

(1)针对第1步反应，根据底物巴豆酰辅酶A的结构特点和酶催化反应机理，本发明分别筛选来自糖丁酸梭状芽胞杆菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)的bld-bdh，来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的adhE2，来自深海锰氧化菌(Marinobactermanganoxydans)的Mmfar，来自河氏菌(Hahella chejuensis)的Hcfar作为候选基因，在含有助溶标签TRX的pET32M中构建含以上基因的重组质粒(助溶标签在N端)，在大肠杆菌(E.coliBL21-Z)中诱导表达、分离纯化获得四个重组酶，即丁醛脱氢酶-丁醇脱氢酶(butyraldehyde dehydrogenase-butanol dehydrogenase,BLD-BDH)，醛醇脱氢酶(butyraldehyde and butanol dehydrogenase,ADHE2)，两个脂酰辅酶A还原酶(FattyAcyl-CoAReductase,FAR)；设计体外酶活反应体系，GC-MS直接比较分析产物巴豆醇的生成量，发现来源于深海锰氧化菌(M.manganoxydans)的脂酰辅酶A还原酶FAR具有最高的催化效力；酶动力学研究进一步表征FAR催化底物巴豆醇的K_m和k_cat值分别是5.48±1.27mM和0.05±0.009s^-1，3h其转化合成巴豆醇的转化率是1％，而催化本源底物十六烷酰辅酶A(palmitoyl-CoA)的K_m是4.0±0.3μM，V_max是197±8nmol/min/mg；为了解析该双功能酶的催化巴豆酰辅酶A效力偏低的原因，分别以巴豆酰辅酶A和巴豆醛作为底物，酶活分析发现FAR催化巴豆酰辅酶A合成巴豆醛是主要限速反应，而巴豆醛合成巴豆醇的反应速率较快，这为后续改造提高FAR催化能力，提供重要信息基础。

(2)针对第2步反应，根据与巴豆醇分子结构相似性和酶催化反应机理，选择来源于大肠杆菌(Escherichia coli.K-12)的thim基因编码的羟乙基噻唑激酶(hydroxyethylthiazole kinase)，肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)thik基因编码的硫胺素激酶(thiamine kinase)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)erg12基因编码的甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase)作为候选酶，对候选基因在甲基细菌中过表达并进行1mM巴豆醇底物饲喂，检测细胞内巴豆醇单磷酸酯的积累，发现来源于大肠杆菌的基因thim编码的羟乙基噻唑激酶催化巴豆醇生成巴豆醇单磷酸酯的产量最高，此外转化空质粒pCM80的重组子也产生少量巴豆醇单磷酸酯，体外检测甲基细菌基因组上gck的重组酶活性，证明该酶可能具有一定催化混乱性；体外酶活动力学分析酶THK，该激酶对于巴豆醇的催化效力K_m值7.23±0.79mM，k_cat值是1.24±0.26s^-1，6h时间内巴豆醇到巴豆醇单磷酸酯的转化率是22.4％。

为进一步提高该酶催化效力，通过酶定向进化策略，高通量筛选获得酶催化效率提高的菌株，具体筛选策略(图3)如下：1)首先对基因thim进行易错PCR，获得该基因的易错突变库；2)构建突变重组子库；3)在48孔板上培养突变菌株，指数初期加200μM浓度的巴豆醇培养至指数后期，取上清液加入高锰酸钾作为颜色指示剂，上清液中被酶THK催化后剩余的巴豆醇与高锰酸钾发生氧化还原反应，产生颜色变化；4)用酶标仪检测其OD，进行高通量筛选OD值最高(即高锰酸钾反应量最小)的菌株；5)将获得的酶催化活性提高的突变序列重组酶进行体外酶活检测，确定其酶的催化活性的提高。

