KR20010093800A - 세균의 병원성을 조절하는 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 정제된 세균의 세포외 자가유도체-2 신호분자(autoinducer-2 signaling molecule)를 제공하며, 전기 분자의 생산은 자유 유영 상태로부터 숙주 생물체에서의 집락화 또는 병원성 상태로의 전환과 관련되는 환경적 조건에서의 변화에 의하여 조절된다. 전기 신호분자는 발광유전자LuxQ를 자극하며, 또한 이를 생산하는 세균종에서의 다양한 병원성과 관련하는 유전자를 자극하는 것으로 여겨진다. 본 발명은 또한 신호분자의 생합성에 관련하는 세균 유전자의 새로운 한 군(class)을 제공한다.

Description

세균의 병원성을 조절하는 조성물 및 방법{Compositions and Methods for Regulating Bacterial Pathogenesis}

발명의 배경

본 출원에서는, 본 발명이 관련하는 당업계의 기술을 보다 상세히 기술하기 위한 수개의 문헌이 인용되어 있다. 각 문헌은 참고로 본문에 개시되어 있다.

세포 밀도(cell density) 혹은 정족수 감지(quorum sensing)에 반응하여 유전자 발현을 조절하는 것은 해양 발광세균(marine luminous bacteria)인Vibrio fischeri와Vibrio harveyi에서 처음으로 개시되었다. 최근에는 이러한 현상이 많은 그람 음성 세균에서의 유전자 조절을 위한 일반적 기작으로서 인식되게 되었다. 정족수 감지 세균은 자가유도체(autoinducer)라 불리는 특이적인 아실-호모세린 락톤 신호분자를 합성, 분비하고 이에 반응함으로써 세포밀도에 따라 유전자 발현을 조절한다.V. harveyi의 경우를 제외한, 지금까지 개시된 모든 아실-호모세린 락톤 정족수 감지계에서 자가유도체 합성효소(autoinducer synthase)는V. fischeri의 luxI 과 유사한 유전자에 의하여 암호화되고, 자가유도체에 대한 반응은V. fischeri의 luxR과 유사한 유전자에 의하여 암호화되는 전사활성화 단백질에 의하여 매개된다(참조: Bassler and Silverman, in Two Component Signal Transduction, Hoch,et al.,eds, Am. Soc. Microbiol. Washington, D.C., pp 432-435, 1995). 반대로,V. harveyi는 두개의 독립적인 밀도감지계(신호계 1과 2라 함)를 가지고 있는데, 각각은 센서-자가유도체 쌍으로 구성된다.V. harveyi신호계 1(Signaling System 1)은 센서 1과 자가유도체 1(AI-1)로 구성되며, 자가유도체는 N-(3-하이드록시부타노일)-L-호모세린 락톤(N-(3-hydroxybutanoyl)-L-homoserine lactone)이다(참조: Bassleret al., Microbiol. 9:773-786, 1993).V. harveyi신호계 2(Signaling System 2)는 센서 2와 자가유도체 2(AI-2) 로 구성되어 있다(참조: Bassleret al., Mol. Microbiol., 13:273-286, 1994). AI-2 heterofore의 구조는 결정되지 않았으며, AI-2의 생합성에 관여하는 유전자도 동정되지 않았다. 신호계 1은 종 내 신호교류(intra-species communication)에 이용되기 위하여 고안된 매우 특이적인 계이며, 신호계 2는 보다 적은 종-선택성을 보이며, 종 간 신호교류(inter-species comminication)에 이용되기 위한 것으로 보인다(참조: Bassleret al., J. Bateriol. 179:4043-4045, 1997).

리포터 균주(reporter strain)인V. harveyi는 AI-1 또는 AI-2에 반응하여 배타적으로 빛 생성이 가능하도록 제조된 것이다(참조: Bassleret al., 1994, supra).V. harveyi리포터 균주는 몇몇 종의 세균들이 AI -2를 흉내내는 자극 물질(stimulatory substance)을 생산한다는 것을 확인하기 위하여 이용되어 왔다 (참조: Bassleret al., 1997, supra).

신호계 1과 2에 의해 매개되는,V. harveyi의 정족수 감지는 생물체로 하여금 어떤 세포 밀도에서 생물발광(bioluminesce)을 하도록 자극한다. 이들 유사한 신호계, 특히 신호계 2는V. harveyi및 유사한 신호계를 가지는 다른 세균에서 여러 생리학적 변화들을 유도하는 것으로 여겨진다. 이에, 그 신호인자인 자가유도체-2 및 그의 생산에 필요한 단백질을 암호화하는 유전자들을 동정하고 특성화하는 것은 기술에서의 진보이고, 이는 포유류의 장내세균 혹은 병원성세균의 조절에 유용한 새로운 군(class)의 화합물(compound)을 동정하는 수단으로 제공될 것이다.

발명의 요약

본 발명에 따라서, 다양한 세균 종(이들 중 몇몇은 포유류의 병원성 세균)이V. harveyi의 신호계 2를 위한 생물학적 검정(boiassay)에서 발광(luminescence)의 발현을 자극하는 유기신호분자(organic signaling molecule)를 분비하는 것이 발견되었다. 이들 생물체가 분비하는 분자는 생리적 및 기능적 측면에서V. harveyiAI-2를 흉내낸다. 세균에서 이러한 새로운 신호물질의 생산은 자유유영상태(free-living existance)에서 숙주에서 균체 혹은 병원성 상태로의 전환과 연관된 환경조건의 변화에 의하여 조절된다. 따라서,V. harveyi의 자극적(stimulating) 발광 유전자(특히 LuxCDABE) 뿐 아니라, 신호분자는 그것을 생산하는 세균 종에서 다양한 질병유발에 관련되는 유전자들을 자극하는 것으로 기대된다. 고도로 정제된 형태의 신호분자가 본 발명에서 제공된다. 또한, 전기 신호분자의 생합성에 관련된 새로운 군의 세균성 유전자가 제공된다.

본 발명의 한가지 측면에 의하여, 본 발명은 극성이고 전하를 띠고 있지 않은 분자가 적어도 하나 이상을 포함하며, 분자량이 약 1,000kDa이하인 분리된 세균성 세포외(extracelluar) 신호 인자를 제공하는데, 전기 인자는 LuxQ단백질과 상호 작용하여 발광 유전자 LuxCDABE를 포함한V. harveyi오페론의 발현을 유도한다. 바람직한 실시태양에서,V. harveyi센서 2+ 리포터 균주를 이용한 생물학적 검정에서 측정하였을 때, 전기 인자는 약 0.1 ~ 1.0mg의 시료(preparation)로서 발광을 약 1000배 증가시키는 비활성(specific activity)을 가진다. 특별히 바람직한 실시태양에서, 전기 인자가 약 1 ~ 10 μg의 시료(preparation)로서 발광을 약 1000배 증가시키는 비활성(specific activity)을 가지는 방식으로 정제된다.

본 발명의 신호 인자는 이에 제한되지는 않지만 다음을 포함하는 다양한 세균에 의하여 생산된다:Vibrio harveyi, Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus, Vibrio alginolyticus, Psedomonas, phosphorum, Yersinia enterocolitica, Escherchia coli, Salmonella typhimurium, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Bacillus subtilis, Borrelia burgfdorferi, Neisseria mengitidis, Neisseria gonorrhoeae, Yersinia pestis, Campylobacter jejuni, Deinococcus rasiodurans, Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyrogenes및Staphylococcus aureus.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 하기의 일반식을 갖는 분리된 신호 인자가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 신호인자와 화합물(compound)이 접촉함으로써 신호 인자의 활성을 조절하는 화합물의 동정(identification)방법을 제공하는 데, 화합물의 존재하에 신호 전달 인자의 활성을 측정하고, 이를 화합물의 부재하에 얻어지는 신호 인자의 활성과 비교하여 신호 인자의 활성을 조절하는 화합물을 확인하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 표본시료(sample)에서 자가유도체의 검출 방법을 제공하는데, 외재성(exogenous) 자가유도체에 반응하여 검출될 만한 양의 빛을 생성하는 생합성 경로(biosynthetic pathway)를 가지고, 자가유도체 경로(autoinducer pathway)에 관여하는 유전자 좌(gene loci)에서 적어도 2개의 다른 변화(alteration)(첫번째 변화는 첫번째 자가유도체의 검출을 저해하는 변화를 포함하고, 두번째 변화는 두번째 자가유도체의 생산을 저해하는 변화를 포함한다)를 포함하는 세균 또는 그의 추출물과 표본시료를 접촉하는 단계와 세균 또는 그의 추출물에 의하여 생성되는 빛의 양을 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 자가유도체 경로에 관여하는 유전자 좌(gene loci)에서 적어도 2개의 다른 변화(alteration)를 가지고 있으며, 유전자 좌에서의 첫번째 변화는 첫번째 자가유도체의 검출을 저해하는 변화를 포함하고, 유전자 좌에서의 두번째 변화는 두번째 자가유도체의 생산을 저해하는 변화를 포함하며, 자가유도체와 접촉하였을 때 생물발광하는 세균을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 자가유도체의 활성을 조절하는 자가유도체의 유사체(analog)의 동정(identification)방법을 제공하는데, 자가유도체에 반응하여 검출될 만한 양의 빛을 생성하는 생합성 경로(biosynthetic pathway)를 가지는 세균 또는 그의 추출물과 자가유도체의 유사체(analog)가 접촉하는 단계와 세균 또는 그의 추출물에 의하여, 자가유도체 존재하에 생성되는 빛의 양을 자가유도체의 유사체 존재하에 생성되는 양과 비교하여, 빛의 생성량의 변화로서 자가유도체의 활성을 조절하는 자가유도체의 유사체를 확인하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 S-아데노실호모시스테인(S-adenosylhomocysteine, SAH)이 자가유도체-2로의 전환(conversion)을 증진시키는 시간과 조건에서, S-아데노실호모시스테인과 LuxS단백질과의 접촉을 포함하는 자가유도체-2를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 S-리보실호모시스테인(S-ribosylhomocysteine, SRH)이 자가유도체-2로의 전환을 촉진하기 위한 시간과 조건에서, S-리보실호모시스테인과 LuxS폴리펩티드의 접촉을 포함하는 자가유도체-2를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 자가유도체-2를 생산하는 방법을 제공하는데, S-아데노실호모시스테인이 S-리보실호모시스테인으로의 전환을 촉진하기 위한 시간과 조건에서, S-아데노실호모시스테인(SAH)와 5´메틸티오아데노신/S-아데노실호모시스테인 뉴클레오시다제(pfs)단백질을 접촉하는 단계와 S-리보실호모시스테인이 자가유도체-2로의 전환을 촉진하기 위한 시간과 조건에서, S-리보실호모시스테인과 LuxS단백질을 접촉하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 자가유도체-관련 세균의 생물표지자(biomarker)를 검출하는 방법을 제공하는데, 세균의 생물표지자의 유도를 촉진하기 위한 시간과 조건에서, 적어도 하나의 세균과 자가유도체가 접촉하는 단계와 세균의 생물표지자를 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 LuxP단백질과 목적화합물(target compound)의 접촉 및 전기 화합물이 LuxP에의 결합을 검출하는 것을 포함하는, LuxP단백질에 결합하는 목적 화합물의 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 바이오필름(biofilm) 형성이 가능한 세균과 바이오필름 형성 조절이 가능한 화합물과의 접촉을 포함하며, 전기 화합물이 자가유도체-2의 활성을 조절하는, 세균성 바이오필름 형성을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 전기한 세균의 세포외 신호 인자의 정제 방법을 제공한다: (a) 배양 배지에서 신호 분자를 생산하는 세균의 성장; (b) 배양 배지로부터 세균의 분리; (c) 세균으로부터 신호분자의 분비와 생산을 허용하는 조건하에, 고삼투압 용액에서 세균의 배양; (d) 고삼투압 용액으로부터 세균의 분리; 및 (e) 고삼투압 용액에서 전기 인자의 정제. 전기 방법은 다음을 추가로 포함한다: (f) 고삼투압 용액에서 수분이 제거된 시료의 비극성 화합물로부터 극성 화합물의 분리; 및, (g) 극성 화합물의 역상 HPLC(reverse-phase High Performance Liquid Chromatography) 분석. 바람직한 실시태양에서, 고삼투압 용액은 적어도 0.4M의 단가 염(monovalent salt)을, 보다 바람직하게는 0.4 내지 0.5M의 염화나트륨(NaCl)을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서 전기 방법은 글루코스, 프럭토스, 만노스, 글루시톨, 글루코사민, 갈락토스 및 아라비노스를 포함하는 그룹으로부터 선택된 탄수화물을 함유하는 배양배지에서 세균의 성장을 추가로 포함한다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 비브리오 하베이의 LuxQ 발광유전자의 발현을 유도하는 세균의 세포외 신호 인자의 생합성에 필요한 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공하는 데, 전기 핵산 분자는Vibrio harveyi, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Bacillus subtilis 및 Borrelia burgfdorferi를 포함하는 다양한 세균으로부터 분리될 수 있다.

전기한 핵산 분자는 약 150 과 200개의 아미노산 잔기 사이를 가지는 단백질을 암호화한다. 바람직하게는, 암호화된 단백질은 서열번호 10 내지 17 또는 서열번호 10 내지 17의 둘 또는 그 이상의 비교로부터 유도된 보존서열(consensus sequence)을 포함하는 그룹에서 선택된 서열과 대체적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 핵산 분자는 바람직하게, 서열번호 1 내지 9 또는 서열번호 1 내지 9의 둘 또는 그 이상의 비교로부터 유도된 보존서열을 포함하는 그룹에서 선택된 서열과 대체적으로 동일한 서열을 가지고 있다.

전기한 어느 핵산분자의 발현에 의하여 생산되는 단백질만 아니라, 전기한 핵산 분자를 포함하는 재조합 DNA분자 역시 본 발명에 따라 제공된다.

본 발명의 추가적인 특성과 장점은 도면, 상세한 설명 및 실시예에서 보다 잘 이해될 것이다.

관련출원들에 관한 상호참조

본 출원은 1988년 12월 2일 출원한 미합중국 출원번호 60/110, 570로부터 우선권을 주장하며, 이는 참고로 본문에 개시되어 있다.

연합지원 연구에 관한 기술

미합중국법 제 202조 (c)항에 의하여, 미국정부는 여기에 개시한 발명에 대하여 권리를 가지며, 국립과학재단(National Science Foundation) 기금 번호 MCB-9506033으로부터 부분지원받았음을 밝힌다.

발명의 분야

본 발명은 사람과 다른 포유동물의 세균성 질병 분야에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 어떤 세균에서 질병 유발에 관여하는 새로운 유전자와 신호 인자(signaling factor) 및 전기 인자와 유전자의 조작을 통하여 질병 유발(pathogenesis)을 조절하는 방법을 제공한다.

도 1은E. coliAB1157과S. typhimuriumLT2 세포가 제거된 배양액에서 유래하고V. harveyi에서의 발광을 유도하는 신호물질(signaling substance)을 나타낸 그래프이다.V. harveyi리포터 균주BB170(센서 1^-, 센서 2⁺)(도 1A) 및 BB886(센서 1⁺, 센서 2^-)(도 1B)의E. coli,S. typhimurium및V. harveyi균주들의 세포가 제거된 배양액에 존재하는 신호물질들에 대한 반응을 보여 준다. 각 리포터 균주의 브라이트(bright) 배양액을 새 배지로 1:5000으로 희석하고, 세포 당 빛 생성을 그 희석배양의 증식동안 측정하였다. 세포가 제거된 배양액 혹은 멸균 증식 배지를 최종농도 10% (v/v)로 실험 시작에서 첨가하였으며,V. harveyi세포가 제거된 배양액이 첨가될 때 얻어지는 활성도의 퍼센트는 5시간 점에 대한 데이터로 제시하였다. 균주에 대해 이용한 약어들은 다음과 같다: V.h;V. harveyi, S.t;S. typhimurium및 E.c;E. coli.

도 2는 살아있는E. coli및S. typhimurium에 의한 신호분자의 능동분비를 나타낸 그래프이다.E. coliDH5에 의해서는 생산이 되지 않으며,V. harveyi리포터 균주BB170(센서 1^-, 센서 2⁺)의E. coliAB1157과S. typhimuriumLT2에 반응하여, 생산, 분비되는 신호물질에 대한 반응을 나타낸다.V. harveyi리포터 균주 BB170을 AB배지로 1:5000으로 희석하여, 세포 당 빛 생성을 세균이 성장하는 동안관찰하였다. 실험시작에서, 1 x 10⁶세포수로E. coliAB1157,S. typhimuriumLT2 혹은E. coliDH5을 세척하고 재현탁한 살아있는 세포들(왼쪽, 흰 바) 혹은 UV로 사멸된 세포들(오른쪽, 검은 바)을 첨가하였다. 데이터는 5 시간 점에서V. harveyiBB170에 의하여 발현되는 발광의 내재성 수준(level)에 대한 활성도 배수(fold-activation)로 제시하였다.

도 3은S. typhimuriumLT2의 신호활성의 생성과 분해에 대한 포도당 고갈(depletion)의 효과를 나타낸 그래프이다.S. typhimuriumLT2는 0.1% 포도당 혹은 0.5% 포도당이 포함된 LB배지에서 증식되었다. 특정 시간에 세포가 제거된 배양액을 채취하여 발광자극검정(바)에서 신호활성과 잔류 포도당의 농도(원)를 검정하였다. 세포 수는 LB배지에S. typhimuriumLT2를 각 시간에 희석, 플레이팅(plating)하여 그 다음날 집락의 수를 세어서 결정하였다(네모). 신호활성은V. harveyi세포가 제거된 배양액이 첨가될 때 얻어지는 활성의 퍼센트로 제시하였다. 데이터는 발광자극검정에서 5시간 점에 해당된다. 포도당의 농도는 %잔류 포도당으로 제시하였다. 표시 ＼＼는 시간 축이 8시간 이후 스케일(scale)이 도시되지 않음을 나타낸다.

도 4는V. harveyi와S. typhimurium가 생산하는 AI-2에 대한V. harveyi의 반응 곡선을 나타낸 그래프이다.V. harveyi주 BB152(AI-1^-, AI-2⁺)가 만든 외재성(exogenous) AI-2의 첨가에 따른V. harveyi리포터 균주BB170 (센서 1^-, 센서 2⁺)의 반응을 검정하였다. 전기 리포터 균주의 브라이트(bright)배양액을 1:5000으로 희석하고, 10%(v/v) 증식 배지(닫힌 원), AB에서 하루 밤 동안 증식한V. harveyiBB152로부터 얻은 세포가 제거된 배양액(열린 원), 혹은 LB + 0.5% 포도당에서 6시간 동안 증식한S. typhimuriumLT2로부터 세포가 제거된 배양액(닫힌 네모)을 실험 시작에서 첨가하였다. RLU는 상대 빛 단위이고 (수 min^-1x 10³)/ (집락형성 단위 ml^-1)로서 정의 된다.

도 5는S. typhimurium에서 자가유도체 생산에 영향을 미치는 조건들을 나타낸 그래프이다.S. typhimurium에 다양한 처리들을 한 후, 세포가 제거된 배양액이나 삼투적 자극액을 조제하였다. 이들 시료(preparation)를V. harveyiAI-2리포터 균주BB170의 희석 배지에 10% (v/v)로 첨가하고 난 후, 빛 생성을 측정하였다. 활성도 배수(fold avtivation)는 특정S. typhimurium의 첨가 후에 리포터 균주가 생성하는 빛을, 증식배지만을 첨가했을 때 리포터 균주가 생성하는 빛으로 나누어 준 수준(level)이다. 도 5A에서 바는 하기의 처리조건 후에S. typhimurium로 부터 만들어진 세포가 제거된 배양액을 나타낸다: LB 6h; LB배지에서 6시간 동안 30^oC에서 증식, LB + Glc 6h; 0.5% 글루코스가 포함된 LB배지에서 6시간 동안 30^oC에서 증식, LB + Glc 24h; 0.5% 글루코스가 포함된 LB배지에서 24시간 동안 30^oC에서 증식. 도 5B에서 제시한 모든 실험에서,S. typhimurium은 0.5% 글루코스를 포함한 LB에서 6시간 동안 0^oC에서 전 증식(pre-grown)되었고, 펠렛(pellet)화시키고, 하기의 조건하에서 2시간 동안 재현탁하였다: LB; LB배지에서 30^oC, LB + Glc; 0.5% 글루코스가 포함된 LB배지에서 30^oC, LB pH 5; LB배지에서 pH 5, 30^oC.

도 6은 제한 및 비제한 포도당 농도에서의S. typhimurium신호 활성을 나타낸 그래프이다.S. typhimuriumLT2는 제한(0.1%) 및 비제한(1%) 포도당 농도의 LB배지에서 증식시켰다. 세포가 제거된 배양액(검은 바)에 존재하는 활성을 각각 표시된 시간에 분석하여 1 x 10⁹세포에 의하여 생성된 것으로 환산하였다. 동일 세포들로부터 만들어진 0.4M 삼투적 자극액에서 측정된 신호활성에서의 증가를 검은 바 위에 흰 바로 나타내었다. 이 데이터 역시 1 x 10⁹세포에 의하여 생성된 것으로 환산하였다. 제한된 포도당에 대한 신호활성은 도 6A, 6C 및 6E에서, 비 제한된 포도당에 대한 것은 6B, 6D 및 6F에서 보여준다. 도 6A와 6B는 잔류 포도당(삼각형), 도 6C와 6D는 세포 수를 보여 주며(네모), 도 6E과 6F는 각 시간 점에서의 pH를 나타낸다(팬널).

도 7은S. typhimurium에 의한 신호생성에 포도당과 pH가 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.S. typhimuriumLT2에 의하여 유리된 정족수 감지 신호는 세포가 0.5% 포도당을 포함하는 LB배지에서, pH 7.2에서 자랄 때(도 7A, 바) 및 첨가된 탄소원 없는 LB배지에서, pH 5.0에서 자랄 때(도 7B, 바) 측정되었다. 세포가 제거된 배양액(검은 바) 및 0.4M 삼투적 자극액(검은 바 위에 흰 바)에 각각 존재하는 신호수준을 제시된 각 시간 점에서 측정하였다. 각 팬널(panel)에서 원은 배지의 pH를, 네모는 각 시간에서의 세포 수를 보인다.

도 8은S. typhimuriumLT2에서 고삼투압은 신호 유리를 유도하고, 저삼투압은 신호분해를 유도함을 나타내 주는 그래프이다.S. typhimuriumLT2에 의하여 유리된 정족수 감지 신호를 0.4M NaCl에 재현탁하고, 단백질합성의 존재와 부재상태에서 각각 측정하였다.S. typhimuriumLT2를 0.5% 포도당에서 6시간 동안 전 증식(pre-growth)시켜, 표시된 시간 동안 30 g/ml Cm의 존재 혹은 부재 하에서 0.4M NaCl(도 8A) 혹은 0.1M NaCl(도 8B)에서 세포를 수확하여 재현탁하였다. 각 팬널에서 열린 표시는 Cm의 부재 하에서, 그리고 닫힌 표시는 Cm의 존재하에서 측정된 활성을 나타낸다.

도 9는V. harveyi와E.coliMG1655로부터 분리한luxS와ygaG유전자를 나타낸 그림이다. 도 9A는 Tn5 삽입으로 정의되는V. harvey luxS _{V .h.}염색체 부분의 제한지도(restriction map)를 보여 준다. AI-2생산능력을 파괴하는 Tn5 삽입 및luxS _{V .h.}유전자 좌의 바깥쪽 하나의 조절 Tn5 삽입부위가 보여진다(삼각형). 도 9B는E.coliMG1655의 염색체에ygaG부분을 나타낸다. 이 ORF는 emrB와 gshA유전자들에 의하여 연결되어 있다. 각 유전자의 전사방향은 수평화살표로 나타내었다.S. typhimuriumLT2에서의 AI-2생산을 제거하는 MudJ삽입의 상응하는 위치는 수직화살표로 나타내었다. H, R, P 및 B는 각각HindIII, EcoRI, PstI및BamHI제한위치를 나타낸다.

도 10은V. harveyi와S. typhimurium균주들의 자가유도체 생성 표현형을 나타내는 그래프이다.V. harveyi와S. typhimurium균주들로부터 세포가 제거된 배양액을 만들어V. harveyiBB170의 생물학적 검정으로 AI-2활성을 알아보았다. 도 10A는luxS _V.h.의 바깥쪽에 Tn5 삽입부위를 가지고 있는 야생형V. harveyi균주 MM28(WT로 표시) 및 Tn5 돌연변이 균주 MM30(luxS-로 표시)의 AI-2 생성 표현형을 나타낸다. 도 10B는 야생형S. typhimuriumLT2 (WT로 표시)와ygaG::MudJ 삽입 돌연변이 균주 CS132(ygaG-로 표시)의 AI-2 생성 표현형을 나타낸다. 활성은 멸균 배지를 첨가한 위에V. harveyiBB170 리포터 균주의 발광발현의 유도배수(fold-induction)로 나타내었다.

도 11은S. typhimuriumCS132와E. coliDH5에서 AI-2생산의 상보성(complementation)을 나타낸 그래프이다.E.coli와S. typhimurium균주로부터 세포가 제거된 배양액으로 생물학적 검정에서 AI-2활성을 알아보았다. 전기 배양액에 존재하는 활성을 야생형V. harveyiBB120이 생산한 것과 비교하였으며, BB120 활성 수준(level)을 100%로 환산하였다. 도 11A는 야생형V. harveyiBB120와E.coliO157: H7 및S. typhimuriumLT2의 세포가 제거된 전기 배양액에 존재하는 AI-2활성을 나타내었다. 도 11B는S. typhimuriumCS132 (ygaG:: MudJ)의 상보성 및 도 11C는E.coliDH5의 상보성을 나타내었다. 팬널 B와 C에서,In transAI-2생산 유전자는 다음과 같다: 벡터 대조군(control)(none으로 표시),E.coliO157: H7ygaG; 및V. harveyiBB120luxSv. h이며,E.coli와V. harveyi는 각각E.c와 V.h로 약기하였다.

도 12는luxS와YgaG단백질 서열의 정렬(alignment)을 나타낸 그림이다. AI-2 생산집단(family) 단백질의 전사된 단백질 서열을 보여준다.V. harveyiBB120로부터luxS _V.h.유전자 서열을,E.coliMG165,E.coliO157: H7 및E.coliDH5로부터YgaG유전자 서열(여기서,luxS _E.C 로 다시 명명)을 결정하였고,S. typhimuriumLT2ygaG(여기서,luxS _{s.t .} 로 다시 명명) 부분서열은S. typhimurium데이터베이스에서 가져왔다.luxS _{V .h.}단백질과 일치하지 않은 아미노산 잔기들은 굵은 선으로 밑줄 그었다.E. coliDH5 DNA 서열에서 해독틀 변환(frame shift) 돌연변이는 "＊”로 표시하였다. 해독틀 변환 다음에 오는 번역(translation)되는 20개의 달라진 아미노산 잔기는 박스로 묶었다.

도 13은V. harvey의 교잡형(hybrid) 정족수 감지환(qourum sening circuit)을 나타낸 그림이다. AI-1와 AI-2환(circuit)은 독립적으로 자극되지만 빛 발현을 위한 신호들은 서로 연관되어 있다. 그러나 각 경로는 또한 독립적으로 빛을 생성할 수 있다. 이는 LuxN혹은 LuxQ센서에서 상반돌연변이(reciprocal mutations)로 AI-1 또는 AI-2 각각에 대하여 리포터(reporter)특이적으로 만드는 것을 가능하게 한다.

도 14는V. harveyi야생형과 lux조절 돌연변이의 반응 표현형을 나타낸 그래프이다. 처음시간 점에서, 세포가 제거된 배양액(10%)을 첨가하거나 무첨가(N.A)하였다. 야생형, 세포가 제거된 배양액(AI-1 + AI-2); LuxS^-세포가 제거된 배양액(AI-1); LuxM^-세포가 제거된 배양액(AI-2). 상대적 빛 단위는 cpm x 10³/CFU/ml로 정의 하였다.

도 15는 자가유도체-2(AI-2)의 생합성 경로를 나타낸 그림이다.

도 16은 AI-2구조와 AI-2가 만들어지는 생합성 전구체를 보여주는 그림이다.

본 발명에 의하면,S. typhimurium과 대장균이 포함하는 몇 가지 병원균에 의하여 생산되는 세포외 신호인자를 동정, 분리, 특성화(characterization)하였는데, 이는 발병 혹은 병원성에 있어서 중요한 역할을 한다. 본 발명자들은 또한 전기 신호인자의 생합성에 관여하는 유전자들을 동정, 클로닝하였다. 신호분자 및 그의 생합성을 촉매하는 단백질을 암호화하는 유전자들의 정제 및/또는 클로닝은 세균에 의한 신호분자의 생산저해 혹은 이에 대한 반응을 목적으로 하는 약물을 고안하는 데 있어 새로운 장을 연다. 전기 분자에 의한 신호(signalling)를 방해하기 위하여 고안된 약물들은 새로운 종류의 항생제가 될 것이다. 본 발명은 더욱이 자가유도체를 검출하는 방법과 자가유도체-2의 생체외(생체외(in vitro)) 생산을 위한 방법을 제시한다.

I. 정의:

본 발명의 생물학적 분자에 관련한 다양한 용어들은 명세서 본문과 청구범위에서 이용되었다. “실제적으로 유사한 것(sustantially the same)" “% 유사성(percent similarity)” 및 “% 동일성(percent identity)”이라는 용어는 하기에서 상세히 정의된다.

본 발명의 새로운 신호인자와 관련하여, "신호인자(signaling factor)", “신호분자(signaling molecule)”, “자가유도체(autoinducer)" 및 보다 구체적으로는, “자가유도체-2(autoinducer-2)” 혹은 “AI-2”로 언급하였다. “자가유도체-2”와 “AI-2”라는 용어는 특히V. harveyi가 생산한 신호분자를 말한다. “신호인자”, “신호분자” 혹은 “AI-2 유사 분자(AI-2-like molecule)”라는 용어는 본 발명의 신호인자, 예를 들어 AI-2를 일반적으로 언급하기 위함이다.

본 발명의 핵산과 관련하여, “분리된 핵산(isolated nucleic acid)”이라는 용어가 때때로 이용된다. 전기 용어는, DNA에 이용될 때 그것이 유래된 생물체의 자연 발생적 게놈에 있어서 바로 연결된 (5’과 3’방향에서) 서열로부터 분리된 DNA분자를 말한다. 예를 들어, “분리된 핵산”은 플라스미드 혹은 바이러스벡터와 같은 벡터속으로 삽입되거나 진핵 혹은 원핵 생물의 게놈 DNA로 끼어 들어가는 DNA분자를 말한다. “분리된 핵산 분자”는 또한 cDNA 분자를 포함할 수 있다.

본 발명의 RNA 분자와 관련하여, “분리된 핵산”은 위에 정의된 분리된 DNA분자에 의하여 암호화되는 RNA분자를 주로 언급한다. 다시 말하면, 이 용어는 그것의 자연적 상태에서(즉, 세포나 조직에서) 연관되는 RNA분자들로부터 충분히 분리된, 그래서 “실제적으로 순수한(substantially pure)” 형태로 존재하는 (“실제적으로 순수한"이라는 용어는 아래에 정의되어 있다) 어떤 RNA 분자를 말한다.

