BRPI0717476B1

BRPI0717476B1 - Métodos para aumentar a produção de etanol em uma célula etanologênica e para produzir etanol, uso de uma molécula autoindutora nos ditos 5 métodos, célula etanologênica transfectada, recipiente de reação,aparelho para a produção e coleta de etanol por uma célula e uso de uma célula bacteriana de zymomonas mobilis

Info

Publication number: BRPI0717476B1
Application number: BRPI0717476-4A
Authority: BR
Inventors: Adrian Robert Walmsley; Maria Ines Borges-Walmsley; Jung Woo Yang
Original assignee: University Of Durham
Priority date: 2006-10-18
Filing date: 2007-10-17
Publication date: 2023-10-10
Also published as: GB0620715D0; US20110053236A1; US8163526B2; EP2092070A2; WO2008047113A3; EP2092070B1; BRPI0717476A2; WO2008047113A2

Abstract

produção de etanol. a presente invenção refere-se a um método para aumentar a produção de etanol em uma célula etanologênica usando-se uma molécula 5 autoindutora, por exemplo, al-2.

Description

A presente invenção refere-se a um método para aumentar a produção de etanol em uma célula etanologênica usando uma molécula autoindutora. Mais particularmente, a invenção refere-se a um sistema de expressão recombinante para a produção de etanol.

ANTECEDENTES

Em face à escalada de preços de óleo e os crescentes conceitos ambientais sobre o uso e esgotamento de fontes não-renováveis de energia, há um desejo crescente de redução desta dependência, estimulando interesse no uso de métodos de fermentação para a produção em larga escala de biocombustíveis alternativos como etanol (Editorial (July, 2006) Bioethanol needs biotech now. Nat Biotechnol. 24, 725, Gray, KA et al. (2006) Bioethanol. Cur. Opin. Chem. Biol. 10, 141-6). Como um combustível, etanol é principalmente de interesse como um aditivo ou substituto de gasolina, porque combustível combinado com etanol produz uma combustão mais completa, mais limpa, que reduz emissões tóxicas e de gás de estufa. A produção de etanol nos E.U.A aumentou de menos que 800 milhões de litros em 1980 para cerca de 19 bilhões de litros em 2006, mas existem planos para reforçar a produção para mais de 36 bilhões de litros em 2012. Em 2004 esta indústria adicionou 14 bilhões de dólares ao Produto Bruto Norte-Americano (Securing America’s energy future (2006), brochura produzida pela Renewable Fuels Association). Entretanto, os E.U.A não são o maior produtor de bioetanol, isto ocorre no Brasil. Recentemente, Brasil e GB concordaram em cooperar no desenvolvimento das instalações para produção de bioetanol em outros países, como os da África do Sul.

Em consequência do aumento da demanda por biocombustíveis, micro-organismos produtores de etanol, como a bactéria Gram-negativa Zymomonas mobilis, são de considerável interesse devido ao seu potencial para a produção de bioetanol (Jeffries, TW (2005) Ethanol fermentation on the move. Nat. Biotechnol. 23, 40-1). Z. mobilis atraiu atenção cedo no desenvolvimento de tecnologia de combustível etanol porque cresce e fermenta rapidamente, e tem uma taxa de produto e rendimento significantemente maiores que aquelas da levedura. Além disso, ela tolera altos níveis de eta- nol, uma propriedade virtualmente única entre bactérias, e açúcares. Ela é distintiva pelo fato de usar a via de Entner-Doudoroff (E-D) para metabolismo de glicose preferivelmente à via glicolítica mais familiar usada pela maioria das bactérias e leveduras. A enzima chave da via E-D é piruvato descarboxi- lase (PDC), que é somente raramente encontrada em bactérias. Diferente da glicólise, que pode teoricamente gerar dois moles de ATP para cada mol de glicose fermentada a etanol, o caminho E-D tem um rendimento líquido de somente uma ATP por mol de glicose. Este baixo rendimento de ATP resulta em baixa massa de células e permite maiores rendimentos de etanol. Embora linhagens tipo selvagem de Z. mobilis possam usar somente glicose, fru- tose, e sacarose como substratos de carbono, recente pesquisa focou no desenvolvimento de linhagens recombinantes capazes de converterem hi- drolisados lignocelulósicos mais baratos em etanol. No final estas características da Z. mobilis tornaram-na um candidato atraente para produção de bio- etanol (Seo, J-S et al. (2005) The genome sequence of the ethanologenic bacterium Zymomonas mobilis ZM4. Nat. Biotechnol. 23, 63-8).

Manter-se em compasso com a crescente demanda por biocom- bustíveis requererá a engenharia de novas linhagens de micro-organismos fermentativos que possam produzir estes mais eficazmente; e a capacitação para engenheirar tais linhagens irá requerer informação mais detalhada sobre os circuitos genéticos envolvidos na regulação de produção de biocom- bustível.

A patente US 5.514.583 mostra uma cepa transformada de Z. mobilis fermentadora de xilose (CP4/pZB4 e pZB5) tendo genes exógenos, e vetores plasmídeos (pZB4 e pZB5) codificando xilose isomerase, xilulocina- se, transaldolase e transcetolase, e ainda compreendendo pelo menos um promotor (Pgap e Peno) reconhecido por Zymomonas que regula a expressão de pelo menos um dos ditos genes. O micro-organismo é capaz de crescer em xilose como a única fonte de carbono, e fermentar xilose a etanol com cerca de 88% do rendimento teórico máximo.

As Patentes US 5.712.133 e US 5.726.053 referem-se a, entre outros, transformantes de Z. mobilis (39676/pZB 206) fermentandores de arabinose, contendo genes exógenos que codificam L-arabinose isomerase, L-ribulocinase e L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase, transaldolase, e trans- cetolase que proporcionam capacidade de fermentação de arabinose a eta- nol. O vetor plasmideo (pZB 206) e um método de uso de transformantes da fermentação de um substrato contendo glicose e arabinose também são descritos.

A Patente US 5.843.760 descreve um transformante de Z. mobilis (206C/pZB301) fermentandor de xilose e arabinose contendo genes exógenos que codificam xilose isomerase, xilulocinase, L-arabinose isomerase, L-ribulocinase, L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase, transaldolase e trans- cetolase, e ainda compreendendo pelo menos um promotor reconhecido por Zymomonas, que regula a expressão de pelo menos um dos ditos genes, onde o dito micro-organismo é capaz de crescer sobre arabinose e/ou xilose, sozinhas ou em combinação, como a fonte de carbono e fermentação da dita arabinose e xilose a etanol. O método de uso de transformantes junto com os vetores plasmídeos (pZB301, pZB401, pZB402 e pZB403) também é descrito.

Foi aqui estabelecido que a produção de bioetanol por Z. mobilis é regulada pela molécula de percepção de quorum (QS) AI-2 (Bassier BL et al. (1997) Cross-species induction of luminescence in the quorum-sensing bacterium Vibrio herveyi. J. Bacteriol. 179, 40-3, Chen, X et al. (2002) Structural identification of a bacterial quorum-sensing signal containing boron. Nature 415, 545-9). O uso de AI-2 para aperfeiçoar a produção de bioetanol é provável de ser uma tática melhor que simplesmente engenharia de bactérias, uma vez que se pode esperar que a expressão de todos os genes necessários para aperfeiçoamento de produção será regulada em uma maneira coordenada, ao mesmo tempo em que são ativados os mecanismos para aumentar a tolerância da bactéria aos aumentados níveis de etanol.

BREVE SUMÁRIO DE INVENÇÃO

Em um primeiro aspecto, a invenção proporciona um método para aumentar a produção de etanol em uma célula etanologênica compreendendo cultivar a célula etanologênica na presença de uma molécula auto- indutora.

Em um segundo aspecto, a invenção proporciona o uso de uma molécula autoindutora em um método para a produção de etanol usando uma célula bacteriana que produz etanol.

Em um terceiro aspecto, a invenção proporciona uma célula eta-nologênica transfectada com um primeiro ácido nucleico que codifica pelo menos um polipeptídeo que mediante expressão resulta na célula produtora de uma molécula autoindutora, que quando percebida pela célula aumenta a produção de etanol de células comparadas a células não-transfectadas.

Em um quarto aspecto, a invenção proporciona uma célula eta-nologênica tratada com uma molécula autoindutora e que produz etanol em quantidades aumentadas comparação com uma contraparte etanologênica não-tratada.

Em um quinto aspecto, a invenção proporciona uma célula eta-nologênica geneticamente modificada que produz pelo menos uma molécula autoindutora e que exibe produção de etanol aperfeiçoada em comparação com uma contraparte etanologênica não-modificada.

Em um sexto aspecto, a invenção proporciona um método para produção de etanol compreendendo: i) incorporação de uma primeira molécula de ácido nucleico, que codifica um polipeptídeo para a produção de uma molécula autoindutora em um vetor de expressão para expressão em uma célula hospedeira; ii) transfecção de uma célula etanologênica com o vetor de ex-pressão, onde a célula transfectada resultante exibe produção de etanol au-mentada em comparação com uma contraparte etanologênica não- transformada.

Em um sétimo aspecto, a invenção proporciona um recipiente de reação contendo uma célula etanologênica de acordo com um aspecto da presente invenção e meio suficiente para suportar o crescimento da dita célula.

Em um oitavo aspecto, a invenção proporciona um método para a produção de etanol, que compreende: i) proporcionar um recipiente que compreende uma célula etano- logênica de acordo com qualquer aspecto da presente invenção; ii) proporcionar a célula com um substrato para conversão enzi- mática em uma molécula autoindutora; iii) proporcionar condições de cultura de células que facilitem a produção de etanol por uma cultura de células da dita célula etanologênica contida no recipiente; e opcionalmente iv) coletar etanol a partir do recipiente.

Em um nono aspecto, a invenção proporciona um aparelho para a produção e coleta de etanol por uma célula compreendendo: i) um recipiente de reação contendo uma célula etanologênica de acordo com qualquer aspecto da presente invenção; e ii) um segundo recipiente em conexão fluida com o dito recipiente de cultura onde o dito segundo recipiente é adaptado para a coleta e/ou estocagem de etanol produzido por células contidas no recipiente de cultura de células em (i).