高通量筛选的结果：通过分析2141个突变株，筛选获得1个正突变株，其THK的氨基酸序列在82位处M(甲硫氨酸)变成V(缬氨酸)，突变序列重组酶体外酶活研究证明生成巴豆醇单磷酸酯的转化率提高10倍，利用同源建模解析其催化效力提高的可能机制是：M82与M28是两个临近的甲硫氨酸，具有强疏水性相互作用和明显的范德华力，这个作用限制了与底物作相用的分支环的柔性，并且对该分支环具有的反向拉力使底物孔道变大，不利于小底物分子的结合催化，而M82V这一突变消除了强疏水性相互作用和明显的范德华力，促进了与底物分子的结合，提高了酶催化效率(图4)。

M82V这一突变消除了强疏水性相互作用和明显的范德华力，以该突变酶作为出发模板，一方面进一步通过易错PCR和高通量筛选策略开展定向进化研究，另一方面对突变点进行定点饱和突变，研究是否可能进一步提高催化效率。

(3)针对第3步反应，根据与巴豆醇单磷酸酯结构的相似性和酶催化反应机理，选择来自古细菌(Methanocaldococcus jannaschii，Methanocaldococcusthermautotrophicus,Thermoplasma acidophilum)的异戊烯基磷酸激酶(isopentenylphosphatekinase，IPK)，该酶能够催化异戊烯基磷酸酯(isopentenylphosphate，IP)磷酸化生成异戊烯焦磷酸酯(isopentenyl diphosphate，IPP)，以质粒pET32M作为骨架构建重组质粒pET32M-ipk，在大肠杆菌(Escherichia coliBL21-Z)中表达、纯化，以巴豆醇单磷酸酯作为底物，体外建立级联反应(图5)，即：巴豆醇单磷酸酯在纯化的异戊烯基磷酸激酶催化下和ATP反应生成巴豆醇焦磷酸酯和ADP，ADP和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)在丙酮酸激酶的催化下生成ATP和丙酮酸，丙酮酸和NADH在乳酸脱氢酶的催化下生成乳酸和NAD⁺，通过340nm下检测NADH的下降表征IPK催化巴豆醇单磷酸酯的能力，酶动力学分析显示其催化巴豆醇单磷酸酯的K_m和k_cat值分别是1.28±0.5mM和127.94±30.34s^-1，同时我们通过LC-MS检测是否确实有巴豆醇焦磷酸酯的生成，进而验证该催化反应产物的正确性，体外酶活结果在6h时间内巴豆醇单磷酸酯生成巴豆醇焦磷酸酯的转化率是57.2％。

(4)针对第4步反应，烯萜合成酶(即丁二烯合成酶)能够催化作用于焦磷酸酯键，去除焦磷酸，同时发生环化、氢离子迁移等重排，生成各种烯萜化合物，前期文献报道异戊烯焦磷酸IPP生成异戊二烯是在来源于银白杨(Populus alba)，山葛(Pueraria montana)物种的异戊二烯合成酶(isoprene synthase)的催化下产生，另外有文献报道来源于蓝桉树(Eucalyptusglobulus)物种的单烯萜合成酶(monotepene synthase)能催化香叶基焦磷酸酯生成烯萜醇类的芳樟醇(linalool)，考虑分子结构相似度，我们首选ISPS和MTS作为候选酶。在含有助溶标签TRX的pET32M中构建含mts基因的重组质粒(助溶标签在N端)，大肠杆菌培养和优化诱导条件后，但始终是包涵体蛋白，进而采用含有信号肽片段22个氨基酸长度的pET25b质粒(助溶标签在N端)，仍然无法获得可溶性蛋白，最终我们选择利用含有SUMO标签的pET28a构建重组质粒，发现在0.5mM IPTG，20℃，220rpm的诱导条件下，有一定量可溶性蛋白出现，Westenblotting分析确定该蛋白是目的条带，成功在3L菌液中纯化出5.4mg的MTS，体外酶活结果在6h时间内巴豆醇焦磷酸酯生成丁二烯的转化率是0.06％。

实施例2

承接实施例1的实验操作，从巴豆酰辅酶A到丁二烯体外一锅反应的构建。

选择每步催化效率最高的酶构建一锅反应体系，分别是FAR(来自Marinobactermanganoxydans)、THK、IPK和MTS这四种酶，首先分别优化了四个酶反应的pH，pH梯度是6、6.5、7、7.5、8、8.5和9，发现pH在8.0时多数酶催化生成各自目标产物最高。优化了四个酶反应的温度，温度梯度为：29.5℃、32℃、34.5℃、37℃、39.5℃、42℃和44.5℃。发现在39.5℃多数酶催化生成目标产物最高。

