CN104822831A - 1,4丁二醇的制造方法、微生物以及基因 - Google Patents

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Abstract

一种能够经济地获得1,4丁二醇的新制造方法，其利用微生物及/或其培养物，并经由乙酰CoA、乙酰乙酰CoA、3-羟基丁酰CoA、巴豆酰CoA、4-羟基丁酰CoA来制造1,4丁二醇。所述微生物包含(a)具有序列号1的碱基序列的基因；(b)具有在序列号1的碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于序列号1的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；(c)与相对于具有序列号1所记载的碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因的任一个基因，并且还包含(d)具有序列号2至9的碱基序列的基因；(e)具有在序列号2至9的碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于原碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；(f)与相对于具有序列号2至9的碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因的任一个以上基因。

Description

1,4丁二醇的制造方法、微生物以及基因
技术领域
本发明涉及1,4丁二醇的制造方法、微生物以及基因。
背景技术
近年来，从化石资源枯竭及全球变暖对策等的观点，以可再生资源为原料的化合物制造工艺受到关注。尤其是，以生物质作为原料并利用生物化学工艺来制造各种聚合物原料化合物或化学品原料化合物的技术，即所谓的生物炼制被广泛研究。
作为被期待进行生物质原料转化的化合物，可举出1,4丁二醇。1,4-丁二醇被广泛用于精密有机化学品的合成原料、聚酯及工程塑料的单体单位等，其市场规模大。因此，对于以生物质等可再生资源为原料并利用生物化学工艺来高效制造1,4丁二醇的制造方法的要求在提高。
作为利用生物化学工艺来制造1,4丁二醇的制造方法，例如可举出专利文献1和2以及非专利文献1记载的方法。
专利文献1：(日本)专利第4380704号公报
专利文献2：国际公布2008/115840号公报
非专利文献1：Harry Yim et al.,Metabolic engineering of Escherichia coli for directproduction of 1,4-butanediol,Nature Chemical Biology,7,445-452(2011).
发明内容
<本发明所要解决的技术问题>
然而，专利文献1和2及非专利文献1记载的方法的工艺复杂。
针对上述问题，本发明提供一种制造1,4丁二醇的新制造方法，其能够经济地获得1,4丁二醇。
<用于解决技术问题的方案>
本发明包括以下内容。
[1]一种利用微生物及/或其培养物制造1,4丁二醇的制造方法，其包括：
(1)将乙酰CoA转换成乙酰乙酰CoA的工序；
(2)将乙酰乙酰CoA转换成3-羟基丁酰CoA的工序；
(3)将3-羟基丁酰CoA转换成巴豆酰CoA的工序；
(4)将巴豆酰CoA转换成4-羟基丁酰CoA的工序；
(5)将4-羟基丁酰CoA转换成1,4-丁二醇的工序，
作为催化所述工序(4)的酶的编码基因，所述微生物包含以下基因的任一个：
(a)具有序列号1的碱基序列的基因；
(b)具有在序列号1的碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于序列号1的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(c)与相对于具有序列号1所记载的碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因，
并且，作为催化所述工序(1)～(3)、(5)的任一个的酶的编码基因，所述微生物包含以下基因的任一个以上：
(d)具有序列号2至9的任一个碱基序列的基因；
(e)具有在序列号2至9的任一个碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于原碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(f)与相对于具有序列号2至9的任一个碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因。