Em um décimo aspecto, a invenção proporciona o uso de uma célula bacteriana de Zymomonas mobilis como um sistema de expressão recombinante para a produção de etanol, onde a dita célula é transformada com uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que converte S-ribosil homocistina em uma molécula autoindutora-2.

Em um décimo-primeiro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma constructo de expressão LuxS em um sistema de expressão recombinante para a produção de etanol.

Em uma modalidade preferida, a dita célula etanologênica é uma célula de bactéria, mais preferivelmente uma célula de bactéria Gram- negativa. Preferivelmente, a célula de bactéria é do gênero Zymomonas spp, mais preferivelmente Zymomonas mobilis, ainda mais preferivelmente Zymomonas mobilis ZM4.

Em uma modalidade preferida, a célula etanologênica não sinte-tiza a molécula autoindutora.

Em uma modalidade preferida, a dita molécula autoindutora é uma molécula autoindutora-2. Preferivelmente a molécula autoindutora é produzida in vitro. Preferivelmente, a dita molécula autoindutora é provida em um meio de cultura.

Alternativamente, a dita molécula autoindutora é proporcionada por co-cultura de célula bacteriana produtora de etanol com célula bacteria- na produtora de molécula autoindutora. Preferivelmente, a dita célula produtora de molécula autoindutora é selecionada do grupo que consistindo em Vibrio harveyi, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Neisseria meningitides, Porphyromonas gingivalis, Streptococcus pyrogenes, Shigella flexneri e Salmonella typhimurium.

Em uma modalidade preferida, a molécula autoindutora está presente no início de cultura. Alternativamente, a molécula autoindutora está presente após o início de cultura. Alternativamente, a molécula autoindutora está presente continuamente durante a cultura. Alternativamente, a molécula autoindutora está presente na fase log da cultura.

Em uma modalidade preferida, a dita primeira molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo para a conversão de S-ribosil homocisteína em uma molécula autoindutora-2. Preferivelmente, a dita primeira molécula de ácido nucleico é selecionada do grupo que consiste em: i) uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1; ii) uma molécula de ácido nucleico tendo pelo menos 60% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 e que codifica um polipeptídeo que tem atividade LuxS; iii) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza à sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 e que codifica um polipeptídeo que tem atividade LuxS; iv) uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é degenerada como um resultado do código genético para as sequências de i), ii) e iii) acima; v) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e vi) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 60% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Mais preferivelmente, a dita molécula de ácido nucleico consiste na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1.

Preferivelmente, a dita célula etanologênica é transfectada com uma segunda molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo para a conversão de S-adenosil homocisteína em S-ribosil homocisteína. Preferi-velmente, a dita segunda molécula de ácido nucleico é selecionada do grupo que consiste em: i) uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3; ii) uma molécula de ácido nucleico tendo pelo menos 60% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 e que codifica um polipeptídeo que tem atividade MTA/SAHase; iii) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza para a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 3 e que codifica um polipeptídeo que tem atividade MTA/SAHase; iv) uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é degenerada como um resultado do código genético para as sequências de i), ii) e iii) acima; v) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; e vi) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 60% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

Mais preferivelmente, a dita segunda molécula de ácido nucleico consiste na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3.

Em uma modalidade preferida, o dito vetor de expressão compreende um elemento promotor de transcrição que confere expressão indu- zível na dita primeira molécula de ácido nucleico. Alternativamente, o dito vetor de expressão compreende um elemento promotor de transcrição que confere expressão reprimível sobre a dita primeira molécula de ácido nucleico. Alternativamente, o dito vetor de expressão compreende um elemento promotor de transcrição que confere expressão constitutiva sobre a dita primeira molécula de ácido nucleico. Alternativamente, a dita segunda molécula de ácido nucleico é incorporada ao vetor de expressão compreendendo a primeira molécula de ácido nucleico.

Em uma modalidade preferida, o dito recipiente de reação é um biorreator, mais preferivelmente um fermentador.

Por toda a descrição e reivindicações deste relatório descritivo, as palavras “compreendem” e “contêm” e variações das palavras, por exemplo, “compreendendo” e “compreende”, significam “incluindo, mas sem limitação,”, e não tem por objetivo (e não) excluir outras porções, aditivos, componentes, inteiros ou etapas.

Por toda a descrição e reivindicações deste relatório descritivo, o singular abrange o plural a menos que o contexto requeira de outro modo. Em particular, onde o artigo indefinido é usado, o relatório descritivo é para ser entendido como contemplando pluralidade assim como singularidade, a menos que o contexto requeira de outro modo.

Características, inteiros, compostos, porções químicas ou grupos descritos em conjunção com um aspecto particular, modalidade ou e- xemplo da invenção são para serem entendidos como sendo aplicáveis a qualquer outro aspecto, modalidade ou exemplo aqui descrito, a menos que incompatível com o mesmo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 é uma representação esquemática da via de fermentação de Entner-Doudoroff (ED);

A figura 2 mostra a superprodução de enolase e piruvato des- carboxilase em Z. mobilis tratada com sobrenadantes de E.coli;

A figura 3 é uma representação gráfica mostrando o aumento da produção de etanol em Z. mobilis tratada com AI-2;

A figura 4 é a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1;

A figura 5 é a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

A figura 6 é a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3;

A figura 7 é a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Bactéria do gênero Zymomonas, emprega a via de fermentação de Entner-Doudoroff (ED), ilustrada genericamente na figura 1. A via ED produz dois etanóis e dois CO2 formam glicose, com um ganho de energia líquido de um mol de ATP por molécula de glicose. A via requer somente duas atividades enzimáticas; piruvato descarboxilase e álcool desidrogena- se. Piruvato descarboxilase direciona o fluxo de piruvato para etanol. Piruvato descarboxilase catalisa a descarboxilação não-oxidativa de piruvato para produzir acetaldeído e dióxido de carbono. Duas isoenzimas de álcool desi- drogenase estão presentes em Zymomonas e servem para catalisar a redução de acetaldeído a etanol durante o método de fermentação, acompanhado pela oxidação de NADH a NAD+. A enzima chave da via E-D é a piruvato descarboxilase (PDC), que é raramente encontrada em bactérias. Diferente de glicólise, que teoricamente pode gerar dois mols de ATP para cada mol de glicose fermentado a etanol, a via E-D tem um rendimento líquido de somente uma ATP por mol de glicose. Este baixo rendimento de ATP resulta em baixa massa de células e permite maiores rendimentos de etanol. Embora as linhagens tipo selvagem de Z. mobilis somente possam usar somente glicose, frutose e sacarose como substratos de carbono, pesquisa recente focou no desenvolvimento de linhagens recombinantes capazes de converterem hidrolisados lignocelulósicos mais baratos em etanol.

A presente invenção é baseada na surpreendente constatação de que a produção de bioetanol por Z. mobilis é suprarregulada na presença de moléculas envolvidas em percepção de quorum conhecidas como moléculas autoindutoras. Percepção de quorum é o fenômeno através do qual as bactérias se comunicam.

Moléculas autoindutoras de percepção de quorum são moléculas de sinalização química, secretadas, produzidas por bactérias que permitem às bactérias se comunicarem. Em percepção de quorum, as bactérias avaliam sua densidade de população e a densidade de população de outros tipos de bactérias através da detecção de concentração de uma particular autoin- dutora de percepção de quorum, que se correlaciona com densidade de célula. Isto permite que a expressão de gene bacteriana seja coordenada de uma maneira multicelular (Withers, H., Swift & Williams, P. (2001). Curr Opin Microbiol 4, 186-193). Percepção de quorum ocorre em numerosas bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Verificou-se que uma ampla variedade de comportamentos multicelulares é controlada por percepção de quorum, por exemplo, bioluminescência, biossíntese de antibióticos, diferenciação de bio- filme, transferência conjugal de plasmídeo, competência para recaptação de DNA e esporulação. Várias famílias de autoindutoras foram identificadas. N- acil-L-homosserina lactonas (AHL’s) são produzidas por bactérias Gram- negativas através de enzimas da família de proteínas Luxl. Moléculas de AHL mostraram que ativam reguladores transcricionais da família LuxR em uma concentração crítica e também mostraram que atuam como fatores de virulência (Gardiner, S. M., Chhabra, S. R. Harty, C., Williams, P., Pritchard, D. I., Bycroft, B.W. & Bennett, T. (2001), Br J Pharmacol 133, 1047-1054, Telford, G., Wheeler, D., Williams, P., Tomkins, P.T., Appleby, P. Sewell, H., Stewart, G.S.A.B., Bycroft, B. W. & Pritchard, D. I. (1998) Infect Immun 66, 36-42).

Em bactérias Gram-positivas, peptídeos modificados pós- traducionalmente mostraram que atuam como autoindutoras (Kleerebezem. M., Quadri, L.E.N., Kuipers, O.P. & de Vos, W.M. (1997). Mol Microbiol 24, 895-904).

Uma família de autoindutoras foi descrita a qual está presente em ambas as bactérias Gram-negativas e Gram-positivas (Surette, M. G., Miller, M.B. & Bassler, B.L. (1999) Proc Natl Acad Sei USA 96, 1639-1644). Autoindutora-2 (AI-2) é um membro desta família. A proteína LuxS é requerida para a produção da autoindutora-2 (AI-2), a qual exerce sua atividade via um complexo de sistema de fosfo-retardo. A atividade de AI-2 foi verificada em muitas bactérias incluindo Escherichia coli, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis, Porphyromonas gingivalis, Streptococcus pyogenes, Shigella flexneri e Salmonella typhimurium. Em adição, homólogos de LuxS altamen- te conservados foram identificados em um grande número de bactérias patogênicas e não-patogênicas através de análises de bases de dados.