단백질과 관련하여, “분리된 단백질(isolated protein)” 혹은 “분리, 정제된 단백질(isolated, purified protein)”이라는 용어가 여기에서 때때로 사용된다. 이 용어는 본 발명의 분리된 핵산분자의 발현에 의하여 생성된 단백질을 주로 언급한다. 또한 이 용어는 자연적으로 연관된 다른 단백질들과 충분히 분리되어서 “실제적으로 순수한” 형태로 존재하는 단백질을 말한다.

“실제적으로 순수한”이라는 용어는 중요한 인자(the factor of interest)(예로서, 질병 발생 신호인자, 핵산 및 단백질 등)가 적어도 무게로 50~60%가 들어 있는 시료(preparation)를 말한다. 보다 바람직하게는, 전기 시료가 적어도 무게의 75%를 구성하고, 가장 바람직하게는 무게의 90~99%이다. 순도는 전기 중요한 인자에 적합한 방법(예, 크로마토그라피법, 아가로스 또는 폴리아크릴아미이드 젤 전기영동, HPLC 분석 등)으로 측정하였다.

본 발명의 항체와 관련하여, “면역학적으로 특이적(immunologically specific)”이라는 용어는 중요한 단백질의 한 개 이상의 항원 결정소(epitope)에 결합하지만, 항원생물분자의 혼합된 집단을 함유하는 표본(sample)에 있는 다른 분자들을 실제적으로 인식하고 결합하지 못하는 항체들을 언급한다.

올리고뉴클레오타이드와 관련하여, “특이적으로 혼성화하는(specifically hybridizing)”이라는 용어는 당업계에서 통상적으로 이용되는 선-결정된 조건(pre-determined condition)하에서 그런 혼성화를 가능하게 하는 충분히 상보적인 서열을 가진 두 단일쇄 뉴클레오타이드 사이의 연합(association)을 말한다(때로는 “실제적으로 상보적”이라고 함). 특히, 어떤 올리고뉴클레오타이드와 본 발명의 단일쇄 DNA 혹은 RNA분자내에 포함된 실제적으로 상보적인 서열과 혼성화 및 올리고뉴클레오타이드와 단일쇄의 비상보적 서열과의 혼성화를 말한다.

“프로모터부위(promoter region)”라는 용어는 유전자의 전사조절부위이고, 암호화부위의 5′또는 3′ 암호화부위 내 또는 인트론들 내에서 발견된다.

“선택 가능한 표시 유전자(selectable marker gene)”라는 용어는 형질 전환된 세포에서 발현되었을 때, 항생제 저항성과 유사한 선택가능한 표현형을 가지는 산물을 암호화하는 유전자를 말한다.

“리포터유전자(reporter gene)”라는 용어는 표준방법에 의하여, 직접 혹은 간접적으로 쉽게 검출가능한 산물을 암호화하는 유전자를 말한다.

“작동적으로 연관된(operably linked)”라는 용어는 암호서열의 발현에 필요한 조절서열이 암호에 관련하여 적당한 위치에 존재함으로써, 암호서열의 발현을 가능하게 하는 것을 의미한다. 이와 유사한 정의는 때로 전사단위 및 다른 조절인자(예, 촉진자(enhancer) 혹은 전사조절서열)의 정렬(arrangement)에 적용된다.

II. 신호인자에 대한 설명:

본 발명은 “이질성 생물학적 검정(heterologous bio-assay)”을 제공하는데 이것은 병원균 중에서S. typhimurium와E.coli에 의하여 생산되는 세포외 신호인자의 동정을 가능하게 한다. 전기 인자는 본 명세서에서 병원성 신호(pathogenesis signaling) 인자 혹은 분자로 언급되며, 질병발생 이외에 세균에서 다양한 생리적 변화에 대한 신호로써 작용한다. 전기 인자는 정족수 감지 세균인S. typhimurium의 AI-2의 활동을 흉내내고, 이는V. harveyi신호계 2 검출자(detector)인 LuxQ를 통하여 특이적으로 작용한다.

전기 신호분자는 작고 가용성이며, 열에 불안정한 유기분자로 세가지 세균 모두에서 세포간 신호교류(communication)에 관여한다. 대장균과 살모넬라에서 전기 분자의 최대분비는 중간적 대수 증식기(mid-exponential phase)에 나타나고 세포외 활성은 포도당이 배지에서 고갈됨에 따라서 혹은 정지기에 접어들면서(the onset of stationary phase) 분해된다. 정지기에서 신호분자의 파괴는 다른 정족수 감지계와는 반대로, 신호분자를 이용하는 세균에서 정족수 감지는 전 정지기(pre-stationary phase)에서 조절적 행동에 핵심적이라는 것을 시사한다. 단백질 합성이 그 활성의 분해에 필요한데, 이는 복합적 조절환(a complex regulatory circuitry)이 이들 장내 세균에서 정족수 감지를 조절한다는 것을 시사한다.

증가된 신호활성은 세균이 포도당 존재하에서 성장 후 고삼투압(예, 0.4M NaCl) 혹은 낮은 pH (예, pH 5.0)환경으로 옮겨질 때 관찰된다. 아울러, 그 신호의 분해는 저삼투압 조건(예, 0.4M NaCl)에 의하여 유도된다. 고삼투압과 낮은 pH는S. typhimurium와E. coli같은 병원성 장내세균이 접하는 두 가지 환경이며, 숙주 내에서 병원성 상태로의 전환을 거친다. 따라서, 이들 세균에서 정족수 감지는 숙주의 질병을 조절하는데, 세균과 숙주의 연합 상태(host-associated existence 즉, pathogenic existence)와 자유 유영 상태(free-living existence)사이에 전이(transition)를 하게 하는 방법으로 관여하는 것으로 보인다.

신호분자의 활성을 조절하는 다른 인자들은 실시예 2에 보다 상세히 기술되어 있다. 구체적으로S. typhimurium에서 분자의 조절이 예시되어 있다. 생물학적 검정에서 lux 유도시간과S. typhimurium와E.coli신호에 대한V. harveyi의 반응곡선 모양은 그 자신의 신호계 2 유도자인 AI-2에 반응하는V. harveyi의 그것과 구별이 안된다. 더 나아가서,S. typhimurium , E.coli및V. harveyi로부터의 신호분자 각각은 유사한 방법에 따라 부분 정제할 수 있다. 이들 결과는 앞서 언급한 생물체들의 각각으로부터의 분자들이 유사하거나 매우 밀접하게 연관된다는 것을 시사한다. 따라서,V. harveyi로부터 AI-2는 본 발명의 신호분자이지만,Salmonella와Escherichia같은 병원성 장내세균에서의 역할과는 다른 역할을 하는 것으로 보인다.

A: AI-2 신호인자의 구조

따라서, 본 발명의 다른 측면에 의하면, 자가유도체-2(AI-2) 신호인자와 그 유도체들이 제공된다. 본 발명의 AI-2는 다양한 응용에서 세균 증식을 조절하는 데 이용될 수 있다. 본 발명은 하기의 일반식을 가지는 자가유도체-2분자를 제공한다:

상기 식에서, R₁, R₂, R₃,및 R₄은 하리드리도(hydrido), 할로(halo), 알킬(alkyl), 할로알킬(haloalkyl), 사이클로알킬(cycloalkyl), 사이클로알케닐(cycloalkenyl), 헤테로사이클릴(heterocyclyl), 메틸(methyl), 시아노(cyano), 알콕시카르보닐(alkoxycarbonyl), 아미노(amino), 카르보닐(carbonyl), 하이드록실(hydroxyl), 포밀(formyl), 나이트로(nitro), 플루오로(fluoro), 클로로(chloro), 브로모(bromo), 메틸(methyl), 아릴(aryl), 헤테로아릴(heteroaryl), 아랄킬(aralkyl), 헤테로아릴알킬(heteroarylalkyl), 알킬설포닐(alkylsulfonyl), 할로알킬설포닐(haloalkylsulfonyl), 아릴설포닐(arylsulfonyl), 헤테로아릴설포닐(heteroarylsulfonyl), 하이드록시알킬(hydroxyalkyl), 헤테로아릴옥시알킬(heteroaryloxyalkyl), 알킬티오알킬(alkylthioalkyl), 아릴티오알킬(arylthioalkyl), 알킬티오알킬(alkylthioalkyl), 헤테로아릴티오알킬(heteroarylthioalkyl), 아랄킬티오알킬(aralkylthioalkyl), 헤테로아릴알킬티오알킬(heteroarylalkylthioalkyl), 할로알킬카보닐(haloalkylcarbonyl), 할로알킬(하이드록시)알킬(haloalkyl(hydroxy)alkyl),알킬카르보닐(alkylcarbonyl), 아릴카르보닐(arylcarbonyl), 아랄킬카르보닐(aralkylcarbonyl), 헤테로아릴카르보닐(heteroarylcarbonyl), 헤테로아릴카르보닐(heteroarylcarbonyl), 카르복시알킬(carboxyalkyl), 알콕시카르보닐알킬(alkoxycarbonylalkyl), 알킬카르보닐옥실알킬 (alkylcarbonyloxylalkyl), 아미노알킬(aminoalkyl), 알킬아미노알킬(alkylaminoalkyl), 아릴아미노알킬(arylaminoalkyl), 아랄킬아미노알킬(aralkylaminoalkyl), 아랄킬아미노알킬(aralkylaminoalkyl), 헤테로아릴아미노알킬(heteroarylaminoalkyl), 헤테로아릴(heteroaryl), 알킬아미노알킬(alkylaminoalkyl), 알콕시(alkoxy) 및 아릴옥시(aryloxy); 페닐(phenyl), 사이클로헥실(cyclohexyl), 사이클로헥세닐(cyclohexenyl), 벤조퓨릴(benzofuryl), 벤조디옥솔일(benzodioxolyl), 퓨릴(furyl), 이미다졸일(imidazolyl), 티에닐(thienyl), 티아졸일(thiazolyl), 피로일(pyrroyl), 옥사졸일(oxazolyl), 이속사졸일(isoxazolyl), 트리아조일(triazoyl), 피리미디닐(pyrimidinyl), 이소퀴노일(isoquinoyl), 퀴놀리닐(quinolinyl), 벤즈이미다졸일(benzimidazolyl), 인돌일(indolyl), 피라졸일(pyrazolyl) 및 피리딜(pyridyl); 아미노설포닐(aminosulfonyl), 플루로(fluro), 클로로(chloro), 브로모(bromo), 메틸티오(methylthio), 메틸(methyl), 에틸(ethyl), 이소프로필(isopropyl),t-부틸(tert-butyl), 이소부틸(isobutyl), 펜틸(pentyl), 헥실(hexyl), 시아노(cyano), 메톡시카르보닐(methoxycarbonyl), 에톡시카르보닐(ethoxycarbonyl), 이소프로폭시카르보닐(isopropoxycarbonyl),t-부톡시카르보닐(tert-butoxycarbonyl), 프로폭시 카르보닐(propoxycarbonyl), 부톡시카르보닐(butoxycarbonyl), 이소부틸카르보닐(isobutoxycarbonyl), 펜타옥시카르보닐(pentoxycarbonyl), 메틸카르보닐(methylcarbonyl), 플루오로메틸(fluoromethyl), 디플루오로메틸(difluoromethyl), 트리플루오로메틸(trifluoromethyl), 클로로메틸(chloromethyl), 디클로로메틸(dichloromethyl), 트리클로로메틸(trichloromethyl), 펜타플루오로에틸(pentafluoroethyl), 헵타플루오로프로필(heptafluoropropyl), 디플루오로에틸(difluoroethyl), 디플루오로프로필(difluoropropyl), 디클로로에틸(dichloroethyl), 디클로로프로필(dichloropropyl), 메톡시(methoxy), 메틸렌에디옥시(methylenedioxy), 에톡시(ethoxy), 프로폭시(propoxy),n-부톡시(n-butoxy), 하이드록시메틸(hydroxymethyl), 하이드록시에틸(hydroxyethyl), 메톡시메틸(methoxymethyl), 에톡시메틸(ethoxymethyl), 트리플루로메틸(trifluoromethyl), 하이드록시에틸(hydroxyethyl), 메틸아미노(methylamino), N,N-디메틸아미노(N,N-dimethylamino), 페닐아미노(phenylamino), 에톡시카르보닐에틸(ethoxycarbonylethyl) 및 메톡시카르보닐메틸(methoxycarbonylmethyl); 메틸(methyl), 에틸(ethyl), 플루오로메틸(fluoromethyl), 디플루로메틸(difluoromethyl), 트리플루로메틸 (trifluoromethyl), 시아노(cyano), 메톡시카보닐(methoxycarbonyl), 에톡시카보닐(ethoxycarbonyl),t-부톡시카보닐(tert-butoxycarbonyl),벤질(benzyl), 페닐에틸(phenylethyl), 페닐프로필(phenylpropyl), 메틸설포닐(methylsulfonyl), 페닐설포닐(phenylsulfonyl), 트리플루오로메틸설포닐(trifluoromethylsulfonyl), 하이드록시메틸(hydroxymethyl), 하이드록시에틸(hydroxyethyl), 메톡시메틸(methoxymethyl), 에톡시메틸(ethoxhymethyl), 메틸카보닐(methylcarbonyl), 에틸카보닐(ethylcarbonyl), 트리플루로메틸카보닐(trifluromethylcarbonyl), 트리플루로(하이드록시)에틸(trifluoro(hydroxy)ethyl), 페닐카보닐(phenylcarbonyl), 벤질카보닐(benzylcarbonyl), 메톡시카보닐메틸(methoxycarbonylmethyl), 에톡시카보닐옥시메틸(ethoxycarbonyloxymethyl), 카복시메틸(carboxymethyl), 카복시프로필(carboxypropyl), 메틸카보닐옥시메틸(methylcarbonyloxymethyl), 페닐옥시(phenyloxy), 페닐옥시메틸(phenyloxymethyl), 티에닐(thienyl), 프릴(furyl), 및 피리딜(pyridyl); 메틸티오(methylthio), 메틸설피닐(methylsulfinyl), 메틸(methyl), 에틸(ethyl), 이소프로필(isopropyl),t-부틸(tert-butyl), 이소부틸(isobutyl), 펜틸(pentyl), 헥실(hexyl), 시아노플루오로메틸(cyanofluoromethyl), 디플루오로메틸(difluoromethyl), 트리플루로메틸(trifluoromethyl), 클로로메틸(chloromethyl), 디클로로메틸(dichloromethyl), 트리클로로메틸(trichloromethyl), 펜타플로로에틸(pentafluoroethyl), 헵타플루오로프로필(heptafluoropropyl), 디플루오로클로로메틸(difluorochloromethyl), 디클로로에틸(dichloroethyl), 디클로로프로필(dichloropropyl), 메톡시(methoxy), 메틸렌디옥시(methylenendioxy), 에톡시(ethoxy), 프로폭시(propoxy), n-부톡시(n-butoxy), 하이드록시메틸(hydroxymethyl), 하이드록시에틸(hydroxyethyl) 및 트리플루로메톡시(trifluoromethoxy)로부터 각각 독립적으로 선택되었다.

본 명세서에 기술된 화학기들(chemical groups)은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있다. 예를 들어, 본 명세서에 사용된 “하이드리도 (hydrido)”라는 용어는 단일 수소원자(H)를 의미한다. 이 하이드리도 라디칼이, 예를 들어, 산소원자에 붙어서 하이드록실 라디칼을 만들거나 두개의 하이드리도 라디칼이 하나의 탄소원자에 붙어서 메틸렌 라디칼을 형성할 수 있다. 게다가 알킬 라디칼은 1개에서 약 10개의 탄소원자를 가지는 “저급 알킬(lower alkyl)”라디칼이다. 가장 바람직한 것은, 1개에서 약 6개의 탄소원자를 가지는 “저급 알킬”라디칼이다. 그러한 라디칼의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소-아밀 및 헥실 등이 포함된다. “할로(halo)”라는 용어는 할로겐들 즉, 불소, 염소, 브롬 혹은 인 등이 포함된다. “카르복시(carboxy)”혹은 “카르복실(carboxyl)”라는 용어는 -CO₂H를 의미한다. “카르보닐(carbonyl)”라는 용어는, 그것 홀로 또는 다른 용어와 함께 사용되어 -(S=O)를 의미한다.

바람직하게는, 본 발명의 자가유도체-2는 다음 구조를 가지는 4,5-디하이드록시-2.3-펜탄디온이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 발명의 자가유도체-2(AI-2)분자는 정족수 감지 신호계-2에 대한 확산 가능한 센서로서 작용하는 분자를 포함한다. 예를 들면, AI-2는 미생물의 병원성과 관련되어 있는 유전자의 발현을 증가 또는 감소시킴으로써 다른 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 통상적으로, 자가유도체 분자는 대사 도중, 세균같은 미생물에 의하여 생산된다. 예를 들면, 본 발명의 자가유도체-2(AI-2)는 LuxP와 상호작용할 수 있으며, LuxP는V. cholerae,S. typhimurium및E. coli같은 병원성 세균의 LuxP 유전자와 유사한 것들에 의하여 암호화되는 단백질이다. AI-2-LuxP복합체는 LuxQ와 상호작용할 수 있으며, LuxQ는 LuxQ유전자에 의하여 암호화되는 단백질이다. AI-2-LuxP-LuxQ의 상호작용은Vibrio spp.같은 세균에서의 발광을 촉진할 수 있다. AI-2- LuxP- LuxQ 상호작용은 세균성 질병 발생에 필요한 생합성경로의 활성화와 연관되어 있다. 따라서, 본 발명은 세균성 유전자 발현을 조절하고, AI-2-LuxP-LuxQ의 상호작용을 조절(control)함으로써 세균성 질병발생을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 자가유도체 분자로서 호모시스테인을 이용하는 방법이 제공된다. 호모시스테인의 구조는 다음과 같다.

호모시스테인은 S-리보실호모시스테인에서 LuxS단백질의 활성에 의하여 생성된다(참조: 도 16). 이로써, 본 발명은 자가유도체로서 호모세린을 이용하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 자가유도체-2의 광학 활성 이성질체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되었듯이, “이성질체(isomer)”는 본 발명의 자가유도체-2의 분자식과 동일하지만 분자내에서 원자의 다른 배열때문에 다른 화학적 그리고 물리적 성질을 가지는 분자들을 포함한다. 본 명세서에서, “광학적으로 활성적인(optically active)”는 극성화 된 빛의 판을 회전시키는 능력을 가진 분자들을 포함한다. 광학 활성 이성질체에는 본 발명의 자가유도체-2 분자의 L- 이성질체와 S-이성질체가 포함된다.

광학 활성 이성질체 이외에도, 자가유도체-2 분자의 유사체(analog)가 본 발명에 포함된다. 본 명세서에서 AI-2의 "유사체”는 문제의 자가유도체 분자 4,5,-디하이드록시-2,3-펜탄디온과 구조적으로 유사하지만 동일하지 않은 분자를 포함한다. AI-2 의 유사체에는 LuxP 단백질의 활성을 자극하기 보다는 저해하는 분자들이 포함될 수 있다. 예를 들어, LuxP와 비생산적 상호작용을 할 수 있는 AI-2 의 유사체가 포함될 수 있다. 그런 분자는 LuxP에 결합하는 능력을 가질 수는 있으나, AI-2-LuxP 복합체의 유사체는 LuxQ와 생산적으로 상호 작용하여 세균성 질병 발생 저해를 초래할 수 없을 것이다. 이로써, 본 발명의 AI-2 유사체는 LuxP 에 결합하기위하여 내재성(endogenous) AI-2와 경쟁함으로써 세균성 질병발병의 저해제로서 작용할 수 있다. 게다가 AI-2 유사체는, AI-2- LuxP 복합체의 유사체가 LuxQ와 비생산적 상호작용을 할 수 있도록 만들어질 수 있다. 이 경우 유사체 AI-2-LuxP-LuxQ복합체는, 예를 들어 질병발생에 필요한 전사적 활성화 같은 연속적인 생화학적과정에 대하여 비기능적이 된다. 본 발명에는 또한 LuxP 단백질의 활성을 증가시키는 AI-2의 능력을 상승적으로(synergistically) 증가시킬 수 있는 AI-2 유사체가 포함된다.

신호분자의 조제

본 발명의 신호분자를 정제하는 초기방식(initial strategy)으로 생물발광을 1000배 증가시키는 부분 정제물의 0.1-1.0 mg으로 산출되는 비활성을 가지는 분자를 포함하는 부분정제시료가 만들어지며, 이는V. harveyi생물분석에서 측정되었다. 이 신호분자는 유기용매 속으로 정량적으로 추출되지 않고 양이온이나 음이온 컬럼에 결합하지 않는다. 이 분자는 작고(1,000kDa이하), 극성이나 비 하전된 유기인자(organic factor)이다. 그 활성은 산에 안정하고 염기에 불안정하며, 그리고 80^oC까지 열에 안정하나 100^oC 까지는 안정하지 않다. 신호분자의 특성으로 이 분자가 이전에 기술된 어떤 자가유도체와도 다르다는 것은 명백하다.

본 발명의 신호분자는 그것의 자연적인 원료, 즉 그것을 생산하는 세균들, 로부터 정제될 수 있다. 자연적인 원료로부터의 정제와 관련하여, 배지를 바꿈으로써, 예로서 포도당이나 다른 당(sugar)을 첨가함으로써, 삼투압을 증가시킴으로써, 및/또는 pH를 감소시킴으로써, 살모넬라와 다른 장내 세균에서 신호분자를 증가시킬 수 있고, 또한 신호분자의 정제를 거의 순수하게 할 수 있다. 이로써, 전기 분자는 하기의 프로토콜을 이용하여 장내세균(예,E. coli, S. typhimurium)의 배양액으로부터 고도로 정제되었다:

1. 0.5% 포도당이나 다른 당을 포함하는 LB배지에 그 신호분자를 생산하는 장내세균이 들어있는 배지를 하룻밤(overnight) 배양(30^oC, 통기(aeration)하면서)하고, 0.5% 포도당이나 다른 당을 포함하는 새로운 LB배지에 하룻밤 배양한 액을 1:100 희석하여 접종한다. 이 희석된 배양액을 중간 대수 증식기까지 배양한다(3.5 h, 30^oC, 통기하면서).

2. 세포를 펠렛화(pelleting)하고(10,000 rpm, 10min, 4^oC), 배지를 제거한 후, 전기 세포를 원래 부피의 1/10 만큼의 저삼투압 용액(0.1M NaCl수용액)으로 재현탁하고 세척한다.

3. 세포를 다시 펠렛화하고(10,000 rpm, 10min, 4^oC), 저삼투압 배양액을 제거한 후, 전기 세포를 원래 부피의 1/10 만큼의 고삼투압 용액(0.4M NaCl수용액)으로 재현탁하고 세척한 다음, 현탁액을 30^oC에서 2h 동안 통기하면서 배양한다. 배양하는 동안 신호분자의 생성과 분비가 증가된다.

4. 세포를 펠렛화하고(10,000 rpm, 10min, 4^oC), 분비된 신호분자가 들어 있는 상층액은 모아서, 0.2M 세균성 필터를 통과시켜 잔류 세포을 제거한다.

5. 액상의 여과물(filtrate)을 회전식 증발기(evaporator)를 이용하여 30^oC에서 증발시킨 후, 건조시킨 여과물을 원래 부피의 1/10 만큼의 클로로포름:메탄올(70:30)로 추출한다.

6. 유기추출물을 회전식 증발기를 이용하여 실온에서 증발시킨후, 건조된 추출물을 원래 부피의 1/100 만큼의 메탄올(70:30)로 추출한다.

7. 부분 정제된 신호물을 조제용(preparative) 역상 C18컬럼을 이용하여 고성능 액상 크로마토그라피(HPLC)에 적용한 후, 수중 0-100% 아세토니트릴의 선상 구배로 분당 5ml의 속도로 이 분자를 용출(elution)시킨 다음, 5 ml씩 30 분획을 수집한다.

8. 이 HPLC 분획을V. harveyiBB170 AI-2 분석방법으로 분석하여, 활성 분획을 수집한다.

C18컬럼의 결과물에는 신호분자와 소수의 다른 유기 분자들이 포함되어 있다. 이 고도로 정제된 신호분자 시료는 위에서 언급한 부분 정제물(고삼투압 단계나 마지막 HPLC 단계를 거치지 않은 시료) 보다 50-100배 더 높은 활성을 가진다. 즉, 1-10 μg의 시료가V. harveyi의 생물 분석에서 1000배 발광증가를 촉진한다.

이 신호분자를 정제하기 위한 연속적인 기술들로 AI-2를 생성하는 생체외(생체외(in vitro))계의 동정이 가능하다. 이로써, 클론화되고, 과발현되어 정제된S. typhimuriumLuxS 단백질 이외에, 본 발명은 또한생체외(in vitro)에서 AI-2를 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명은 매스 스펙트럼분석(mass spectral analysis)과 NMR분석, 그리고 AI-2의 활성을 조절하는 성분을 스크리닝하는데 유용한 많은 양의 순수한 AI-2를 만드는 기술을 제공한다. 더욱이 본 발명은 AI-2를 합성하는 생체 내(생체내(in vivo)) 생합성 경로를 결정하는 방법을 제공한다. AI-2 생성을 위한 생체외(생체외(in vitro)) 방법은 후술하는 실시예 5와 도 15에 개시하였다. 이 방법은 앞으로의 연구를 위한 자가유도체의 효과적 생산에 새로운 수단을 제시한다. 이 방법은 또한, 상업적 실시에 이용하기 위한 상당량의 AI-2 생산을 위한 수단을 제공한다. 그러한 실시에는, 이에 국한되지는 않지만, 본 발명의 AI-2 를 증식배지에 첨가하여 세균성장을 증가시키는 것이 포함된다. 이런 방법은 배양된 세포로부터 항생물질을 생산하는데 특히 유용하다. AI-2 첨가로 세포증식을 촉진시킴으로써 이러한 생물체들의 항생물질 생산을 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, 신호인자 AI-2는 실시예 5에서 개시한 생체외(생체외(in vitro)) 방법에 의하여 생산된다.

신호인자의 활용

본 발명에서 분리 정제된 신호분자는 AI-2활성 조절을 위한 성분 고안의 표적(target)으로서 이용될 수 있다. 본 명세서에 기술된 “조절하다”라는 용어는 AI-2활성을 증가 혹은 감소시키는 것을 포함한다. 본 명세서에 기술된, “AI-2활성”이라는 용어는 세균성 정족수감지에 있어서 신호인자로써 작용할 수 있는 이 분자활성의 어떤 측면들을 포함한다. “성분(compound)"은 AI-2활성에 영향을 미치는 어떤 작용물질(agent)이나 조성물(composition)이 될 수 있다. 예로서, 본 발명의 성분은 핵산이나 단백질 혹은 작은 분자들이 될 수 있다. 이로써, 본 발명은 AI-2분자의 활성을 저해하거나 아니면 이 분자가 관여하는 신호경로를 차단시키는 새로운 종류의 항생물질을 동정하는 수단을 제공한다. 이러한 저해 인자들은 다양한 검사 성분들의 대량 스크리닝에 의해 동정되는데, 그 정제된 신호분자 존재하에서V. harveyi생물분석을 이용한다. 검정성분의 존재하에서 신호활성의 감소는 그 성분이 그 신호분자의 활성을 저해하거나 그 병원성 신호경로의 다른 부분을 차단시키는 능력을 가지는 것으로 볼 수 있다.

또한, 본 발명은 AI-2의 특이적인 저해제나 비기능적 유사체의 합리적 디자인을 위한 근거를 제시한다. 그러한 구조 특이적 저해제나 유사체는V. harveyi생물분석으로 그 신호분자를 저해하거나, 그 병원성 신호경로를 차단시키는 능력을 검정할 수 있다.

본 발명은 자연적으로 생성되어 자가유도체-2와 같은 신호분자의 활성을 저해하는 성분들을 검정하는 방법을 제시한다. 예로서, 세균성 균체화를 피하기 위하여 진핵 생물체가 이용하는 방어적 전략은 정족수감지가 조절되는 기능들을 표적으로 하여 저해하는 것이다. 이러한 기작이D. pulchra에서 밝혀졌다. 최근 연구에 따르면D. pulchra에 의해 생성된 할로겐화된 퓨라논(halogenated furanone)이 LuxR의 호모세린-락톤(HSL) 자가유도체 결합자리에 대하여 경쟁함으로써 정족수감지를 저해한다. 새로운 자가유도체와 그 자가유도체와 상호 작용하는 세포성 성분을 제공함으로써, 본 발명은 자연적으로 발생되는 성분들에 있어서 정족수감지계-2에 대한 그들의 효과를 조사하는 방법을 또한 제공한다. 예로서, 자연적으로 생성되는 성분들을 자가유도체-2-LuxP 상호작용에 대한 그들의 효과에 조사할 수 있다. 혹은, 그런 성분들을 자가유도체-2-LuxP- LuxQ 상호작용에 대한 그들의 효과에 조사할 수 있다.

당업계의 통상의 지식을 가진 자들은 신호분자에 대한 표적이 대장균에서 동정되어 왔기 때문에, 그 대장균 표적의 저해는 또한 잠재적인 신호분자의 저해제 혹은 유사체를 찾는데 이용할 수 있을 것이다. 본 발명에서 ler-lacZ 리포터 융합물이 만들어져 대장균 O157:H7(병원성 균주)에서 유형III 분비 유전자의 발현 감소를 검정하는데 사용하였다. 더욱이, 어떤 유사한 좌위가S. typhimurium에 존재한다.

이로써, 본 발명은 자가유도체-2 분자, 4,5,-디하이드록시-2,3-펜탄에디온, 의 저해제들이나 시너지스트(synergiest)를 찾는 방법을 제공한다.

본 명세서에 기술된, AI-2의 “저해제”는, 그 자가유도분자의 발광 혹은 질병발생에 대한 신호로서 작용하는 능력을 방해하는 분자들을 포함하는 것이다. 저해제들에는 AI-2를 분해시키거나, 이에 결합하는 분자들이 포함된다. 그 방법에는 자가유도분자를 의심되는 저해제나 상승제(synergiest)와 접촉시키는 것, 그 의심되는 저해제나 상승제가 자가유도분자의 활성을 억제하는지 혹은 증가시키는지를 결정하는 어떤 선택된 유전자의 활성을 그 처리된 자가유도분자가 촉진하는지를 결정하는 것이 포함된다. 그리고 나서 자가유도분자의 실제적인 저해제들이나 상승제들이 선택된다. 예로서, 어떤 의심되는 저해제를 4,5,-디하이드록시-2,3-펜탄디온과 혼합하고 그 혼합물을 여기서 밝힌 리포터 균주V. harveyi와 함께 혼합한다. 의심되는 저해제 존재하에서의 발광량을 그 저해제를 포함하지 않은 대조(control) 혼합물과 비교할 수 있다. 발광의 감소는 AI-2 저해가 일어났다는 것이다. 이런 방식으로 세균성 질병발생을 조절하는 성분들을 빠르게 조사할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, AI-2의 저해적 혹은 상승제 유사체들을 선택하는 방법이 제공된다. 이 방법은 알려진 양의 자가유도분자를 알려진 양의 의심되는 저해적 혹은 상승적(synergistic) 유사체와 혼합하여, 그 처리된 자가유도분자의 어떤 선택된 유전자의 활성을 촉진하는 능력을 측정한 후, 그 의심되는 저해적 혹은 상승제 유사체가 그 자가유도분자의 활성을 억제하는지 혹은 증가시키는지를 결정하는 것이다. 그리고 나서 자가유도분자의 실제적인 저해제들이나 상승제들이 선택된다.