[2]一种微生物，其具有通过以下工序来制造1,4丁二醇的能力，
所述工序包括：
(1)将乙酰CoA转换成乙酰乙酰CoA的工序；
(2)将乙酰乙酰CoA转换成3-羟基丁酰CoA的工序；
(3)将3-羟基丁酰CoA转换成巴豆酰CoA的工序；
(4)将巴豆酰CoA转换成4-羟基丁酰CoA的工序；
(5)将4-羟基丁酰CoA转换成1,4-丁二醇的工序，
作为对所述工序(4)进行催化的酶的编码基因，所述微生物包含以下基因的任一个：
(a)具有序列号1的碱基序列的基因；
(b)具有在序列号1的碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于序列号1的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(c)与相对于具有序列号1所记载的碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因，
并且，作为催化所述工序(1)～(3)、(5)的任一个的酶的编码基因，所述微生物包含以下基因的任一个以上：
(d)具有序列号2至9的任一个碱基序列的基因；
(e)具有在序列号2至9的任一个碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于原碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(f)与相对于具有序列号2至9的任一个的碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因。
[3]用于[1]记载的1,4丁二醇的制造方法的基因，该基因是以下(a)～(c)所记载的任一个基因：
(a)具有序列号1至9的任一个碱基序列的基因；
(b)具有在序列号1至9的任一个碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于原碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(c)与相对于具有序列号1至9的任一个碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因。
<发明的效果>
本发明提供一种新的1,4丁二醇的制造方法，其能够经济地获得1,4丁二醇。
附图说明
图1是本实施方式的1,4丁二醇的制造方法的酶系的一个例子。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。需要说明的是，在本说明书中，“CoA”表示“辅酶A”。另外，若无特别记载，“％”表示“质量％”。“ppm”是质量基准。
本实施方式的1,4丁二醇的制造方法是一个经由乙酰CoA、乙酰乙酰CoA、3-羟基丁酰CoA、巴豆酰CoA以及4-羟基丁酰CoA，并利用微生物及其培养物进行酶反应，从而制造1,4丁二醇的方法。各酶反应具体包括以下工序。
(1)将乙酰CoA转换成乙酰乙酰CoA的工序；
(2)将乙酰乙酰CoA转换成3-羟基丁酰CoA的工序；
(3)将3-羟基丁酰CoA转换成巴豆酰CoA的工序；
(4)将巴豆酰CoA转换成4-羟基丁酰CoA的工序；
(5)将4-羟基丁酰CoA转换成1,4-丁二醇的工序。
为了提高1,4丁二醇的生产性，发明者们进行了各种研究，其结果发现，通过在用于催化上述工序中的各反应的酶的编码基因中，使用特定的基因及其同源物，能够提高1,4丁二醇的生产性。
作为上述特定的基因，具体而言，作为催化(4)将巴豆酰CoA转换成4-羟基丁酰CoA的工序中的反应的酶的编码基因，适当使用以下基因中的任一个：
(a)具有序列号1的碱基序列的基因；
(b)具有在序列号1的碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于序列号1的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(c)与相对于具有序列号1记载的碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因。
另外，作为在其他工序(1)、(2)、(3)、(5)的任一个以上的工序中催化相应转换反应的酶的编码基因，优选使用以下基因中的任一个：
(a)具有序列号2至9的任一个碱基序列的基因；
(b)具有在序列号2至9的任一个碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基的，并且相对于原碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(c)与相对于具有序列号2至9所记载的任一个碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因。