AI-2 é produzida através de ações de LuxS, a AI-2 sintase a partir de S-adenosilmetionina (SAM) via três etapas enzimáticas. SAM é usada como doadora de metila e metil transferases dependentes de SAM seceral atuam sobre SAM para transferir o grupo metila de SAM. Um subproduto desta etapa é a produção de S-adenosil homocisteína (SAH). SAH é degradada por uma enzima chamada Pfs. Pfs é uma MTA/SAHase e catalisa a formação de S-ribosil homocisteína (SRH) a partir de S-adenosil homocisteína (SAH) para liberar adenina e a produção de 5’-metiltiorribose (MTR) a partir de 5’-metiltioadenosina (MTA), também liberando adenina (Delia Ragi- one, F., M. Porcelli, M. Carteni-Farina, V. Zappia, e A. E. Pegg, 1985, Bio- chem. J. 232:335-341, Greene, R.C. 1996. Biosynthesis of methionine, p. 542-560. In F.C. Neidhardt, R. Curtiss III, J.L. Ingraham, E.C.C. Lin, K.B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, e H. E. Um- barger (ed.), Escherichia co//and Salmonella: cellular and molecular biology, 2a ed., vol. 1, ASM Press, Washington, D.C., Miller, C.H., e J.A. Duerre, 1968, J. Biol. Chem. 243:92-97). SAH e MTA são inibidores de reações re-querendo S-adenosil metionina (SAM), e a acumulação destes metabólitos é evitada através das atividades de Pfs.

Em uma etapa final, SRH é convertida em homocisteína e 4,5- diidróxi-2,3-pentanodiona através da ação enzimática de LuxS. A enzima Pfs atua diretamente a montante de LuxS na via de produção de AI-2 e é responsável por geração de adenina e o substrato de LuxS SRH a partir de SAH (Schauder, S., K. Shokat, M.G. Surrette, e B.L. Bassler. 2001. Mol. Microbiol. 41:463-476).

Um estudo recente por Schauder et al. mostrou que enzimas Pfs e LuxS purificadas são necessárias e suficientes para produção de AI-2 in vitro com SAH como um substrato (Schauder, S., e B.L. Bassler.2001. The languages of bactéria. Genes Dev. 15:1468-1480).

Após sua formação por LuxS, 4,5-diidróxi-2,3-pentanodiona cicli- za espontaneamente para se tornar uma furanona. Foi demonstrado que Al- 2 é uma furanona de cinco carbonos que resulta da ciclização espontânea de 4,5-diidróxi-2,3-pentanodiona, o produto da clivagem catalisada com LuxS da porção ribosila de SRH (Schauder, S., Shokat, K., Surette, M.G. & Bassler, B.L. (2001), Mol. Microbiol. 41, 463-476). Por isso foi sugerido que AI-2 é um diéster de borato de furanosila (Che et al. (2002), Nature, 415, 545).

De modo a estimular a produção de etanol, a célula etanologênica pode ser suprida diretamente com AI-2 ou modificada de modo a conter as enzimas necessárias (LuxS ou LuxS e Pfs) para produção de AI-2.

O substrato direto requerido para a produção de AI-2 a partir de LuxS é S-ribosil homocisteína. De modo a expressar AI-2 uma célula requererá uma fonte direta de S-ribosil homocisteína ou um mecanismo para produzir S-ribosil homocisteína, por exemplo, o polipeptídeo Pfs e seu substrato S-adenosil homocisteína.

Portanto, uma célula etanologênica ou vetor de expressão da presente invenção pode incluir a sequência que codifica LuxS ilustrada na figura 4 e que codifica o polipeptídeo de figura 5, ou a sequência que codifica LuxS e a sequência que codifica Pfs ilustrada na figura 6 que codifica o polipeptídeo Pfs ilustrado na figura 7.

Se a célula é transfectada justamente com a sequência que codifica LuxS, a célula irá requerer uma fonte direta de S-ribosil homocisteína para produzir AI-2. Se a célula é transfectada com ambas, a sequência que codifica LuxSA e a sequência que codifica Pfs, a célula irá requerer S- adenosil homocisteína para produzir AI-2. S-adenosil homocisteína é um produto do metabolismo de S-adenosil metionina. Da mesma maneira, S- adenosil homocisteína pode ser provida pelo metabolismo direto da S- adenosil metionina (SAM) em células de bactérias (Winzer et al., (2002), Microbiol., 148, 909-922).

Vetor

Como aqui usado, o termo “vetor” refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar um outro ácido nucleico que foi ligado. O vetor pode ser capaz de replicação autônoma ou ele pode integrar-se em um DNA hospedeiro. O vetor pode incluir sítios de enzimas de restrição para inserção de DNA recombinante e pode incluir um ou mais marcadores selecionáveis. O vetor pode ser um ácido nucleico na forma de um plasmídeo, um bacteriófago ou um cosmídeo. Mais preferivelmente, o vetor é apropriado para expressão em bactérias, por exemplo, em Zymomonas spp, preferivelmente para expressão em Zymomonas mobilis.

Preferivelmente, o vetor é capaz de propagação na célula de bactéria e é estavelmente transmitido para gerações futuras.

“Ligado operavelmente”, como usado aqui, refere-se a um elemento de controle simples ou uma combinação dos descritos acima junto com uma sequência de codificação em uma relação funcional um com outro, por exemplo, em uma relação ligada de modo a direcionar expressão da sequência de codificação.

“Sequências reguladoras”, como usadas aqui, referem-se a DNA ou RNA que são capazes de controlarem a expressão gênica. Exemplos de sequências de controle de expressão incluem promotores, aperfeiçoadores, silenciadores, sequências Shine Dalgarno, caixas TATA, sítios de entrada de ribossoma interno (IRES), sítios de ligação para fatores de transcrição, ter- minadores transcricionais, sítios de poliadenilação, sinais de transporte de RNA ou sequências importantes para resposta de gene mediada por luz UV. Preferivelmente, o vetor de expressão inclui uma ou mais sequências reguladoras ligadas operativamente à sequência de ácido nucleico a ser expressa. Sequências reguladoras incluem aquelas que acionam a expressão constitutiva, assim como as sequências induzíveis e/ou reguladoras específicas de tecido.

“Promotor”, como aqui usado, refere-se às sequências de nucle-otídeos em DNA ou RNA às quais RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição. O promotor pode ser induzível ou expresso constitutivamente. Alternativamente, o promotor está sob o controle de uma proteína repressora ou estimuladora. Preferivelmente, o promotor é um promotor T7, T3, lac, lac UV5, tac, trc, [lambda]PL, Sp6 ou induzivel com UV.

“Terminador transcricional”, como aqui usado, refere-se a um elemento de DNA, que termina a função de RNA polimerase responsável por transcrição de DNA em RNA, Terminadores transcricionais preferidos são caracterizados por uma corrida de resíduos T precedida por uma região simétrica díade rica em GC.

“Elemento de controle traducional”, como aqui usado, refere-se a elementos de DNA ou RNA que controlam a tradução de mRNA. Elementos de controle traducional preferidos são sítios de ligação de ribossomo. Prefe-rivelmente, o elemento de controle traducional é de um sistema homólogo como o promotor, por exemplo, um promotor e seu sítio de ligação de ribo- zima associado. Sítios de ligação de ribossomo preferidos são sítios de ligação de ribossomo T7 ou T3.

“Sítio de reconhecimento de enzima de restrição”, como usado aqui, se refere a um motivo sobre o DNA reconhecido por uma enzima de restrição.

“Marcador selecionável”, como aqui usado, refere-se a proteínas que, quando expressas em uma célula hospedeira, conferem um fenótipo à célula que permite seleção da célula que expressa o dito gene marcador selecionável. Genericamente, este pode ser uma proteína que confere resistência a um antibiótico como ampicilina, canamicina, cloranfenicol, tetracicli- na, higromicina, neomicina ou metotrexato. Ainda exemplos de antibióticos são penicilinas; ampicilina HCI, ampicilina Na, amoxicilina Na, carbenicilina sódica, penicilina G, cefalosporinas, cefotaxim Na, cefalexina HCI, vancomi- cina, ciclosserina. Outros exemplos incluem inibidores bacteriostáticos como: cloranfenicol, eritromicina, lincomicina, tetraciclina, sulfato de espectinomici- na, clindamicina HCI, clortetraciclina HCI.

O desenho do vetor de expressão depende de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado, e similares. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos em células hospedeiras para assim produzirem proteínas ou polipeptídeos, incluindo proteínas de fusão ou polipeptídeos, codificados por ácidos nucleicos como aqui descritos (por exemplo, o polipeptídeo LuxS co-dificado por SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo MTA/SAHase codificado por SEQ ID NO: 4).

A expressão de proteínas em procariotes é mais frequentemente realizada em uma célula hospedeira bacteriana com vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis que direcionam a expressão de proteínas de fusão ou de não-fusão. Vetores de fusão adicionam vários aminoácidos a uma proteína ali codificada, usualmente à terminação amino da proteína re- combinante. Tais vetores de fusão servem tipicamente para três propósitos: 1) para aumentar a expressão da proteína recombinante; 2) para aumentar a solubilidade da proteína recombinante; e 3) para auxiliar a purificação da proteína recombinante através de atuação como um ligante em purificação por afinidade. Frequentemente, um sítio de clivagem proteolítica é introduzido na junção da porção de fusão e a proteína recombinante para permitir que a proteína recombinante se separe de porção de fusão subsequente à purificação da proteína de fusão. Tais vetores estão dentro do escopo da presente invenção.

Preferivelmente, o vetor compreende aqueles elementos genéticos que são necessários para expressão da proteína LuxS na célula bacteriana. Os elementos requeridos para transcrição e tradução na célula de bactéria incluem um promotor, uma região que codifica o complexo de proteína LuxS, e um terminador transcricional.

Vetores de expressão da invenção podem ser vetores de expressão bacterianos, por exemplo, DNA bacteriófago recombinante, DNA de plasmídeo ou DNA de cosmídeo, vetores de expressão de levedura, por e- xemplo, vetores de expressão de levedura recombinantes, vetores para expressão em células de inseto, por exemplo, vetores de expressão de vírus recombinante, por exemplo, baculovírus, ou vetores para expressão em células vegetais, por exemplo, vetores de expressão de vírus recombinante tal como vírus do mosaico da couve-flor, CaMV, vírus do mosaico do tabaco, TMV, ou vetores de expressão de plasmídeos recombinantes, tais como plasmídeos Ti.

Preferivelmente, o vetor é um vetor de expressão bacteriano. Preferivelmente, o vetor de expressão é um vetor de expressão de alto número de cópias; alternativamente, o vetor de expressão é um vetor de expressão de baixo número de cópias, por exemplo, um plasmídeo Mini-F. Preferivelmente, é um vetor apropriado para expressão em Zymomonas spp, mais preferivelmente um vetor RP1, RP4, R68, ou RSF1010.