在最优温度是39.5℃和pH是8.0的条件下，优化了各个酶在一锅反应中的最优酶量，酶量梯度为0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL和1.5mg/mL。发现FAR在1mg/mL的浓度时，催化产生的目标产物已经达到了较高值。THK、IPK和MTS的分别是1mg/mL、0.5mg/mL和1.5mg/mL。

在以上优化的条件下，加入4mM的巴豆酰辅酶A，反应6h后测得丁二烯产量为2.63ng/mL，在反应3h时再补加一次各反应所需的酶，丁二烯产量提高至4.15ng/mL。

(6)将这四步反应所需的基因之间用RBS连接，构建在pCM80质粒上，电转入扭脱甲基杆菌AM1，在AM1体内过表达这四步反应所需的基因，培养基加入123mM的甲醇，培养至至指数期收集细胞。破壁获得粗酶液，然后用粗酶液外加4mM巴豆酰辅酶A，6h测得丁二烯产量为1.03ng/mL。

实施例3

在扭脱甲基杆菌AM1(Methylobacterium extorquens AM1)表达far+thim+ipk+mts这四个基因，每两个基因间用RBS连接。构建BamHI酶切位点+far+RBS+thim+RBS+ipk+RBS+mts+SacI酶切位点的目的基因片段，同时对该目的基因片段和pCM80进行分步酶切，将目的基因和质粒骨架通过酶切位点BamHI和SacI连接后，及得到质粒pYJ。然后点转入扭脱甲基杆菌AM1中，构建得菌株M.extorquensAM1-pYJ。接种菌株AM1-pYJ制得种子液，然后进行小瓶培养，具体的小瓶培养条件为在50mL厌氧小瓶中以10mL带有10ug/mL四环素的Hypho培养基在30℃，200rpm的摇床避光密封培养70h。接种量的标准为以OD₆₀₀＝0.8的种子液接种1mL，上述培养的菌体生长状况用吸光度OD₆₀₀来表征；丁二烯产量用单位体积菌液，单位OD₆₀₀值的菌体产生的丁二烯质量来表征(ng/m1/OD₆₀₀)。丁二烯产量的测定方法参照专利实验方法中描述的方法。经过70h培养后，构建的菌株AM1-pYJ的丁二烯产量为1.7ng/m1/OD₆₀₀。

Hypho培养基：

大量元素(2X)：大量元素A：5.06g/LK₂HPO₄，5.17g/LNaH₂PO₄；大量元素B：0.4095g/LMgSO₄·7H₂O，1g/L(NH₄)₂SO₄；若配制固体培养基，则在大量元素B中，加入琼脂30g/L。单独灭菌，使用时按照1：1比例混匀。

微量元素：微量元素A和微量元素B分开储存，配置100mL 1000X微量元素。微量元素A：1gNa₂EDTA，0.1gFeSO₄·7H₂0，用1MNaOH调pH至4；微量元素B：0.14g CaCl₂·2H₂O，0.1gMnCl₂·4H₂O，0.02gNa₂MoO₄·2H₂O，0.03g CuSO₄·5H₂O，0.32g CoCl₂·6H₂O，0.44g ZnSO₄·7H₂O，用HCl调pH到1-2。微量元素需要过滤除菌，切记不能高压灭菌，配好之后放在4℃保存，最长可使用两周。使用时加入1X的微量元素A和微量元素B，甲醇的最终浓度为125mM。

实施例4

(1)在扭脱甲基杆菌PA1(Methylobacterium extorquens PA1)表达far+thim+ipk+mts这四个基因，扭脱甲基杆菌PA1的培养基、培养方法、相关基因操作和相关菌种的构建方法同实施例4的甲基扭脱杆菌AM1相同。采用实施例3中构建的pYJ质粒，将pYJ质粒用电击转化法导入到扭脱甲基杆菌PA1中，并筛选得到带有pYJ质粒的扭脱甲基杆菌PA1，PA1-pYJ。具体的构建方法和培养方法与实施例3所述的方法相同。经过70h培养后，PA1-pYJ的丁二烯产量为1.2ng/ml/OD₆₀₀。