자가유도체-2 분자는 자연적 원료로부터 보편적인 정제기술을 이용하여 정제되거나, 화학적 방법을 이용하여 합성적으로 유도되거나, 혹은 아래 기술된 본 발명의 생체외 방법에 의하여 생산될 수 있다. 본 명세서에 기술된, “자연적 원료로부터 정제된”이라 함은 한 생물체에 의하여 만들어진 전기 분자식(formula)의 자가유도체-2를 포함하기 위함이다. “자연적원료로부터 정제된”에는S. typhimurium같은 세균의 배양액 혹은 세포질로부터 그 자가유도체분자를 보편적인정제기술을 이용하여 분리하는 것을 포함한다. 본 명세서에 기술된, “화학적 수단으로 합성된”이라함은 생체외에서 인공적으로 제조된 청구범위에 개시된 자가유도체 분자를 포함하고자 함이다. 본 발명에는, 당업계의 통상의 지식을 가진 자가 표준적인 화학적 합성 기술을 이용하여 화학적 전구체로부터 만든 본 발명의 자가유도체를 포함한다. 본 발명에는 더욱이 병원성 생물체의 감염성을 저해하는 방법들뿐만 아니라, 본 발명의 AI-2 유사체나 AI-2 저해제를 포함하는 치료적 조성물도 포함된다. 방법들에는 어떤 물질이나 치료적으로 효과적인 양의 의약 조성물(AI-2활성을 저해할 수 있는)을 처치하는 것을 포함한다. 본 명세서에 기술된 “저해시키는 감염성”에는 그러한 처리가 도움이 될 수 있는 물질을 초기적으로 감염시키는 혹은 더 감염시키는 병원성 생물체의 능력에 영향을 미치는 방법들이 포함된다. 본 발명의 의약조성물에는, 여기에 국한되지는 않지만, 엑소토신 A(exotoxin A)와 엘라스틴 단백질 분해효소(elastolytic protease) 같은 세포외성 질병 인자들의 전사적 활성을 방해하는 물질(agent)들이 포함된다. 본 명세서에 기술된 “작용물질(agent)”에는 세포외성 질병인자들의 전사를 활성화시키는 LuxP와 LuxQ 단백질의 능력을 저해하는 분자들이 포함된다. 작용물질들에는 AI-2가 정족수감지계-2에 대한 센서로서 작용하는 것을 방해하는 것처럼 AI-2와 직접 작용하는 저해제들이 포함된다. 바람직하게는 작용물질들은 4,5,-디하이드록시-2,3-펜탄디온과 상호작용한다. 작용물질들에는 LuxP와 LuxQ에 결합하기 위하여 4,5,-디하이드록시-2,3-펜탄디온과 경쟁할 수 있는 AI-2유사체들이 추가로 포함된다.

또한, 본 발명은 신호계 유형-2경로에 관여하는 인자를 표적으로 하여 병원물질에 연관된 질병을 막거나 치료하는 의약조성물들을 제공한다. 예로서, LuxP혹은 LuxQ, 혹은 이들 유사체가 백신개발을 위한 공동 표적이 된다. LuxP혹은 LuxQ, 혹은 이들 유사체에 대해서 만들어진 항체는 발병과 관련된 세균성 경로의 활성화를 저해할 수 있다. 이로써, LuxP와 LuxQ는 다중 병원성 질병 상태들에 대하여 어떤 물질을 면역시키는데 이용할 수 있는 공통적인 항원 결정자들을 제공한다. 예로서, 자가유도체 신호계 유형-2는 넓은 범위의 세균 종들을 포함하는 세균성 병원물질에 존재하는 것으로 여겨진다. 위에서 논의된 바처럼, 자가유도체-2 신호인자는 종 내 뿐만 아니라 종간 신호교류(communication)에 관여하는 것으로 생각된다. 정족수감지 신호계 유형-2 가 종간 신호교환에 효과적이기 위해서는 이것이 다양한 종들간에 고도로 보존적일 것이다. 그래서, LuxP와 LuxQ 폴리펩타이드와 함께 물질 혹은 특정생물체로부터 분리된 항원 절편(antigenic fragment)을 투여하면, 다른 생물체와 관련된 다른 질병에 대하여 방어적 면역을 줄 수 있을 것이다. 예로서,V. cholera에서 분리된 LuxP 단백질에 대해 만들어진 백신은 다른 생물체에서 발현된 LuxP 유사체와 교차반응할 수 있다. 그리하여, 본 발명의 방법들은 병원성 물질과 연관된 질병상태를 치료하는데 이용될 수 있다고 보여진다.

일반적으로, 여기서 처리(treating), 처치(treatment), 그리고 그와 같은 용어들은 원하는 약학적 혹은 생리적 효과를 얻는 것을 의미하기 위하여 사용되었다. 그 효과는 스파이로헤타 감염이나 질병, 징후 혹은 증상을 완전히 혹은 부분적으로 막는 식으로의 예방일 수 있고, 혹은 감염이나 질병의 부분적 혹은 완전한 치료 및/또는 그러한 감염 질병에 기여할 수 있는 것의 반대적 효과를 나타내는 식으로서 치료적일 수 있다. 여기에서 이용된 처리는 포유류, 특히 사람에서의 감염이나 질병의 어떠한 처리(예를 들면, 완전한 혹은 부분적인)나 방어를 다 포함하며, 그리고 다음을 포함한다:

(a) 그 질병에 영향을 주지만, 아직 그것을 가지고 있다고 진단되지 않은 어떤 물질에서 일어나는 것으로부터 그 질병을 보호하는 것;

(b) 감염이나 질병을 저해하는 것, 즉 그것의 발생을 지연시키는 것; 혹은

(c) 감염이나 질병을 완화 혹은 개선시키는 것, 즉 감염이나 질병의 억제를 일으키는 것.

따라서, 본 발명에는 세균성 감염에 기여할 만한 증상을 개선시키는데 유용한, 혹은, 다르게는, 감염같은 것을 막을 수 있는 방어적 면역반응을 유도하는 데 유용한 다양한 의약적 조성물이 포함된다. 예를 들어, 본 발명에 따르는 의약 조성물은 예로서, LuxP와 LuxQ, LuxP와 LuxQ의 펩타이드 혹은 펩타이드 유도체, LuxP와 LuxQminetic 혹은, 본 발명에 따르는 LuxP와 LuxQ-결합하는 작용물질에 대한 항체를 운반체(carrier), 부형제(excipient) 그리고 첨가제(additive) 혹은 보조제(auxiliary)를 이용한 물질에 부착이 적합한 형태가 포함되도록 조제할 수 있다. 자주 이용되는 운반체들이나 보조제로는, 마그네슘카보네이트, 티타늄다이옥사이드, 락토오스, 만니톨 그리고 다른 당들, 탈크(talc), 우유 단백질, 젤라틴, 녹말, 비타민, 섬유소 그리고 그의 유도체들, 동물성과 식물성 유지, 폴리에틸렌 글리콜과 용매들, 멸균수, 알코올, 글리세롤과 폴리하이드릭 알코올이 있다. 정맥 내(intravenous) 운반체들에는 액(fluid)과 영양 보충물(replenisher)이 포함된다.보존제(preservative)에는 항 미생물적, 항 산화제, 킬레이팅제 그리고 불활성 기체가 포함된다. 다른 의약적으로 허용가능한 담체들에는 수용성 용매와 염을 포함한 비독성 부형제, 보존제, 완충용액 그리고, 레밍톤의 약리과학(Pharmacetutic Sciences), 15th ed. Easton: Mark Publishing Co., 1405-1412, 1461-1487 91975)과 The Pharmaceutical Association(1975)에 기술한 바와 같은 것이 포함된다. 의약조성물에 있는 다양한 성분들의 pH와 정확한 농도는 당업계의 통상적인 기술에 따른다(참조: Goodman and Gilmam, The pharmacological basis for Therapeutics, 7th ed.).

본 발명에 따른 의약물 조성은 국부적 혹은 체계적으로 투여될 수 있다. “약리적으로 효과적인 양”은 그 질병의 증상들과 그것들의 합병증(complications)을 막거나 치료, 혹은 적어도 부분적으로 중지시키기 위해 필요한, 본 발명에 따른 성분의 양을 의미한다. 이런 이용을 위해 효과적인 양은, 물론 질병의 심각성과 환자의 체중과 일반적인 상태에 의존한다. 전형적으로, 생체 밖에서 이용되는 투여량(dosage)은 의약조성물의 제자리투여(in situadministration)에 유효한 양에 대한 유용한 가이드라인을 제공할 것이고, 그리고 동물 모델은 특정장애(disorder)의 처리에 대해 유용한 투여량(dosage)을 결정하는데 이용될 것이다. 다양한 고려사항들이, 예를 들어, Langer, Science, 249:1527, (1990); Gilman et al. (eds) (1990)같은 문헌들에 기술되어 있고, 이들 각각은 참조문헌에 포함되어 있다.

여기서 사용된 "치료적으로 효과적인 양의 투여”는 본 발명의 의약 조성물을 의도된 치료적 기능 실행을 위해 어떤 대상(subject)에 주거나 적용하는 방법들을 포함하려는 것이다. 치료적으로 효과적인 양은 감염의 정도, 대상, 나이, 성별, 개체의 무게와 같은 인자에 따라 다양하다. 투여량 요법(dosage regima)은 최적치료반응을 제공하도록 조정할 수 있다. 예를 들어, 수개의 나누어진 양을 일일 (daily) 처방할 수 있고, 혹은 그 양(dose)을 그 치료상황의 긴급성에 따라 비율적으로 감소시킬 수 있다. 의약 조성물은 주사(피하, 정맥내 등), 구강투여(oral administration), 흡입(inhalation), 경피투여(transdermal application) 혹은 직장투여(rectal administration)와 같은 보편적인 방법으로 투여할 수 있다. 투여 경로에 따라 의약 조성물은, 그 의약 조성물을 불활성화 시킬 수 있는 효소, 산 그리고 다른 영양 성분들의 활성으로부터 그 의약 조성물을 보호할 수 있는 물질로 코팅될 수 있다. 그 의약 조성물은 또한 비경구적(parenterally) 혹은 복강내로(intraperitoneally) 투여될 수 있다. 분산액(dispersion)은 또한 글리세롤, 액상 폴리에틸렌글리콜 및 이들의 혼합물 그리고 유지 속에서 제조될 수 있다. 일반적인 저장과 사용 조건하에서, 이들 시료에 미생물의 성장을 억제하는 보존제를 포함시킬 수 있다.

주사적 이용(injectable use)에 적합한 의약 조성물에는, 멸균수용액(수용성인) 혹은 분산액(dispersion)와, 멸균 주사용액이나 분산액의 즉석 제조(extemporaneous preparation)를 가능하게 하는 멸균파우더가 포함된다. 이 모든 경우에, 그 조성물은 멸균되어야 하며, 주사성(syringability)이 용이한 정도로 유동적이어야 한다. 그것은 생산과 저장 조건하에서 안정하여야 하며, 세균과 곰팡이 같은 미생물의 오염 작용에 대하여 보존적이어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액성 폴리에틸렌 글리콜 등), 그에 대한 적당한 혼합물 그리고 식물성 유지 등을 포함하는 용매 혹은 분산배지가 될 수 있다. 레시틴 같은 코팅제를 사용하거나, 분산의 경우에 필요한 입자의 크기를 유지하거나, 계면활성제(surfactant)를 사용한다든지 함으로 적당한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물의 활동에 대해서는, 다양한 항세균·항곰팡이제, 예로서, 파라벤(paraben), 클로로부탄올, 페놀, 아스코르빈산, 티머로잘 등을 사용함으로 방해할 수 있다. 많은 경우에, 당, 만니톨 같은 폴리알콜, 솔비톨, 소금 등과 같은 등장제(isotonic agent)가 그 조성물에 포함되는 것이 바람직하다. 주사적 조성물의 장기적 흡수는, 알미늄 모노스테아레이트(alminium monostearate)나 젤라틴 등과 같이 흡수를 늦추는 물질을 포함시킴으로써 가능하다. 멸균 주사용액은, 그 의약조성물을 위에 열거한 성분들 중 한가지 혹은 한 조합으로 만들어진 적당한 용매에 필요량을 넣고, 필요하면 여과, 멸균을 함으로써 조제 가능하다. 일반적으로 분산은, 그 의약 조성물을, 기본적 분산배지와 위에 열거한 것들에서 필요한 다른 성분들을 포함하고 있는 멸균운반체에 혼합함으로써 조제된다.

전기 의약 조성물은 비반응성 희석제나 융합하여(assimilable) 먹을 수 있는 담체 등과 함께 구강으로 투여 가능하다. 전기 의약조성물과 다른 성분들은 또한, 단단하거나 부드러운 껍질의 젤라틴 캡슐 속에 두거나, 알약으로 압축하거나, 음식물에 직접 첨가될 수 있다. 치료상의 구강 투여(oral therapeutic administration)에 대하여, 의약조성물은 부형제와 함께 혼합(incorporation) 가능하며, 주사제 정제(ingestable tablet), 경구 정제(buccal tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭서(elixir), 현탁액(suspension), 시럽(syrup), 웨이퍼(wafer) 등의 형태로 사용 가능하다. 전기한 조성물과 시료는 활성성분 무게의 적어도 1%를 포함하여야 한다. 성분들과 시료의 비율은 물론 다양하며, 단위무게의 약 5~80% 사이가 보편적이다.

정제(tablet), 트로키(troche), 환제(pill), 캡슐(capsule) 등은 또한 다음을 포함한다: 검(gum), 그라가칸타(gragacanta), 아카시아, 옥수수 전분, 혹은 젤라틴 같은 접합체; 부형제(excipient)로서 DCP(dicalsium phosphate); 분해제(disintegrating agent)로서 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산(alginic acid) 등; 활택제(lubricant)로서 스테아르산 마그네슘(magnesium stearate); 감미제로 슈크로스, 락토스나 삭카린 혹은 향신제로 박하, 노루발풀(wintergreen)의 기름, 체리향. 투여 단위형태가 캡슐일 때는, 위에 언급한 재료 이외에 액상 담체가 포함될 수 있다. 다양한 다른 물질이 입혀질 수 있고, 아니면 그 투여단위의 물리적 형태를 변형시킬 수 있다. 예로서, 정제(tablet), 트로키(troche), 환제(pill), 혹은 캡슐(capsule)이 쉴락(shellac), 당(sugar) 혹은 둘다로 입혀질 수 있다. 시럽이나 엘릭서는 감미제로서 슈크로스, 보존제로서 메틸과 프로필파라벤(propylparaben), 어떤 염료와 딸기, 오렌지향 같은 향이 포함될 수 있다. 물론 어떤 투여 단위 제조에 이용된 물질은 약리적으로 순수하고 사용된 양에서 충분히 비독성이어야 한다. 또한, 그 약학적 조성물은 서방형 제제(sustained-release prepararion)와 제제화(formulation)로 함입될 수 있다.

본 명세서에 기술된, “약학적으로 허용 가능한 담체"란 용매와 분산배지 (dispersion media), 코팅제, 항세균·항곰팡이제, 등장제와 흡수지연제 등이 포함됨을 의미한다. 약학적 활성물질에 대해 그러한 배지(media)와 작용물질(agent)의 사용은 당업계에서 잘 알려져 있다. 어떤 보편적인 배지와 작용물질로서 지금까지의 것 이외의 것은 약학적 조성물로 맞지 않으며, 치료적 조성물과 처리방법에서의 사용이 감안된다. 보조적 활성 성분 또한 그 조성물에 함유될 수 있다.

투여량 단위에 있어서 비경구 조성물(parenteral composition)을 간편한 투여와 투여량의 동일성을 위해 제제화시키는 것은 특히 유리하다. 여기서 이용된 투여량 단위 형태는 처치될 개체에 대하여 동일한 투여량으로 적합한, 물리적으로 구별되는 단위를 의미한다. 미리 결정된 양의 의약 조성물을 함유하는 각 단위는, 필요한 약리적 운반체와 연관하여 원하는 치료적 효과를 낳도록 계산된다. 본 발명의 새로운 용량 단위 형성(dosage unit form)를 위하여 다음에 의해 구체적으로 개시된다: (a) 그 약리적 조성물의 고유한 특성과 얻게 될 특별한 치료적 효과, 그리고 (b) 한 개체(subject)에서 병원성 감염의 치료를 위한 약리적 조성물을 조제(compounding)하는 기술에서의 내재적 제한.

주요한 약학적 조성물은, 1회에 수용 가능한 투여량 단위에서 간편하고 효과적인 투여를 위해, 적합하고 약학적으로 허용 가능한 운반체와 함께 제조된다. 보조적 활성 성분을 포함하는 조성물의 경우에, 그 투여량은 그 언급된 성분들의 일반적 투여양과 투여방식에 대한 참조문헌(reference)에 의해 결정된다.

본 발명의 단백질의 항원 결정소에 결합하는 항체 제조에 추가하여, 본 발명의 방법은, 예를 들어 LuxP혹은 LuxQ 같은 항원 결정소에 대하여 세포성 반응, 특히 세포파괴적 T림프세포(CTLs) 를 유도시키는데 이용될 수 있다고 여겨진다. 전형적으로 변형 안된 수용성 단백질은 주조직 적합성 복합체(MHC) 군(class) I-제한 된 CTL 반응을 일으키지 못하는 반면, 미립 단백질들은 극히 면역적이며, 생체 내에서 CTL 반응을 일으키는 것이 보여져 왔다. CTL 항원 결정소와 헬퍼 항원 결정소(helper epitope)는 많은 감염성 병원물질로부터 유래한 단백질에서 동정되어 왔다. 더욱이 이들 항원 결정소들은 동시적으로 생산될 수 있어서 다중 항원 결정소가 MHC 군) I- 제한 CTL 반응을 초회감작(prime)시킬 수 있는 형태로 수송될 수 있다. 한 개 이상의 항원 결정소들을 운반하는 재조합 단백질입자를 생산할 수 있는 계의 한 예는Saccharomyces cerevisiae의 레트로트랜스포존(retrotransposon)인 pI 단백질의 사용을 필요로 한다(참조: Adams, et al., Nature, 329:68, 1987). CTL 항원 결정소를 암호화하는 서열은, 예를 들어, pI의 C-말단에 붙여질 수 있고, 그렇게 만들어진 Ty 바이러스 유사 입자 (Ty-VLPs)는 CTL 반응을 유발시킬 수 있다. 그래서, 신호체계-2의 활성화에 관계된, 혹은 그것으로부터 유래한 것들과 같은 병원성 항원의 보존된 부위들이 동정되고, 숙주면역계가 다중 스파이로헤타 생물체에 대하여 효과적 면역반응을 준비할 수 있게 하는 입자에 통합될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 방법들은 LuxP 같은 단일 단백질에 대하여 다중 항원 결정소들을 가진, 혹은 다양한 단백질에서 유래한 다중 항원 결정소들을 가진 입자를 만들기 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 방법은 또한, 항원을 리포좀 안으로 미세캡슐화하는 것과 같은,천천히 유리되는 항원 전달시스템을 포함한다. 이러한 전달시스템은 전통적인 항원보강제(adjuvant)의 사용없이 단백질들의 면역성을 증가 시키는 방법으로서 이용되어져 왔다. 혈액흐름에서 리포좀은 일반적으로 간과 비장에 의해 흡수되며 대식세포에 의해 쉽게 세포소화될 수 있다. 리포좀은 또한 항원들과 함께 면역조절 분자들의 동시포장(co-entrapment)을 가능케 한다. 그래서 그런 분자들이 항원을 만나는 위치로 수송될 수 있어, 방어적 반응들에 대하여 면역계의 조절(modulation)을 가능케 한다.

본 발명의 다른 실시 태양에 따르면, 본 발명의 LuxP혹은 LuxQ 같은 단백질에 결합하는 성분을 동정하는 방법이 제공된다. 그 방법에는 그 성분과 LuxP혹은 LuxQ를 포함하는 성분들을 그 성분들이 상호작용을 허락하는 조건하에서 반응시키고 LuxP혹은 LuxQ에 그 성분의 결합을 측정하는 것이 포함된다. LuxP혹은 LuxQ에 결합하는 성분에는 펩타이드, 펩티도미메틱스(peptidominetics), 폴리펩타이드, 화학적 성분들 및 전기한 생물학적 작용성분들이 포함된다.

반응에는 LuxP혹은 LuxQ와 검정 성분사이에 접촉을 허락하는 조건들이 포함된다. 접촉(contacting)에는 액상 및 고체상(solid phase)에서 수행될 수 있다. 그 검정 리간드(들)/성분은 성분들의 복수성(plurality)를 탐색하기(screening)을 위한 조합적 라이브러리(combinatorial library)가 선택적으로 가능하다. 본 발명의 방법에서 동정된 성분들은 용액 속에서 혹은 고체 지지체(solid support)에 결합시킨 후에 PCR, 올리고머 제한(oligomer restriction)(참조: Saiki, et al., Bio/technology, 3:1008-1012, 19850), 상동유전자(Allele)-특이적 올리고뉴클레오티드(ASO) 탐침 분석(참조: Conner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80:278, 1983), 올리고뉴클레오티드 결찰 분석(OLAs)(참조: Landegren, et al., Sciencee, 241: 1077, 1988) 등과 같은 특정 DNA서열을 검출하는 데 일반적으로 적용되는 방법에 의해 더욱 평가, 검출, 클로닝, 서열결정 (sequencing) 등이 이루어 질 수 있다. DNA 분석을 위한 분자적 기술은 분석되어 왔다(참조: Landegren, et al., Science, 242:229-237, 1988). 본 발명의 탐색 방법에 포함되는 것으로 LuxP혹은 LuxQ에 결합하는 화학적 성분을 동정하기 위한 조합적 화학 방법이 있다( 참조: Plunkett 와 Ellman, “Combinatorial Chemistry and New drugs”,Scientific American, April, p.69, (1997)).

본 발명은 더욱이, 세포 대사, 성장, 혹은 회복을 자극하거나 촉진시키는데 효과적인 농도에서 본 발명의 AI-2를 세균배양과 접촉시킴으로써, 예를 들어 항생제(antibiotic) 같은 세균적 산물의 생성을 촉진시키는 방법을 제공한다. 예로서, 항생제를 생성하는 세균은 대수 증식기의 최고점이나 근처에서만 항생제를 생산한다. 그런 항생제 생성세균을 본 발명의 AI-2와 접촉시킴으로써 항생제 생성을 증식의 보다 빠른 시기에 유도시킬 수 있다. 그래서, 본 발명의 AI-2는 배양물에 의해 생산되는 항생제의 양을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 명세서에 기술된 “배양 배지”라는 용어는 세균이 그 위에서 혹은 그 속에서 자라는 물질을 함축하는 의미이다. 그 자가유도분자는, 액체 배지(broth), 아가(agar) 및 젤라틴을 포함하는 상업적으로 입수 가능한 세포배양 배지에 존재할 수 있다.

본 발명은 더욱이 자가유도체-2를 분해하거나 합성을 저해하는 인자들을 동정하는 방법을 제시한다. 예로서, 자가유도체-1의 농도는 중간 내지 대수 증식기 후반에서 최고인 것이 알려져 있다. 반대로, 자가유도체-2 농도는 대수 증식기에서 보다 빨리 증가하며 후 대수 증식기와 정지기에서 보다 낮은 농도로 존재한다. 이 데이터는 자가유도체-2를 분해시키는 기작이 세균증식의 특정점에서 존재함을 시사한다. 자가유도체-2를 분리, 동정하는 방법을 제시함으로써, 본 발명은 자가유도분자수준을 조절하는 기작의 동정을 가능케 한다. 예로서, 부분 정제된 세균 추출물을 분리된 자가유도체-2에 대하여 분석하여 자가유도체-2를 분해하는 분획들을 동정할 수 있다. 자가유도체-2를 분해하는 분획들은 당업계의 숙련된 이들에게 알려져 있는 기술로 더욱 분획되어, 자가유도체-2를 분해하는 데 관련된 세포성 성분들이 분리될 수 있다.

본 발명은 또한 유전자의 발현을 조절하는 방법을 제공한다. 그 방법에는 선택된 세균 속으로 유전자를 삽입하여 LuxQ 단백질의 활성을 자극할 수 있는 작용물질에 의해 유전자 발현을 증가시키고, 그 세균을 LuxP단백질의 활성을 자극할 수 있는 작용물질과 함께 배양시키는 것이 포함된다. 그래서 본 발명의 신호분자는 또한 그 분자에 의해 조절되는 다른 표적을 찾는데 이용될 수 있다. 클로닝된 프로모터가 용합된 라이브러리들은 어떤 종의 세균으로부터도 준비될 수 있고, 그 분자를 포함하지 않는 플레이트의 활성에 비교된 그 신호분자를 포함하는 페트리나 마이크로타이터에의 리포터 활성의 차이를 단순히 조사함으로써, 그 신호인자에 의해 유도되거나 억제되는 유전자를 동정하는데 이용될 수 있다.

또한, 정족수 감지는 생물 막 조절의 주요 조절자이며 그리고 정족수 감지차단자는 그래서 생물 막 형성을 막거나 혹은 저해하는 데 이용될 수 있다. 또한, 정족수 감지 차단자는 표면에 이미 형성된 생물 막을 제거하거나, 그 막의 양을 현저히 감소시키는데 효과적이다. 그리하여 자가유도체-2의 구조를 제공함으로써, 본 발명은 생물 막 형성을 조절함으로써 세균 감염을 저해하는 성분들을 동정하는 새로운 접근 방법을 제시한다.

정족수 감지 차단자는 어떤 세균 주에서는 단백질 분해효소 생성을 50%로 감소시킬 수 있다는 것이 알려져 있으나 어떤 성분들이 단백질 분해효소 생성을 많이 감소시킬 수 있다는 발견은, 의미심장한 의료적 장점들이다. 세균 막 형성이 정족수 감지 차단자에 의해 저해되거나 막을 수 있다는 예기치 않은 발견은, 다른 계에서, 단백질 분해효소 생성 같은, 정족수 감지 차단을 보이는 것이 알려진 다른 정족수 감지 차단자가 또한 생물 막 형성에 대하여 효과적일 수 있다는 타당한 결론을 유도한다.

본 발명의 성분들은V. angufflarum혹은Aeromonas spp에 의해 유발되는 것과 같은 감염을 치료하거나 막는데 이용될 수 있다. 이런 유형의 감염의 예는 어류에서의 비브리오병(Vibriosis) 그리고 부스럼증(furunclosis) 질병이다. 세균에 의한 생물 막 형성저해는, 때때로 세포 외재성 단백질 분해효소의 감소나 제거와 함께 세균이 충분히 비 병원성이 되도록 한다. 본 발명의 성분들은 세균성 감염의 치료 및/또는 예방에의 사용을 위해 보편적인 방법으로 제제화할 수 있다. 예로서, 그 성분들은 (구강 투여나 멸균 주사제(injectable) 조성물을 위한 정제(tablets), 현탁액 혹은 용액 등) 고체 혹은 액체시료로서, 약리적으로 가능한희석제, 운반체 혹은 다른 첨가물과 선택적으로 함께 이용될 수 있다. 어류에서의 비브리오병(Vibriosis) 그리고 부스럼증(furunclosis) 질병의 처치를 위해, 그들을 포함하는 성분들이나 조성물들이 그 어류에 직접투여될 수 있고 혹은 그들을 그 어류의 음식이나 물에 첨가할 수 있다.

본 발명의 다른 실시 태양으로는, 본 발명의 성분으로 표면처리한 표면으로부터 생물막을 제거하는 방법이 제공된다. 그 표면은 보다 바람직하게는 음료수 분포계(dringking water distribution system)나 치과적인 공기-물 분사계 같은 수용성의 액상 분사계의 내부가 된다. 이런 유형의 표면으로부터 생물막 제거는 특히 어려울 수 있다. 그 성분은 보다 바람직하게는 그 성분만 혹은 보편적 세제 혹은 표면제 등과 함께 용액으로서 표면에 처리된다. 본 발명의 다른 실시 태양은 세균성 인자와 함께 본 발명의 성분을 포함하는 항 세균성 조성물이다. 그 항 세균성 조성물에 있어서, 본 발명의 성분은 생물 막의 제거를 돕는 반면에 세균성 인자는 그 세균을 사멸시킨다. 그 항 세균성 조성물은 표면에 뿌리기 위한 및/또는 표면을 세척하기 위한 용액 혹은 현탁액의 형태가 더 바람직하다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 생체막 형성을 저해하거나 막기 위하여 본 발명의 성분으로 코팅 및/또는 각인된(impringed) 한 제품이 제공된다. 그 제품은 본 발명의 성분이 그 물질에 걸쳐 분포된 플라스틱이 더 바람직하다.

III.신호인자 생합성에 관여하는 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 설명

본 발명의 또 다른 측면과 관련하여, 발명자들은V. harveyi,S.typhimurium, 그리고E. coli에서 신호분자의 합성에 관계하는 유전자들을 클로닝, 특성화하였다. 이들 유전자들은 자가유도체 생성에 관여하는 고유한 집단(family)의 단백질을 암호화한다. 본 발명자들은 이 집단의 자가유도체 생성 유전자들의 구성원들을LuxS로, 특히E. coli,S. typhimurium,그리고V. harveyi각각에 대하여LuxS _E.c. , LuxS _S.t.. , LuxS _V.h. 로 명명하였다.

V. harveyi,S. typhimurium, 그리고E. coli에서LuxS돌연변이는 이 세 종 세균 모두에서 신호분자의 생성을 막는다.S. typhimurium에서는E. coliO157:H7LuxS _E.c. 유전자 혹은V. harveyiBB120LuxS _V.h. 유전자의 도입으로 그 분자의 완전한 생성이 보완될 수 있다. 이들 결과는V. harveyi와E. coli LuxS단백질 둘 모두가S. typhimurium세포성 성분들과 기능을 하여 신호분자를 생성할 수 있음을 시사한다.E. coliDH5는E. coliO157:H7LuxS _E.c. 혹은V. harveyiBB120LuxS _V.h. 유전자의 도입으로 그 신호분자의 생성이 부분적으로만 상보된다.E. coliDH5에서LuxS유전자의in trans발현이 신호분자 생성을 완전히 상보하지 않았기 때문에, 다른 생화학적 생리적 인자들이 신호생성에 기여할 수 있다.