Enzimas produtoras de AI2

Como aqui usado, o termo “molécula de ácido nucleico” inclui moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos de DNA ou RNA gerado, por exemplo, através do uso de análogos de nucleotídeos. A molécula de ácido nucleico pode ser de fita simples ou fita dupla, mas preferivelmente é DNA de fita dupla.

Com relação ao DNA genômico, o termo “isolado” inclui moléculas de ácido nucleico que são separadas do cromossomo com o qual o DNA genômico está naturalmente associado. Preferivelmente, um ácido nucleico “isolado” está livre de sequências que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas na extremidade 5’ e /ou 3’ do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo do qual o ácido nucleico é derivado. Além disso, uma molécula de ácido nucleico “isolada”, tal como uma molécula de cDNA, pode estar substancialmente isenta de outro material celular, ou meio de cultura quando produzido através de técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros compostos químicos quando sintetizada quimicamente.

Como aqui usado, o termo “hibridiza sob condições estringentes” descreve condições para hibridização e lavagem. Condições estringentes são conhecidas por aqueles versados na técnica e podem ser encontradas em referências disponíveis (por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1-6.3.6). Métodos aquosos e não- aquosos são descritos nesta referência e qualquer um pode ser usado. Um exemplo preferido de condições estringentes de hibridização são hibridização em 6x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2xSSC, SDS 0,1% (peso/volume) a 50°C. Um outro exemplo de condições estringentes de hibridização é a hibridização em 6x SSC em cerca de 45°C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2x SSC, SDS 0,1% (peso/volume) a 55°C. Ainda um exemplo de condições rigorosas de hibridização é a hibridização em 6x SSC a cerca de 45°C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2x SSC, SDS 0,1% (peso/volume) a 60°C. Preferivelmente, condições estringentes de hibridização são hibridização em 6x SSC a cerca de 45°C seguido por uma ou mais lavagens em 0,2x SSC, SDS 0,1% (peso/volume) a 65°C. Condições estringentes particularmente preferidas (e as condições que devem ser usadas se o técnico está indeciso sobre que condições devem ser aplicadas para determinar se uma molécula está dentro de uma limitação de hibridização da invenção) são fosfato de sódio 0,5 molar, SDS 7% (peso/volume) a 65°C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2x SSC, SDS 1% (peso/volume) a 65°C. Preferivelmente, uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção que hibridiza sob condições estringentes à sequência de SEQ ID NO: 1 ou 3.

Como aqui usado, uma molécula de ácido nucleico “que ocorre naturalmente” refere-se a uma molécula de RNA ou DNA tendo uma sequência de nucleotídeos que ocorre na natureza (por exemplo, codifica uma proteína natural).

Como aqui usados, os termos “gene” e “gene recombinante” referem-se a moléculas de ácido nucleico que incluem um quadro de leitura aberto que codifica a proteína, e ainda podem incluir sequências reguladoras de não codificação e introns.

Um resíduo de aminoácido “não essencial” é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência do tipo selvagem de (por exemplo, a sequência de SEQ ID NO: 2 ou 4) sem abolir ou, mais preferivelmente, sem alterar substancialmente uma atividade biológica, enquanto um resíduo de aminoácido “essencial” resulta em uma tal mudança. Por exemplo, resíduos de aminoácidos que são conservados entre os polipeptídeos da presente invenção, por exemplo, aqueles presentes no domínio de canal de potássio conservado são previstos serem particularmente não suscetíveis à alteração, exceto que resíduos de aminoácidos em domínios transmembrânicos gene-ricamente podem ser substituídos por outros resíduos tendo hidrofobicidade aproximadamente equivalente sem alterar significantemente a atividade.

Uma “substituição de aminoácido conservative” é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, his- tidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmi- co), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagi- na, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apoiares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácido não essencial em proteína é preferivelmente substituído com um outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Alternativamente, em uma outra modalidade, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de todas ou parte de sequências de codificação, tal como através de mutagê- nese de saturação, e os resultantes mutantes podem ser separados por atividade biológica para identificação de mutantes que retêm atividade. Seguindo mutagênese de SEQ ID NO: 1 ou 3, as proteínas codificadas podem ser expressas recombinantemente e a atividade da proteína pode ser deter-minada.

Como aqui usado, uma “porção biologicamente ativa" de proteína inclui fragmentos de proteína que participam em uma interação entre moléculas e não-moléculas. Porções biologicamente ativas de proteína incluem peptídeos compreendendo sequências de aminoácidos suficientemente homólogas a ou derivadas das sequências de aminoácidos da proteína, por exemplo, as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NO: 2 ou 4, que incluem menos aminoácidos que a proteína de tamanho inteiro, e exibem pelo menos uma atividade da proteína codificada. Tipicamente, porções biologicamente ativas compreendem um domínio ou motivo com pelo menos uma atividade da proteína, por exemplo, a conversão enzimática de S- adenosil homocisteína a S-ribosil homocisteína ou conversão enzimática de S-ribosil homocisteína em autoindutora-2.

Uma porção biologicamente ativa de proteína pode ser um poli- peptídeo que é de, por exemplo, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ou mais aminoácidos em comprimento de SEQ ID NO: 3, 5, 8, 10 ou 13. Porções biologicamente ativas de proteína podem ser usadas como alvos para desenvolvimento de agentes que modulam atividades mediadas, por exemplo, atividades biológicas aqui descritas.

Cálculos de homologia ou identidade de sequências (os termos são aqui usados intercambiavelmente) entre sequências são realizados como a seguir.

Para determinar a porcentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos, ou de duas sequências de ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para propósitos de comparação ótima (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas em uma ou ambas de uma primeira e uma segunda sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos para ótimo alinhamento e sequências não homólogas podem ser ignoradas para propósitos de comparação). Em uma modalidade preferida, o comprimento de uma sequência de referência alinhada para propósitos de comparação é pelo menos 30%, preferivelmente pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%, mesmo mais preferivelmente pelo menos 60%, e mesmo mais preferivelmente pelo menos 70%, 75%, 80%, 82%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% do comprimento da sequência de referência. Os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos em posições de aminoácidos correspondentes ou posições de nucleotídeos são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo como a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas naquela posição (como aqui usado “identidade” de aminoácido ou ácido nucleico é equivalente à “homologia” de aminoácido ou ácido nuclei- co). A porcentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências, levando em conta o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna, que precisa ser introduzida para ótimo alinhamento das duas sequências.

A comparação de sequências e a determinação de porcentagem de identidade entre duas sequências podem ser realizadas usando-se um algoritmo matemático. Em uma modalidade preferida, a porcentagem de i- dentidade entre as sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) que foi incorporado ao programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.qcq.com), usando tanto uma matriz BLOSUM 62 como uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. Ainda, em uma outra modalidade preferida, a porcentagem de identidade entre duas sequências de nucleotídeos é determinada usando o programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.qcq.com), usando uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de lacuna de 40, 50, 60,70 ou 80 e um peso de comprimento de 1,2, 3, 4, 5, ou 6. Um conjunto particularmente preferido de parâmetros (e o que deve ser usado se o técnico está incerto sobre que parâmetros devem ser aplicados para determinar se uma molécula está dentro de uma limitação de identidade ou homologia de sequência da invenção) são uma matriz de escore BLOSUM 62 com uma penalidade de lacuna de 12, uma penalidade de extensão de lacuna de 4, e uma penalidade de adição ou supressão de um par de bases de 5.

A porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos ou nucleotídeos pode ser determinada usando o algoritmo de Meyers et al. (1989) CABIOS 4:11-17) que foi incorporado ao programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4.

As sequências de proteína e ácidos nucleicos aqui descritas podem ser usadas como uma “sequência de consulta” para realização de uma busca contra bases de dados públicas para, por exemplo, identificar outros membros da família ou das sequências relacionadas. Tais buscas podem ser realizadas usando-se os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410). Buscas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, escore = 100, comprimento de palavra = 12 para obter sequências de nucleotídeos homólogas às moléculas de ácido nucleico da invenção. Buscas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, escore = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína da invenção. Para obter alinhamentos com lacunas para propósitos de comparação, BLAST com lacunas pode ser utilizado como descrito por Altschul et al. (1997, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402). Quando os programas BLAST e BLAST com lacunas são usados, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ter sequências de aminoácidos suficiente ou substancialmente idênticas às sequências de a- minoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 4. Os termos “suficientemente idêntica” ou “substancialmente idêntica” são aqui usados com referência a uma primeira sequência de aminoácidos ou de nucleotídeos que contém um número suficiente ou mínimo de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos ou equivalentes (por exemplo, com uma cadeia lateral similar) a uma segunda sequência de aminoácidos ou de nucleotídeos de modo que as primeira e segunda sequências de aminoácidos ou de nucleotídeos tenham um domínio estrutural comum ou atividade funcional comum. Por exemplo, as sequências de aminoácidos ou de nucleotídeos que contêm um domínio estrutural comum tendo pelo menos cerca de 60%, 65% de identidade, provavelmente 75% de identidade, mais provavelmente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade são aqui definidas como suficiente ou substancialmente idênticas.

Preferivelmente vetores de expressão e células etanologênicas do presente pedido compreendem uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína LuxS.

A sequência de ácidos nucleicos preferivelmente codifica o poli- peptídeo LuxS a partir de E.coli, que é codificado pelo ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 e que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

A sequência de ácido nucleicos de LuxS é mostrada em SEQ ID NO: 1. A sequência é de aproximadamente 516 nucleotídeos em comprimento e codifica um polipeptídeo de 171 aminoácidos designado LuxS (SEQ ID NO: 2).

A sequência de ácidos nucleicos de Pfs é mostrada em SEQ ID NO: 3. A sequência é de aproximadamente 699 nucleotídeos em comprimento e codifica um polipeptídeo de 232 aminoácidos designado Pfs (SEQ ID NO: 4).

Ainda, moléculas de ácidos nucleicos incorporadas nos vetores de expressão e células etanologênicas da presente invenção são descritas abaixo.