在本实施方式中，特定的基因，如上所述，其包含具有序列表中具体示出的碱基序列的基因及其同源物。同源物包括直系同源物和旁系同源物。直系同源物是指，从共同祖先的基因通过分化而生成的种类之间所对应的基因以及从该基因得到的酶的组合。旁系同源物是指，在同种内，不是通过分化而是通过基因复制而生成的种类之间所对应的基因以及从该基因得到的酶的组合。不论直系同源物或旁系同源物，同源物是指序列具有同一性的基因以及从该基因得到的酶。
更具体是，上述基因的同源物(基因)是指，具有相对于该基因的同一性为90％以上、优选为95％以上的某碱基序列的基因，更优选是与该基因完全相同，或者缺失、取代或插入了一个或多个碱基的基因。
另外，同源物基因包括，与相对于对象基因具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因。具体而言，应用针对公知的数据库的同源性检索程序(例如BLAST、FASTA)，或者通过利用由认定基因的至少一部分构成的探针(由该基因的碱基序列构成的DNA和由互补的碱基序列构成的DNA)在严格条件下的进行杂交或聚合酶链反应(PCR)等的常规方法，能够取得基因或由该基因转化而成的酶。另外，本领域技术人员能够通过取代等方法，来自行设计碱基序列。另外，在此所说的严格条件，例如可以举出非专利文献Molecular Cloning-A LABORATORY MANUALTHIRD EDITION(Joseph Sambrook,David W.Russell.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress)中记载的进行杂交的条件。具体而言，是在包含6×SSC(1×SSC的组成：0.15M氯化钠、0.015M柠檬酸钠，pH：7.0)、0.5％SDS、5×Denhardt溶液及100mg/mL鲱鱼精子DNA的溶液中，与探针一同在65℃下保持恒温8～16小时，进行杂交的条件。
在本发明中，例如，使通过以上方式选择的基因编码的酶或者一系列酶群，在以下说明的宿主微生物经基因重组而转化的微生物体内表达(亦可为共表达)，从而推进反应。
以下，对本实施方式中使用的微生物的特征、微生物的制作方法、微生物的使用方法(即，1,4丁二醇的制造方法)以及制造出的1,4丁二醇的取得方法等进行说明。
(宿主微生物)
本实施方式中使用的宿主微生物，是可以导入后述的各种基因的微生物，例如可对宿主微生物应用基因重组技术。
在本实施方式中，作为上述能够导入基因的宿主微生物的例子，只要是能够应用基因重组技术的微生物，便无特别限定。从产业利用的观点来看，作为具体例子，可以举出大肠杆菌、酵母、棒状杆菌、或梭菌属细菌。作为酵母，可举出酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母等。作为棒状杆菌，可举出谷氨酸棒杆菌、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、短杆菌(Brevibacterium divaricatum)、糖短杆菌、immariophilum短杆菌(Brevibacterium immariophilum)、乳发酵短杆菌、玫瑰色短杆菌、黄色短杆菌、生硫短杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、醋谷棒杆菌、帚石南棒杆菌、百合棒状杆菌、mellassecola棒状杆菌(Corynebacterium mellassecola)、嗜氨微杆菌等。作为梭菌，可举出克氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、氨基酪酸梭菌、拜氏梭菌、saccharoperbutylacetonicum梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)等。其中，使用大肠杆菌、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母，或谷氨酸棒杆菌容易进行转化，因此优选使用大肠杆菌。