实施例5

(2)耐辐射甲基杆菌(Methylobacterium radiotolerans)表达far+thim+ipk+mts这四个基因，耐辐射甲基杆菌的培养基、培养方法、相关基因操作和相关菌种的构建方法同实施例3的甲基扭脱杆菌AM1相同。采用实施例3中构建的pYJ质粒，将pYJ质粒用电击转化法导入到耐辐射甲基杆菌中，并筛选得到带有pYJ质粒的耐辐射甲基杆菌，MR-pYJ。具体的构建方法和培养方法与实施例3所述的方法相同。经过70h培养后，MR-pYJ的丁二烯产量为0.9ng/ml/OD₆₀₀。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种丁二烯生产菌及其生产丁二烯的方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 582

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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<211> 608

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Glu Lys Pro Lys Val Ser Ser Glu Gln Val Ala Phe Ala Ala Ile Met

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660

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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20 25 30

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Ser Asp Glu Gln Val Val Gly Val Val Gly Asp Leu Ala Gln Pro Met

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Leu Gly Val Ser Glu Lys Asp Ala Ala Met Leu Arg Gly Lys Val Gly

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210 215 220

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645 650 655

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 11

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

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565 570 575

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<210> 12

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Gln Val Asp Leu Leu Gly Ser Ala Gln Ser Ala His Ala Leu His

1 5 10 15

Leu Phe His Gln His Ser Pro Leu Val His Cys Met Thr Asn Asp Val

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35 40 45

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50 55 60

Ser Ala Leu Leu Ile Asn Val Gly Thr Leu Thr Gln Pro Arg Ala Gln

65 70 75 80

Ala Val Arg Ala Ala Val Glu Gln Ala Lys Ser Ser Gln Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Leu Asp Pro Val Ala Val Gly Ala Leu Asp Tyr Arg Arg His Phe

100 105 110

Cys His Glu Leu Leu Ser Phe Lys Pro Ala Ala Ile Arg Gly Asn Ala

115 120 125

Ser Glu Ile Met Ala Leu Ala Gly Ile Ala Asn Gly Gly Arg Gly Val

130 135 140

Asp Thr Thr Asp Ala Ala Ala Asn Ala Ile Pro Ala Ala Gln Thr Leu

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Ala Arg Glu Thr Gly Ala Ile Val Val Val Thr Gly Glu Met Asp Tyr

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Cys His Trp Met Lys Gln Ala Gly Glu Arg Ala Val Ala Arg Ser Glu

225 230 235 240

Gly Pro Gly Ser Phe Val Pro His Phe Leu Asp Ala Leu Trp Gln Leu

245 250 255

Thr Gln Glu Val Gln Ala

260

Claims

1.一种丁二烯生产菌，其特征在于，所述生产菌属于甲基杆菌属，所述生产菌由甲基杆菌经表达以下几种酶的外源基因导入修饰表达获得：丁二烯合成酶MTS；巴豆醇单磷酸酯激酶IPK；巴豆醇激酶THK和辅酶A还原酶FAR；所述丁二烯合成酶MTS的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，利用含有SUMO标签的pET28a表达MTS；所述巴豆醇单磷酸酯激酶IPK的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述巴豆醇激酶THK的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述辅酶A还原酶FAR来自Marinobacter manganoxydans，来自Marinobacter manganoxydans的辅酶A还原酶FAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述甲基杆菌为扭脱甲基杆菌AM1(Methylobacterium extorquens AM1)、扭脱甲基杆菌PA1(Methylobacterium extorquens PA1)或耐辐射甲基杆菌(Methylobacteriumradiotolerans)；

所述甲基杆菌含有丝氨酸循环途径和乙酰丙二酰辅酶A途径。

2.一种基于权利要求1所述丁二烯生产菌的丁二烯生产方法，包括以下步骤：以甲醇为原料对所述丁二烯生产菌进行培养。