신호분자생성의 조절은 병원성과 비병원성 균주사이에서 다르다. 예를 들어E. coliO157:H7 균주는 AI-2를 30 ℃와 37 ℃에서 포도당이 있거나 없거나 생성하는 반면에E. coliK-12 균주는 선호하는 탄소원이 없으면 그 분자를 생성하지 않는다. 그리고, 검정된E. coliO157 모든 균주는 비병원성 대장균주보다 더 큰 신호활성을 생성한다. 이와 같이, 병원성S. typhimurium14028은S.typhimuriumLT2 에 비해 유의적으로 보다 더 큰 활성을 생성한다.

서열분석은LuxS단백질이 고도로 유사하다는 것을 보여주며, 상보성 데이터는 그 단백질이 종간에 기능을 한다는 것을 시사한다. 이들 결과는 그 효소적 활성이LuxS단백질에 의하여 수행되며, 그 신호분자의 합성에 관여하는 다른 세포성 기구들은 보존되어 있다는 것을 시사한다. 본 발명자들은 그LuxS단백질에서 특정한 기능을 나타내는 어떤 아미노산 서열모티프(motif)도 동정하지 않았다. 그러므로LuxS단백질은 신호분자의 생합성에서 하나의 특이적인 효소적 단계를 촉매하는 것으로 보인다. 신호분자 생합성에 관련된 그 단계들 중 나머지는 정상적인 중간단계의(intermediary) 대사적 과정들일 수 있다. 여기서 동정된LuxS유전자들은 아실-호모세린 락톤 자가유도체들(LuxI-유사)(참조: Fugaet al.,J. Bacteriol. 176, 269-275, 1994),LuxI-ainS유사(참조: Bassleret al.,1993, supra; Gilsonet al.,J. Bacteriol.177, 6946-6951, 1995)) 의 생성에 관련된 것으로 알려진 다른 유전자들과 동일성이 없으며, 본 발명의 신호분자가 신규화다는 것을 시사한다.

완결된 그리고 비 완결된 세균게놈들의 데이터베이스 분석은 많은 다른 종의 세균들이V. harveyi,S. typhimurium, 그리고E. coli의LuxS과 유사한 유전자를 가지고 있음을 보인다. 동정된 세균 종들과V. harveyi의LuxS단백질에 대한 상동성(homology)/동일도(identity)의 비(H/I)는 다음과 같다:Haemophilus influenza(88/72),Helicobacter pylori(62/40),Bacillus subtilis(58/38),Borrelia burgfdorferi(52/32),Neisseria meningitidis(89/80),Neisseriagonorrhoeae(89/80),Yersinia pestis(85/77),Campylobacter jejuni(85/74),Vibrio cholerae(95/90),Deinococcus radiodurans(65/45),Mycobacterium tuberculosis(59/41),Enterococcus faecalis(60/44),Streptococcus pnemoniae(57/36) 및Streptococcus pyrogenes(57/36). 앞서 보고된 바와 같이, 이들 중에 두 세 종만이 그 신호분자의 생산에 대하여 검정되었다(참조: Bassler et al., 1977, supra). 본 발명자들에 의해V.cholerae와Y. enterocolitica는 신호활성을 생산하지만B. subtilis는 신호활성을 생산하지 않는다는 것이 보여졌다. 본 발명자들은B. subtilis는 그 분자를 생산하지만 그것의 합성을 유도하는 환경적 조건들이 아직 결정되지 않았다고 믿는다. 더욱이, 본 발명자들은 그 데이터베이스 분석에서 동정된 종들 모두가 AI-2 유사분자를 생산한다고 믿는다.

V. harveyi,S. typhimurium, 그리고E. coli로부터의LuxS유전자들의 유전자 서열들은 각각 서열번호:1, 서열번호:2와 서열번호:3 그리고 서열번호:4(서열들은 5’에서 3’방향으로 읽는다)로서 명세서의 끝에 개시되어 있다. 이들 유전자들은 때때로 여기서 각각LuxS _V.h LuxS _E.c. 와LuxS _S.t .로 언급한다. 서열번호: 1-4로부터 추론된 아미노산 서열들은 각각 서열번호:10, 서열번호:11 와 서열번호:12 명세서(그리고 도 11에서)의 끝에 개시되어 있다. 서열번호:1와 서열번호:2는 완전한 클론(full-length clone)인 반면에, 서열번호:3과 서열번호:4는 아닌 것으로 보인다.

V. harveyi,E. coli와S. typhimurium로부터의LuxS유전자는 실시예 3에보다 상세히 기술되어 있다. 이들 특정LuxS유전자들과 그들이 암호화하는 단백질들은 여기에 예시되어 있을지라도, 본 발명은 어떤 세균 종들로부터LuxS유전자들과 그들이 암호화하는 효소들을 포함하며,LuxS에 의해 암호화되는 단백질들의 서열, 구조적 기능적 특성들이 여기에 기술되어 있다. 실시예 3에서 언급한 바 처럼, 상동성 있는(homologous) 핵산 서열들이 다양한 세균 종에서 동정되어 왔지만,LuxS유전자들로서 그들 서열들의 동일성(identity)은 아직 밝혀지지 않았다. 다른 세균 종들로부터LuxS뉴클레오타이드와 추론된 아미노산 서열들은 각각 서열번호: -9 와 13-17 로서 명세서의 끝에 개시되어 있고, 다음 종들로부터의 서열들이 포함된다:Haemophilus influenza, Helicobacter pylori, Bacillus subtilis, Borrelia burg dorferi와Vibrio cholerae.

V. harveyi,E. coli또는S. typhimurium이외의 다른 종들로부터의LuxS에 추가하여, 서열번호: 1 내지 9의 변종들과 자연돌연변이들이Vibrio, Escherichia와Salmonella의 다른 종들 혹은 균주들 내에 존재하는 것으로 보인다(실제로E. coliDH5는 그 유전자의 비기능성 돌연변이를 가진다). 그런 변종들은 뉴클레오타이드와 아미노산서열에서 어떤 차이점을 가질 것으로 예상되기 때문에, 본 발명은 분리된 핵산분자와 암호화된 단백질을 제공하는데 이는 각각 서열번호: 1 내지 9(바람직하게는, 서열번호: 1 내지 9의 암호화부위를 특히 포함한다)로서 개시된 뉴클레오타이드 서열번호: 10 내지 17 의 아미노산 서열을 가진 암호화 영역(coding region)에서 적어도 약 50-60%(바람직하게는 60-80%, 가장 바람직하게는 80% 이상) 서열 상동성(homology)을 가진다. 자연적인 서열변이가 이들 단백질과 그들을 암호화하는 핵산서열에 존재하기 때문에, 본 기술에 숙련된 사람은 본 발명의LuxS에 의해 암호화되는 단백질들의 고유한 특성은 유지하면서, 약 40-50% 서열 변이를 찾을 것으로 기대된다. 그런 예상은 유전자 암호의 퇴화성(degeneracy)에 부분적으로 기인하며, 또한 보존적인 아마노산 서열 변이의 알려진 진화적 성공에 기인하며, 이것은 단백질의 성질을 뚜렷하게 변화시키지는 않는다. 따라서, 그런 변이체들은 서로 상당히 같은 것으로 간주되며, 본 발명의 범주 내에 포함된다.

본 발명의 목적으로서, “실제적으로 동일한(substantially the same)”는 그 단백질의 성질(즉, 그 단백질의 구조적 특성 및/또는 생물학적 활성)에 중요한 영향을 미치지 않는 서열변이를 가지는 핵산이나 아미노산 서열을 의미한다. 핵산서열에 대한 특별한 언급으로써, “실제적으로 동일한”이라는 용어는, 발현을 지배하는 암호화 부위와 보존된 서열을 의미하며, 같은 아미노산 서열을 암호화하는 퇴화된(degenerated) 코돈 혹은 그 암호화된 폴리펩타이드에서 보존적으로 대체되는 아미노산을 암호화하는 또 다른(alternate) 코돈을 주로 언급한다. 아미노산 서열에 대한 언급으로서, “실제적으로 동일한”이라는 용어는 구조나 기능의 결정에 관여하지 않은 폴리펩타이드의 부위들에서 보존적인 치환(substitution) 및/또는 변이(variation)를 일반적으로 의미한다. “동일성 비(percent identity)”와 “유사성 비(percent similarity)”라는 용어는 아미노산들 사이의 비교에서 또한 사용된다. 이들 용어는, 위스콘신(Wisconsin)대학으로부터 이용가능한 UWGCG 서열분석 프로그램(참조: Devereauxet al., Nucl. Acids Res. 12:387-397, 1984)에 있는 것으로 한정되며, 그리고 그 프로그램에 이용되는 변수들은 서열동일성과 유사성을 비교하기 위하여 본 명세서에서 이용된 것이다.

A. LuxS 핵산분자, 암호화되는 단백질들 및 면역학적으로 특이적인 항체

1.핵산 분자

본 발명의LuxS핵산 분자들은 두 가지 일반적인 방법에 의해 만들어진다: (1) 적당한 뉴클레오타이드 트리포스페이트들로 합성되거나, (2) 생물원(biological source)으로부터 분리된다. 두 방법은 당업계에서 잘 알려진 프로토콜을 이용한다. 서열번호: 1 내지 9를 가진 DNA들과 같은 뉴클레오타이드 서열정보의 이용으로, 올리고뉴클레오타이드 합성에 의해 본 발명의 분리된 핵산분자를 제조할 수 있다. 합성 올리고뉴클레오타이드는 DNA 합성기(Applied Biosystem 38A DNA synthesizer)와 유사한 기계에서 이용되는 포스포라아다이트(phosphoramadite) 방법으로 제조된다. 그 결과물은 고성능액체크로마토그라피(HPLC)와 같이 당업계에서 알려진 방법으로 정제된다. 본 발명의 DNA 분자와 같은 긴 이중나선 폴리뉴클레오타이드는 단계들로 합성되어야 하는데, 이는 현재 올리고뉴클레오타이드 합성 방법에 존재하는 크기 제한 때문이다. 그러한 긴 이중나선 분자의 합성은 적당한 상보성을 가진 몇 개의 보다 작은 단편들로 합성된다. 생성된 상보성 단편들은 그래서 어닐링(annealing)되어 각 단편들은 인접단편에 부착되기 위해 적당한 접촉(cohesive) 말단을 가진다. 인접 단편들은 DNA 연결효소(ligase) 존재하에서 상동접촉(annealing cohesive) 말단들에 의해 연결(ligation)되어 전체 길이 1.8kb 이중나선분자로 만들어진다. 그렇게 만들어진 합성 DNA분자는 적당한 벡터에 클로닝되고 증폭된다.

LuxS핵산 분자들은 또한 당업계에서 알려진 방법을 이용하여 적당한 생물 원으로부터 분리된다. 보다 바람직한 실시태양으로는, 한 게놈 클론을S. typhimurium또는E. coli게놈의 코스미드 발현 라이브러리로부터 분리하는 것이다. 다른 실시태양으로는 한 게놈 클론을 다른 세균 게놈의 코스미드 라이브러리로부터 분리하는 것이다.

본 발명과 함께, 서열번호: 1 내지 9 중 어떤 것의 단백질 암호부위와 적당한 수준의 상동성을 가진 핵산들을 적당한 강도(stringency)의 혼성화와 세척 조건으로 동정할 수 있다. 예를 들어, 삼브룩(Sambrook) 등의 방법에 따라서, 다음을 포함하는 혼성화용액을 이용하여 혼성화를 수행할 수 있다.: 5x SSC, 5x Denhardt의 반응용액, 1.0% SDS, 변성되고, 조각난 연어 정자 DNA 100 g/ml, 0.5% 소디움피로포스페이트(sodium pyrophosphate) 그리고 50% 까지의 포름아마이드. 혼성화를 37-42 ℃에서 적어도 6시간 동안 실시한다. 혼성화 후, 필터를 다음에 따라 세척한다: (1) 실온에서 2x SSC 와 1% SDS에서 5 분; (2) 실온에서 2x SSC 와 0.1% SDS에서 15 분; (3) 37 ℃에서 1x SSC 와 1% SDS에서 30분에서 1 시간; (4) 42-65 ℃에서 1x SSC 와 1% SDS에서 2 시간, 용액을 바꾸어 각 30분.

특정 서열 상동성을 가진 핵산 분자들 사이에 혼성화가 일어나기 위해 필요한 강도(stringency) 조건을 계산하기 위한 한가지 일반적인 식은 다음과 같다(참조: Sambrook 등, 1989):

Tm = 81.5C + 16.6Log[Na+] + 0.41(%G+C)-0.63 (% fomamide)-600/#bp in duplex

상기식에 의하면, [Na+] =[0.368] 과 50% 포름아마이드를 사용하고, G+C 함량이 42% 이고 평균 탐침 크기가 200베이스(base)이면, Tm 은 57℃이다. DNA 이중선의 Tm은 상동성 1% 감소 당 1 내지 1.5 ℃씩 감소한다. 그래서 75% 이상의 서열 일치를 가지는 표적들은 혼성화온도 42℃ 를 이용하는 것이다.

LuxS핵산을 분리하는 또 다른 방법은, 관심있는 세균 게놈에서의LuxS서열에 대하여 이용 가능한 데이터베이스를 조사하여서, 그 서열로부터 PCR 탐침을 디자인하고 그 염색체로부터 그 유전자를 직접 증폭시켜 그 PCR산물을 클로닝하는 것이다. 또한, 특정 세균 게놈의 완전한 서열이 얻어지지 않으면, 본 발명에 개시된 서열 혹은 어떤 다른LuxS서열을 이용하여 퇴화(degenerate) 올리고뉴클레오타이드를 디자인하여, 그 염색체로부터LuxS을 PCR 증폭과 클로닝을 할 수 있다.

본 발명의 핵산들은 어떤 보편적인 클로닝 벡터에서도 DNA로 유지된다. 더 나은 실시 태양으로는, 클론들은 pBluescript(Stratagene La Jolla, CA) 같은 플라스미드 클로닝/발현벡터에서 유지되며, 이것은 적당한 대장균 숙주세포에서 증식된다.

본 발명의LuxS핵산분자들은 DNA, RNA, 그리고 단일 혹은 이중쇄의 단편들이 포함된다. 그래서 본 발명에 의해서 서열번호: 1, 2 혹은 3을 가지는 DNA 중선택된 분절(segment)같은, 적어도 한 서열의 본 발명의 핵산분자의 서열과 혼성화 가능한 서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드(센스 혹은 안티센스의 DNA 혹은 RNA)가 제공된다. 그런 올리고뉴클레오타이드들은LuxS유전자들과 전사체들을 검출하기 위한 탐침으로 유용하다.

2.단백질과 항체

본 발명의LuxS유전자 산물은 알려진 방법들에 따라서 다양한 방식으로 만들어진다. 그 단백질은 적당한 원료들, 예컨대S. typhimurium,E. coli, 나V. harveyi같은 배양된 세균들로부터 정제될 수 있다.

완전한 길이의LuxS핵산분자가 이용가능하면 당업계에서 알려진 생체외 발현 방법을 이용하여, 그 암호화되는 단백질 생산이 가능하다. 바람직한 실시태양에 따르면, 그 효소는 적당한 발현계에서의 발현에 의해 생산될 수 있다. 예로서 서열번호: 1이나 2를 가지는 DNA 등의 DNA 분자의 부분이나 전부를 대장균 같은 세균세포나Saccharomyces cerevisiae혹은 다른 효모 등의 진핵세포에서 발현에 적합한 플라스미드 벡터로 삽입될 수 있다. 그런 벡터에는 숙주세포에서 그 DNA의 발현에 필요한 조절적 인자들이 포함되며, 이들은 그 숙주세포에서 발현을 허용하는 방식으로 위치가 정해진다. 발현에 필요한 조절적 인자들에는 프로모터 서열, 전사개시 서열, 및 선택적으로, 촉진자(enhancer)서열이 포함된다.

재조합 원핵 혹은 진핵 계에서LuxS유전자 발현에 의해 생성된 단백질은 당업계에서 알려진 방법에 따라서 정제될 수 있다. 바람직한 실시태양로는, 상업적으로 입수 가능한 발현/분비계를 이용할 수 있는데, 이것에 의해 그 재조합 단백질이 발현되고 그 후 숙주 세포로부터 분비되고, 그 주위 배지로부터 쉽게 정제된다. 만약 발현/분비벡터가 이용되지 않으면, 다른 접근 방법에는 그 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 면역학적 상호작용 같은 친화분리에 의한 그 재조합 단백질의 정제가 포함된다. 그런 방법은 숙련된 기술자에 의해 일반적으로 이용된다.

본 발명의LuxS유전자에 의해 암호화되는 단백질은, 앞서 언급된 방법들 중 하나로 조제된, 표준적인 방법에 따라서 분석될 수 있다. 예를 들어, 그 단백질을 알려진 방법에 따라서 아미노산 서열분석할 수 있다. 그 효소의 안정성과 생물학적 활성은, 그 단백질이 다른 조건들 하에서 그 신호분자의 생성을 촉매하는 능력 같은 표준적인 방법들에 따라서 결정될 수 있다.

본 발명에 의해서 또한 본 발명의LuxS에 의해 암호화되는 단백질에 면역적으로 결합을 할 수 있는 항체들이 제공된다. 다클론 항체들은 표준적인 방법들에 따라서 제조될 수 있다. 보다 바람직한 실시태양으로는, 단클론항체를 만들고, 이를 단백질의 다양한 항원결정소들과 면역적으로 반응시키는 것이다. 단클론항체를 콜러(Kohler)와 밀스타인(Milstein)의 일반적인 방법에 따라서 만들 수 있다.LuxS에 의해 암호화되는 단백질과 면역학적으로 상호작용하는 다클론이나 단클론 항체들은 그런 단백질들을 동정하고 정제하는데 이용될 수 있다. 예로서, 항체들은 그들이 면역적으로 상호작용하는 단백질의 친화 분리에 이용될 수 있으며, 또한, 단백질과 다른 생물학적 혼합물이 들어있는 시료로부터 단백질들을 면역 침전시키는데 이용될 수 있다.

B. LuxS 핵산 분자들과 암호화되는 단백질, 면역적으로 특이적인 항체의 이용

LuxS핵산들은 본 발명과 함께 다양한 목적을 위해 이용될 수 있다. DNA, RNA, 혹은 그의 절편들은 탐침으로서LuxS유전자의 존재 및/또는 발현을 검출하는데 이용될 수 있다.LuxS핵산이 그런 검정들에 탐침으로서 이용되는 방법들에는 다음이 포함되나 여기에 한정되지는 않는다: (1) 제자리 혼성화(in situ hybridization); (2) 써던 혼성화(Southern hybridization); (3) 노던 혼성화(Northern hybridization); 및, (4) PCR같은 종류의 증폭반응(Assorted amplification reaction such as polymerase chain reaction(PCR)).

본 발명의LuxS핵산은 다른 세균으로부터 관련 유전자를 동정하기 위해 탐침으로서 이용될 수 있다. 당업계에서 알려진 바처럼, 혼성화 강도(hybridization stringency)는 조정하여 핵산탐침과 다양한 정도의 상동성을 가진 상보적 서열과의 혼성화를 가능케 할 수 있다.

전술한 바와 같이,LuxS핵산은 또한 많은 양의 충분히 순수한 암호화되는 단백질이나, 그것의 선택된 부분을 생산하는데 유리하게 이용된다. 발현벡터로 삽입된 클론 유전자들은 어떤 선택된 세균 종으로부터 신호 분자 그 자체를 대장균 DH5 같은 재조합 숙주에서 대량으로 만드는데 이용될 수 있다. 특이적인LuxS유전자들이 클로닝되고, 많은 양의 그 암호화된 단백질이 생산되어 많은 양의 그 특이적인 신호분자가 생산된다. 이는 다른 종들의 신호분자의 구조에 있어서의 차이를, 만약 그러한 차이가 존재하는 것으로 밝혀지면, 결정하는데 특히 유용하다. 또한 관심 종으로부터 많은 양의 신호분자를 발현벡터에 클로닝된 유전자를 이용하여 만들고, 위에 기술한 것처럼 페트리디쉬 분석에서 잠재적인 표적에 대한 라이브러리 조사에 이용될 수 있다.

정제된LuxS유전자 산물이나, 이의 절편들은 다클론이나 단클론 항체들을 생산하는데 이용되고, 이들 항체들은 배양된 세포에 이들 단백질의 존재와 축적에 대하여 민감한 검출 시약으로 이용될 수 있다. 재조합기술로 선택된LuxS이 암호화하는 단백질의 부분 혹은 모두를 포함하는 융합 단백질의 발현이 가능하다. 완전한 길이의 단백질이나 그 단백질의 단편들은 그 단백질의 다양한 항원결정소에 특이적인 일련의 단클론이나 다클론 항체를 만들어, 세포나 조직에서 그 단백질의 검출에 대하여 보다 큰 민감성을 제공하는데 유용할 수 있다.LuxS단백질의 다른 이용에는 과발현시켜서 결정화에 충분한 양의LuxS단백질을 만드는 것이 포함된다.LuxS단백질의 결정 구조를 해석함으로써 그 신호분자의 생산을 촉매하는LuxS활성화 자리의 정확한 결정이 가능하다. 그러므로LuxS결정구조는 신호분자 유사체,LuxS저해제의 디자인, 그리고 일반적으로 합리적인 약물 디자인 크게 증대시키는 컴퓨터 모델링에 유용할 수 있다.

LuxS에 의해 암호화되는 단백질에 면역적으로 특이적인 단클론이나 다클론 항체들은 그 단백질을 검출하고 정성화하기 위해 고안된 다양한 분석에 이용될 수 있다. 이러한 분석에는 이에 한정되지는 않으나, 다음을 포함한다:(1)유세포측정(Flow cytometric analysis); (2) 세포와 조직에서LuxS단백질의 면역화학적 위치결정(localization); 및, (3) 다양한 세포와 조직으로부터의 추출물의 면역블롯 분석(immunoblot analysis) (즉, 점적법(dot blot), 웨스턴블롯(Western blot)). 또한 위에 언급한 것처럼, 항체들은 그 단백질의 정제에 이용될 수 있다 (즉, 친화 컬럼 정제, 면역침전).

IV. Vibrio harvey 조사 균주(Screening Strain)

본 발명의 또 다른 측면에서는 LuxN, LuxS의 유전자형을 가지는 새로운 균주인Vibrio harveyi가 제공한다. 그람음성세균Vibrio harveyi는 두 개의 평행한 정족수 감지경로(guorum sensing circuit)를 가지며, 이것은 두 개의 다른 자가유도체 분자를 합성하고 검출한다. 경로 1은 AI-1, HSL 자가유도체를 합성하며, 이는 그람음성세균에서 발견된 LuxI/R 경로에 합성된 자가유도체와 구조적으로 유사하다. 경로 2는 AI-2를 합성하며, 구조는 결정되지 않았다. AI-1과 AI-2의 합성은 각각 LuxN과 LuxS에 의존한다. 정확한 외부 농도의 자가유도체 농도에 도달한 다음, 신호는 일련의 인산화/탈인산화 반응을 통해 일어난다. 각각 LuxN과 LuxS 인 AI-1과 AI-2 검출자(detectors)는 보존된 히스티딘 (H1)을 가지는 센서 키나제(kinase)도메인과 보존된 아스파르산을 가지는 붙어있는 반응 조절자 도메인을 가진다. 두 센서로부터의 신호는 공유된 통합 단백질 LuxU로 유출되며, 이것은 히스티딘 잔기(D2)에서 인산화된다. 연속적으로, 그 신호는 반응 조절자 단백질 LuxO의 보존된 아스파르산 잔기로 전달된다. LuxO-인산화는 루시퍼라제 구조 오페론LuxCDABE의 발현을 조절한다. AI-1나 AI-2의 존재는 야생형Vibrio harveyi(균주 BB120)에서 빛 생성을 일으키기에 충분하다. 이런 이유로, 본 발명자들은 다른 돌연변이를 가지는 Lux 유전자들 L, M, S 혹은 Q를 - 이들은 각각 AI-1나 AI-2을 검출하거나 합성하는 능력에서 결함을 가진다 - 가지는 LuxN- 와 LuxQ-를 가지고 있다. AI-2는 센서 1^-, 센서 2⁺(LuxN^-, LuxQ⁺)인 균주를 이용하여 검출할 수 있다. 이 균주는 다양한 세균에서 AI-2를 검출하는데 쓰인다. 세포밀도(density) 증가에 따른 야생형, LuxN- 와 LuxQ- 표현형의 빛 방사 반응을 도 14에 나타내었다.

BB170은 AI-2에 민감한 리포터이나, BB170균주는 마이크로타이터에 의거한 측정(마이크로타이터 based assay)에서 최소 경로의 저해자들에 대한 보고주로 이용에 적합하지 않다. 원하는 균주는 AI-1을 검출하는 능력이 없어야 하고(sensor 1^-), AI-2를 합성하는 능력이 없어야 한다. 따라서, 본 발명에 의하여 유전자형적으로 LuxN- 와 LuxS-인Vibrio harveyi균주가 제공된다. MM32로 명명된 이 새로운 균주는 정족수 감지경로의 저해자들을 검정하는데 유용하다. 예로서, 이 새로운 균주는 센서 1^-이기 때문에, 이것의 증식과 발광능력은 AI-1을 생산하는 생물체들에 의해 영향을 받지 않을 것이다. 더욱이, MM32는 AI-2를 생산하지 못하기 때문에, 외래의 AI-2, 혹은 그의 유사체 첨가로 AI-2 저해제의 빠른 동정이 가능하다. 또한, 위에서 언급한 재료들은 키트를 만드는데 이상적으로 적합하다. 그런 키트에는 닫힌영역(confinement)에 바이알들(vials), 튜브 등과 같은 한 개 이상의 컨테이너 수단(container means)을 수용하기 위해 구획화 된 담체수단(carrier means)이 포함되며, 각 용기에는 그 방법에서 이용될 개별 인자들 중 하나가 포함될 것이다.

이들 용기에는 자가유도체의 존재 검증이 가능한 세균 균주가 포함될 것이다. 보다 바람직하게는 그 세균 균주는 자가유도체-2의 존재에 있어서 쉽게 검출 가능한 신호를 제공하는 것이 가능할 것이다. 보다 바람직하게는, 원하는 균주는 AI-1 검출하는 능력에 결함이 있고(sensor 1^-) AI-2를 합성하는 능력에 결함이 있는 것이다. 그리하여, kit는 유전자형적으로 LuxN^-와 LuxS^-이며, MM32로 명명된Vibrio harveyi균주를 제공할 것이다. 이 세균 균주는 자가유도체-2와 정족수 감지경로의 저해자들 뿐만 아니라 자가유도체-2를 동정하는데 유용하다.

V.세균적 생물 표지자(biomarker)를 검출하는 방법

현재까지 많은 균주들은 그들의 생활환 동안의 어떤 점에서 식물이나 동물 같은 고등생물체와 관련된 자가유도체-1 신호인자를 이용하는 것이 알려졌다. 예로서,Pseudomonas aeruginosa는 사람에 있어서 낭성 섬유증과 연관된 기회주의적인 병원균이다.P. aeruginosa는 AI와 함께 다양한 질병 조절자들을 조절한다. AI를 생산하는 세균의 다른 예에는Erwinia carotovora, Pseudomonas aureofaciens, Yersinia enterocolitica, Vibrio harvei,그리고Agrobacterium tumefaciens이 포함된다.E. carotovora는 어떤 식물을 감염시켜 식물 세포벽을분해하는 효소를 만들고, 그래서 soft rot disease라 불리는 질병을 가져온다.Yersinia enterocolitica는 사람에서의 위장병의 원인균이고 자가유도체를 생산하는 것으로 보고되었다.P. aureofaciens는 식물의 뿌리와 관련되어 있으며 뿌리에서 곰팡이 증식을 차단하는 항생물질을 생산한다. 이 항생물질 합성은 자기유도자의 조절을 받는다. 본 발명은 고유한 자가유도체-2와 자가유도체-2을 이용하는 방법을 제공한다. 자가유도체-1과 반대로 자가유도체-2는 종내 신호인자 뿐만 아니라 종간 신호인자인 것으로 믿어진다. 자가유도체-2는 더욱이 자가유도체-1에 의해 조절되지 않은 병원성인자와 질병인자의 발현을 조절하는 것으로 믿어진다. 그래서 본 발명은 예로서 병원성 세균에서 세균성 표지자의 발현을 동정하고 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법들은 식물이나 동물에 존재하는 세균성 병원인자의 활성을 조절하는데 이용될 수 있다.

더욱이 본 발명은 적어도 한 개의 세균세포와 자가유도분자를 세균성 생물표지자의 유도를 촉진시키는 조건과 그런 시간하에서 자가유도분자와 접촉시킴으로써 자가유도체 관련 세균성 생물 표지자를 검출하는 방법을 제공한다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 자가유도체 관련 세균성 생물 표지자는 자가유도체에 반응하여 조절, 변형, 촉진, 저해나 유도되는 어떤 세균성 세포 성분이다. 생물 표지자는 알려진 현미경적, 조직학적 혹은 분자생물학적 기술들에 의해 동정 가능한 어떤 세균성 세포 성분이다. 그런 생물 표지자는, 예컨대, 비 병원성 세균을 병원성 세균으로부터 병원성 세균을 구별하는데 이용될 수 있다. 그런 생물 표지자는, 예컨대, 세포표면에 존재하는 분자들, 핵산, 인산화 반응 혹은 세균이 자가유도체와 결합하는 결과로 변형되는 어떤 분자적 형태적인 특성이 될 수 있다. 본 발명의 방법은 세균성 질병발생을 시사하는 생물 표지자를 동정하는 데 특히 유용하다. 전술한 바와 같이, 자가유도체는 세포 외 신호인자이고 이는 다양한 세균이 높은 군집밀도를 포함하는 다양한 환경적 자극에 반응하여 세포성 기능을 조절하기 위해 이용한다. 병원성 세균은 주위환경에 자가유도체 농도가 증가된 결과로, 항원결정자 같은 생물 표지자를 발현하는 것으로 믿어진다. 그래서, 본 발명은 세균을 자가유도체-2와 접촉시키고 생물 표지자의 존재에 대한 분석을 함으로써 생물 표지자를 동정하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 세균에 존재하는 생물 표지자를 동정하는 탐침 사용을 고려한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 탐침은 시료에 존재하는 세균성 생물 표지자를 검출하는데 유용한 핵산, 단백질, 작은 분자 혹은 항체가 될 수 있다. 탐침은, 어떤 시료를, 예컨대 자가유도체 같은 것과 접촉시킨 후에 그 시료에 존재하는 생물 표지자를 동정하기 위한 조사실험에 이용될 수 있다. 예로서 세균이 자가유도체와 접촉함에 따라 생산하는 세균성 생물 표지자는 그 세균을 포함하는 시료를 그 생물 표지자에 결합하는 탐침과 접촉시킴으로써 동정될 수 있다. 그런 분석은 다양한 조건들, 질병, 장애를 검출하고, 예견, 진단, 모니터링하는 데에, 혹은 그런 치료의 모니터링에 이용될 수 있다. 탐침은 검출 가능하게 표지(label)될 수 있으며 그 탐침은 그것의 표적 표지에 결합할 때 검출 가능하다. 탐침을 검출 가능하게 라벨하는 수단들에는 효소적, 형광성 혹은 방사성 표지 같은 리포터 분자에 결합하는 아비딘 혹은 스트렙타비딘 같은 바이오틴-결합 단백질들이 포함된다.다른 리포터 수단들과 라벨들이 기술에 잘 알려져 있다. 또한, 본 발명의 방법은 자가유도분자와 접촉에 따르는 세균세포에서의 차별적 유전자 발현을 분석하는데 이용될 수 있다. 예로서, 다른 세포들, 일반적으로 관심(interest) 세포와 대조(control) 세포, 유전자들의 발현을 비교하여 발현에 있어서 어떤 불일치(discrepancies)를 동정한다. 그런 분석에 있어서 불일치의 존재는 비교된 세포들에서 발현되는 유전자 집단들에 있어서 차이를 시사한다. 계속되는 실시에서 이용되는 방법들은 당업계에서 알려져 있다.