另外，本实施方式的转化微生物，可以使用微生物培养菌体本身或者其培养物的各种形态。本实施方式的微生物的培养物具体包括：微生物培养菌体的培养基、缓冲液等介质的悬浮物；从微生物培养体提取的无细胞提取液；以及，从该无细胞提取液中浓缩、提炼、提取用于催化该反应的成分的处理物。本实施方式的微生物的培养物还包括，将上述微生物的处理物固定于难溶性载体的产物。作为这种固定化载体，可以举出丙烯酰胺共聚物、聚乙烯醇、聚N-乙烯基甲酰胺、聚丙烯胺、聚乙烯亚胺、甲基纤维素、葡甘露聚糖、藻酸盐、卡拉胶等，以及它们的共聚合、交联物等，可形成包含上述微生物菌体或者其处理物的水难溶性固体份的化合物。可以单独使用其中的一种，也可以混合2种以上使用。另外，在活性炭、多孔陶瓷、玻璃纤维、多孔聚合成形体、硝化纤维薄膜等作为固形物被预先形成的物体上保持微生物或其提取液、提取成分的物体也可以用作微生物的培养物。
(转化微生物)
在本实施方式中使用的宿主微生物是能够导入下述各种基因的宿主微生物，例如能够在宿主微生物应用基因重组技术。具体而言，在该宿主微生物原本有的酶系，还具有能够经由乙酰CoA、乙酰乙酰CoA、3-羟基丁酰CoA、巴豆酰CoA、4-羟基丁酰CoA来生产1,4丁二醇的酶反应系的各种酶系。以下，关于本实施方式的1,4丁二醇制造方法的酶系以及各酶系的编码基因进行说明。
图1表示本实施方式的1,4丁二醇制造方法的酶系的一个例子。在本实施方式中，能够利用在微生物体内以转化等方式表达下述一系列基因的培养物，来获得1,4丁二醇。需要说明的是，基因单独或作为一系列簇插入到任意的载体，转化宿主微生物。通过将获得的转化体在适当的碳源，例如以葡萄糖为碳源的培养基中进行培养，从而表达各基因。当基因在宿主中能够配置并表达时，通过在培养基中培养转化体，从而使基因表达。另一方面，当在设在载体上的调节器的控制下对各基因进行配置时，通过添加诱导基质并使其转移到诱导环境，从而使各个编码的基因表达。需要说明的是，本实施方式中的培养包括所有通常的微生物培养的培养条件，另外培养意味着以用于制造1,4丁二醇的充分的时间及条件来培养微生物。
[对乙酰CoA转换成乙酰乙酰CoA的反应进行催化的基因]
在本实施方式中，作为对乙酰CoA转换成乙酰乙酰CoA的反应进行催化的酶的编码基因，优选使用发明者提供的以下基因。
(a)具有序列号2的碱基序列的基因；
(b)具有在序列号2的碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于序列号2的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(c)与相对于具有序列号2所记载的碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因。
另外，在本实施方式中，作为对乙酰CoA转换成乙酰乙酰CoA的反应进行催化的酶的编码基因，优选使用发明者提供的以下基因。
(a)具有序列号3的碱基序列的基因；
(b)具有在序列号3的碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于序列号3的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(c)与相对于具有序列号3所记载的碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因。
[对乙酰乙酰CoA转换成3-羟基丁酰CoA的反应进行催化的基因]
在本实施方式中，作为对乙酰乙酰CoA转换成3-羟基丁酰CoA的反应进行催化的酶的编码基因，优选使用发明者提供的以下基因。
(a)具有序列号4的碱基序列的基因；
(b)具有在序列号4的碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于序列号4的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(c)与相对于具有序列号4所记载的碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因。
另外，在本实施方式中，作为对乙酰乙酰CoA转换成3-羟基丁酰CoA的反应进行催化的酶的编码基因，优选使用发明者提供的以下基因。
(a)具有序列号5的碱基序列的基因；
(b)具有在序列号5的碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于序列号5的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(c)与相对于具有序列号5所记载的碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下将杂交的基因。
[对3-羟基丁酰CoA转换成巴豆酰CoA的反应进行催化的基因]
在本实施方式中，作为对3-羟基丁酰CoA转换成巴豆酰CoA的反应进行催化的酶的编码基因，优选使用发明者提供的以下基因。
(a)具有序列号6的碱基序列的基因；