Em uma modalidade, o vetor de expressão ou célula etanologênica da invenção compreende molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, ou uma sua porção ou fragmento. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Ainda em uma outra modalidade, a sequência de nucleotídeos compreende fragmentos de SEQ ID NO: 1, preferivelmente os fragmentos são fragmentos biologicamente ativos, isto é, tendo atividade LuxS.

Em uma outra modalidade, a sequência de ácidos nucleicos é o complemento da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 1, ou suas porções ou fragmentos. Em outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos é suficientemente complementar à sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 1 de modo que ela pode hibridizar para a sequência de nucleotídeos mostrada em qualquer uma de SEQ ID NO: 1, pelo que formando duplexes estáveis.

Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, homóloga ao comprimento intei- ro da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 1, ou suas porções ou fragmentos.

Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos codifica uma variante alélica que ocorre naturalmente de um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1. Variantes alélicas funcionais tipicamente conterão somente substituição conservative de um ou mais aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou substituição, deleção ou inserção de resíduos não críticos em regiões não críticas da proteína. Variantes alélicas não funcionais são variantes de sequência de aminoácidos que ocorre naturalmente de SEQ ID NO: 1, que não têm atividade LuxS. Variantes alélicas não funcionais conterão tipicamente uma substituição não conservativa, uma deleção, ou inserção ou truncamento prematuro da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou uma substituição, inserção ou deleção em resíduos críticos ou regiões críticas. Moléculas de ácidos nucleicos correspondendo a variantes alélicas naturais e homólogos das moléculas de ácido nucleico LuxS da invenção podem ser isoladas com base em sua homologia com as moléculas de ácido nucleico da invenção, usando as sequências descritas em SEQ ID NO: 1 ou uma sua porção, como uma sonda de hibridização sob condições de hibridização estringentes.

Em uma outra modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou suas porções ou fragmentos. Em uma outra modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que é pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91% , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% homóloga ao comprimento inteiro do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, ou suas porções ou fragmentos.

Ainda em uma outra modalidade, o vetor de expressão ou célula etanologênica adicionalmente compreende uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, ou suas porções ou fragmentos. Em uma outra modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, homóloga ao comprimento inteiro da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, ou suas porções ou fragmentos. Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos codifica uma variante alélica que ocorre naturalmente de um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 3. Variantes alélicas funcionais conterão tipicamente somente substituição conservative de um ou mais aminoácidos de SEQ ID NO: 3, ou substituição, deleção, ou inserção de resíduos não críticos em regiões não críticas da proteína. Variantes alélicas não funcionais são variantes de sequência de aminoácidos que ocorrem naturalmente de SEQ ID NO: 3 que não têm atividade MTA/SAHase. Variantes alélicas não funcionais tipicamente conterão uma substituição não con- servativa, uma deleção, ou inserção ou truncamento prematuro da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, ou uma substituição, inserção ou deleção em resíduos críticos ou regiões críticas. Moléculas de ácidos nucleicos correspondendo a variantes alélicas naturais e homólogos das moléculas de ácido nucleico Pfm da invenção podem ser isoladas com base em sua ho- mologia com as moléculas de ácidos nucleicos da invenção usando as sequências de nucleotídeos descritas em SEQ ID NO: 3 ou uma sua porção, como uma sonda de hibridização sob condições estringentes de hibridiza- ção.

Em uma outra modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 ou suas porções ou fragmentos. Em uma outra molécula, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que é pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, homóloga ao comprimento inteiro do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, ou suas porções ou fragmentos.

Em uma outra modalidade, qualquer uma das moléculas de ácidos nucleicos descritas anteriormente, compreende mudanças específicas na sequência de nucleotídeos de modo a otimizar códons e a estrutura se cundária de mRNA para tradução na célula hospedeira. Preferivelmente, a utilização de códon do ácido nucleico é adaptada para expressão na célula hospedeira, por exemplo, otimização de códon pode ser obtida usando Ca- logene, Hale, RS e Thomas G. Protein Exper. Purif. 12, 185-188 (1998), Up- Gene, Gao, W et al. Biotechnol. Prog. 20, 443-448 (2004), ou Codon Optimizer, Fuglsang, A. Protein Exper. Purif. 31,247-249 (2003). Emenda de ácido nucleico de acordo com a preferida otimização de códon pode ser obtida através de vários protocolos diferentes experimentais, incluindo modificação de um pequeno número de códons, Vervoort et al. Nucleic Acids Res. 25:2069-2074 (2000), ou reescrevendo uma grande seção da sequência de ácidos nucleicos, por exemplo, até 1.000 bp de DNA, Hale, RS e Thomas G. Protein Exper. Purif. 12, 185-188 (1998). Reescrita da sequência de ácidos nucleicos pode ser obtida através de PCR recursiva, onde a desejada sequência é produzida através de extensão de iniciadores de oligonucleotídeos em sobreposição, Prodomou e Pearl, Protein Eng. 5:827-829 (1992). Reescrita de maiores estiramentos de DNA pode requerer até três ciclos consecu-tivos de PCR recursiva, Hale, RS e Thomas G. Protein Exper. Purif. 12, 185- 188 (1998), Te’o et al., FEMS Microbiol. Lett. 190:13-19 (2000).

Alternativamente, o nível impelido de tRNA pode ser elevado na célula hospedeira. Esta elevação pode ser obtida através de aumento de número de cópias do respectivo gene de tRNA, por exemplo, através de inserção na célula hospedeira do gene de tRNA relevante em um plasmídeo de cópias múltiplas compatível, ou alternativamente inserindo o gene tRNA no próprio vetor de expressão.

Em uma outra modalidade qualquer uma das moléculas de ácidos nucleicos, descritas anteriormente, compreende mudanças específicas na sequência de nucleotídeos de modo a otimizar expressão, atividade ou vida funcional dos polipeptídeos LuxS e MTA/SAHase. Preferivelmente, os ácidos nucleicos descritos anteriormente são submetidos a técnicas de interrupção e manipulação genética. Várias técnicas de interrupção e manipulação genética são conhecidas incluindo, mas sem limitação, embaralhamento de DNA (Patente US 6.132.970, Punnonen J et al., Science & Medicine, 7(2):38-47 (2000), Patente US 6.132.970), mutagênese serial e varredura. Um exemplo de mutagênese é PCR propensa a erro, por meio do que as mutações são deliberadamente introduzidas durante PCR através do uso de DNA polimerases propensas a erro e condições reacionais como descritas em US 2003152944, usando, por exemplo, kits comercialmente disponíveis como o The GeneMorph II kit (Stratagene, US). Sequências de DNA aleato- rizadas são clonadas em vetores de expressão e as resultantes bibliotecas mutantes selecionadas para atividade de proteína aperfeiçoada ou alterada. Preparação de vetores de expressão de LuxS

Aqueles versados na técnica estão cientes das técnicas moleculares disponíveis para a preparação de vetores de expressão.

A molécula de ácido nucleico para incorporação no vetor de ex-pressão da invenção, como descrito acima, pode ser preparada através de síntese de moléculas de ácidos nucleicos usando oligonucleotídeos de sensibilização mútua e as sequências de ácidos nucleicos, aqui descritos.

Várias técnicas moleculares foram desenvolvidas para ligar ope- ravelmente DNA a vetores via terminais coesivos complementares. Em uma modalidade, tratos de homopolímero complementares podem ser adicionados à molécula de ácido nucleico a ser inserida no vetor DNA. O vetor e a molécula de ácido nucleico então são ligados através de ponte de hidrogênio entre as caudas homopoliméricas complementares para formação de moléculas de DNA recombinante.

Em uma modalidade alternativa, ligantes sintéticos contendo um ou mais sítios de restrição são usados para ligar operavelmente a molécula de ácido nucleico ao vetor de expressão. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico é gerada por digestão com endonuclease de restrição como descrito anteriormente. Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico é tratada com bacteriófago T4 DNA polimerase ou DNA polimerase I de E. coli, enzimas que removem terminais de fita simples 3’, em protrusão, com suas atividades 3’-5’-exonucleolíticas, e preenchem extremidades 3’ em recesso com suas atividades polimerizadoras, gerando, desse modo, segmentos de DNA de extremidade embotada. Os segmentos de extremidade embotada são então incubados com um grande excesso molar de moléculas ligantes na presença de uma enzima que é capaz de catalisar a ligação de moléculas de DNA de extremidade embotada, tal como DNA ligase de bacteriófago. Assim, o produto da reação é uma molécula de ácido nucleico carreando sequências ligantes poliméricas em suas extremidades. Estas moléculas de ácidos nucleicos são então clivadas com a enzima de restrição apropriada e ligadas a um vetor de expressão que foi clivado com uma enzima que produz terminais compatíveis com aqueles da molécula de ácido nucleico.

Alternativamente, um vetor compreendendo sítios de clonagem independente de ligação (LIC) pode ser empregado. A molécula de ácido nucleico amplificada por PCR requerida pode ser então clonada no vetor LIC sem digestão ou ligação de restrição (Aslanidis e de Jong, Nucl. Acid. Res. 18, 6069-6074 (1990), Haun, et al., Biotechniques 13, 515-518 (1992).

De modo a isolar e/ou modificar a molécula de ácido nucleico de interesse para inserção no plasmídeo escolhido, é preferível usar PCR. Inici-adores apropriados para uso na preparação de PCR da sequência podem ser projetados para isolarem a requerida região de codificação da molécula de ácido nucleico, adicionarem endonucleases de restrição ou sítios LIC, colocarem a região de codificação no desejado quadro de leitura.

Em uma modalidade preferida, uma molécula de ácido nucleico para incorporação em um vetor de expressão da invenção é preparada através de uso da reação em cadeia polimerase como mostrado por Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491, usando apropriados iniciadores oligonucleotí- deos. A região de codificação é amplificada, enquanto os próprios iniciadores tornam-se incorporados no produto sequência amplificada. Em uma modalidade preferida os iniciadores de amplificação contêm sítios de reconhecimento de endonuclease de restrição que permitem o produto sequência amplificada ser clonado em um apropriado vetor.

Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 é obtida por PCR e introduzida em um vetor de expressão usando digestão com endonuclease de restrição e ligação, uma técnica que é bem conhecida.