본 발명은 단백질일 수 있는 생물 표지자를 동정하는 방법을 제공한다. 예로서, 자가유도분자에 반응하여 발현되는 세균성 단백질은 적당한 항체를 이용하여 검출될 수 있다. 예로서 그 발현된 단백질은 병원성 세균임을 시사하는 항원결정소일 수 있다. 본 발명의 방법에서 이용되는 항체들은, 예로서, 그런 결정소의 검출을 위한 면역분석에서의 이용에 적합하다.여기서 이용된 용어 “항체”는 완전한 분자의 다클론이나 단클론 항체, 뿐만 아니라, Fab 와 F(ab’)₂같은 그들의 절편들이 포함됨을 의미한다. 예로서, 단일 항체들은 당업계에 숙련된 이들에게 잘 알려진 방법에 의한 단백질의 절편들은 포함하는 항원으로부터 만들어진다(참조: Kohler,et al.,Nature, 256, 1975).

또한, 이들 면역 분석에서 단일 항체들은 다양한 방법으로 검출 가능하게 표식될 수 있다. 예로서, 방사성 동위원소를 직접적으로 혹은 간접적으로 중간적인 기능기(intermediate functioal group)를 이용하여 면역글로블린에 결합시킬 수 있다. 면역글로블린에 금속이온으로 존재하는 방사성 동위원소를 결합시키는데 이용되는 중간적인 기능기는 디에틸렌트리아민-펜타아세트산(DTPA)와 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 그리고 유사한 분자들 같은 이종적 기능을 하는 킬레이팅제들이다. 단일항체에 결합하는 금속성 이온들의 전형적인 예는 111In, 97Ru, 67Ga, 68Ga, 72As, 89Zr 과 201T1이다.

본 발명의 방법에서 유용한 탐침은 또한 핵산 탐침이 될 수 있다. 예로서, 핵산혼성화기술은 당업계에서 잘 알려져 있으며, 자가유도체와 접촉된 세균을 포함하는 시료에 존재하는 RNA 혹은 DNA생물 표지자를 동정하기 위해 이용된다. 핵산혼성화에 의존하는 조사 방법은, 적당한 탐침이 제공되면, 어떤 시료로부터 생물 표지자를 동정하는 것을 가능케 한다. 예로서, 표적단백질을 암호화하는 서열의 일부분에 상응할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 탐침들은 화학적으로 합성할 수 있다. 그 단백질을 암호화하는 서열은 그 유전적 암호로부터 추론할 수 있으나, 그 암호의 퇴화성을 감안하여야 한다. 그런 조사를 위해서, 혼성화는 당업계에서 숙련된 자들에게 알려진 생체 외 혹은 생체 내 조건하에서 보다 바람직하게 수행될 수 있다.

또한, 위에 언급한 재료들은 키트(kit)의 제작에 매우 적합하다. 그런 키트 에는 닫힌 구역(confinement)에 바이알(vial), 튜브 등과 같은 한 개 이상의 컨테이너 수단을 수용하기 위해 구획화된 운반수단(carrier means)이 포함되며, 각 용기에는 그 방법에서 이용될 개별 인자들 중 하나가 포함될 것이다. 본 발명의 키트에는 우선 분리된 자가유도체-2를 포함하는 용기가 포함될 것이다. 그 분리된자가유도체-2는 표적 세균에서 생물 표지자의 발현을 조절하는데 이용될 수 있다. 예로서, 자가유도체-2는 특정 생물 표지자의 발현을 유도시키고 그 다음 이를 탐침으로 동정하는데 이용될 수 있다. 그래서 그 키트의 제2의 용기에는 검출 가능하게 표지될 수 있는 탐침이 포함될 것이다. 그 키트의 제3 용기에는 효소적, 형광성 혹은 방사성 표지 같은 리포터 분자에 결합하는 아비딘 혹은 스트렙타비딘같은 바이오틴-결합 단백질 같은 리포터 수단이 포함될 것이다. 다른 리포터 수단들과 표지들 또한 당업계에서 잘 알려져 있다. 예로서, 본 발명의 키트에 의해 본 명세서에 언급한 바처럼 핵산혼성화 분석에 필요한 시약들과 표적에 항체결합을 검출하는데 필요한 시약들이 포함된다.

본 발명 키트는 엄격히 제한된 상황에서 유리병이나 튜브, 또는 그 밖의 비슷한 것들 같은 컨테이너 수단을 하나 혹은 그 이상 수령하기 위해 구획화된 하나의 운반 수단으로서 컨테이너 수단 각각은 실험에 이용되는 재료들을 하나씩 담고 있다. 본 발명 키트는 분리된 자가유도체(autoinducer)-2를 담고 있는 첫번째 컨테이너 수단을 포함한다. 분리된 자가유도체-2는 목적하는 세균에서 생물 표지자(biomarker)의 발현을 조절하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 자가유도체-2는 탐침에 의해 확인되는 특정 생물 표지자의 발현을 유도하기 위해 이용될 수 있다. 또한 본 키트는 탐지될 수 있도록 표식된 탐침을 담고 있는 두 번째 컨테이너 수단와 리포터 수단(reporter-means)를 담고 있는 세번째 컨테이너 수단을 포함한다. 아비딘(avidin)이나 스트랩트아비딘(streptavidin) 같은 비오틴 결합 단백질 등의 리포터 수단은 효소 표지, 형광 표지, 방사성 핵종 표지같은 리포터 분자(reporter molecule)에 결합한다. 다른 리포터 수단과 표지들도 매우 많이 알려져 있다. 예를 들어, 본 발명 키트는 본 명세서에 기술된 핵산 혼성 분석을 행하는데 필요한 시약들 혹은 목적 물질에 결합하는 항체를 탐지하는데 필요한 시약들을 제공할 수 있다.

일반적인 실험 방법과, 그 후에 따르는 기술 사항은 본 발명의 실제 수행과 관련되어 있다. 특수한 물질들이 언급되는 한, 단지 설명의 목적을 위함이며, 본 발명을 제한하기 위해 의도되지 않았다. 특별히 언급되지 않은 부분은 삼부룩(Sambrook) 등(참조: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)(이후 본 명세서에서는 "삼브룩(Sambrook) 등"이라 함) 또는 Ausubel 등의 (Current Protocols in Molecular Biology, John Willy & Sons (1998) (이후 "Austin 등"이라 함) 이후의 일반적인 클로닝 방법이 이용된 것이다.

실시예 1

Escherichia coli 와 Salmonella typhimurium 의 정족수 감지(quorum sensing)

E. coli가 세포 밀도를 감지한다는 예비적인 증거들이 있었다(참조 : Huisman 등, Science 265: 537-539, 1994; Sitnikov 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 336-341, 1996; Garcia-Lara 등, J. Bacteriol. 178: 2742-2748, 1996). 본 발명자들은,V. harveyi의 신호 시스템 2 센서의 감소된 선택성을E. coli와S.typhimurium에 의해 생성되는 세포외 신호 분자 탐지를 위한 분석을 발전시키는데 이용하였다. 이 분석을 이용하여, 본 발명자들은E. coli와S. typhimurim의 많은 변종(strain)들이V. harveyi시스템 2 탐지기와 상호 작용하는 신호 물질을 합성, 분비, 분해하는 조건을 결정하였다.

실험 물질 및 방법

무세포 배양 용액의 준비 : E. coliAB1157과 DH5a,S. typhimuriumLT2는, 본문에 제시된 농도의 글루코스가 첨가된 LB 배지에서, 30℃로 하룻밤 유산소 배양하였다. 다음 날 같은 농도의 글루코스가 첨가된 새로운 LB 배지로 하룻밤 배양된 배양액을 1: 100으로 희석하였고, 희석된 새로운 배양액은, 30℃의 유산소 상태에서, 다양한 시간동안 배양되었다. 무세포 배양 용액은 소형 원심 분리기에서, 15,000 rpm으로 5분 동안 원심 분리하여 배양액으로부터 세포를 제거함으로써 준비하였다. 투명해진 상층액은, 0.2 mm HT Tuffryn 필터 (Gelman)로 여과하여 -20℃에 보관하였다.V. harveyi자가유도체-2를 포함한 무세포 배양 용액은V. harveyiBB152 (자가유도체 1^-, 자가유도체 2⁺)에서 준비되었고, 자가유도체-1를 포함하는 배양 용액은V. harveyiBB120 (자가유도체 1⁺, 자가유도체 2⁺)에서 준비하였다. 두 경우 모두에서V. harveyi변종들은 AB (Autoinducer Bioassay) (참조: Bassler 등, 1993, supra) 배지에서, 30℃로 하룻밤 유산소 배양하였다.V. harveyi무세포 배양 용액은, 위에 기술된E. coli나S. typhimurium의 경우와 같은 방법으로, 하룻밤 배양된 배양액에서 준비하였다.

신호 분자 생성의 분석: E. coli와S. typhimurium,V. harveyi의 무세포 배양 용액에서,V. harveyi의 리포터 변종 BB170 혹은 BB886에서 발광을 유도하는 신호 물질의 존재를 시험하였다. 위에 기술된 방법으로, 준비된E. coliAB1157과E. coliDH5a,S. typhimuriumLT2의 무세포 배양 용액 10 mL를 96-well 마이크로타이터 dish의 웰(well)에 담았다.V. harveyiBB170 또는 BB886은 AB 배지에서, 30℃로 16시간 동안 유산소 배양한 후, 새로운 AB 배지에 의해 1: 5000으로 희석하였고, 희석된 배양액 90 mL는E. coli와S. typhimurium무세포 배양 용액이 담긴 마이크로타이터 dish의 웰(well)에 첨가하였다. 양성대조군(positive control)로는V. harveyiBB152 (자가유도체-1^-, 자가유도체-2⁺) 혹은 BB120 (자가유도체-1⁺, 자가유도체-2⁺)의 무세포 배양 용액 10 mL, 음성대조군(negative control)로는 멸균된 생장 배지 10 mL를 이용하였다. 마이크로타이터 dish는 30℃에서 175 rpm으로 로터리 쉐이커를 이용해 흔들어 주었다. 생성된 빛은 매 시간마다 Wallac Model 1450 마이크로베타 플러스 액체 섬광 측정기를 이용해 화학발광 모드에서 측정하였다.V. harveyi의 세포 밀도는, 같은 양의 세포를 희석해서, 그 희석액을 고체 LM 배지 (Bassler 등, 1993, supra)에 도말하여 30℃에서 하룻밤 배양한 후, 다음 날 나타난 집락의 수를 세어 보아 측정하였다.

활성 분석을 위한 E. coli 와 S. typhimurium 의 생균과 UV-처리한 사균의 준비: E. coliAB1157,E.coliDH5a와S. typhimuriumLT2는 0.5% 글루코스를 첨가한 LB 배지에서, 30℃로 8시간 동안 유산소 배양하였다. 배양액은 소형 원심 분리기에서, 15,000 rpm으로 5분 동안 원심 분리하였고, 흡인(aspiration)을 통해 세포 침전물을 제외한 생장 배지는 모두 제거하였다. 세포 침전물은 AB 배지에 재현탁시키고 격렬하게 혼합(mixing) 운동을 통해 세척하였다. 이것은 다시 15,000 rpm으로 5분 동안 원심 분리하고 AB 배지는 제거하였다. 세포 침전물은 새로운 AB 배지에 재현탁 하였다. 각 세포 현탁액은 1 x 10⁶세포/10 mL가 되도록 희석하여 10 mL씩 마이크로타이터 dish에 나누어 담았다. 그 중 절반은 단파장의 UV 빛으로 10cm 거리에서 15분 동안 처리되었다. 이 처리는 UV-처리된 균의 배양과 도말에 의해, 그리고 다음 날까지 아무런 성장도 하지 않았음을 확인함에 의해 알 수 있듯이 모든 균을 죽이기에 충분하다. 다음으로, 희석된V. harveyiBB170 90 mL를 살았거나 혹은 죽은E. coli와S. typhimurium이 들어있는 웰에 첨가하고, 이전 장에서 기술한 것과 같이 활성 분석을 행하였다.

S. typhimurium LT2 배양 용액 내 글루코스 분석:글루코스 농도는 글루코스 기준물질을 제외하고는 제조업자의 권고에 따라 Trinder 분석(참조: Diagnostic Chemicals Ltd.)을 통해S. typhimurium의 무세포 배양 용액에서 결정하였다. 이 분석은, 0.002% 이하의 글루코스 농도에서 민감하다. 어떤 방해 물질도 LB 배지나 소모된 LB 배양 용액에서 발견되지 않았다.

결과 및 고찰

E. coliAB1157과S. typhimuriumLT2는V. harveyi의 두 정족수 감지 시스템 중 하나만을 특이적으로 유도하는 신호 물질을 생성한다.V. harveyi리포터 변종 BB170은 정족수 감지 유전표현형 Sensor 1^-, Sensor 2⁺를 갖는다. 그것은 신호 시스템 2 탐지기를 통해, 독점적으로 행동하는 세포 외 신호에 대한 반응으로lux의 발현을 유도한다.V. harveyiBB152 (시스템 2 자가유도체를 포함)에서 준비된 무세포 소모 배양 용액(cell-free spent culture fluid) 10%의 첨가는, 내부 발광 발현 수준이 대략 1000배 이상이 되도록 리포터 변종을 자극한다. 도 1에서 무세포 소모 배양 용액 10% 첨가에 의해 유도된V. harneyiBB170의 빛 생성은 100% 활성으로 표준화하였다.

E. coliAB1157과S. typhimuriumLT2는, 0.5% 글루코스가 첨가되거나 첨가되지 않은 LB 배지에서 8시간 동안 배양되었다.E. coli와S. typhimurium세포는 생장 배지에서 제거되고, 무세포 배양 용액을 준비하여,V. harveyi에서 발광 발현 유도 활성을 분석하였다. 글루코스를 첨가한 배지에서 배양된E. coli나S. typhimurium의 무세포 배양 용액 10%의 첨가는,V. harveyiBB152 배양 용액과 유사하게 리포터 변종 BB170에서 최대의 발광을 유도하였다(도 1A). 특이적으로,E. coliAB1157과S. typhimurium은V. harveyiBB152 활성의 106%와 237%를 나타냈다.E. coli와S. typhimurium이, 글루코스가 첨가되지 않은 LB 배지에서 배양하였을 때, 이들은 신호 인자를 생성하지 않았다. 0.5% 글루코스를 첨가한 LB 배지로 10% 치환한 경우에도 리포터 변종에서의 발광은 자극받지 않았고, 이것은V.harveyi에서 발광 발현을 유도하는 물질이, LB-글루코스 생장 배지 내에 존재하지 않음을 보여주었다. 본 발명자들은 글루코스와 아미노산, cAMP, 아세테이트, 호모세린, 락톤(homoserine, lactone), α-케토글루타레이트, 그리고 분비하는 것으로 알려진 다른 케토산들을 포함한 확실한 신호 물질 후보들을 시험했지만, 이들 중 어느 것도 활성을 갖지 않았다. 이 결과는,V. harveyiBB170이E. coliAB1157과S. typhimuriumLT2은, 글루코스를 첨가한 LB 배지에서 배양할 때, 분비하는 어떤 물질에 대해 반응한다는 사실을 제안한다.

유사한 실험이V. harveyiBB886(Sensor 1⁺, Sensor 2^-)에서 수행되었다.V. harveyiBB886은, 신호 시스템 2 탐지기를 통해 작용하는 신호 분자에 대한 반응에서 결함을 가지는 것을 제외하고는 다른 모든 면에서 야생형이다(참조: Bassler 등, Mol. Microbiol. 13:273-286, 1994). 도 1B는V. harveyiBB120의 무세포 소모 배양 용액에 의한,V.harveyiBB886의 표준화된 100% 활성을 보여준다.V. harveyiBB120은 시스템 1 자가유도체 N-(3-하이드록시부타노일)-L-호모세린 락톤 (참조: Bassler 등, 1993, supra)을 생성한다.S. typhimuriumLT2와E. coliAB1157 무세포 배양 용액의V. harveyiBB886으로의 첨가는 기준 수준에 비해 각각 5%와 1%의 증가를 일으켰다(도 1B). 도 1A와 1B의 결과는,E. coli와S. typhimurium이 생성하는 신호 분자가, 특이적으로V. harveyi신호 시스템 2를 통해서만 작용하고 다른 알려지지 않은 경로로는 작용하지 않음을 보여주었다.

신호 분자의 분비를 위해서는 살아있는E. coliAB1157과S. typhimuriumLT2가 필요하다. 본 발명자들은 글루코스가 첨가된 LB 배지에서의E. coliAB1157과S. typhimuriumLT2 배양을, 단순히 배지 내에 이미 존재하는 발광 유도 억제제를 제거하기 위해 이용할 수 있는 가능성을 고려해 보았다. 이들 세포가 자체적으로 수용성 신호 인자를 생성한다는 것을 보여주기 위해, 본 발명자들은 세척한E. coli와S. typhimurium세포를 직접 발광 분석에 첨가하였다. 그 결과는 도 2에 나타나있다. 본 실험에서,E. coliAB1157과S. typhimuriumLT2는 신호 인자의 최대 생성을 위한 조건인 0.5% 글루코스가 첨가된 LB 배지에서 8시간 동안 배양되었다. 배양 후 세포들은 원심 분리에 의해, LB-글루코스 생장 배지에서 제거하였고, 멸균된V. harveyi발광 분석용 배지로 세포 침전물을 세척하고 재현탁 하였다. 실험의 시작 단계에서 1 x 10⁶정도의E. coliAB1157과S. typhimuriumLT2 세포를 희석된V. harveyiBB170 배양액에 첨가하였다. 도 2에서 각 시리즈의 왼쪽 막대표는 세척된E. coliAB1157 혹은S. typhimuriumLT2의 존재가V. harveyi의 발광을 완전하게 유도하기에 충분함을 보여준다.E. coliAB1157과S. typhimuriumLT2은V. harveyiBB170의lux발현을 각각 821배와 766배로 증가시켰다. 실험에 이용한 것과 동일한 양의 세척된E. coli와S. typhimurium세포는, 분석에 이용하기 전에 단파장의 UV 빛으로 처리되었다. UV로 처리한 사균들이 분석에 이용되었을 때에는, 발광에 어떤 변화도 일어나지 않았다. 이 결과는 도 2에서 각 균들의 오른쪽 막대표에 나타나있다. 둘의 결과에서 발광에 영향을 주는 자극 인자는, 세포가 배양되었던 배지에 의해서가 아니라, 실험이 진행되는 동안E.coliAB1157과S. typhimuriumLT2에 의해 생성되는 것임을 알 수 있다. 사균은 전혀 활성을 갖지 않기 때문에, 이 인자는E. coli와S. typhimuriumLT2에 의해 배지로 활발하게 분비된다.

E. coliDH5a는 신호 활성을 생성하지 않는다. E. coli와Salmonella의 임상 분리균들 또한 신호 성분을 생성한다. 10 종류의Salmonella임상 분리균과 5 종류의E. coli병원 분리균이 분석되었고, 모두 신호 매개 활성을 보여주었다. 신호 매개 성분이 단순하게 세포 밖으로 확산되는 글루코스 물질 대사의 정상적인 부산물일 가능성이 있다. 하지만E. coliAB1157이나S. typhimuriumLT2와 동일한 글루코스 대사를 할 수 있는E. coliDH5a는 신호 활성을 갖지 않는다는 사실에 의해 이 가능성은 받아들여지지 않는다. 도 1A는E. coliAB1157이나S. typhimuriumLT2와는 달리, 0.5% 글루코스가 첨가된 LB 배지에서 8시간 동안 배양된E. coliDH5a의 무세포 배양 용액의 10% 첨가는,V. harveyiBB170의 발광을 자극하지 않음을 보여주었다. 마찬가지로 발광 분석에 세척된E. coliDH5a 생균 혹은 사균이 첨가된 경우에도V.harveyiBB170은 발광을 자극받지 않았다(도 2).E. coliDH5a가 발광을 자극하지 못한다는 사실은, 고도로 순화된(domesticated) 이 변종이 신호 활성을 생성하거나 분비하는데 필요한 유전자 또는 유전자들을 갖고 있지 않다는 것을 알려주었다. 본 발명자들은E. coli의 다른 실험실 변종들에서 신호 활성을 시험 하였으며,E. coliDH5a만이 세포외 신호 생성에서 완전한 결함을 보였다(표 1).

표 1:V. harveyi, S. typhimurium, E. coli의 무세포 배양 용액에 의한V. harvryi리포터 변종 BB170에서의 발광 유도 무세포 배양 용액은V. harveyi, S. typhimurium, E. coli의 다양한 변종으로부터, 이미 기술 된 바와 같은 방법으로 준비하였고,V. harveyiBB170에서 발광을 자 극하는 신호 물질의 생성을 시험하였다.V. harveyi를 자극하는 수준 은 100%로 표준화하였다. 5시간 째의 자료가 나타나있다.

종과 변종	발광 유도 (%)
V. harveyi V. harveyi BB152	100
Salmonella S. typhimurium LT2	237
E. coli E. coliAB1157E. coliDH5aE. coliJM109E. coliMG1655E. coliMC4100	10657610093

글루코스는S. typhimuriumLT2에 의한 신호 인자의 생성과 분해를 조절한다. 글루코스가 첨가되지 않은 LB 배지에서 배양된E. coliAB1157와S. typhimuriumLT2의 무세포 배양 용액은 리포터 변종에서 발광 발현을 자극하지 않았다. 이는 글루코스의 물질 대사가 신호 생성에 필수적임을 보여준다. 본 발명자들은, 다른 탄수화물들을 시험하였고 일반적으로 PTS 당(참조: Postma 등, in Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology; F. C. Niehardt, ed), Am. Soc. Microbiol., Washington D.C., pp. 1149-1174, 1996)에서의 배양은E. coliAB1157과S. typhimuriumLT2가 신호를 생성하도록 하였다. 시험된 당들 중에서, 글루코스에서의 배양은 가장 높은 수준의 활성을 나타냈고, 다른 탄소 공급원, 예를 들면 TCA 순환 매개물이나 글리세롤 등에서의 배양은 신호 활성의 주목할만한 생성을 유도하지 않았다.

본 발명자들은, 글루코스가 세포의 신호 생성을 지속시키는데 필요한지 그렇지 않은지를 시험하였다. 도 3은 제한된 농도(0.1%)와 무제한된 농도(0.5%)의 글루코스가 첨가된 두 종류의 LB 배지에서 배양된S. typhimuriumLT2와 관련된 결과이다. 도 3A는 글루코스의 농도가 제한되었을 때,S. typhimuriumLT2는 중간 지수기(약 4시간 배양 후)에서 신호를 생성하지만, 일단 글루코스가 배지에서 모두 고갈되고 나면 생성을 멈춘다는 것을 도 3A에서 알 수 있다. 도 3B는 글루코스 농도가 제한되지 않았을 때S. typhimuriumLT2는 매우 큰 전체 활성을 생성하고, 지수기 전체 기간동안 계속하여 활성을 나타내어 배양 후 6시간 째에 최고의 활성을 나타냄을 보여준다. 도 3B는 또한 중간 지수기의 세포에 의해 합성된 신호 활성이 세포가 정지기에 이르면 소멸됨을 보여준다. 글루코스가 제한된 조건에서 정지기에는 어떤 활성도 유지되지 않으며, 글루코스가 풍부하더라도 고작 24%의 활성만이 정지기에서 유지될 뿐이다. 생장 배지내 글루코스의 농도를 증가시켜도 결과는 다르지 않다. 다시 말해 신호 활성은 중간 지수기 동안에 분비되고, 소모된 배양 용액에서 정지기까지는 감소된 활성이 유지된다.

본 실험에서 나타난 결과를 요약하면,E. coli와S. typhimurium는V. harveyi의 하나의 특수한 정족수 감지 시스템을 자극하는 신호 물질을 생성한다는 것이다. 이전에 많은 다른 세균에서 활성이 시험되었지만 극소수의 종만이 신호 인자를 생성했다(참조: Bassler 등, 1997, supra). 본 명세서에서 보여주듯이E.coli와S. typhimurium의 신호는 강력하고,V. harveyi의 것과 동일한 활성을 나타낸다.E. coli와S. typhimurium의 신호가 정지기 이전에 분해되는 것은, 이들 세균에서의 정족수 감지가 저밀도에 맞춰 조절되고 그러므로 신호에 대한 반응이 정지기로 지속되지 않음을 제안한다. 추가로,E. coli와S. typhimurium의 정족수 감지는 여러 환경 인자에 의해 영향을 받는다. 신호의 생성과 분해는 생장기뿐만 아니라 세포의 물질 대사 활동에 민감하다. 이 결과는,E. coli와S. typhimurium의 정족수 감지 신호가 세포를 다음의 생장기로 넘어갈 수 있도록 하고 환경의 대사 능력과 신호교류하게 하는 두 가지 기능을 가짐을 보여준다.

E. coli와S. typhimurium의 정족수 감지 조절에 대한 이해는 질병 발생에서 세포간 상호 작용과 신호교류 구조를 이해하는데 중요하다. 야생에서는 병원성의E. coli와S. typhimurium은 넓은 분산 상태로 인해 절대로 정지기에 이르지 않을지도 모른다. 그러므로E. coli와S. typhimurium의 정족수 감지가 저 밀도에서 작동된다는 것은 적절해 보인다. 이 상황은 발광성 해양 공생균인V. fischeri의 경우에서는 반대이다.V. fischri의 정족수 감지 시스템은 오직 고밀도에서만 작동하고, 이것은 숙주 내부에 특수화된 빛 기관이 존재함을 나타내는 세포 밀도 지표가 된다.E. coli와S. typhimurium, V. fischeri에서의 이 특수한 정족수 감지 시스템은 각 개체가 존재하는 영역을 적절하게 조절한다. 두 경우 모두에서, 정족수 감지는 세균가 숙주 내에 살기 위한 교류에는 유용하지만 자연에서 자유롭게 사는 데에는 그다지 유용하지 않다.E. coli와S. typhimurium의 경우, 이들 세균가 세포 밀도 정보와 대사를 정족수 감지 순환계로 삽입시키는 경로 때문에 부가적인복잡성이 있다. 글루코스나 다른 대사 산물이 풍부함을 알려주는 신호는 세균에게 전달되어 세균는 자연에서 숙주로 모드의 전환을 한다.

본 발명자들이 시험한 모든 조건 아래에서 본 실시예에 기술된 신호 활성은 유기 용매에 의해 정량적으로 추출되지 않고, 양이온 또는 음이온 교환 컬럼에 결합하지도 않는다. 임시적인 특성화 작업은 신호 전달 물질은 작은(분자량 1000 Da 이하) 극성 물질이지만 명백히 무이온성인 유기 물질임을 말해준다. 이 신호 물질은 산에 안정하고 염기에 약하며 80℃에서는 열에 저항성을 갖지만 100℃에서는 그렇지 않다.E. coli, S. typhimurium, V. harveyi의 신호 정제는 다음의 실시예에 자세히 기술되어있다.

실시예 2

Salmonella typhimurium 에서의 자가유도체 생성의 조절

본 실시예에서는,S. typhimuriumLT2가V. harveyiSensor 1^-, Sensor 2⁺리포터 변종에서lux발현을 자극하는 AI-2를 생성하는 조건이 밝혀졌다.S. typhimurium에 의한 신호 분자는 세균가 선호하는 탄수화물 배지에서 배양되는 동안 생성되었고, 결과로 배지의 pH가 감소하였다. 선호되는 탄소 공급원이 부재한 상황에서 낮아지는 생장 배지의 pH는 신호 인자의 제한된 생성을 유도하고, 이것은 세포가 pH 변화와 탄소 공급원의 이용 모두에 의해 영향을 받는다는 것을 보여준다. 신호 활성은 세포가 정지기에 도달할 때까지 소멸되고, 활성의 소멸을위해 단백질 합성이 필요하게 된다. 적절한 탄소 공급원에서의 배양 이후 따르는 삼투 충격은S. typhimurium배양 용액 내에 존재하는, 신호 활성의 양을 급격하게 증가시킨다. 이 현상은 명백히 자가유도체의 합성 유도와 신호 물질 분해의 억제에 의한 것이다.E. coli와S. typhimurium은V. fischeri의 LuxR (참조: Wang 등, EMBO J. 10:3363-3372, 1991; Ahmer 등, J. Bacteriol. 180:1185-1193, 1998)과 상동적인 SdiA 단백질을 가진다. SdiA는 세포외 인자(참조: Sitnikov 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 336-341, 1996; Garcia-Lara 등, J. Bacteriol. 178: 2742-2748, 1996)에 반응하는 것으로 알려져 있고, 그것은S. typhimurium에서 바이러스성 인자 생성을 조절하기 위한 것으로 보여진다(참조: Ahmer 등, 1998, supra). 아래의 분석들은 AI-2 자가유도체 신호 활성이 SdiA 경로를 통해 기능하지 않음을 보여준다.

실험 재료 및 방법

변종과 배지: 본 연구에 이용된 세균 변종과 그들의 유전자형 및 표현형은 표 2에 나열되어 있다.

표 2: 세균 변종; 그들의 유전자형과 관련된 표현형

균주	유전자형	관련된 표현형
S. typhimuriumLT2		야생형
E. coli0157		야생형
E. coliMG1655	F-,ilvG, rfb-50	야생형
E. coliMC4100	(lac)U169,araD139, rpsL, thi	LacZ-
E. coliDH5	supE44,hsdR17,recA1,endA1,gyrA96,thi-1,relA1	AI-2-
V. harveyiBB170	luxN: : Tn 5	Sensor 1-, Sensor 2+
V. harveyiBB152	luxL: : Tn 5	AI-1-, AI-2+
V. harveyiJAF305	luxN: : Cmr	Sensor 1-, Sensor 2+

LB 배지(Luria broth)는 L 당 10g Bacto Tryptone (Difco), 5g Yeast Extract (Difco), 10g NaCl로 구성된다(참조: 샘브룩 등, 1998). 자가유도체 분석을 위한 AB 배지의 조성은 이미 보고되어 있다(참조: Greenberg 등, Arch. Microbiol.120: 87-91,1979). LM(L-Marine) 배지는 L 당 20g NaCl, 10g Bacto tryptone, 5g Bacto Yeast Extract, 15g Agar로 구성된다(참조 : Bassler 등, 1994, supra). 본 명세서에 보고된 것과 유사한 AI-2 생성의 조절이 ATCC 변종Salmonella enterica Serovar Typhimurium14028과 독립적으로 임상 분리된Salmonella enterica Serovar Typhimurium, 그리고 9 종류의 다른Salmonella enterica Serovar(Typhimurium과는 다른)에서 또한 관찰하였다.