(b)具有在序列号6的碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于序列号6的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(c)与相对于具有序列号6所记载的碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因。
在本实施方式中，作为对3-羟基丁酰CoA转换成巴豆酰CoA的反应进行催化的酶的编码基因，优选使用发明者提供的以下基因。
(a)具有序列号7的碱基序列的基因；
(b)具有在序列号7的碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于序列号7的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(c)与相对于具有序列号7所记载的碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因。
[对巴豆酰CoA转换成4-羟基丁酰CoA的反应进行催化的基因]
在本实施方式中，作为对巴豆酰CoA转换成4-羟基丁酰CoA的反应进行催化的酶的编码基因，优选使用发明者提供的以下基因。
(a)具有序列号1的碱基序列的基因；
(b)具有在序列号1的碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于序列号1的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(c)与相对于具有序列号1所记载的碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因。
[对4-羟基丁酰CoA转换成1,4丁二醇的反应进行催化的基因]
在本实施方式中，作为对4-羟基丁酰CoA转换成1,4丁二醇的反应进行催化的酶的编码基因，优选使用发明者提供的以下基因。
(a)具有序列号8的碱基序列的基因；
(b)具有在序列号8的碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于序列号8的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(c)与相对于具有序列号所记载的碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因。
在本实施方式中，作为对4-羟基丁酰CoA转换成1,4丁二醇的反应进行催化的酶的编码基因，优选使用发明者提供的以下基因。
(a)具有序列号9的碱基序列的基因；
(b)具有在序列号9的碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于序列号9的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(c)与相对于具有序列号9所记载的碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因。
需要说明的是，上述基因编码的酶对4-羟基丁酰CoA转换成4-羟基丁醛的反应进行催化，但实际上，所获得的4-羟基丁醛会被上述宿主微生物通常具有的乙醇还原酶立即转变成1,4丁二醇。
[乙醇CoA的提供]
关于本实施方式的1,4丁二醇制造方法中作为基质的乙酰CoA的提供方法，无特别限定，可采用已知的各种方法。例如，通过宿主微生物的糖酵解的作用，可从葡萄糖等糖类获得。另外，通过脂类的β-氧化过程，也能够获得乙酰CoA。以及，还可以利用CoA转移酶，通过与适当的CoA物质进行偶联反应，使CoA转移至醋酸，从而提供乙酰CoA。
(微生物的制作方法)
向宿主微生物导入基因的方法有多种，通过适当组合利用例如基于限制酶/连接的方法、In-Fusion克隆方法等，能够将上述基因或其一部分连接于适当的载体，从而将获得的重组载体导入可表达目标基因的宿主中。另外，可通过同源重组，将目标基因或其一部分插入基因组上的任意位置。“一部分”是指，在被导入宿主中的情况下，能够表达各基因编码的蛋白质的各基因的一部分。本发明的基因包括DNA以及RNA，优选为DNA。
作为连接上述基因的载体，只要能够在宿主内复制，并无特别限定。例如可举出，用于在大肠杆菌中导入外来基因的质粒、抗菌素以及粘粒等。作为质粒，可举出pHSG398、pUC18、pBR322、pSC101、pUC19、pUC118、pUC119、pACYC117、pBluescriptII SK(+)、pET17b、pETDuet-1、pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pRSFDuet-1、pCOLADuet-1等。作为抗菌素，例如可举出λgt10、Charon 4A、EMBL-、M13mp18、M13mp19等。其中的一部分有市售品，可按照市售品(成套品)的使用说明，或加以适当改变使用之。