Alternativamente, a molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 é introduzida em um vetor de expressão através de recombinação homóloga de levedura (Raymon et al., Biotechniques. 26(1): 134-8, 140-1, 1999).

Os vetores de expressão da invenção podem conter uma cópia simples da molécula de ácido nucleico descrita anteriormente, ou cópias múltiplas da molécula de ácido nucleico descrita previamente.

Preferivelmente, o vetor de expressão da presente invenção compreende a sequência que codifica LuxS de SEQ ID NO: 1 e o gene que codifica MTA/SAHase de SEQ ID NO: 3.

Células hospedeiras

“Preparação purificada de células”, como aqui usada, refere-se a, no caso de células cultivadas ou células microbianas, uma preparação de pelo menos 10%, e mais preferivelmente, 50% das células objeto.

“Célula etanologênica”, como aqui usada, refere-se a qualquer célula capaz de produzir etanol. O termo refere-se à particular célula objeto e também à progénie ou potencial progénie de tal célula. Devido ao fato de certas modificações poderem ocorrer em gerações sucessoras devido à mutação ou influências ambientais, tal progénie pode de fato, não ser idêntica à célula parente, mas são ainda incluídas no escopo do termo como aqui usado.

Um outro aspecto da invenção proporciona uma célula etanologênica para uso no sistema de expressão da presente invenção que compreende um vetor de expressão, compreendendo uma molécula de ácido nucleico aqui descrita, por exemplo, SEQ ID NO: 1, ou suas porções ou fragmentos. Em uma modalidade alternativa, a célula compreende um vetor de expressão da presente invenção, compreendendo uma molécula de ácido nucleico aqui descrita, por exemplo, SED ID NO: 1, ou suas porções ou fragmentos, o vetor ainda compreendendo sequências que permitem o mesmo recombinar de modo homólogo em um específico sítio do genoma de célula.

A célula para uso no sistema de expressão da presente invenção pode ser uma célula aeróbica ou alternativamente uma célula anaeróbi- ca alternativa. Preferivelmente, a célula é uma célula bacteriana. Alternativamente, a célula pode ser uma célula de levedura (por exemplo, Saccha- romyces, Pichia), uma célula de alga, uma célula de inseto, ou uma célula de planta.

Células etanologênicas bacterianas incluem bactérias Gram- positivas e Gram-negativas. Células hospedeiras bacterianas apropriadas incluem, mas não são limitadas às bactérias Gram-negativas, por exemplo, uma bactéria da família Zymomonas, mais preferivelmente Zymomonas mo- bilis. Zymomonas mobilis ZM4 é a célula hospedeira bacteriana mais preferida para a presente invenção. Expressão em Z. mobilis oferece numerosas vantagens sobre outros sistemas de expressão, particularmente quando ela cresce e fermenta rapidamente, e tem uma taxa de produto e rendimento significantemente maior que aquelas de levedura. Além disso, ela tolera altos níveis de etanol.

Técnicas padrões para propagação de vetores em hospedeiros procarióticos são bem conhecidas por aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology 3a Edição (John Wiley & Sons 1995)).

Para maximizar expressão de proteína recombinante em Z. mobilis, os vetores de expressão da invenção podem expressar a molécula de ácido nucleico ali incorporada em uma bactéria hospedeira com uma capacidade prejudicada para clivar proteoliticamente a proteína recombinante (Got- tesman, S., (1990), Gene Expression Technology: Methods in Enzimology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia, 119-128). Alternativamente, a molécula de ácido nucleico incorporada em um vetor de expressão da invenção pode ser atenuada de modo que os códons individuais para cada aminoácido são aqueles preferencialmente utilizados em Z. mobilis (Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Tal alteração de sequências de ácido nucleico da invenção pode ser realizada através de técnicas padrão de síntese de DNA.

Transformação de Célula Hospedeira

O vetor de expressão da presente invenção pode ser introduzido em células etanologênicas através de técnicas convencionais de transformação ou transfecção.

“Transformação” e “transfecção”, como aqui usadas, referem-se a uma variedade de técnicas conhecidas para introdução de ácidos nucleicos estranhos em uma célula etanologênica. Transformação de células a- propriadas com um vetor de expressão da presente invenção é realizada por meios conhecidos na técnica e tipicamente depende do tipo de vetor e célula. Tais técnicas incluem, mas não são limitadas a co-precipitação com cloreto de cálcio ou fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextran, lipofecção, quimioporação ou eletroporação.

Técnicas conhecidas para a transformação de células etanolo- gênicas são mostradas em, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y; Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY; Cohen et al. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69, 2110; Luchansky et al. (1988) Mol. Microbio\. 2, 637-646. Todos tais métodos são aqui incorporados a título de referência.

Células transformadas com sucesso, ou seja, aquelas células contendo o vetor de expressão da presente invenção, podem ser identificadas através de técnicas bem conhecidas. Por exemplo, células transfectadas com o vetor de expressão da presente invenção podem ser cultivadas para produzirem o complexo de proteína LuxS. Células podem ser examinadas quanto à de presença do DNA de vetor de expressão através de técnicas bem conhecidas. Alternativamente, a presença de LuxS, ou sua porção ou fragmentos podem ser detectados usando anticorpos que hibridizam para a mesma.

Em uma modalidade preferida a invenção compreende uma cultura de células etanologênicas transformadas. Preferivelmente, a cultura é clonalmente homogênea.

A célula etanologênica pode conter uma cópia simples do vetor de expressão descrito anteriormente, ou alternativamente, múltiplas cópias do vetor de expressão. Adicionalmente, a célula etanologênica pode ser transformada com genes codificando hidrolases para produção de etanol a partir de substratos alternativos.

Produção de etanol

Produção de etanol por células etanologênicas pode ser regulada ascendentemente através de exposição das ditas células a moléculas autoindutoras. Moléculas autoindutoras podem ser supridas para a célula em um meio de cultura. Moléculas autoindutoras podem ser supridas diretamente ao meio de cultura. Alternativamente, as células etanologênicas podem ser co-cultivadas com uma célula de bactéria produzindo autoindutora.

Uma célula etanologênica transformada ou transfectada com um vetor de expressão da invenção, compreendendo uma molécula de ácido nucleico como anteriormente descrita, pode ser usada para produzir (isto é, expressar) um etanol em uma aumentada taxa de produção em relação a uma célula não transformada ou transfectada.

Preferivelmente, a presente invenção compreende um sistema de expressão para a produção em larga escala de etanol, utilizando uma sequência de codificação do ácido nucleico da presente invenção, codificando proteína LuxS. Preferivelmente, o sistema de expressão é um sistema de expressão de Z. mobilis.

Células transformadas ou transfectadas da invenção ou células etanologênicas são crescidas ou cultivadas na maneira com a qual o trabalhador versado está familiarizado, dependendo do organismo hospedeiro. Geralmente, células etanologênicas são crescidas em um meio líquido compreendendo uma fonte de carbono, usualmente na forma de açúcares, uma fonte de nitrogênio, usualmente na forma de fontes de nitrogênio orgânicas como um extrato de levedura ou sais tais como sulfato de amónio, elementos em traços tais como sais de ferro, manganês e magnésio e, se apropriado, vitaminas, em temperaturas de entre 0°C e 100°C, preferivelmente entre 10°C e 60°C, enquanto é efetuada a gaseificação com oxigênio.

O pH do meio líquido tanto pode ser mantido constante, ou seja regulado durante o período de cultura, como não. As culturas podem ser crescidas em batelada, em semi-batelada ou continuamente. Nutrientes podem ser proporcionados no início da fermentação ou alimentados semi- continuamente ou continuamente. Os produtos produzidos podem ser isola- dos dos organismos conforme descrição acima através de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, através de extração, destilação, cristalização, se apropriado precipitação com sal, e/ou cromatografia. Para este fim, as células hospedeiras podem ser vantajosamente rompidas de antemão. Neste método, o valor do pH é vantajosamente mantido entre pH 4 e 12, preferivelmente entre pH 6 e 9, especialmente entre pH 7 e 8.

Uma visão geral de métodos de cultura conhecidos pode ser en-contrada no livro texto por Chmiel (Bioprozeβtechnik 1. Einfuhrung in die Bi- overfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to Bioprocess te- chnology](Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) ou no livro didático por Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreators and peripheral equipment] (Vieweg Verlag, Brunswick / Wiesbaden, 1994)).

O meio de cultura a ser usado apropriadamente tem de satisfazer os requisitos das linhagens em questão. Descrições de meios de cultura para vários micro-organismos podem ser encontradas no livro didático “Manual of Methods for General Bacteriology” da American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981).

Como descrito acima, estes meios que podem ser empregados de acordo com a invenção usualmente compreendem uma ou mais fontes de carbono, fontes de nitrogênio, sais inorgânicos, vitaminas e/ou elementos em traços.

Fontes de carbono preferidas são açúcares, tais como mono, di ou polissacarídeos. Exemplos de fontes de carbono são glicose, frutose, manose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sacarose, rafinose, amido ou celulose. Açúcares também podem ser adicionados aos meios via compostos complexos como melaços ou outros subprodutos de refino de açúcar. A adição de misturas de uma variedade de fontes de carbono também pode ser vantajosa. Outras possíveis fontes de carbono são óleos e gorduras tais como, por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e/ou gordura de coco, ácidos graxos tais como, por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e/ou ácido linoleico, álcoois e/ou poliálcoois tais como, por exemplo, glicerol, metanol e/ou etanol, e/ou ácidos orgânicos como, por exemplo, ácido acético e/ou ácido lático.

Fontes de nitrogênio são usualmente compostos de nitrogênio orgânicos ou inorgânicos ou materiais compreendendo estes compostos. Exemplos de fontes de nitrogênio compreendem amónia em forma líquida ou gasosa ou sais de amónio como sulfato de amónio, cloreto de amónio, fosfato de amónio, carbonato de amónio ou nitrato de amónio, nitratos, ureia, a- minoácidos ou fontes de nitrogênio complexo como licor de infusão de milho, farinha de soja, proteína de soja, extrato de levedura, extrato de carne e outros. As fontes de nitrogênio podem ser usadas individualmente ou como uma mistura.

Compostos de sais inorgânicos que podem estar presentes nos meios compreendem os sais cloreto, fósforo e sulfato de cálcio, magnésio, sódio, cobalto, molibdênio, potássio, manganês, zinco, cobre e ferro.