S. typhimurium LT2의 생장 조건과 무세포 배양 용액의 준비: S. typhimuriumLT2는 LB 배지에서, 30℃로 하룻밤 흔들면서 배양되었고, 다음 날 배양액의 30mL를 새로운 LB 배지 3 mL에 접종하였다. 부가의 탄소 공급원이 첨가되는 배양에서는, 멸균된 20% 보관 용액이 특정한 최종 농도에 맞춰 접종 시기에 첨가하였다. 접종 후 배양액은 본 명세서에 제시된 시간동안 30℃에서 200 rpm으로 흔들면서 배양하였다. 무세포 배양 용액은 소형 원심분리기에서, 15,000 rpm으로5분 동안의 원심 분리를 통해 배양 배지에서 세포를 제거함으로써 준비하였다. 투명한 상층액은 0.2 mm cellulose acetate Spin X 필터(참조 : CoStar, Cambridge, MA)로 8000 X g로, 1분 동안의 원심 분리를 통해 여과하여 -20℃에 보관하였다. 본 명세서에 밝혀진 것과 유사한 결과가 본 발명자들이,S. typhimurium을 37℃에서 배양하였을 때 얻어졌다.V. harveyi의 무세포 배양 용액 준비는 이미 밝혀져 있다(참조 : Bassler 등, 1993, supra; Bassler 등, 1997, supra).

밀도의존적 발광분석: V. harveyi리포터 변종 BB170 (Sensor 1^-, Sensor 2⁺) (참조: Bassler 등, 1993, supra)은 AB 배지에서 30℃로 12시간동안 배양된 후, 새로운 AB 배지에 의해 1:5000으로 희석되었다. 발광 현상은 세포 밀도의 기능으로서, 배양되는 동안 다양한 시간대에 생성된 빛을 Wallac Model 1409 액체 섬광 측정기 (참조 : Wallac INC., Gaithersburg, MD)로 정량함으로써 측정하였다. 세포 밀도는, 발광 측정에 이용된 것과 같은 양의 세포를 희석하고, 그 희석액을 고체 LM 배지 (Bassler 등, 1993, supra)에 도말하여 30℃에서 하룻밤 배양한 후에, 다음 날 생성된 집락의 수를 세어보는 것으로 측정하였다. 상대적인 빛의 단위(relative light unit)는 (count min^-1ml^-1x 10³)/(colony forming units ml^-1) 이다.V. harveyi와S. typhimurium무세포 배양 용액은 최종 농도 10% (v/v)가 되도록 측정 초기에 첨가되었다. 기준 실험에서는 AB 배지와 LB 배지 또는 0.5% 글루코스가 첨가된 LB 배지 10%가 무세포 배양 용액 대신 첨가되었다.

S. typhimurium 자가유도체 활성 분석: S. typhimuriumLT2에 의해 분비되는 정족수 감지 신호 활성이 다양한 조건에서의 배양 후 분석되었다.S. typhimuriumLT2의 무세포 배양 용액 10 mL가 마이크로타이터 dish의 well에 첨가되었다.V. harveyi리포터 변종 BB170은 하룻밤 배양되어 위에 기술된 바와 같이 희석되었고, 희석된V. harveyi배양액 90 mL가S. typhimurium무세포 배양 용액이 담겨 있는 well에 첨가되었다. 양성대조군으로는 V. harveyi BB152 (AI-1^-, AI-2⁺) (참조 : Bassler 등, 1993, supra)의 무세포 배양 용액 10 mL를 이용했다.

마이크로타이터 dish는 30℃에서 200 rpm으로 로터리 쉐이커를 이용해 흔들어 주었다. 생성되는 빛은 매 시간마다, 마이크로타이터 dish를 위해 고안된 Wallac Model 1450 마이크로베타 플러스 액체 섬광 측정기(Wallac INC., Gaithersburg, MD)를 이용하여 측정되었다. 본 실험에서 세포 밀도는 각 시간마다 측정하지 않았다. 대신, 생성되는 빛의 증가가 생장 배지 성분에서 기인하는 것이 아니라, 신호 활성에서 기인한 것임을 확실하게 하기 위해, 무세포 배양 용액이 담긴 웰에서의V. harveyi발광을 동일한 생장 배지만을 담고 있는 웰에서의 발광과 비교하였다. 자료는 생장 배지만에서 얻어진 값에 대한 배율(fold)로 나타났다.

S. typhimurium 에서 신호 생성을 조절하는 인자: S. typhimuriumLT2는 위에 기술된 바와 같이, 0.5% 글루코스가 첨가된 LB 배지에서 6시간 동안 배양하였다. 중간 지수기의 배양액은 여러 개의 동일한 부피로 나뉘었고, 그 중 하나는 정지기로 배양하였다(30℃에서 24시간 동안 흔들면서 배양). 나뉘어진 남은 배양액들은, 15,000 rpm으로 5분 동안의 원심분리를 통해 배지로부터 세포를 모두 제거하였다. 세포 침전물은 OD₆₀₀=2.0이 되도록 LB, LB+0.5% 글루코스, pH 5의 LB 혹은 0.1M NaCl이나 0.4M NaCl (물에 녹인)에 재현탁하였다. 현탁된 세포는 30℃ 또는 43℃에서 2시간 동안 흔들면서 배양하였다. 무세포 용액은 정지기 배양액과, 다양한 배지 혹은 삼투 충격 용액 (osmotic shock solution)에 재현탁하여 배양된 균에서 준비하였다. 이 무세포 용액들은 이전에 기술된S. typhimurium활성 분석에서 신호 활성을 위해 시험하였다.

S. typhimurium 의 자가유도체 생성에 대한 생장기, pH, 글루코스 농도 및 삼투압의 효과: S. typhimuriumLT2는 제한된 농도(0.1%)와 무제한된 농도(1.0%)의 글루코스가 첨가된 LB 배지에서 30℃로 다양한 시간동안 배양하였다. 본 명세서에 제시된 시간에, 세포수는 S. typhimurium 배양액을 희석하여 도말한 후, 다음 날 집락 수를 세어 결정하였다. 두 배양액의 pH를 측정하였고, 각 배양액에 남아있는 글루코스의 양은, 실시예 1에 기술된 Trinder 분석에 의해 결정되었다. 무세포 배양 용액은 이전과 같은 방법으로, LB-글루코스 배양액으로부터 준비되었고, 무세포 배양 용액을 만든 같은 세포가 0.4M NaCl 삼투 충격 용액에 재현탁되어 200 rpm으로 30℃에서 2시간 동안 배양하였다. 본 발명자들은 그 시간이 자가유도체 생성에 가장 적합하다고 결정하였다. 세포들은 15,000 rpm에서 5분 동안의 원심 분리에 의해 삼투 충격 용액에서 제거하였다. 무세포 삼투 충격 용액은, 무세포 배양 용액을 준비하는 것과 같은 방법으로 재현탁된 세포 배양액에서 준비하였다. 무세포 배양 용액과 무세포 삼투 충격 용액에서의 신호 활성은 이전에 기술한 것과 동일하게 분석되었다. pH가 7.2로 유지되는 실험에서, 세포는 50mM MOPS와 0.5% 글루코스가 첨가된 pH 7.2의 배지에서 배양하였고, 매 15-30분 마다 pH 7.2의 1M MOPS로 배지의 pH를 적정하였다. pH 5.2에서 수행되는 실험에서는 1M NaOH로 LB 배지의 pH를 5.0-5.2사이로 유지시켰다.

S. typhimurium LT2에 의한 신호 생성과 분비, 소멸에서 단백질 합성의 필요성:S. typhimuriumLT2는 OD₆₀₀=2.5가 될 때까지 0.5% 글루코스가 첨가된 LB 배지에서 30℃로 전배양(pre-incubation)되었다(약 6-8시간). 이 배양액은 동일한 부피로 4등분 되었고, 그 중 두 개를 15,000 rpm으로 5분 동안 원심 분리하여, 세포를 회수한 후에 상온에서 5분 동안 100 mg/ml의 Cm으로 처리하였다. Cm 처리된 세포 침전물 중 하나는 30 mg/ml의 Cm이 첨가된 0.1M NaCl에, 남은 하나는 30 mg/ml의 Cm이 첨가된 0.4M NaCl에 최종 OD₆₀₀=2.0이 되도록 재현탁하였다. Cm 처리하지 않은 두 배양액은 마찬가지로 원심 분리에 의해 세포를 회수하여 각각 0.1M NaCl과 0.4M NaCl에 재현탁하였다. 현탁액은 30℃에서 흔들면서 배양하였고, 본 명세서에 명시한 시간에 현탁액으로부터 1.5ml을 취하여 이전과 같은 방법으로 무세포 삼투 충격 용액을 준비하였다.

SdiA에 의해 조절되는 유전자 발현에 대한 자가유도체의 효과 분석:ftsQ1p와 ftsQ2p 촉진자(promoter)를 포함하는 염기서열은, 다음의 프라이머(primer)를 이용해E. coliMG1655의 염색체 DNA로부터 증폭되었다 : ftsQ1p, 5′CGGAGATCTGCGCTTTCAATG GATAAACTACG-3′ ftsQ2p,5′CGCGGATCCTCTTCTTCGCTGTTTCGCGTG-3′ 증폭 산물은, 두개의 ftsQ 촉진자와 좌우에 BamHI 자리와 BglII 자리를 갖는 ftsQ 유전자의 처음 14개 코돈(codon)을 포함한다. ftsQ1p2p PCR 산물은 촉진자와 리보좀 결합 부위,ftsQ의 개시 코돈을 포함하는lacZ 연합체(fusion)를 생성하기 위해 플라스미드 벡터 pMLB1034(참조 : Silhavy 등, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Press, 1984)의 BamHI 자리로 클로닝하였다. 삽입 유전자가 정확한 방향으로 삽입된 클론과 pMS207, 그리고 삽입 유전자가 반대 방향으로 삽입된 클론과 pMS209가, 앞으로의 분석을 위해 선택하였다. 두 삽입 유전자는, PCR 반응이 진행되는 동안 아무런 에러도 발생되지 않았음을 확인하기 위해 염기 서열을 분석하였다.

E. coli에서의ftsQ조절을 위해 플라스미드 pMS207과 pMS209는E. coliMC4100 (참조: Silhavy 등, 1984, supra)으로 형질 전환하였고, 형질 전환세포는 100 mg/L의 암피실린(ampicillin)이 첨가된 LB 배지에서 30℃로 하룻밤 유산소 배양하였다.rck조절을 위해서는,S. typhimuriumBA1105(rck: :MudJ)와 BA1305 (rck: :MudJsdiA)이 100 mg/L 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 LB 배지에서, 30℃로 하룻밤 유산소 배양되었다. 밤새 배양된 배양액은, 새로운 배지로 20배 희석하여 다시 4.5시간 동안 배양한 후, 배양액을 동일한 부피로 5등분하였다. 그리고 다음의 첨가물 중 하나를 최종 10% (v/v) 농도로 각 배양액에 첨가하였다: LB, 0.4M NaCl,S. typhimuriumLT2에서 준비된 0.4M 삼투 충격 용액,E. coli0157, 및E. coliDH5a (음성대조군). 삼투 충격 용액은 0.5% 글루코스가 첨가된 LB 배지에서,S. typhimuriumLT2와E. coli를 6시간동안 전배양한 배양액으로부터 이전과 같은 방법으로 준비하였다. 세포 현탁액은 기준-갈락토시다아제 반응이 샘플에서 수행된 후에, 30℃에서 2시간 배양하였다(참조: Miller, A Short courcr in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992).

결과

S. typhimurium LT2는 자가유도체와 유사한 활성을 생성한다:실시예 1에서S. typhimurium과E. coli변종이V. harveyi에서의 lux 발현을 자극하는 신호 활성을 생성한다는 것과, 그 신호 분자가V. harveyi정족수 감지 시스템 2를 통해 독점적으로 행동한다는 것이 증명되었다. 도 4는V. harveyi시스템 2 리포터 변종 (Sensor 1^-, Sensor 2⁺)에서의 발광 유도를 보여준다.V. harveyi의 독특한 정족수 감지 행동은 기준 실험(●)에서 나타난다. 새로운 배지로 희석한 직후,V. harveyi에 의해 방출되는 세포 하나 당 빛의 수치는 1000배 이상으로 급격하게 떨어진다. 배지 내 내부적으로 생성된 자가유도체(AI-2)의 임계 농도 축적에 상응하는 임계의 세포 밀도에서, 세포 하나당 발광 수치는 다시 희석되기 전 수준에 도달하기 위해 3 광도 등급 이상으로 지수적으로 증가한다.

V. harveyiBB152 (AI-1^-, AI-2⁺)의 무세포 배양 용액의 10% 첨가는 리포터 변종이 희석 이후 방출되는 빛을 높은 수준으로 유지하게 하였다(○). 방출되는 빛의 증가는V. harveyiBB152(참조 : Bassler 등, 1993, supra)의 무세포 배양 용액 내 AI-2의 존재에 반응하는V. harveyiBB170으로부터 기인한다. 유사하게,0.5% 글루코스가 첨가된 LB 배지에서 배양된S. typhimuriumLT2 무세포 배양 용액의 첨가도 이 리포터 변종에서 기준 수준(■)보다 약 800배 이상의 발광을 유도한다. 이 조건에서S. typhimuriumLT2는V. harveyiAI-1과 유사한 활성은 생성하지 않았고, 0.5% 글루코스가 첨가된 LB 배지에서도 AI-1 또는 AI-2 활성은 나타나지 않았다 (실시예 1).

환경 인자들은 S. typhimurium 의 자가유도체 생성과 소멸에 영향을 준다: S. typhimurium에서의 자가유도체 생성의 조절은 알려진 다른 정족수 감지 시스템과는 다르다. 도 5A는S. typhimurium에서의 자가유도체 생성 조절에 관한 세 가지 중요한 점을 알려준다. 첫째,S. typhimurium이 글루코스가 첨가되지 않은 LB 배지에서 배양되었을 때에는 어떤 자가유도체 활성도 관찰되지 않는다. 둘째, 글루코스가 첨가된 배지에서의 6시간 배양은 상당한 양의 자가유도체를 생성하게 한다(리포터 변종의 760배 활성화). 셋째,S. typhimurium이 정지기로 배양되었을 때에는, 비록 측정 가능하기는 했지만 활성이 크게 감소한다(리포터 변종의 33배 활성화).

본 발명자들은 어떤 조건이 자가유도체의 생성과 소멸에 유리한지를 이해하기 위해S. typhimurium에 일종의 환경적 스트레스를 포함한 여러가지 처리를 하였다. 도 5B에 나타난 실험에서,S. typhimurium은 0.5% 글루코스가 포함된 LB 배지에서의 6시간 전배양에 의해 신호 생성을 유도하였다. 본 발명자들은, 이들 조건에서 글루코스가 고갈되지 않았음을 보여주었다(참조 : Surette와 Bassler, 198). 배양에서 유도시기 후에, 배양 용액은 제거되었고 세포의 일부분은 재현탁되어 도2의 설명에 나타나 있는 다양한 조건에서 2시간 동안 배양하였다. 처리 후 각각에서 무세포 배양 용액이 준비되었고, BB170에서 활성이 시험되었다.

도 5B에 나타난 결과에서,S. typhimurium이 본 실험의 초기에 자가유도체 생성을 전유도(pre-induced)하였다는 것, 다시 말해 이 무세포 배양 용액들이 리포터 변종을 760배나 활성화시켰다는 것은 중요한 사실이다. 도 5B는 세포로부터의 전배양 용액의 제거와 글루코스가 첨가되지 않은 LB 배지나 0.1M NaCl(저장 조건)로의 재현탁, 또는 43℃에서 2시간 동안의 열 충격이 자가유도체를 전혀 생성하지 않거나, 혹은 매우 낮은 수준으로 생성한다는 결과를 보여준다. 이들 결과는 위와 같은 처리들이 자가유도체의 생성을 중단시키거나, 혹은 새롭게 분비되는 자가유도체를 분해시키거나 혹은 둘 다의 결과를 가져옴을 나타낸다.

위의 결과들과는 반대로, 신선한 LB-글루코스 배지에서 전배양된 세포의 재현탁은 높은 수준의 자가유도체 생성을 지속시키는 결과를 보여주었다(리포터 변종의 735배 활성화). 유사하게, 산성의 pH는 자가유도체의 지속적인 생성을 촉진했고(600배 활성화), 고장 삼투 충격(0.4M NaCl)은 1300배의 활성 유도를 촉진하였다. 증가된 AI-2 활성은 오직 pH 5.0의 용액, 또는 이미 활발하게 AI-2를 생성하고 있는 세포의 0.4M NaCl 삼투 충격 용액에서만 관찰하였다. 다시 말해, 만약 전배양하는 동안 글루코스가 첨가되지 않았다면, 동일한 2시간의 처리 후에 측정 가능한 아무런 활성도 생성되지 않았을 것이다.

S. typhimurium세포의 LB+글루코스 배지에서, 0.4M NaCl로의 이동은 시험된 다른 어떤 조건에서 관찰된 것보다 훨씬 높은 수준의 AI-2 활성 축적의 결과를 가져왔다. 0.4M NaCl에 재현탁된S. typhimurium은 자가유도체의 생합성과/또는 분비를 증가시켰고, 또한 분명히 분비된 활성의 상당량을 소멸시키지 않았다. AI-2 생성에서의 유사한 증가 현상이S. typhimurium세포를 0.4M NaCl이나 0.4M KCl, 0.8M 자당(sucrose)에 재현탁 시켰을 때 일어났고, 이것은 AI-2 생성에 대한 NaCl 효과가 이온적인 것이 아닌 삼투적인 것임을 나타낸다.S. typhimurium세포에 대한 분명한 삼투 충격 효과는 본 발명자들이 소멸로 인한 자가유도체의 손실이 없는 상황에서, 자가유도체의 최대 분비를 측정할 수 있게 해 주기 때문에 매우 유용하다.

S. typhimurium 에서 신호 생성에 대한 글루코스의 효과: 실시예 1에서 본 발명자들은 글루코스의 지속적인 존재가 정족수 감지 신호 인자를 생성하기 위해,S. typhimurium에게 필수적임을 보여주었다. 당의 이용에 의해 생장 속도가 증가되고 배지의 pH가 낮아지기 때문에, 본 발명자들은S. typhimurium의 신호 생성에 대한 글루코스 대사와 감소하는 pH, 증가하는 세포수의 효과를 더 분석하였다. 도 6에 나타난 실험에서, 본 발명자들은 제한된 농도(0.1%)와 제한되지 않은 농도(1.0%)의 글루코스가 첨가된 배지에서의S. typhimurium배양에서 신호 생성과 생장 속도, pH를 측정하였다. 무세포 배양 용액과 그에 상응하는 0.4M NaCl 삼투 충격 용액에서 생성된 자가유도체의 수준이 다양한 시간에 측정되었고, 1 x 10⁹세포로 표준화된 자료가 도 6에 나타나 있다. 도 5와는 달리 본 실험에서의 세포는 신호 생성을 위해 전유도되지 않았음에 주목해야만 한다.

도 6은 0.4M NaCl 삼투 충격 용액에서 관찰된 자가유도체의 생성과 소멸 양상이 무세포 배양 용액에서 관찰된 것과 유사함을 보여준다. 그러나 자가유도체가 생성되는 각 시간에서 매우 큰 활성은 상응하는 무세포 배양 용액에서보다는 삼투 충격 용액에서 관찰되었다. 제한된(0.1%) 글루코스 조건에서(도 6A와 6C, 6E),S. typhimurium은 배양 후 2-4시간 사이에 신호 활성을 생성했다(막대표). 그러나 배양 후 4시간이 되면 글루코즈는 완전하게 고갈되었고, 신호 인자의 생성도 중단되었다(도 6A). 반대로 세포가 1.0% 글루코스 조건에서 배양되었을 때, 글루코스는 전체 실험 시간 동안 배지에 계속해서 존재했고(도 6B), 세포는 12시간 동안 계속해서 활성을 생성하였다. 글루코스 농도에 제한받지 않고 24시간 동안 배양된 정지기 세포로부터의 무세포 배양 용액 또는 삼투 충격 용액에서는 거의 아무런 활성도 관찰되지 않았다는 유사한 결과가 도 5와 실시예 1 내의 도에서 보여진다.

S. typhimurium은 지수기 동안 높은 글루코스 배지와 낮은 글루코스 배지에서 거의 같은 속도로 성장하였다. 사실, 높은 글루코스 배지에서, 배양된S. typhimurium배양액은 낮은 글루코스 배지에서, 배양된S. typhimurium배양액의 세포 밀도에 도달하지 않는다(도 6C와 6D). 세포 생장은 증가되는 글루코스 이용에서 기인하는 급격한 pH 감소로 인해 배지 내에서 억제되는 것 같다. 이들 결과는 1% 글루코스가 첨가된 LB 배지에서S. typhimurium에 의해 생성되는 높은 수준의 활성이 높은 세포 수에서 기인하는 것이 아니라 글루코스 대사에 의한 신호 생성 유도에서 기인하는 것임을 보여준다.

도 6E와 6F는 낮은 글루코스 배지와 높은 글루코스 배지의 각 시간에서의 pH를 보여준다. 낮은 글루코스 조건에서 배지의 pH는 세포가 글루코스를 이용함에 따라 초기에는 감소한다(도 6E). 그러나 글루코스가 완전히 고갈됨과 동시에 pH는 다시 올라가게 된다. 반대로 높은 글루코스 조건에서 배지의 pH는 pH 5 이하로 내려간다(도 6F). 도 6의 실험은 글루코스 이화 작용과 감소하는 pH라는 두 인자 중 하나 또는 이들 둘 다가S. typhimurium에 의한 신호 생성을 야기할 수 있음을 나타낸다.

글루코스 대사 작용과 낮은 pH는 S. typhimurium 에서의 신호 생성을 독립적으로 조절한다: S. typhimurium의 신호 생성에 대한 글루코스 대사 작용의 효과와 낮은 pH의 효과를 구별하기 위해, 본 발명자들은 0.5% 글루코스가 첨가된 LB 배지에서 배양된S. typhimurium에서 생성되는 활성(도 7A)과 글루코스가 첨가되지 않은 배지에서 배양된S. typhimurium에서 생성되는 활성(도 7B)을 비교하였다. 이 실험에서, 글루코스가 첨가된 배지와 첨가되지 않은 배지의 pH는 각각 7.2와 5.0으로 유지되었다. 또한 본 발명자들은 무세포 배양 용액과 0.4M NaCl 삼투 충격 용액에 존재하는 신호를 측정했다. 도 3에서 보여진 자료와 비슷하게도, 무세포 배양 용액에서 관찰된 신호 수준은 0.4M NaCl 삼투 충격 용액에서 관찰된 것보다 낮았다.

S. typhimurium이 0.5% 글루코스가 첨가된 pH 7.2의 LB 배지에서 배양되었을 때, 정족수 감지 신호의 양의 증가는 6시간 동안 관찰하였다. 6시간째에 0.4M NaCl 삼투 충격 용액에서,V. harveyi리포터 변종 BB170의 빛 생성은 약 550배나 자극하였다. 6시간 이후에는 아무런 활성도 생성되지 않았다. 도 7A는 배지의 pH가 더 이상 감소하지 않는 시간 이후에도 8시간 동안은 pH가 7.15-7.25 사이로 유지되었지만, 세포가 글루코스를 고갈시킴으로 인해 pH가 다시 올라가기 시작했음을 보여준다. 본 발명자들은 실험이 진행되는 동안 pH가 계속해서 증가되도록 하였다. 또한 각 시간에서의 세포 수를 보여준다. pH 7.2에서 세포는 급속하게 성장하여 높은 세포 밀도에 도달했다.

본 명세서에서 보여지는 것과, 유사한 시간 추이 분석(time course analysis)은S. typhimurium이 글루코스가 첨가되지 않은 중성 pH의 LB 배지에서 배양되었을 때,S. typhimurium은 어떤 신호도 생성하지 않음을 보여준다(실시예 1). 그러나S. typhimurium이 글루코스가 첨가되지 않은 pH 5.0의 배지에서 자랐을 때에는 일시적으로 정족수 감지 신호를 생성하였다(도 7B). 신호는 4시간 동안 생성하였고, 0.4M NaCl 삼투 충격 용액세서 얻은 최대의 활성은 리포터 변종의 약 450배였다. 매우 적은 신호가 5시간까지 생성되었지만, 배양 후 6시간 이후에, 신호는 완전히 소멸하였다. 본 실험에서, pH는 5.0-5.2 사이로 유지되었음이 도 7B에 나타나 있다. 세포는 pH 5.0에서는 pH 7.2에서보다 매우 천천히 성장했음을 명시해 둔다.

S. typhimurium 자가유도체 분해 기구의 임시적인 특성화: S. typhimuriumLT2에 의해 생성되는 정족수 감지 활성은 정지기의 개시에 의해 분해된다. 본 발명자들은, 글루코스가 첨가된 LB 배지에서, 6시간 동안 배양된 세포로부터 준비된 무세포 배양 용액과 0.4M NaCl 삼투 충격 용액에 포함되어 있는 신호가 30℃에서, 적어도 24시간 동안 안정하다는 것과 이 사실이 이들 무세포 용액 내에는 신호 분해 활성이 존재하지 않음을 나타낸다는 것을 알아냈다. 더구나 활발하게 신호를 생성하는,S. typhimurium(글루코스가 첨가된 LB 배지에서 6시간 배양된 세포) 무세포 배양 용액과 분해 인자를 갖는S. typhimurium(글루코스가 첨가된 LB 배지에서 12시간 또는 24시간 동안 배양된 세포) 무세포 배양 용액을 섞었을 때 신호의 분해가 일어나지 않았다. 이 결과는 분해 활성은 분비되는 것이 아니라 세포와 관련되어 있음을 보여준다.

본 발명자들은, 활발하게 자가유도체를 분비하는S. typhimurium세포를 0.1M NaCl 용액으로 옮겼을 때, 더 이상의 자가유도체는 생성되지 않는 것을 도 5에서 보여주었다. 그러나 이 세포가 0.4M NaCl 용액으로 옮겨졌을 때에는, 매우 많은 양의 자가유도체가 생성됨을 관찰하였다. 이 결과는, 저삼투성이 자가유도체 분해 기구를 유도하는 신호가 될 수 있음을 암시한다. 본 발명자들은 삼투가S. typhimurium에서의 자가유도체의 생성과 분해에 영향을 주는 기작을 분석하기위해,S. typhimurium의 신호 생성과 분해에서의 단백질 합성 필요성을 고삼투와 저삼투의 조건에서 조사하였다. 도 5의 해설에 쓰여진 것 처럼,S. typhimuriumLT2는 최대의 신호 생성을 유도하기 위해, 0.5% 글루코스가 첨가된 LB 배지에서 배양하였고, 단백질 합성의 유무 조건에서, 0.1M 또는 0.4M NaCl 용액이 처리하였다. 그리고 무세포 배양 용액이 준비되어 신호 활성을 분석하였다. 무세포 삼투 충격 용액의 절반에는 chloramphenicol (Cm)이 포함되어 있기 때문에,V. harveyiJAF304가 리포터 변종으로 신호 활성을 이용하였다.V. harveyiJAF304는,luxN유전자에Cm^r카셋트를 포함하고 있으며, 표현형은 Sensor 1^-, Sensor 2⁺로V. harveyiBB170의 표현형과 동일하다.

세포가 0.4M NaCl에 재현탁되었을 때,S. typhimurium은 200분 동안 증가된 양의 신호를 생산하여 분비하였다(도 8A, 열린 사각형). 그러나 이 시간 이후 무세포 삼투 충격 용액에 존재하는 신호 활성의 양은 얼마간 감소하였다. 이것은 분비된 신호 중 일부분이 분해되었음을 말해준다. 매우 다른 결과가S. typhimurium이 0.1M NaCl에 재현탁되었을 때 나타났다(도 8B, 열린 사각형). 이 경우에서,S. typhimurium은 초기 시간에는 0.4M NaCl에 재현탁된 세포가 생성하는 것과 같은 양의 활성을 생성하였다. 그러나 120분쯤에 무세포 저삼투 용액에는 어떤 활성도 남아있지 않았다. 이것은 분비된 활성이 저삼투 조건에서 빠르게 분해됨을 나타낸다. 본 발명자들은, 무세포 배양 용액에서는 활성의 분해를 관찰할 수 없었으며, 이것은 무세포 저삼투 용액에서의 활성 소멸의 원인은 신호 분자의 화학적 불안정성이 아님을 보여준다.

고삼투 조건에서는, 세포가 단백질 합성을 억제하는 Cm으로 처리되었을 때 Cm-처리되지 않은 세포에 비해 약 1/4의 활성을 생성하였다. 도 8A의 (■)는 Cm의 존재할 때 리포터 변종의 활성이 300배 유도된 것을 Cm-처리되지 않은 세포가 1200배의 활성을 유도(도 8A, □)한 것과 비교하여 보여준다.S. typhimurium이 저삼투 용액에 현탁되었을 때에는 (도 8B), Cm 부재시 생성되는 활성(□)의 약 3/4이 Cm이 존재(■)할 때 생성하였다. Cm이 존재할 때, 분비된 활성은 고삼투에서는300분까지 분해되지 않았고, 저삼투에서는 오직 일부분만 분해되었다.

고삼투가 AI-2 신호 분해를 억제하지 않음을 보여주기 위해, 본 발명자들은 0.4M NaCl 무세포 삼투 충격 용액에 포함되어 있는 활성을 0.1M NaCl에 2시간동안 재현탁되어 있었던S. typhimurium세포에 첨가하였다. 도 8에서 보여지듯이, 이들은 신호 인자를 분해할 수 있는 세포이다. 표 3은 이들S. typhimurium세포가 고삼투 조건에서 배양되는 동안 신호 활성의 98% 이상을 분해했음을 보여준다. 또한 표는 0.4M NaCl에서 배양되었던S. typhimurium세포(이들은 활발하게 신호를 분비하고 있는 세포이다)가 활발하게 신호를 분해하고 있는 세포로부터 준비된 0.1M NaCl 배양 용액에 재현탁되었을 때, 더 이상의 활성을 분비하지 않았음을 보여준다. 더구나, 활성이 있는 0.4M 무세포 삼투 용액과 활성이 없는 0.1M 무세포 삼투 용액의 혼합은 0.4M 용액 내 활성의 분해를 일으키지 않았다.

표 2: 고삼투는S. Typhimurium신호 인자의 분비를 유도하고 저삼투는 분해 를 유도

처리	발광 유도의 수준 (fold)
0.1M NaCl 활성a	4
0.4M NaCl 활성a	944
0.1M 세포 + 0.4M NaCl 활성b	17
0.4M 세포 + 0.1M NaCl 활성c	6

^a S. typhimurium은 0.5% 글루코스가 첨가된 LB 배지에서 6시간 동안 배양되었다. 이 세포는 침전되었고, 0.1M 또는 0.4M NaCl 용액에 2시간 동안 재현탁되었다. 무세포 배양 용액이 준비되었고 활성을 위해 시험되었다.