在上述载体中，为了着实表达被插入的基因，可在该基因的上游连接适当的表达启动子。对于所使用的表达启动子并无特别限定，本领域技术人员可根据宿主适当选择。例如，在大肠杆菌中表达外来基因时利用T7启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、λ-PL启动子。另外，还能够利用参与大肠杆菌的硝酸呼吸的硝酸还原基因narGHJI操纵子的Nar启动子区域，或作为大肠杆菌的硝酸还原酶基因的Frd基因的启动子区域。
另外，有时还优选破坏宿主微生物的原有的基因，不让其基因表达。关于破坏基因的方法，可使用大肠杆菌中用于破坏基因的公知方法。具体可采用例如，利用可在目标基因的任意位置进行同源重组的载体(靶载体)来破坏该基因的方法(基因靶向法)、通过在目标基因的任意位置上插入捕获载体(不具备启动子的报告基因)来破坏该基因使其失去功能的方法(基因捕获法)，以及组合这些的方法等，在该技术领域中制作剔除细胞等时采用的方法。
进行同源重组的位置或者插入捕获载体的位置，只要是产生变异而使想要破坏的目标基因的表达消失的位置即可，对此并无特别限定，但优选转录调节区域。
另外，关于将上述载体导入宿主的方法，并无特别限定，例如可举出将载体导入大肠杆菌时一般采用的利用钙离子方法、原生质体法、电穿孔法等。
关于通过同源重组在基因组的任意位置插入目标基因的方法，能够按照与基因组上的序列相同序列，将目标基因与启动子一同插入，并通过电穿孔将该核酸断片导入细胞内进行同源重组的方式来实施该方法。在向基因组导入时，如果使用连接目标基因与耐药性基因的核酸断片，能够容易地选出发生了同源重组的株。另外，也可以将连接了耐药性基因以及在特定条件下表达致死的基因的基因，通过上述方法进行同源重组插入基因组，然后置换耐药性基因和在特定条件下表达致死的基因，从而以同源置换的形式导入目标基因。
另外，对于选择目标基因所被导入的重组微生物的方法，并无特别限定，但优选能够容易地、只选择导入了目标基因的重组微生物的手法。
(培养方法及所获得的1,4丁二醇的取得方法)
本发明的反应的最方便的实现方式例如是，将转化体在LB培养基等营养培养基中以15℃～40℃、优选18℃～37℃的温度培养24小时左右，之后移植到以通常的碳源、例如0.01～50％、优选0.1～30％的葡萄糖为碳源的培养基中，继续以同样的温度培养1小时～200小时左右，在该过程中使1,4丁二醇积存在培养液中。另外，可以根据菌的增值或反应的进行引起的碳源的消耗，连续地或间断地添加碳源，此时的反应液中的碳源的浓度不限于上述浓度。
作为用于培养微生物的培养基碳源，可单独或组合地用葡萄糖、蔗糖、果糖等糖类、甘油等多元醇、乙醇、乙酸、柠檬酸、琥珀酸酸、乳酸、苯甲酸、脂肪酸等有机物质或其碱金属盐、正链烷烃等脂肪族烃、芳香烃、或者例如蛋白胨、肉提取物、鱼肉提取物、大豆粉、麸皮等天然有机物，从而能够以通常0.01％～30％、优选0.1％～20％左右的浓度来使用。
作为用于培养微生物的培养基氮源，例如可单独或组合利用硫酸铵、磷酸铵、硝酸钠、硝酸钾等无机氮化合物、尿素、尿酸等含氮有机物、或蛋白胨、肉提取物、鱼肉提取物、大豆粉等天然有机物，从而能够以通常0.01％～20％、优选0.1％～10％左右的浓度来使用。
另外可根据需要添加磷酸二氢钾等磷酸盐、硫酸镁、硫酸亚铁、醋酸钙、氯化锰、硫酸铜、硫酸锌、硫酸钴、硫酸镍等金属盐，以改善菌的生长、酶活性。添加浓度根据培养条件而不同，但通常磷酸盐为0.01％～5％，镁盐中为10ppm～1％，其他化合物中为0.1ppm～1,000ppm左右。另外，根据所选择的培养基，作为维生素、氨基酸、核酸等供给源，可以添加1ppm～100ppm左右的酶提取物、酪蛋白氨基酸、酵母核酸，以改善菌的生长、酶活性。
培养基的pH值，优选调整为4.5～9，更优选调整为5～8。另外可以利用离心分离或膜过滤等方法将在上述培养基中预先培养的微生物菌体从培养液中分离，并使其再次悬浊、反应为包含反应原料的水、生理食盐水、或与培养的pH值同等的pH值的磷酸、乙酸、硼酸、三(羟甲基)氨基甲烷等和该盐组成的缓冲液等，这有助于降低反应液中的杂质、简化后续生成物的分流。对于反应中的pH值，当使用足够浓度的缓冲液时通常可被维持，但当由于反应而脱离上述pH值时，优选使用氢氧化钠、氨等将其适当调整为同样的pH值。