Compostos contendo enxofre inorgânicos tais como, por exemplo, sulfatos, sulfitos, ditionitas, tetrationatos, tiossulfatos, sulfetos, ou também compostos de enxofre orgânicos como mercaptanas e tióis podem ser usados como fontes de enxofre para a produção de compostos químicos finos contendo enxofre, em particular metionina.

Ácido fosfórico, bifosfato de potássio, ou bifosfato de dipotássio ou os sais correspondentes contendo sódio podem ser usados como fontes de fósforo.

Agentes quelantes podem ser adicionados ao meio de modo a manter os íons de metais em solução. Agentes quelantes particularmente apropriados compreendem di-idroxifenóis como catecol ou protocatechuato e ácidos orgânicos como ácido cítrico.

Os meios de fermentação usados de acordo com a invenção para cultura de células etanologênicas usualmente também compreendem outros fatores de crescimento tais como vitaminas ou promotores de crescimento, que incluem, por exemplo, biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotenato e piridoxina. Fatores de crescimento e sais são frequentemente derivados de componentes de meios complexos como extrato de levedura, melaços, licor de infusão de milho, e similares. Além disso, é possível adicionar precursores apropriados ao meio de cultura. A exata composição dos compostos de meios depende muito do experimento em particular e é decidida individualmente para cada caso. Informação sobre otimização de meios pode ser encontrada no livro texto “Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach” (Editors P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Meios de crescimento também podem ser obtidos de fornecedores comerciais, por exemplo, Standard 1 (Merck) ou BHI (infusão coração cérebro, DIFCO) e similares.

Todos os componentes de meios são esterilizados, tanto através de calor (20 minutos em 150 kPa (1,5 bar) e 121 °C) como através de esterilização em filtro. Os componentes podem ser esterilizados juntos ou, se requerido, separadamente. Todos os componentes dos meios podem estar presentes no início da cultura ou adicionados, continuamente ou em batelada, como desejado.

A temperatura de cultura está normalmente entre 15°C e 45°C, preferivelmente de 25°C a 40°C, mais preferivelmente de 25 a 37°C, mais preferivelmente de 35 a 37°C, mais preferivelmente em 37°C, e pode ser mantida constante ou pode ser alterada durante o experimento. O pH do meio deve estar na faixa de 5 a 8,5, preferivelmente ao redor de 7,0. O pH para cultura pode ser controlado durante a cultura através da adição de compostos básicos tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, a- mônia e amónia aquosa ou compostos ácidos como ácido fosfórico, ou ácido sulfúrico. Formação de espuma pode ser controlada através do emprego de antiespumantes tais como, por exemplo, poliglicol ésteres de ácido graxo. Para manter a estabilidade de vetor é possível adicionar, ao meio, substâncias apropriadas tendo um efeito seletivo, por exemplo, antibióticos. Condições aeróbicas são mantidas através de introdução de oxigênio ou misturas gasosas contendo oxigênio como, por exemplo, ar ambiente na cultura. A temperatura da cultura é normalmente de 20°C a 45°C e preferivelmente de 25°C a 40°C. A cultura é continuada até a formação de o desejado produto atingir um máximo. Esta meta é normalmente alcançada dentro de 10 a 160 horas.

Os caldos de fermentação obtidos desta maneira, em particular aqueles compreendendo ácidos graxos poli-insaturados, contêm usualmente uma massa seca de 7,5 a 25% em peso.

O caldo de fermentação pode ser então ainda processado. A biomassa pode, de acordo com o requisito, ser completa ou parcialmente removida do caldo de fermentação através de métodos de separação tais como, por exemplo, centrifugação, filtração, decantação ou uma combinação destes métodos ou ser deixada completamente no dito caldo. É vantajoso processar a biomassa após sua separação.

Entretanto, o caldo de fermentação também pode ser espessado ou concentrado sem separação de células, usando métodos conhecidos como, por exemplo, com o auxílio de um evaporador rotatório, evaporador de filme delgado, evaporador de filme em queda, através de osmose reversa ou através de não-filtração. Finalmente, este caldo de fermentação concentrado pode ser processado para obtenção dos presentes ácidos graxos.

Preferivelmente, células hospedeiras transformadas ou transfec- tadas são cultivadas de modo que uma molécula AI-2 é produzida. Preferi-velmente, as células são cultivadas em condições capazes de induzirem a produção de etanol pela célula hospedeira.

Preferivelmente, as células são providas com os substratos ne-cessários para a produção de AI-2.

Células hospedeiras transformadas ou transfectadas podem ser cultivadas usando uma fermentação em batelada, particularmente quando a produção de etanol em larga escala usando o sistema de expressão de LuxS da presente invenção é requerida. Alternativamente, uma cultura contínua e/ou alimentada em batelada pode ser usada para gerar um rendimento de etanol a partir de células hospedeiras transformadas com o sistema de expressão de LuxS da presente invenção.

Células hospedeiras transformadas ou transfectadas podem ser cultivadas em condições aeróbicas ou anaeróbicas. Em condições aeróbi- cas, preferivelmente, oxigênio é continuamente removido do meio de cultura, através de, por exemplo, a adição de redutores ou eliminadores de oxigênio, ou, através de purga do meio reacional com gases neutros.

Técnicas conhecidas para a cultura em larga escala de células hospedeiras são mostradas, por exemplo, por Bailey e Ollis (1986) Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill, Singapore; ou Shuler (2001) Bioprocess Engineering: Basic Concepts, Prentice Hall. Todas tais técnicas são aqui incorporadas por referência.

As células hospedeiras da invenção podem ser cultivadas em um recipiente, por exemplo, um biorreator. Biorreatores, por exemplo, fer- mentadores, são recipientes que compreendem células ou enzimas e são tipicamente usados para a produção de moléculas em escala industrial. As moléculas podem ser proteínas recombinantes (por exemplo, enzimas como LuxS) ou compostos que são produzidos pelas células contidas no recipiente ou via reações de enzima que são completadas no recipiente de reação. Tipicamente, biorreatores baseados em célula compreendem as células de interesse e incluem todos os nutrientes e/ou co-fatores necessários para realização das reações.

Exemplos Produção de etanol aumentada

Os inventores demonstraram que Z. mobilis é responsivo a moléculas autoindutoras de ambas, bactérias e leveduras. Quando linhagem E. coll KX1123 (Xavier, KB e Bassier, BL (2005) Interference with AI-2 mediated bacterial cell-cell communication. Nature 437, 750-753) foi co-cultivada com Z. mobilis, da qual foi separada por uma bolsa de diálise (com um corte de 10 kDa) para evitar os efeitos tóxicos de produção de bacteriocina, ela estimulou Z. mobilis a superproduzir pelo menos 5 proteínas, 2 das quais foram retidas no citoplasma e 3 que foram secretadas. Estas proteínas não foram produzidas quando Z. mobilis foi co-cultivada com a linhagem de deleção de luxS KX1128, que carece de enzima LuxS que é responsável pela síntese de 4,5-diidróxi-2,3-pentanodiona (DPD) a partir de S-ribosil homocisteína, que cicliza espontaneamente para formar a molécula autoindutora Autoindutora-2 (AI-2). A mesma resposta de Z. mobilis para a co-cultura com linhagens de luxS e deleção de luxS de Staphylococcus aureus (9) também foi verificada (Doherty, N et al. (2006) Functional analysis of luxS in Staphylococcus aureus reveals a role in metabolism but not quorum sensing. J Bacteriol. 188, 2885-97).

As enzimas PufX e LuxS purificadas foram usadas para produção de AI-2 in vitro e os resultados demonstram o mesmo efeito sobre Z. mobilis, isto é, uma superprodução das mesmas cinco proteínas. Interessan- temente, foi verificado que Z. mobilis também foi responsiva a DH5a que também careceu de gene luxS, sugerindo que ele produz uma outra molécula autoindutora ainda não identificada.

Um ensaio de luminescência, baseado no uso de Vibrio harveyi BB170 que produz bioluminescência em resposta a AI-2, para detectar AI-2 (Xavier, KB e Bassler, BL (2005) Interference with AI-2 mediated bacterial cell-cell communication, Nature 437, 750-753). Uma busca do genoma de Z. mobilis falhou em identificar um homólogo de luxS e, usando o ensaio de bioluminescência, nenhuma produção de AI-2 foi detectada por Z. mobilis. Realmente, a maior parte, se não todos, os organismos têm uma via para reciclar S-adenosil metionina (SAM), via S-adenosil homocisteína (SAH), usando uma conversão enzimática de duas etapas através de Pfs e LuxS para produzir AI-2; ou, uma conversão de uma etapa usando SAH hidrolase. Z. mobilis tem um gene que parece codificar uma SAH hidrolase, indicando que ele utiliza esta via, antes que a via Pfs/LuxS que pode conduzir a produção de AI-2.

As proteínas superproduzidas em resposta a AI-2 foram identificadas por sequenciamento com espectrometria de massa de fragmentos trípticos. A primeira das proteínas secretadas, ZMO1147, foi identificada como um homólogo da chaperona periplásmica de E. coli Skp/HIpA (Walton, TA e Sousa MC (2004) Crystal structure of Skp, a prefoldin-like chaperone thar protects soluble and membrane proteins from aggregation. Mol Cell. 15, 367-74). Esta chaperona trabalha em conjunção com a proteína de membrana externa YaeT, que foi mostrada ser um componente chave de um complexo que é responsável pela inserção de proteínas na membrana externa (Wu T et al. (2005) Identification of a multicomponent complex required for outer membrane biogenesis in Escherichia coli. Cell 121,235-45). Em E. coli, os genes yaeT e hlpA estão em cacho. Em Z. mobilis, ZMO1147 está claramente transcricionalmente ligada a ZMO1148, um homólogo de yaeT, estando diretamente a jusante de ZMO1148, de modo que elas compartilham o mesmo promotor. Consequentemente, ambas ZMO1147 e ZMO1148 têm de ser induzidas por AI-2. Considerando que os membros da família YaeT têm homologia com os componentes OMP de sistemas de secreção tipo II, sugere que ZMO1148 é utilizada para a secreção de ZMO1147 e as outras proteínas induzidas por AI-2. Claramente, ZMO1147 tem de ter um papel acima, além de atuação como uma chaperona periplásmica. As outras duas proteínas secretadas foram identificadas como ZMO1034, com homologia com um grupo de proteínas de ligação de Ca2+ mão-EF pequenas, e ZMO0994, com homologia com proteínas LEA. Todas as proteínas secretadas tiveram sequências de sinais que podem sugerir que elas sejam alvejadas para o peri- plasma. Testou-se o alvejamento destas proteínas expressas em E. coli e verificou-se que enquanto ZMO1147 foi retida dentro da célula, ambas ZMO1034 e ZMO0994 foram excretadas. Isto é uma importante descoberta porque é genericamente aceito que linhagens não patogênicas de E. coli, particularmente derivadas de K12, não secretam proteínas sob condições de crescimento rotineiras. Tais proteínas secretadas têm aplicação como carre- adores para proteínas transgênicas para circunavegar toxidez e outros tecidos de contaminação, tal como a presença de lipolissacarídeos, associados à produção de proteína em E. coli.