^b0.1M NaCl 용액에서 2시간 동안 배양되었던S. typhimurium은 침전되었고, 0.4M NaCl 용액에 2시간동안 현탁되었던 세포로부터 준비되어, 활성을 포함하는 무세포 삼투 충격 용액에 재현탁되었다. 무세포 배양 용액은 2시간 배양 후에 준비되었고 신호 활성이 분석되었다.

^c0.4M NaCl 용액에 현탁되었던S. typhimurium은 회수되어, 0.1M NaCl 용액에 2시간 동안 현탁되었던 세포에서 준비한 무세포 삼투 충격 용액에서 2시간 동안 배양되었다. 무세포 용액은 2시간 배양 후 준비되어 신호 활성이 분석되었다.

LuxR 상동체 SdiA는 AI-2 자가유도체에 대한 반응에 관련되어 있지 않다: V.fischeri의luxR과 상동적인 유전자가E. coli와S. typhimurium에서 발견되었고, sdiA라고 명명되었다. 두 개의 기록은E. coli에서 SdiA가 무세포 배양 용액에 존재하는 인자(Garcia-Lara 등, 1996, supra)와 약간의 호모세린 락톤 자동유도자들(참조: Sitnikov 등, 1996, supra)에 대해 반응하여, 세포 분열좌ftsQAZ의 발현을 적절하게 조절한다고 시사하고 있다.E. coli유전체(genome)의 완전한 염기서열에서 LuXRI 상동체는,E. coli에 존재하지 않았으므로, 가정되는 수용성 인자의 생합성에 상응하는 유전좌는 결정되지 않았다.S. typhimurium에서의 SdiA 과잉발현은,S. typhimurium의 바이러스성 플라스미드에 위치한 여러 ORFs의 발현에 영향을 미친다는 것이 최근에 알려졌다(참조: Ahmer 등, 1998, supra).E.coli에서의 연구와 같이,S. typhimurium에서의 SdiA 활성은 세포외 인자에 의해 조절되는 것으로 제안되고 있다.

본 발명자들이,S. typhimurium과E. coli에서 특성화한 AI-2 자가유도체는 SdiA를 통해 행동할 수도 있다. 본 발명자들은,S. typhimurium과E. coli에서 AI-2가 SdiA에 의해 조절되는 유전자에 대해 영향력을 가지는지 그렇지 않은지를 시험하였다. 본 발명자들은,ftsQ1p2p-lacZ리포터를E. coli에서 분석하였고,S. typhimurium에서는sdiA ⁺와sdiA ^-모두의 배경(background)에서rck: :MudJ 연합체를 분석하였다. 본 발명자들은, LB, 0.4M NaCl,S. typhimuriumLT2와E. coli에서 준비하였고, AI-2 활성을 포함하는 0.4M NaCl 삼투 충격 용액, 그리고E. coliDH5a의 0.4M NaCl 삼투 충격 용액의 첨가 효과를 시험하였다. 본 발명자들은,E. coliDH5a가 본 생장 조건에서 AI-2 활성을 생성하지 않음을 이미 실시예 1에서 보여주었다.

E. coli실험을 위해 본 발명자들은, MC4100과 MC4100/pMS209(부적합한 방향으로ftsQ1p2p를 포함하고 있는)가 측정될만한 갈락토시다제의 활성을 갖지 않음을 확인하였다. MC4100/pMS207(ftsQ1p2p-lacZ연합체를 포함하고 있는)에 의해 생성되는 갈락토시다제의 수준은 대략 20-30 밀러 단위로, 이 활성 수준은 본 명세서에서 시험된 어떤 조건에서도 변화되지 않았다. 연합체의 활성 수준은 이미 알려진 것과 비교되었다(참조: Sitnikov 등, 1996, supra; Garcia-Lara 등, 1996, supra).S. typhimurium의 SdiA 연구에서, 본 발명자들은 Ahmer 등과 유사하게sdiA ⁺배경에서 ~30 밀러 단위의rck: :MudJ 활성을 얻었다. 이 활성 수준은sdiA ^-배경에서 10 단위로 감소하였다.E. coli나S. typhimurium으로부터의 AI-2 첨가 후에도 α갈락토시다제 생성에는 아무 변화도 일어나지 않았다. 이들 결과로부터, 본 발명자들이, 시험한 조건들에서 SdiA의 활성을 조절하는 세포외 인자가 존재한다면 그것은 AI-2가 아니라는 결론을 얻을 수 있다.

고찰

E. coli와 S . typhimurium 에서의 정족수 감지: 본 발명자들은, S. typhimurium에 의해 생성되는 세포외 신호 인자를 탐지할 수 있는 이종 생물학적 검정 방법(heterologous bio-assay)을 개발하였다. 신호 인자는 정족수 감지 기능을 가진 세균인V. harveyi의 AI-2와 흡사하게 행동하고, 특이하게도V. harveyi신호 시스템 2 탐지기 LuxQ를 통해서 작용한다.ftsQ와rck촉진자를 포함하는 LacZ 연합체를 이용한 결과, 본 분석 조건에서 AI-2 정족수 감지 인자는 적어도 이들 유전자들의 조절에 관해서는 SdiA로 신호를 전달하지 않았음이 밝혀졌다. 그러므로 AI-2 정족수 감지 시스템은, 이전에 조사된 경로(들)가 아닌 S. typhimurium이나E. coli의 다른 신호 변환 경로와 관련되어 있다고 할 수 있다.

S. typhimuriumLT2는,V. harveyi에 의해 생성되는 것과 거의 같은 양의 활성을 생성한다. 본 발명자들은, 10%S. typhimurium무세포 배양 용액의 첨가에 의해,V. harveyi리포터 변종 BB170이 약 800배나 자극됨을 관찰했다.S.typhimurium신호에 의해,lux가 유도되는 시간과V. harveyi의 반응 곡선의 모양은V. harveyi자신의 AI-2에 의한 것과 구별되지 않는다. 더구나, 본 발명자들은 동일한 정제 방법을 이용하여,V. harveyiAI-2와S. typhimurium의 신호 분자를 부분적으로 정제하는데 성공하였다. 이들 두 결과는S. typhimurium의 신호 분자가V. harveyi의 AI-2와 동일하거나 혹은 매우 밀접하게 관련되어 있음을 보여준다.

생장 조건은 S. typhimurium 에 의한 신호 생성과 소멸을 조절한다:본 실시예에서, 본 발명자들은S. typhimuriumLT2에서의 신호 활성의 조절을 보다 특성화시켰다.S. typhimurium무세포 배양 용액 내 신호 활성의 축적 정도는, 세포가 영양 배지(rich medium)에서 글루코스를 활발하게 이용하고 있을 때 중간 지수기 동안 최대이었다. 이 생장 조건들에서 글루코스의 이용은 배지 내 pH의 급격한 감소를 동반한다. 이 결과들은, 글루코스 대사 혹은 낮은 pH가S. typhimuriumLT2로 하여금 정족수 감지 인자를 생성하도록 유도하기에 충분함을 증명하며, 글루코스와 산도(acidity) 모두가 자가유도체 생성을 유도하는 독립적인 신호들을 생성함을 밝혀준다. 글루코스가 존재하는 조건에서, pH가 유지되지 않았을 때, 감소하는 pH나 적절한 탄소 공급원의 존재는,S. typhimurium에서의 정족수 감지 조절에 기여한다. 결과는, 또한 글루코스가 존재하는 중성 pH의 조건과 글루코스가 존재하지 않는 낮은 pH 조건에서, 자가유도체의 생성이 정지기 이전에 중단됨을 보여준다. 그러므로 산성 조건과 글루코스 부재의 결합은,S. typhimurium이 자가유도체의 생성을 중단하도록 신호를 주는데 필요하지 않다.

글루코스 뿐만 아니라, 여러 다른 탄수화물에서의 배양 역시 신호 활성의 생성을 유도한다. 이들은 PTS 당(프럭토스, 만노스, 글루시톨과 글루코사민)과 비PT당 모두를 포함한다. 이 발견은 자가유도체 생합성의 조절에서 PTS의 독점적인 역할을 제거한다.S. typhimuriumLT2가 여러 다른 탄소 공급원들(아세테이트, 글리세롤, 시트레이트와 세린)에서 배양되었을 때, 신호 활성의 커다란 축적은 관찰되지 않았다. 본 발명자들은, 실시예 1에서 신호 분자가 혼합된 산 발효의 주요 산물을 포함하는S. typhimurium에 의해, 분비되는 것으로 알려진 많은 물질들 중 어떤 것이 아님을 증명하였다. 분명히, 신호 분자의 생성은 세포에 의해 정확히 조절되고, 아직 이해되지 않는 이유들에 의해 세포가 선호하는 탄수화물이 첨가된 배지 조건에서 보다 촉진된다. 신호 분자의 확인과 생합성 유전자(들)의 클로닝은 조절 기작의 완전한 이해에 도움이 될 것이다.

본 실시예에 나타난 결과들은 다른 정족수 감지 시스템과는 반대로,S. typhimurium신호가 정지기에 축적되지 않음을 보여준다. 적어도 두 개의 공존하는 작용이 자가유도체의 생성과 분해의 조절에 기여한다. 본 실시예에서, 본 발명자들은 자가유도체 생성을 무세포 배양 용액에 존재하는 신호 활성의 증가로 정의하고 있다. 본 발명자들은 활성의 증가가 새로 생합성된 자가유도체의 분비, 저장되어 있던 자가유도체의 분비, 자가유도체 분해의 억제 또는 이들 활동의 어떤 조합으로부터 생겨난 결과임을 알았다. 본 발명자들은, 자가유도체 분해를 무세포 배양 용액으로부터의 신호 활성의 소멸로 정의한다. 이 소멸은 자가유도체의 파괴, 자가유도체의 재흡수 또는 이들 활동의 결합에서 생겨난다. 본 연구에 이용된어떤 조건에서, 자가유도체의 생성과 분해는 동시에 진행되는지도 모른다. 만일 그렇다면, 무세포 배양 용액에서 발견된 활성은 생성과 분해 작용에서 우세한 작용의 측정치이다. 이 발견들은S. typhimurium의 정족수 감지가 그와 같은 신호에 의해 조절되고, 아마도 신호에 대한 반응이 정지기에 중단되지 않으리란 것을 암시한다. 선호되는 탄수화물의 이용 또한 신호 생성을 위해 필요하기 때문에,S. typhimurium의 정족수 감지는 세포 밀도 측정과 생장을 위한 환경의 잠재성 측정, 둘 모두를 위해 이용될 수 있다.

삼투는 S. typhimurium 에서의 신호 생성과 소멸에 영향을 끼친다:활발하게 신호를 생성 중인S. typhimurium세포는 특수한 환경적 처리들에 의해 신호의 생성을 보다 더 자극받을 수 있으며, 이것은 여러 독립적인 조절 경로들이 자가유도체 합성으로 정보를 전달한다는 것을 의미한다. 이 처리들 중의 한 가지는 0.4M NaCl 삼투 충격이다. 자가유도체를 생성하는S. typhimurium세포가 0.4 M NaCl에 재현탁되었을 때, 세포는 단백질 합성이 억제되었을 때보다는 단백질 합성의 능력을 가질 때 방대한 양의 활성을 분비한다. 더구나. 신호의 분해 또한 단백질 합성을 필요로 한다. 이들 결과는 여러가지 암시를 가진다. 첫째, Cm이 존재할 때, 고삼투와 저삼투 용액에 재현탁된S. typhimurium는 유사한 양의 활성을 생성한다. 이 결과는 글루코스 존재에서의 배양 후에,S. typhimurium세포는 신호 활성 생성 능력(및/또는 이미 합성되어 있는 활성을 세포로부터 분비하는 능력)이 이미 제한되어 버렸음을 암시한다. 둘째, 세포가 고삼투 용액에 재현탁되었을 때, 신호 생성은 그 수준 보다 훨씬 이상으로 증가한다. 신호 생성에서의 이와 같은 증가는단백질 합성을 필요로하고, 본 발명자들은 이것을 고삼투가S. typhimurium으로 하여금 신호 생성 및/또는 분비를 위해 필요한 생합성 기구를 보다 많이 합성하도록 유도하는 일종의 환경적 인자 역할을 한다고 해석하였다. 셋째, 저삼투 조건에서 본 발명자들은, 활성의 급속한 감소에 뒤따른 활성의 초기 분비를 관찰했다. 그리고, 신호 분해는 Cm 존재 상태에서는 관찰되지 않았기 때문에 단백질 합성을 필요로 한다. 이 결과들은, 환경이 자가유도체 생성에 유리한 조건(LB + 선호되는 탄수화물, 또는 고삼투)에서 자도유도물 생성에 불리한 조건(저삼투, 또는 선호되는 탄소 공급원의 부재)으로 변화하였음을 암시한다. 이 환경적 변화는 신호 활성의 분해를 위해 필요한 단백질(들)을 합성하도록S. typhimurium을 자극한다.

S. typhimurium세포가 0.4M NaCl 용액에서 배양되었을 때, 신호 활성 분해의 200분까지는 거의 일어나지 않았다. 이것은 필요한 분해 활성 단백질(들)이 이들 조건에서 합성되지 않았거나, 혹은 반대로 분해 활성 기구는 완성되었지만 고삼투에 의해 그 활성이 억제되었음이 나타났다. 결과는 고삼투가 신호 분해를 억제하지 않음을 보여준다. 왜냐하면 활성을 분해하도록 유도된 세포는 고삼투에서 그렇게 할 수 있었기 때문이다. 그러므로 고삼투 용액에서의 활성 지속은 분해 기구의 활성 억제때문이 아니라 분해 기구가 합성되지 않았기 때문에 일어난다.

S. typhimurium세포가 언제 자가유도체 생산자로 행동하고, 언제 자가유도체 분해자로 행동하는지를 정확하게 결정하는 것은 어려운 일이다. 왜냐하면 두 반응은 동시에 일어날 수 있기 때문이다. 그러나 고삼투에서 분해는 전혀 일어나지 않거나 혹은 매우 낮은 수준으로 보여지고, 전체 신호 생산자에서 전체 신호 분해자로의 변환은 저삼투에서 일어나며 단백질 합성을 필요로 한다. 분해 기작의 임시적 특성화는 분해 기작이 세포와 관련되어 있음을 보여준다. 자가유도체 활성은 오랫동안 무세포 배양 용액에서 안정하였고, 활성의 무세포 용액과 불활성의 무세포 용액의 혼합, 혹은 활성의 고삼투 무세포 용액과 불활성의 저삼투 무세포 용액의 혼합은 자가유도체 분해를 촉진하지 않았기 때문이다. 본 발명자들은, 최근 AI-2 활성을 생성하지 않는S. typhimurium돌연변이체를 분리하였다. 만일 이 돌연변이체가 자가유도체를 분해하는 능력을 지니고 있다면, 이 돌연변이체의 분석은 분해의 시점을 이해하고, 분해 기구를 유도하는 인자를 확인하는데 유익한 정보를 줄 것이다. 본 발명자들은, 요즘 자가유도체 생성 능력은 가지고 있지만 분해 능력은 가지고 있지 않은S. typhimurium돌연변이체를 분리하기 위한 시도를 하는 중에 있다.

Salmonella 의 질병 발생에서의 정족수 감지의 역할: S. typhimuriumLT2에 의한 신호 생성과 분해의 조절에 대해 본 명세서에 나타난 관점들은,Salmonella의 질병 발생에 대한 정족수 감지의 역할을 암시한다. 신호 생성을 유도하는 조건들(영양분의 풍부함, 고삼투 및 낮은 pH)은, 장내 병원균과 숙주의 최초의 상호작용이 일어나는 것을 유리하게 한다. 신호의 분해에 유리한 조건(영양분의 빈곤함, 저삼투)은, 대부분 병원균이 숙주를 떠나도록 한다. 숙주의 최초의 집락화(colonization)는, 세포-세포 신호 시스템을 통해 조화를 이룬 세포 집단 사이에서의 공동 효과일지도 모른다. 본 발명자들이, 아직 시험해보지 못한 다른 인자들 또한S. typhimurium의 정족수 감지를 조절할 수 있다. 이것은 질병 발생과관련된 독립적인 경로, 혹은 중복된 경로가 존재함을 의미할 수도 있다. 본 발명자들은, 이 가설들을 시험하기 위해S. typhimurium돌연변이체를 분리하고 있다. 마지막으로,Salmonella의 질병 발생은 숙주와 대사적으로 활발한 세균 사이의 역동적인 상호 작용이다. 질병 발생에서의 정족수 감지 역할과 일치하는 본 증거는 이 정족수 감지 시스템이 정지기 동안에는 기능하지 않음을 시사한다. 본 발명자들은, 신호 분자가 정지기 동안에 생성되지 않음과 더불어 존재하는 신호가 분해됨을 보여주었다. 아마도 정족수 감지는S. typhimurium이 숙주 내 기생 생활과 자연에서의 자유로운 생활 사이의 전환을 일으키는 데 중요한 역할을 하는 것 같다.

실시예 3

Escherichia coli, Salmonella typhimurium , 및 Vibrio harveyi 에서의 정족수 감지: 자가유도체 생성에 관여하는 유전자의 새로운 집단

본 발명자들은,V. harveyi,E. coli, 및S. typhimurium에서 AI-2 생성에 관여하는 유전자 분석을 본 실시예에 보고한다. 세 종의 세균에서 확인된 유전자는 고도의 상동성을 가지며, 본 발명자들은 이들 유전자를 자가유도체 생성과 관련한 단백질들의 새로운 집단(family)라고 정의함을 제안한다. 본 발명자들이luxS _V.h., luxS _E.c ., luxS _S.t .라고 명명한 유전자들은 유전체 염기 분석 연구 계획에 의해 많은 세균 종들에서 확인되었지만, 지금까지 어떤 기능도 어느 개체 내의 이 유전자에 상응하지 않았다.luxS유전자는 자가유도체 생성과 관련되었다고 알려진다른 어느 유전자와도 상동성을 갖지 않는다.

실험 재료 및 방법

세균 변종, 배지, 그리고 재조합 DNA 기술: V. harveyiBB120은 야생형이다(참조: Bassler 등, 1997, supra).S. typhimuriumLT2는 Dr. K. Hughes(참조: University of Washington)에게서 얻었고,S. typhimurium14028은 ATCC 변종 14028 개체:Salmonella choleraesuis이다.E. coli0157: H7은 Dr. Paddy Gibb (참조: University of Calgary)가 제공한 병원 분리균이다. Luria broth(LB)는 1L 당 10g Bacto tryptone(Difco), 5g Yeast Extract(Difco), 10g NaCl을 포함한다. 자가유도체 분석(Autoinducer Bioassay, AB)배지의 조성은 이미 보고되어 있다(참조: Greenberg, E. P., Hastings, J. W., 그리고 Ulitzur, S. (1979) Arch. Microbiol. 120: 87-91). 특정한 곳에는 글루코스가 멸균한 20% 보관용액에서 최종 농도 0.5%를 첨가하였다. 항생제는 다음의 농도(mg/L)로 이용하였다 : 암피실린(Amp) 100, 클로람페니콜 (Cm) 10, 젠타마이신 (Gn) 100, 카나마이신 (Kn) 100, 그리고 테트라싸이클린 (Tet) 10. DNA 분리와 제한 분석,E. coli로의 형질 전환은 삼브룩(Sambrook) 등에 의해 쓰여진 대로 수행하였다. 서던 블랏 분석을 위한 탐침은, 아머샴(Amersham)의 멀티프라임 DNA 라벨링 시스템에 의해 표지되었다. 염기 서열 분석은 Applied Biosystems의 염기 서열 분석 기구를 이용하여 수행되었다.V. harveyiBB120의 유전체 라이브러리(genomic library)는 보고되었듯이 코스미드 pLAFR2에 조작되었다. 클론된V. harveyi유전자들의 Tn5 돌연변이를 위한 방법과E. coli염색체로 Tn5-변이된 유전자를 삽입시키기 위한 대립유전자 치환 기술은 보고되어 있다(참조: Bassler 등, 1993, supra).

생체발광 분석: V. harveyi리포터 변종 BB170(Sensor 1^-, Sensor 2⁺)을 이용한 AI-2 생물학적 검정은 이전 실시예에 나타나 있다. AI-2 활성이 시험될V. harveyi,E. coli, 또는S. typhimurium으로부터의 무세포 배양 용액은 이전에 언급된 바와 같이 준비하였고, 10% (v/v)로 분석하였다. AI-2 활성은 기준 배경에 대한 리포터 변종 유도의 배(fold) 수치나 혹은V. harveyiBB120(야생형) 무세포 배양 용액에서 얻어진 활성의 백분율(%) 수치로 기록하였다.

S. typhimurium LT2에서 AI-2 생성 유전자의 분석과 돌연변이: S. typhimuriumLT2의 MudJ 삽입 돌연변이는 서술되었듯이 파지(phage) P22 이동 시스템을 이용하여 생성하였다 (참조: Maloy, S. R., Stewart, V. J., 그리고 Taylor, R. K.(1996)Genetic analysis of pathogenic bacteria: a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.). 0.5% 글루코스가 첨가한 LB 배지에서 중간지수기까지 배양한 후,S. typhimurium삽입 돌연변이체는V. harveyiBB170 생물학적 검정을 이용해 AI-2 생성을 시험하였다.S. typhimurium에서 AI-2 생성 기능을 불활성시키는 MudJ 삽입의 위치는 PCR 증폭과 삽입 부위 염색체 DNA의 염기 서열 분석에 의해 확인하였다. 두 단계의 증폭 방법이 이용되었다(참조: Caetano-Annoles, G. (1993)Meth. Appl.3, 85-92). 첫 번째 PCR 반응에서는, 임의의 프라이머 5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNACGCCC-3′및 MudJ 특이적 프라이머 5′-GCACTACAGGCTTGCAAGCCC-3′을 이용하였다. 그런 다음, PCR 반응 산물 1mL가 두 번째 임의의 프라이머(5′-GGCCACGCGTCGACTAGTCA-3′와 다른 MudJ 특이적 프라이머(5′-TCTAATCCCATCAGATCCCG-3′를 이용하는 두 번째 PCR 증폭에 주형(template)으로 사용되었다. 두 번째 반응에서의 PCR 산물을 정제하여 염기 서열을 분석하였다.

E. coli MG1655, E. coli 0157:H7, 및 E. coli DH5a AI-2 생성 유전자들의 클로닝과 염기 서열 분석: S. typhimuriumLT2 MudJ 스크린(screen)에서 얻어진 DNA 염기 서열은,E. coliMG1655 유전체 염기 서열에서 상응하는E. coli부분(참조: Blattner 등, Science 277, 1453-1462, 1997)을 찾기 위해 이용하였다. 염기 서열 분석 계획으로부터 확인된 유전자는ygaG로 명명하였다.ygaG유전자와 삽입한 제한 자리들로 측면을 접하고 있는 프라이머들을 고안하였고,E. coliMG1655,E. coli0157:H7, 그리고E. coliDH5a의ygaG유전자들을 증폭하는데 이용하였다. 사용된 프라이머는 5′-GTGAAGCTTGTTTACTGACTAGATC-3′및 5′-GTGTCTAGAAAAACACGCCTGACAG-3′이다. PCR 산물은 정제되고, 잘려져서 pUC19로 클론하였다. 각 경우에서 세 가지 독립된 반응으로 생긴 PCR 산물은 클론되고, 염기 서열을 분석하였다.

결과

V. harveyi 에서 AI-2 생성과 관련된 유전자의 확인과 클로닝:본 발명자들은, 많은 다른E. coli변종들과 달리,E. coliDH5a는V. harveyi에 의해 탐지될수 있는 AI-2 신호 분자를 생성하지 못한다는 사실을 이전의 실시예에 밝혀두었다. 그래서 본 발명자들은,V. harveyiAI-2 생성 유전자를 클론하기 위한 돌연변이체로E. coliDH5a를 이용할 수 있다고 판단하였다. 야생형V. harveyiBB120 유전체 DNA 라이브러리는E. coliDH5a로 형질 전환하였고, 그 형질 전환체들은,V. harveyiBB170 AI-2 탐지 생물학적 검정을 통해 AI-2 생성을 스크린하였다. 라이브러리는 2,500개의 클론으로 구성되고, 각 클론들은 약 25 kb의V. harveyi유전체 DNA를 포함한다. 생물학적 검정에서 리포터 변종의 300배 자극을 유도하는 5개의 DH5a 클론들을 확인하였다.

AI-2를 생성하는 5개 DH5a 클론들의 재조합된 코스미드 DNA는 제한 분석과 서던 블랏팅으로 분석하였다. 5개 코스미드들은 모두 동일한V. harveyi유전체 제한 절편을 중복된 조각들로 포함하고 있었으며, 이 결과는 본 발명자들이 같은 위치를 여러 번 클론하였음을 의미한다. PBB2929라 불리는 하나의 코스미드가 보다 많은 분석을 위해 선택하였다. 트랜스포존(transposon) Tn5를 이용한 무작위 돌연변이가 코스미드 pBB2929에서 유도하였고, Tn5가 삽입된 코스미드 집단은 곧바로E. coliDH5a로 형질 전환하였다. 본 발명자들은, 962개의E. coliDH5a/pBB2929::Tn5에서 AI-2 생성 능력의 상실을 시험하였다. PBB2929내에 Tn5를 삽입하고, 있는 4개의E. coliDH5a들이 AI-2 생성에 실패하였음을 확인하였다. 본 발명자들은, pBB2929에서의 이들 Tn5 삽입 위치를 검색하였고, 이들 4개 트랜스포존 삽입이 모두 같은 2.6 kbHindIII V. harveyi유전체 DNA 절편에서 일어났음을 발견하였다(도 9A).

코스미드 pBB2929는HindIII로 절단하였고, 생겨난 8개의 절편은 pLATER(Promega)에 양쪽 방향으로 서브클론 하였다. pLATER 서브클론들은E. coliDH5a로 형질 전환하였고, 곧이어 AI-2 생성을 시험하였다. 2.6 kbHindIII절편을 포함하여, AI-2 생성 능력을 가진 형질 전환체만을 Tn5 돌연변이에서 선택하였다. 이 절편은 염기 서열 분석되었고, 단 하나의 open reading frame(ORF)이 결정하였다. ORF의 위치는 AI-2 생성 능력을 상실시키는 4개 Tn5 삽입 위치와 일치하였다. 본 발명자들은, 그 ORF를luxS _{V.h .}라고 명명하였다(도 9A).

V. harveyi luxS _{V.h .} 의 돌연변이:본 발명자들은,V. harveyi의 AI-2 생성에 대한luxS _{V.h .}무효 돌연변이 (null mutation) 효과를 분석하였다.luxS _{V.h .}유전자에서 확인된 4개의 Tn5 삽입과luxS _{V.h .}위치에 인접한 기준 Tn5 삽입이 MM37, MM30, MM36, MM38 그리고 MM28 변종을 만들기 위해V. harveyiBB120 염색체 내 상응하는 부위로 옮겨졌다 (도 9A). 서던 블롯팅이V. harveyi염색체 내에 5개 Tn5 삽입이 정확하게 자리되었는지를 확인하기위해 수행하였다. 4개의V. harveyi luxS _{V.h .}::Tn5 변종들에서 AI-2 생성 능력이 시험하였고, 네 변종 모두에서 동일한 결과를 얻었다.

도 10A은 야생형 기준 Tn5 삽입 변종 MM28과 대표적인luxS _{V.h .}::Tn5 삽입 변종 MM30의 AI-2 생성 표현형을 보여준다.V. harveyiMM28과 MM30은 고밀도로 배양된 후에, 무세포 배양 용액을 준비하였다. 무세포 배양 용액은 AI-2 탐색 변종BB170에서의 발광 유도 분석을 통해 AI-2 활성을 분석하였다. 도 10A는 기준 Tn5 삽입 변종 MM28에서 준비한 무세포 배양 용액의 첨가가 리포터 변종에서 780배의 발광을 유도한 반면,luxS _{V.h .}::Tn5 삽입 변종 MM30의 무세포 배양 용액은 발광 발현을 유도하지 못한 결과를 보여준다. 이에,V. harveyi의luxS _{V.h .}무효 돌연변이는 AI-2 생성 능력을 제거하였다.

S. typhimurium 자가유도체 생성 돌연변이체의 확인과 분석: S. typhimurium에서 AI-2 생성에 관여하는 유전자를 확인하기 위해서, 본 발명자들은 MudJ 트렌스포존(참조: Maloy 등, 1996, supra)을 이용하여S. typhimuriumLT2를 무작위로 돌연변이하였다. 10,000개의S. typhimuriumLT2 돌연변이체는,V. harveyiBB170에서의 생물학적 검정을 통해 AI-2 생성 능력을 시험하였다. 하나의S. typhimuriumMudJ 삽입 돌연변이체(변종 CS132)만이 중간 지수기의 무세포 용액에서 탐지가능한 AI-2가 결핍되어 있음을 확인하였다.

도 10B는S. typhimuriumLT2와 그에 상응하는 MudJ 삽입 변종 CS132의 AI-2 생성 표현형을 나타내었다. 이 변종들은 글루코스가 첨가된 LB 배지에서 중간 지수기까지 배양하였고, 무세포 배양 용액이 준비되어 AI-2 생성을 분석하였다.S. typhimuriumLT2 무세포 배양 용액은 리포터 변종을 500배 자극한 반면, 변종 CS132 무세포 배양 용액은 AI-2 활성을 갖지 못하였다. 더구나 변종 CS132는S. typhimurium에서 AI-2 생성을 유도한다고 본 발명자들이, 이미 밝혀둔 다른 생장 조건들에서도 AI-2를 생성하지 않았다(자료는 보여주지 않음).

S. typhimuriumCS132 내 MudJ 삽입 자리는 트랜스포존에 근접해 있는 110 bp의 염색체 DNA 염기 서열을 분석함에 의해 밝혀졌다. 이 염기 서열은 데이터베이스에서 DNA의 상동성을 검색하는데 이용하였다. 염기 서열은E. coliMG1655 유전체의 한 부위(89/105 bp 일치)와 짝을 이루었고, 그 부위는ygaG로 명명된 알려지지 않은 기능의 ORF와 상응한다. 염색체에서E. coli의ygaG유전자는gshA유전자와emrB유전자에 접하고 있다(도 9B).ygaG유전자는 그 유전자의 바로 윗부분에 위치한 자신의 촉진자로부터 전사되며, 이것은ygaG유전자가gshA유전자와 함께 하나의 오페론 내에 존재하지 않았음을 보여주었다.emrB유전자는 반대 방향으로 전사한다. 본 발명자들은,E. coli0157:H7과E. coliMG1655의 염색체에서ygaG부분을 PCR 증폭하였고, 두E. coli ygaG유전자를 pUC19로 클론하였다.