由于反应液中积蓄1,4丁二醇，而在反应速度降低时，优选根据生成物的浓度而在反应液中增加水、生理食盐水、反应缓冲液等而连续进行稀释的方法。另外在反应速度降低时，通过对菌进行分馏、将上清作为生产物溶液进行回收，并将所分馏的菌再次回收到包含反应原料的溶液或悬浊液中，从而能够恢复反应速度。该操作可使用离心分离器或分离膜等连续地或分批地实施。
对于在反应液中生成的1,4丁二醇的分离回收及提纯，可在1,4丁二醇的生成量到达实质量的时点，利用离心分离将菌体从反应液中除去后，或直接在反应液中，利用一般的有机化合物的分离回收及提纯的手段来进行。例如，从将菌体和其他从培养液中除去的滤液中，利用适当的有机溶剂进行萃取。除了将该提取物直接蒸馏除去，还进一步用适当的溶剂进行再提取、或使用硅胶等色谱仪进行提纯、或利用多极蒸馏等，来得到高纯度的1,4丁二醇。
(实施例及比较例)
以下，通过实施例，详细说明本发明。
表1概括表示实施例1至3以及比较例1中所设想的反应工序、对各反应工序进行催化的酶、以及关于该酶的编码基因进行概括的内容能够。在此，基因的序列号对应于序列表中的序列号。
[表1]
(比较例1)
在序列号10所示的基因序列的上下游，将与表达载体pET17b(Novagen公司制)的多克隆位点中的分别包含NdeI位点上游侧CAT、下游侧ATG的上游侧、下游侧15碱基对相对应的序列，分别插入5'末端侧、3'末端侧，通过常规方法调制了平末端断片。将该断片以及对pET17b(Novagen公司制)进行NdeI处理后的断片，通过In-Fusion HD Cloning Kit(TAKARA BIO公司制)进行连接，获得了质粒pETBD10。
通过与pETBD10相同的方法，将序列号12所示的基因序列，以pET17b的NdeI位点做为目标进行插入，而获得了包含序列12的质粒pETBD12。
通过限制酶处理，切断位于pETBD10的序列10的终止密码子下游的、pET17b多克隆位点由来的EcoRI位点，调制了pETBD10的开环断片。其次，通过PCR调制了，在pETBD12的序列12的区域与包含上游的pET17b由来T7启动子的区域的上下游，插入了与包含所述pETBD10的EcoRI位点的上游侧15bp部分、下游侧15bp部分对应的序列的断片。将获得的2个断片，通过In-Fusion HD Cloning Kit进行连接，而获得了包含序列10以及序列12的质粒pETBD10-12。
同样，还以pETBD10-12的序列12的下游序列作为目标，依次追加了序列号14、16、17，而获得了质粒pETBD10-12-14-16-17。需要说明的是，在追加序列时，当载体上存在对已插入的序列不进行切断的恰当的限制酶位点时，就通过该酶的切断，而不存在这种位点时，则通过反向PCR，进行被插入侧质粒的开环(以下同样)。通过pETBD10-12-14-16-17，转化大肠杆菌JM109(DE3)，获得了大肠杆菌pETBD10-12-14-16-17。
(实施例1至3)
通过与比较例1相同的方法，将质粒pETBD10-12-14-16-17上的序列号10、12、14、16、17的基因，由如下质粒进行转化，而获得了JM109(DE3)，所述质粒是指由对与催化各工序的酶对应的酶编码的、序列号2、4、6、1、8的基因进行部分置换的质粒。
表2概括表示实施例1至3以及比较例1中所设想的反应工序、催化各反应工序的酶、编码该酶的基因。在此，基因的序列号对应于序列表的序列号。
[表2]
(比较例2)
与实施例1～3以及比较例1同样，首先调制了包含序列号11、13、15、16、18所示的基因序列的质粒pETBD11-13-15-16-18，由此获得了转化大肠杆菌JM109(DE3)株的大肠杆菌pETBD11-13-15-16-18/JM109(DE3)。
(实施例4至6)
另外，将质粒pETBD11-13-15-16-18上的序列号11、13、15、16、18的各基因，由如下质粒进行转化，而获得了JM109(DE3)，所述质粒是指由对与催化各工序的酶对应的酶编码的、序列号3、5、7、1、9的基因进行部分置换的质粒。
利用通常方法使用所得到的pETBD312对大肠杆菌JM109(DE3)进行转化。利用包含100mg/L的氨苄青霉素的LB培养基5mL，在37℃的有氧条件下，对通过各实施例以及比较例所获得的各转化体进行了12小时的培养。将0.1mL的培养液移植到包含1％葡萄糖、100mg/L的氨苄青霉素、0.2mM的IPTG的5mL的LB培养基中，在30℃的有氧条件下培养了48小时。将培养液上清供应给高速液体色谱仪(HPLC：色谱柱；shodex SH-1011(昭和电工制)、柱温度：60℃、洗脱液：25mM硫酸水溶液、流速0.6mL/min、检测：差分折射检测器)。构成所使用的转化质粒的基因与培养液中生成的1,4-丁二醇的量的关系如表3以及表4所示。