As duas proteínas citosólicas superproduzidas foram identificadas como enolase, ZMO1608, e piruvato descarboxilase, ZMO1360 como ilustrado na figura 2. Estas são enzimas sequenciais na via E-D que conduz a produção de etanol. Consequentemente, um ensaio para produção de etanol por células de Z. mobilis tratadas com AI-2 e não tratadas foi conduzido, estabelecendo que o tratamento com AI-2 conduz a um significante aumento em produção de etanol. Um ensaio cromato (por exemplo, 3C2H5OH + 4CrO3 -> 2Cr2O3 + 3H2O) foi usado para avaliar a produção de etanol, monitorando a mudança de cor (por exemplo, em 600 nm) para determinar o etanol produzido. Usando este ensaio, um aumento de 54% em média em produção de etanol foi observado em dois experimentos; com a concentração média de etanol aumentando de 9% para 14,2% como ilustrado na figura 3.

Engenharia de Z. mobilis para produção de AI-2

Z. mobilis foi engenheirada para aumento de produção de etanol ao se prover a célula com os necessários componentes genéticos para a produção de AI-2. Por exemplo, o gene para SAH hidrolase, que é usado para destoxificar SAH pode ser deletado, e os genes para Pfs e LuxS, que utilizam SAH para a produção de DPD que espontaneamente converte em AI-2, expressos a partir de um plasmídeo. Confirmação de produção de AI-2 pode ser obtida usando o ensaio de bioluminescência de V. harveyi. A produção de AI-2 também pode ser confirmada através de teste para a produção de etanol aumentada.

A atenção do leitor é direcionada para todas as publicações e documentos que são depositados simultaneamente com ou anteriores a este relatório descritivo em conexão com este pedido de patente e que estão dis-poníveis à inspeção pública com este relatório descritivo, e o conteúdo de todas tais publicações e documentos é aqui incorporado a título de referência.

Todas as características mostradas neste relatório descritivo (in-cluindo quaisquer reivindicações acompanhantes, resumo e desenhos), e/ou todas as etapas de qualquer método assim mostrado, podem ser combinadas em qualquer combinação, exceto combinações onde pelo menos algumas de tais características e/ou etapas são mutuamente exclusivas.

Cada característica mostrada neste relatório descritivo (incluindo quaisquer reivindicações acompanhantes, resumo e desenhos), pode ser substituída por características alternativas servindo ao mesmo, equivalente ou similar propósito, a menos que expressamente estabelecido de outro modo. Assim, a menos que expressamente estabelecido de outro modo, cada característica mostrada é um exemplo somente de uma série genérica de características equivalentes ou similares.

A invenção não é restrita aos detalhes de quaisquer modalidades anteriores. A invenção estende-se a qualquer uma nova, ou qualquer nova combinação, das características mostradas neste relatório descritivo (incluindo quaisquer reivindicações, resumo e desenhos acompanhantes), 5 ou a qualquer uma nova, ou qualquer nova combinação, das etapas de qualquer método assim mostrado.

Claims

1. Método para aumentar a produção de etanol em uma célula etanologênica, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula etanologênica em presença de uma molécula autoindutora, sendo que a dita célula etanologênica é uma célula bacteriana do gênero Zymomonas spp, sendo que a dita molécula autoindutora é uma molécula autoindutora 2.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita molécula autoindutora é produzida in vitro, ou a dita molécula autoindutora é provida em um meio de cultura, ou a dita molécula autoindutora é fornecida por co-cultivo da célula bacteriana produtora de etanol com uma célula bacteriana produtora de molécula autoindutora.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dita célula bacteriana produtora de molécula autoindutora é selecionada do grupo que consiste em Vibrio harveyi, Escherichia coli, Helicobator pylori, Neisseria meningitides, Porphyromonas gingivalis, Streptococcus pyrogenes, Shigella flexneri e Salmonella typhimurium.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a molécula autoindutora está presente no início da cultura, ou a molécula autoindutora está presente após o início da cultura, ou a molécula autoindutora está presente continuamente durante a cultura, ou a molécula autoindutora está presente na fase log da cultura.

5. Uso de uma molécula autoindutora, caracterizado pelo fato de ser em um método para produzir etanol usando uma célula bacteriana produtora de etanol, sendo que a dita célula etanologênica é uma célula bacteriana do gênero Zymomonas spp, sendo que a dita molécula autoindutora é uma molécula autoindutora 2.

6. Célula etanologênica, caracterizada pelo fato de ser transfectada com um primeiro ácido nucleico que codifica pelo menos um polipeptídeo que, mediante expressão, resulta na célula produtora de uma molécula autoindutora, que, quando detectada pela célula, aumenta a produção de etanol da célula em comparação com uma célula não transfectada, sendo que a dita célula etanologênica é uma célula bacteriana do gênero Zymomonas spp, sendo que a dita primeira molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo para a conversão de S-ribosilhomocisteína em uma molécula autoindutora 2, e a dita primeira molécula de ácido nucleico é uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos.

7. Célula etanologênica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a dita célula bacteriana é transformada com uma segunda molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo para a conversão de S-adenosilhomocisteína em S-ribosilhomocisteína, sendo que a dita segunda molécula de ácido nucleico é uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:3 ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos.

8. Método para produzir etanol, caracterizado pelo fato de que compreende: i) incorporar uma primeira molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo para a produção de uma molécula autoindutora em um vetor de expressão para expressão em uma célula hospedeira; ii) transfectar uma célula etanologênica com o vetor de expressão, em que a célula transfectada resultante exibe produção de etanol aumentada em comparação com um equivalente etanologênico não transformado, sendo que a dita célula etanologênica é uma célula bacteriana do gênero Zymomonas spp, sendo que a dita primeira molécula codifica um polipeptídeo para a conversão de S-ribosilhomocisteína em uma molécula autoindutora 2, e a dita primeira molécula de ácido nucleico é uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:1 ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos; e sendo que a dita célula etanologênica é fornecida com S- ribosilhomocisteína.

9. Método para produzir etanol, caracterizado pelo fato de que compreende: i) incorporar uma primeira molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo para a produção de uma molécula autoindutora em um vetor de expressão para expressão em uma célula hospedeira; ii) transfectar uma célula etanologênica com o vetor de expressão, em que a célula transfectada resultante exibe produção de etanol aumentada em comparação com um equivalente etanologênico não transformado, sendo que a dita célula etanologênica é uma célula bacteriana do gênero Zymomonas spp, sendo que a dita primeira molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo para a conversão de S-ribosilhomocisteína em uma molécula autoindutora 2, e a dita primeira molécula de ácido nucleico é uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos; sendo que a dita célula bacteriana é transformada com uma segunda molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo para a conversão de S-adenosilhomocisteína em S-ribosilhomocisteína, sendo que a dita segunda molécula de ácido nucleico é uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:3 ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos; e sendo que a dita célula etanologênica é fornecida com S- 4 ribosilhomocisteína.

10. Recipiente de reação, caracterizado pelo fato de que contém uma célula etanologênica como definida na reinvindicação 6 ou 7 e um meio suficiente para suportar o crescimento da dita célula, sendo que a dita célula etanologênica é fornecida com S-ribosilhomocisteína, e opcionalmente o dito recipiente é um biorreator ou um fermentador.

11. Recipiente de reação, caracterizado pelo fato de que contém uma célula etanologênica como definida na reinvindicação 6 ou 7 e um meio suficiente para suportar o crescimento da dita célula, sendo que a dita célula etanologênica é fornecida com S-adenosilhomocisteína, e opcionalmente o dito recipiente é um biorreator ou um fermentador.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou uso de acordo com a reivindicação 5, ou célula etanologênica de acordo com a reivindicação 6 ou 7, ou método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, ou recipiente de reação de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado(a) pelo fato de que a dita célula bacteriana é Zymomonas mobilis, ou a dita célula bacteriana é Zymomonas mobilis -ZM4.

13. Método para produzir etanol, caracterizado pelo fato de que compreende: i) proporcionar um recipiente compreendendo uma célula etanologênica como definida em qualquer uma das reivindicações 6, 7 ou 12; ii) proporcionar a célula com um substrato para conversão enzimática em uma molécula autoindutora; iii) proporcionar condições para cultura de célula que facilitem a produção de etanol por uma cultura de célula da dita célula etanologênica contida no recipiente; e, opcionalmente, iv) ) coletar o etanol do recipiente.

14. Aparelho para a produção e coleta de etanol por uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende: i) um recipiente de reação que contém uma célula etanologênica como definida em qualquer uma das reivindicações 6, 7 ou 12; e ii) um segundo recipiente em conexão fluida com o dito recipiente de cultura de célula, em que o dito segundo recipiente é adaptado 5 para a coleta e/ou armazenagem do etanol produzido pelas células contidas no recipiente de cultura de célula em (i).

15. Uso de uma célula bacteriana de Zymomonas mobilis, caracterizado pelo fato ser como um sistema de expressão recombinante para a produção de etanol, em que a dita célula é transformada com uma molécula 10 de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que converte S- ribosilhomocisteína em uma molécula autoindutora 2, sendo que a dita molécula de ácido nucleico é uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma 15 sequência de aminoácidos.