(表3)
(表4)
根据表3以及表4，在包括：
(1)将乙酰CoA转换成乙酰乙酰CoA的工序；
(2)将乙酰乙酰CoA转换成3-羟基丁酰CoA的工序；
(3)将3-羟基丁酰CoA转换成巴豆酰CoA的工序；
(4)将巴豆酰CoA转换成4-羟基丁酰CoA的工序；
(5)将4-羟基丁酰CoA转换成1,4-丁二醇的工序，
并利用微生物或其培养物，采用酶反应生成1,4丁二醇的制造方法中，通过使用特定的基因及其同源物，能够以高生产性获得1,4丁二醇。
本申请根据2012年12月5日向日本专利厅提交的专利申请第2012-266501号请求优先权，并引用专利申请第2012-266501号的全部内容。

Claims (3)

1.一种利用微生物及/或其培养物制造1,4丁二醇的制造方法，其包括：
(1)将乙酰CoA转换成乙酰乙酰CoA的工序；
(2)将乙酰乙酰CoA转换成3-羟基丁酰CoA的工序；
(3)将3-羟基丁酰CoA转换成巴豆酰CoA的工序；
(4)将巴豆酰CoA转换成4-羟基丁酰CoA的工序；
(5)将4-羟基丁酰CoA转换成1,4-丁二醇的工序，
作为催化所述工序(4)的酶的编码基因，所述微生物包含以下基因的任一个：
(a)具有序列号1的碱基序列的基因；
(b)具有在序列号1的碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于序列号1的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(c)与相对于具有序列号1所记载的碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因，
并且，作为催化所述工序(1)～(3)、(5)的任一个的酶的编码基因，所述微生物包含以下基因的任一个以上：
(d)具有序列号2至9的任一个碱基序列的基因；
(e)具有在序列号2至9的任一个碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于原碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(f)与相对于具有序列号2至9的任一个碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因。
2.一种微生物，其具有通过以下工序来制造1,4丁二醇的能力，
所述工序包括：
(1)将乙酰CoA转换成乙酰乙酰CoA的工序；
(2)将乙酰乙酰CoA转换成3-羟基丁酰CoA的工序；
(3)将3-羟基丁酰CoA转换成巴豆酰CoA的工序；
(4)将巴豆酰CoA转换成4-羟基丁酰CoA的工序；
(5)将4-羟基丁酰CoA转换成1,4-丁二醇的工序，
作为催化所述工序(4)的酶的编码基因，所述微生物包含以下基因的任一个：
(a)具有序列号1的碱基序列的基因；
(b)具有在序列号1的碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于序列号1的碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(c)与相对于具有序列号1所记载的碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因，
并且，作为催化所述工序(1)～(3)、(5)的任一个的酶的编码基因，所述微生物包含以下基因的任一个以上：
(d)具有序列号2至9的任一个碱基序列的基因；
(e)具有在序列号2至9的任一个碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于原碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(f)与相对于具有序列号2至9的任一个碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因。
3.用于权利要求1所述的1,4丁二醇的制造方法的基因，该基因是以下(a)～(c)所记载的任一个基因：
(a)具有序列号1至9的任一个碱基序列的基因；
(b)具有在序列号1至9的任一个碱基序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基且相对于原碱基序列的同一性为90％以上的碱基序列的基因；
(c)与相对于具有序列号1至9的任一个碱基序列的基因而言具有互补的碱基序列的基因，在严格条件下杂交的基因。
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