S. typhimurium 과 E. coli AI-2 ^- 돌연변이체의 상보성:본 발명자들은,E. coli0157:H7ygaG유전자와V. harveyi luxS _{V.h .}유전자가 AI-2^-변종인S. typhimuriumCS132,E. coliDH5a에서 AI-2 생성을 일으킬 수 있을 것인지를 시험하였다. 도 11A는 야생형V. harveyiBB120,E. coli0157:H7, 그리고S. typhimuriumLT2에 의해 생성하는 AI-2 활성을 보여주었다.V. harveyiBB120 무세포 배양 용액 내에 존재하는 AI-2 활성 수준은 100%로 표준화하였다.E. coli와S. typhimurium무세포 배양 용액에서의 활성은 그에 비교하였다. 본 실험에서,E. coli0157:H7과S. typhimuriumLT2는V. harveyiBB120의 AI-2 활성보다 보다 각각 1.5배와 1.4배를 생성하였다(즉, 150%와 141%).

도 11B와 11C는S. typhimuriumCS132와E. coliDH5a의 AI-2 상보 결과를 나타냈다. 도 11B는E. coli0157:H7ygaG유전자의S. typhimuriumCS132로의 도입이 야생형S. typhimurium의 생성 수준 이상(209% 활성)으로 AI-2 생성을 일으킴을 증명해주었다. 도 11A와 도 11B의 자료 비교는,S. typhimurium내부의E. coli ygaG유전자가E. coli0157:H7에 의해 생체 내부에서 생성되는 과도한 양의 AI-2 생성 결과를 가져옴을 보여주었다.V. harveyi luxS _{V.h .}유전자의S. typhimurium으로의 도입은, 야생형V. harveyiBB120에 의해 생성되는 수준보다 약간 적은 AI-2를 생성하였다(V. harveyiBB120의 73% 수준). 도 11C는E. coliDH5a가 또한 클론된E. coli0157:H7과V. harveyiBB120 AI-2 생성 유전자 모두에 의해 AI-2 생성을 일으킬 수 있음을 나타냈다. 그러나,E. coli0157:H7ygaG유전자와V. harveyibb120luxS _{V.h .}유전자의E. coliDH5a로의 도입은V. harveyiBB120에 비해 겨우 31%와 41%의 활성이 나타났다. 도 11B와 도 11C는 본 상보성 실험에서 기준 벡터가 아무런 활성도 나타내지 않았음을 보여주었다.

V. harveyi, E. coli 및 S. typhimurium 의 AI-2 생성 유전자 분석:본 발명자들은,V. harveyiBB120의 AI-2 생성 유전자luxS _{V.h .}와E. coli0157:H7,E. coliMG1655, 그리고E. coliDH5a의ygaG부위를 염기 분석하였다.ygaGORF에 암호화되어 있는 번역 단백질의 아미노산 서열은 도 12에 나타나 있고, 그들은V. harveyiLuxS 단백질과 함께 정렬하였다. 굵게 표시되지 않았고 밑줄 표시된 아미노산들은V. harveyiLuxS 단백질과 다른E. coli단백질 아미노산을 표시하였다.E. coli내ygaG부분은 다른 단백질들 또는V. harveyiLuxS 단백질과 고도의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고 있다.E. coliMG1655와E. coli0157:H7 YgaG 단백질들은V. harveyiBB120의 LuxS 단백질과 각각 77%와 76%가 동일하다. 본 발명자들이, 결정한E. coli0157:H7ygaG유전자의 DNA 염기 서열은 보고된E. coliMG1655ygaG유전자의 염기 서열과 5군데가 다르다. 그 변화들 중 4 개는 아무 변화를 일으키지 않고(silent), 남은 하나는E. coli0157:H7 단백질의 103번째 아미노산을 Ala에서 Val으로 변화시켰다.

E. coliMG1655와E. coli0157:H7에서의ygaG유전자 위치 확인을 위해 본 발명자들은,E. coliDH5a에서의 AI-2 생성 결핍을 조사하였다.E. coliDH5a가ygaG유전자를 가지고 있음을 본 발명자들은,E. coliMG1655와E. coli0157:H7에서의ygaG유전자 증폭을 위해 사용한 것과 같은 프라이머들을 가지고,E. coliDH5a 염색체에서 이 부분을 PCR 증폭하여 확인하였다.E. coliDH5aygaG촉진자의 조사 결과는 그것이E. coliMG1655의 촉진자와 동일하다는 것을 보여주었다. 이것은E. coliDH5a에서의 AI-2 결핍이 단순히ygaG의 감소된 전사에서 기인되는 것이 아님을 암시하였다. 그러나E. coliDH5aygaG암호 부위의 염기 서열 분석은, 하나의 G-C 소실(deletion)과 T-A 변환(transversion)이 bp 222번째와 224번째에서 일어났음을 보여주었다. 해독틀 변환 돌연변이(frameshift mutation)는 G/C 소실이E. coliDH5a 단백질의 이른 절단(premature truncation)을 야기한 결과이다. 도 12는 절단된E. coliDH5a 단백질이 111개의 아미노산으로 구성된 반면,E. coliMG1655와E. coli0157:H7 단백질은 171개의 아미노산으로 구성되어 있음을 보여주었다. 20개의 다양한 아미노산은 해독틀 변환 이후와 단백질의 종결 이전에 번역되어진다. 본 상보성 결과는,E. coliDH5a에서의 AI-2 생성 결핍은,E. coliDH5aygaG유전자에서 해독틀 변환에 의해 발생하는 무효 돌연변이에 의한 결핍과도 일치하는ygaG의in trans발현에 대해 열성임을 증명하였다.

본 발명자들은,S. typhimuriumCS132에서 AI-2 생성 기능을 불활성시키는 MudJ에 근접해 있는 염기 서열을 이용하여,S. typhimurium데이터베이스를 조사하였다. 완벽한 일치(110/110 bp)가S. typhimuriumLT2 유전체 염기 서열 데이터베이스(참조: Gemone Sequencing Center, Washington University, St. Louis)에 있는 단편 B_TR7095. 85-T7를 확인하였다. 그러나S. typhimuriumLT2 데이터베이스ygaG염기 서열은 불완전하다(도 12). 전사된 아미노산 서열은 8번째 아미노산에서 시작하는E. coli와V. harveyi서열과 일치하였다. 이 전사된 서열은,S. typhimurium단백질이V. harveyi의 LuxS 단백질과 75% 일치함을 보여주었다.S. typhimurium서열을V. harveyiLuxS 단백질과 정렬시키기 위해, 본 발명자들은 데이터베이스 서열에서 3 개의 해독틀 변환 에러를 정정하였다. 가공되거나 주해되지 않은 서열 자료가S. typhimurium에게 매우 유용하다고 판단하여, 본 발명자들은S. typhimurium단백질의 추가된 7개 아미노산을 포함하여, 해독틀 변환 돌연변이들은 서열 분석의 에러들일 것이라고 추측하였다. 본 발명자들은,S. typhimurium14028 또는S. typhimuriumLT2ygaG유전자를E. coli를 위해 고안된 프라이머들을 이용하여 PCR 증폭하는데 실패하였다. 그래서 본 발명자들은, 아직S. typhimurium유전자의 완벽한 서열을 알지 못하였다.

전기의 결과들은, 본 발명자들이 확인하고 분석한 유전자들이 자가유도체 생성과 관련한 새로운 패밀리의 단백질을 암호하고 있음을 나타내었다. 본 명세서에서LuxS로 언급한 이 새로운 패밀리의 유전자 구성원들은 그들 서로와 고도의 상동성을 갖고 있지만, 확인한 다른 유전자들과는 상동적이지 않았다.LuxS유전자의 암호화한 산물은 본 발명의 신호 분자 합성에서 필수적인 단계를 촉매하였다.

실시예 4

Sensor 1-, AI-2- V. harveyi 리포터 변종의 제조(construction)

luxL, luxM, luxN, luxS, luxQ의lux유전자들 각각에서,V. harveyi무효 돌연변이체(null mutant)가 제조되었다. 이들 돌연변이체는, 하나의 특이적인 자가유도체를 만들지 못하거나, 혹은 그에 대해 반응하지 못한다. 하지만 각 경우에서, 하나의 정족수 감지 시스템만은 작동을 유지하고 있기 때문에 그들은 여전히 빛을 생성할 수 있다.luxN, luxS V. harveyi이중 돌연변이체는 AI-1에는 반응하지 않았고, AI-2는 생성할 수가 없기 때문에 외부에서 AI-2가 첨가되지 않는다면 빛을 방출하지 못할 것이다.

V. harveyi luxS유전자는, 광범위한 숙주 범위를 갖는 pLAFR2 코스미드에 실려E. coliDH5a로 클론하였다. 이 제조된 변이체는E. coliDH5a에서 AI-2 생성을 일으켰다. 선택한 무효 돌연변이가 내부 제한 자리로 클로람페니콜 저항(Cm^r) 카세트를 도입함에 의해luxS유전자에서 디자인하였다.luxS유전자 내 이 위치로의 Cm^r카세트 삽입은 결과적으로E. coliDH5a의 AI-2 생성을 제거하였다.

LuxS:: Cm^r무효 대립유전자는V. harveyibb170의 염색체로 이동하였다. 변종 BB170은luxN에 Tn5Kan^r를 포함하고, AI-1에 반응하지 않았다. 이중 돌연변이체를 제조하기 위해, 세 개 모체의 접합(triparental conjugations)이 pLAFR2(pLAFR2는 테트라싸이크린 저항성을 가진다)에 제조된V. harveyi luxS:: Cm^r을 포함하는,E. coliDH5a,tra기증자 플라스미드 pRK2013을 포함하는,E. coliDH5a, 그리고V. harveyi수령자(recipient) 변종 BB170의 혼합에 의하여 이루어졌다.luxS:: Cm^r돌연변이 대립유전자와 야생형luxS대립 유전자의 염색체에서의 교환은 상동적 재조합에 의해 일어났다.V. harveyi내 존재하는 외부 코스미드는 두 번째의 상반된 플라스미드 pPH1JI의 도입에 의해 제거하였다. 이것은luxS:: Cm^r을 포함하는 수령자V. harveyiBB170과 pPH1JI를 포함하는,E. coliDH5a와의 교배에 의해 이루어지고, 암피실린(공여자인E. coli의 대립 선택(counter selection)을 위해)과 클로람페니콜(luxS:: Cm^r대립 유전자 돌연변이의 유전을 위해), 젠타마이신(플라스미드 pPH1JI의 보존을 위해)이 포함된 플레이트(plate)에서 접합체를 선택하였다. 서던 블랏 분석은 외부 코스미드 pLAFR2가 제거되었음을 증명하기 위해, 그리고luxS:: Cm^r돌연변이체가V. harveyi유전체 내 상응하는 위치로 이동하였음을 확인하기 위해 시행하였다.

LuxN, luxS 이중 돌연변이체가 AI-2에 대해 반응한다는 증명: LuxN, luxS돌연변이인V. harveyi는 외부로부터의 AI-2 첨가에 의해 빛을 방출하도록 자극받았지만, AI-1 첨가에 의해서는 자극받지 않았다. 이것은V. harveyiAI-1과 AI-2에 대한 발광 분석에 의해 입증하였다. 표현형적으로 AI-1⁺, AI-2^-인V. harveyiMM30과 AI-1^-, AI-2⁺인V. harveyiBB152 (luxM::Tn5)가 AI-1과 AI-2 공급원으로서 이용하였다. 이들 변종의 배양 용액에 존재하는 AI-1과 AI-2는,V. harveyi LuxN, luxS이중 돌연변이 리포터 변종의 발광 자극에 시험하였다. 이 분석에서, MM30, BB152의 자가유도체 표본(preparation) 또는 멸균된 기준 배지가 마이크로타이터 plate의 웰에 첨가하였고, 뒤이어 여기에V. harveyi리포터 변종을 첨가하였다. 발광 결과는 액체 섬광 측정기에 의해 화학발광 모드에서 탐지하였다.V. harveyi LuxN, luxS리포터 변종에서 발광의 최대 자극은 Sensor 1⁺, Sensor 2^- V. harveyiBB886과 Sensor 1^-, Sensor 2⁺ V. harveyiBB170에 의해 생성한 것과 비교하였다. 이 두V. harveyi변종은 AI-1과 AI-2 활성의 리포터로서 이 분석에 상투적으로 이용되었다.

마이크로타이터 분석에서 최적의 AI-2 농도 결정:상기한 바와 같이, 스크린은 96-well 마이크로타이터 분석에 이용하기 위해 최적화될 것이다. 스크린은 AI-2 억제제를 확인하기 위해 억제 분석에 이용될 것이다. 정제된 혹은 합성된 AI-2는 새로이 제조된 리포터 변종을 포함하는 마이크로타이터 웰에 첨가될것이고, 억제는 억제제를 포함하는 웰에서 방출되는 빛의 감소에 의해 측정되어질 것이다. 이 분석은 최고의 감광도를 나타내는 마이크로타이터 웰 내부의 AI-2 농도와 세포 농도를 결정함으로써 최적화될 것이다. 최적의 AI-2 농도는 단위 시간당 주어진 농도의 세포가 방출하는 최고 빛의 절반 수준을 자극하는 농도이다. 초기 실험은 빛 방출에서, 최고의 변화를 일으키는 AI-2 농도의 범위를 결정하기 위해 이 농도 범위에서 진행될 것이다. AI-1과 스스로를 자극하지 못하는 sensor-1⁺, sensor-2^-돌연변이체 (BB886)를 이용한 유사한 실험은, 이 분석이 100 nM AI-1정도의 낮은 농도에 민감하고 빛 방출이 6광도 등급 이상으로 선형적으로 증가함을 보여준다. 스스로를 자극하지 못하고 그래서 제로의 배경 방출을 하는 새로운 리포터 변종과 AI-2를 이용한 유사 실험 결과가 예상되었다. 마이크로타이터 웰에서의 빛 방출은 왈락 트리럭스(Wallac TriLux)액체 섬광 측정기 모델 1450-021을 이용하여 화학발광 모드에서 측정될 것이다. 이 기계는 16개 플레이트를 수용할 수 있어 한번의 실행으로 1536개의 농도 분석을 가능하게 할 것이다.

실시예 5

AI-2 합성을 위한 생체외(in vitro) 방법

AI-2의 정제와 확인:AI-2군(class)의 분자는V. harveyiAI-1같은 아실-호모세린, 락톤(HSL) 자가유도체의 분리에 이용되는 전통적인 기술을 가지고는 정제하기가 어렵다. 다른 HSL 자가유도체 과는 달리, 시험된 조건 하에서 AI-2 활성은유기 용매에 정량적으로 추출되지 않았다. 게다가 이들은 양이온이나 음이온 교환 컬럼에도 결합하지 않았다. AI-2의 현재의 특성화 작업은 AI-2가 1000 kDa 이하의 분자량을 가지고, 극성을 갖지만 명백히는 이온성을 띠지 않는 유기 혼합물임을 보여주었다. AI-2 활성은 산에 안정하지만 염기에 불안정하며 약 80℃에서는 열 저항성을 갖지만 100℃에서는 저항성을 갖지 않았다. 이들 결과는 AI-2가 아실-호모세린 락톤이 아님을 입증하고 있다. 본 발명에서, 확인된luxS유전자는 HSL 자가유도체의 생성과 관련되었다고, 알려진 다른 유전자들과 상동성을 갖지 않았고, 이것은 현재의 자가유도체의 AI-2 군이 새로운 것임을 더욱 입증하였다.

또한, 클론하여 과잉생산된 정제된S. tyiphimuriumLuxS 단백질에 덧붙여, 본 발명은 AI-2의 생체외(in vitro) 생성을 위한 방법을 제공하였다. 본 발명은, 질량 스펙트럼 분석과 NMR 분석에 유용한 순수한 AI-2를 과량 생성하기 위한 기작과 AI-2 활성을 조절하는 물질을 스크린하기 위한 기작을 제공하였다. 본 발명은, 또한 AI-2 합성의 생체내(in vivo) 생합성 경로를 결정할 수 있는 방법을 제공하였다.

본 발명에서, 확인된 다양한luxS유전자들의 유전체에서의 위치 분석은,luxS유전자들이 염색체 내 어떤 한 위치에 시종일관 존재하지 않는 것과 그들이 전형적으로 어떤 특이적 유전자(들)와 매우 가까이 존재할 필요가 없다는 것을 보여주었다. 그러나 어떤 경우에,luxS유전자는 두 유전자들 (metK와pfs)과 함께 하나의 오페론을 구성하는 세 번째 유전자이다.E. coli와Salmonella그리고 다른 많은 세균에서, MetK와 Pfs 단백질은 S-아데노실 메티오닌(SAM)이 호모시스테인과 4,5-디하이드록시-2,3-펜탄디온으로 변환되는 데 관련되어 있다(도 15). MetK의 기능은 메티오닌을 어떤 탄소 대사에서 중요한 보조인자로 작용하는 SAM으로 변환시키는 것이다. SAM은 DNA, RNA, 그리고 다양한 세포 단백질들을 메틸화하는데 이용되고, 여러 SAM 의존적 메틸 트랜스퍼라아제들이 이 단계에서 작용하였다. S-아데노실 호모시스테인(SAH)은, 메틸기가 SAM에서 기질로 이동될 때 생성된다. SAH는 SAM 의존적 메틸 트랜스퍼라아제들의 강력한 억제제로서 기능하였다. 그러므로 세균는 Pfs 효소를 이용하여 SAH를 재빠르게 분해하였다. Pfs라는 명칭은 최근 5′메틸치오아데노신/S-아데노실호모시스테인 뉴클레오시다아제, 또는 MTA/SAH 뉴클레오시다아제라고 알려진 효소를 암호화한다고 결정된E. coli유전체의 ORF(open reading frame)에서 참고하였다. 본 시스템에서, 그 효소는 S-아데노실호모시스테인(SAH)의 글리코시드 결합(glycosidic bond)을 절단하였다. 또한 Pfs는 SAH를 아데닌과 S-리보실 호모시스테인으로 변환하는 기능을 하였다. 마지막 단계에서, S-리보실 호모시스테인은 호모시스테인과 4,5-디하이드록시-2.3-펜탄디온으로 변환되었다. 호모시스테인은 이 경로로 다시 진입할 수 있다; 그것은 MetK에 의해 SAM으로 변환될 수 있는 메티오닌을 생성하기 위해 메틸화된다.

SAH의 이화작용은, 대사 중간 산물들(아데닌과 호모시스테인)의 재활용을 위한 구조 경로(salvage pathway)로 생각되었다. 그러나 세균의 어떤 종들은 다른 경로를 통해 SAH를 제거한다. 이 다른 경로에서, 아데노신은 호모시스테인을 생성하는 SAH로부터 직접적으로 제거되었다. 그러므로, 이 두 번째 기작을 갖는 세포는 4,5-디하이드록시-2,3-펜탄디온을 생성하지 않았다. 도 15에 나타난 경로에서,S-리보실 호모시스테인을 4,5-디하이드록시-2,3-펜탄디온으로 변환하는데 관련된 효소는 확인되거나 클론 혹은 정제되지 않았다. 더욱이, 4,5-디하이드록시-2,3-펜탄디온의 역할도 알려지지 않았다.

LuxS는 도 15에 나타난 경로와 관련되어 있었고, SAM과 SAH는 AI-2 생성과 관련되어 있다. AI-2의 구조는 4,5-디하이드록시-2,3-펜탄디온이 될 수 있다. 이 경우, LuxS는 S-리보실 호모시스테인에 작용하는 특성화되지 않은 효소이다. 둘째, LuxS는 AI-2를 만들기 위한 중간 산물들 중 하나에 작용할 수 있다. LuxS는 알려진 경로를 구분해주는 가지(branch)로 상징되었다.

LuxS가 SAM을 AI-2으로 변환하는데 관련되어 있음을 확인하기 위해,S. tyiphimuriumLuxS 단백질을 암호하고 있는 유전자가 클론되어 과잉 발현되었고,S. tyiphimuriumLuxS 단백질을 정제하였다. 이 단백질은 SAM과 LuxS 단백질의 첨가가 AI-2 생성을 다시 일으키는 것을 보여주기 위해,S. tyiphimurium luxS무효 돌연변이에서 준비된 투석된 무세포 추출물과 투석된 LuxS-세포 추출물을 혼합하는 데 이용하였다. 10 mM sodium phosphate 완충 용액 pH 7.0, 투석된S. tyiphimuriumLuxS-세포 추출물, 그리고 SAM으로 구성된 제한 혼합물을 준비하였다. 정제된 LuxS 단백질은, 이 혼합물의 일부를 첨가하였다. 반응은 실온에서 60분동안 진행한 후, 5000 MWCO(centricon)에서 원심 분리하였다. 분자량 5000이하의 물질은 전기와 같이 기준V. harveyi생물학적 검정에 첨가하였다. SAM을 첨가한 투석된 LuxS-세포 추출물과 SAM이 첨가되지 않고, LuxS 단백질을 포함하는 추출물은 AI-2 활성을 생성하지 않았다. 그러나 LuxS 단백질과 SAM이 첨가된 동일한 추출물은 AI-2를 생성하였고, 그 결과 생물학적 검정에서 500배 이상의 발광을 자극하였다.

더 나아가서, SAM이 LuxS의 직접적인 기질이 아니라는 것과 LuxS가 SAM이 SAH로 변환한 후의 단계에 작용해야 하는 것을 확인하였다(도 15). SAM이 LuxS 단백질로 직접 첨가되지 않으면 AI-2는 생성되지 않지만, 활성은 SAM과 LuxS-세포 추출물의 전배양, 여과 및 LuxS 단백질이 여과액에 첨가됨으로써 생성된다는 것이 밝혀졌다. 이 연구들은 SAM이 AI-2를 생성하기 위해 LuxS와 반응하기 전에 세포 추출물 내의 원소와 반응할 수 있다는 사실을 알려주었다. 아마도, 세포 추출물에 존재하는 SAM 의존적 메틸 트랜스퍼라아제가 메틸기의 기증자로서 SAM을 이용하여 SAM을 SAH로 변환시키는 것 같다. 이 사실을 확인하기 위해, 생체외 분석에서 SAM은 SAH로 치환하였다. 생체외 분석에서 SAH의 첨가는 SAM이 첨가되었을 때 보다 더 많은 AI-2를 생성하는 결과를 가져왔다. 이 결과는 LuxS가 SAM의 SAH로의 변환 이후의 경로에 작용함을 나타내었다. 즉, LuxS 단백질로의 SAM의 직접적인 첨가는 AI-2 활성의 생성에 충분하지 않은 반면, SAH와 투석된 LuxS-추출물의 전배양, 여과 및 LuxS 단백질이 여과액에 첨가되므로써 AI-2 생성을 유발하였다. SAH는 S-리보실 호모시스테인으로 변환되고, 이 때 LuxS는 AI-2를 생성하기 위해 작용한다고 여겨진다.

도 15는 이차 대사 산물을 재활용하기 위한 구조 경로가 아니라 AI-2 생성을 위한 경로를 나타내는 도이다. 본 발명은, AI-2 생합성에서의 LuxS 활성의 관점에 대한 가능성을 축소시켰다. 남아있는 가능성은 도 15에 나타나 있다(Lux？로 표시됨).

본 발명에 의하면, AI-2는 리보스의 유도체(derivative)이다.V. harveyi의 AI-2 일차 센서인 LuxP는E. coli와S. tyiphimurium리보스 결합 단백질의 상동 단백질이다.

AI-2의 특성화와 생합성:본 발명은, 순수한 AI-2의 대량 합성을 위한생체외(in vitro)방법을 제공하였다. 도 15에서 나타나듯이, SAH는 LuxS 의존적 AI-2 생합성의 전구체이며, LuxS는 SAH에 직접 작용하지 않았다. LuxS의 작용 이전에, SAH는 투석된 세포 추출물 내에서 어떤 효소에 의해 최초로 작용되어진다. 추측컨대, 이 단계는 Pfs에 의한 SAH의 S-리보실 호모시스테인으로의 변환 단계일 것이다. 따라서 LuxS의 기질은 S-리보실 호모시스테인이다.

LuxS가 S-리보실 호모시스테인에 작용함을 증명하기 위하여, Pfs 효소는 정제되어 SAH의 S-리보실 호모시스테인으로의 변환에 이용하였다. 이를 위해pfs유전자는 발현 벡터 pLM-1로 삽입되어S. tyiphimurium14028으로부터 클론되었다. Pfs 효소는 과잉 발현될 것이고, SAH는 S-리보실 호모시스테인을 생성하기 위해 정제된 Pfs로 첨가될 것이다. SAH의 S-리보실 호모시스테인으로의 변환은 역상 HPLC 분석에 의해 확인될 것이다 (SAH는 UV에 활성적이지만 S-리보실 호모시스테인은 활성적이지 않다). 그런 다음, Pfs에 의해 생성된 S-리보실 호모시스테인은 정제된 LuxS로 첨가될 것이다. 배양 후에, 혼합물은 5000 MWCO centricon을 통해 여과될 것이고, 여과액은 이전에 기술된V. harveyi생물학적 검정으로 AI-2 활성이 시험될 것이다. 활성의 확인은 4,5-디하이드록시-2,3-펜탄디온이 AI-2임을 증명해줄것이다.

게다가,E. coli와V. harveyi에서 생성된 AI-2의 구조가 결정될 것이다.E. coli와V. harveyi의luxS유전자들은 발현 벡터로 클론되어졌다. 본 발명에 의해 제공된S. tyiphimuriumAI-2의 확인/생합성은 이 분석들을 활발하게 촉진시킬 것이다.S. tyiphimurium,E. coli, 그리고V. harveyi의 AI-2들이 동일하다는 사실에서, 이들 자료는 AI-2들이 같다는 것을 입증할 것이다.

본 발명은, 이상에서 기재한 실시예로 제한되지는 않지만 부속된 청구범위 내에서 수정과 변형이 가능하다.

Claims (117)

1. 극성이고 전하를 띠지 않은 분자를 적어도 하나 포함하고 분자량이 약 1,000kDa이하이며, LuxQ단백질과 상호작용하여, luxCDABE 발광유전자(luminescence gene)를 포함하는 비브리오 하베이(Vibrio harveyi) 오페론의 발현을 유도하는 분리된 세균의 세포외 신호 인자.
2. 제 1항에 있어서,

   비브리오 하베이 센서 2+ 리포터주(Sensor 2+ reporter strain)를 이 용하여 생물학적 검정에 의해 측정하였을 때, 약 0.1 내지 1.0mg의 인 자 시료(preparation)가 발광을 약 1000배 증가시키도록 자극하는, 비 활성(specific activity)을 가지는 것을 특징으로 하는

   분리된 세균의 세포외 신호 인자.
3. 제 1항에 있어서,

   비브리오 하베이 센서 2+ 리포터주(Sensor 2+ reporter strain)를 이 용하여 생물학적 검정에 의해 측정하였을 때, 약 1 내지 10μg의 인자 시료가 발광을 약 1000배 증가시키도록 자극하는, 비활성(specificactivity)을 가지는 것을 특징으로 하는

   분리된 세균의 세포외 신호 인자.
4. 제 1항에 있어서,

   Vibrio harveyi, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, Pseudomonas phosphoreum, Yersinia enterocolitica, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Bacillus subtilis, Borrelia burgfdorferi, Neisseria meningitides, Neisseria gonorrhoeae, Yersinia pestis, Campylobacter jejuni, Deinococcus radiodurans, Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphyloccoccus aureus을 포함하는 그룹으 로부터 선택된 세균에 의하여 생산되는

   분리된 세균의 세포외 신호 인자.
5. 하기 일반식으로 나타내어지는 인자를 포함하는 분리된 세균의 신호인자:
6. 제 5항에 있어서,

   Vibrio harveyi, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, Pseudomonas phosphoreum, Yersinia enterocolitica, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Bacillus subtilis, Borrelia burgfdorferi, Neisseria meningitides, neisseria gonorrhoeae, Yersinia pestis, Campylovbacter jejuni, Deinococcus radiodurans, mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Storeptococcus pyogenes, Staphyloccoccus aureus을 포함하는 그룹으 로부터 선택된 세균에 의하여 생산되는

   분리된 세균의 신호 인자.
7. 제 5항에 개시한 일반식을 가지는 인자의 광학활성 이성질체.
8. 제 7항에 있어서.

   이성질체는 L-이성질체인 것을 특징으로 하는

   광학활성 이성질체.
9. 제 7항에 있어서

   이성질체는 D-이성질체인 것을 특징으로 하는

   광학활성 이성질체.
10. 하기 일반식으로 나타내어지는 인자를 포함하는 분리된 세균의 신호 인자:

    상기 식에서, R₁, R₂, R₃및 R₄는 각각 히드리도, 할로, 알킬, 할로알킬, 시클로알킬, 시클로알케닐, 헤테로시크릴, 메틸, 시아노, 알콕시카보닐, 아미노, 카복실, 히드록실, 포르밀, 니트로, 플루오로, 클로로, 브로모, 메틸, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬, 헤테로아릴알킬, 알킬술포닐, 할로알킬술포닐, 아릴술포닐, 헤테로아릴술포닐, 히드록시알킬, 머캅토알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 헤테로아릴옥시알킬, 아르알킬옥시알킬, 헤테로아릴알킬옥시알킬, 알킬티오알킬, 아릴티오알킬, 헤테로아릴티오알킬, 아르알킬티오알킬, 헤테로아릴알킬티오알킬, 할로알킬카보닐, 할로알킬(히드록시)알킬, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 아르알킬카보닐, 헤테로아릴카보닐, 헤테로아릴알킬카보닐, 카복시알킬, 알콕시카보닐알킬, 알킬카보닐옥시알킬,아미노알킬, 알킬아미노알킬, 아릴아미노알킬, 아르알킬아미노알킬, 헤테로아릴아미노알킬, 헤테로아릴알킬아미노알킬, 알콕시 및 아릴옥시;

    페닐, 시클로헥실, 시클로헥시닐, 벤코퓨릴, 벤조디옥소릴, 퓨릴, 이미다졸릴, 티에닐, 티아졸릴, 피로릴, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴, 트리아졸릴, 피리미디닐, 이소퀴놀릴, 벤즈이미다졸릴, 인돌릴, 피라졸릴, 피리딜, 아미노술포닐, 플루오로, 클로로, 브로모, 메틸티오, 메틸, 에틸, 이소프로필, 토실-부틸, 이소부틸, 펜틸, 헥실, 시아노, 메틸옥시카보닐, 에톡시카보닐, 이소프로폭시카보닐, 토실-부톡시카보닐, 프로폭시카보닐, 부톡실카보닐, 이소부톡실카보닐, 펜톡시카보닐, 메틸카보닐, 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 클로로메틸, 디클로로메틸, 트리클로로메틸, 펜타플루오로에틸, 헵타플루오로프로필,디플루오로클로로메틸, 디클로로프루오로메틸, 디플루오로에틸, 디플루오로프로필, 디클로로에틸, 디클로로프로필, 메톡시, 메틸렌디옥시, 에톡시, 프로폭시, n-부톡시, 히드록시메틸, 히드록시에틸, 메톡시메틸, 에톡시메틸, 트리플루오로메톡시, 메틸아미노, N,N-디메틸아미노, 페닐아미노, 에톡시카보닐에틸, 메톡시카보닐메틸;

    메틸, 에틸, 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 시아노, 메톡시카보닐, 에톡시카보닐, 토실-부톡시카보닐, 벤질, 페닐에틸, 페닐프로필, 메틸술포닐, 페닐술포닐,트리플루오로메틸술포닐, 히드록시메틸, 히드록시에틸, 메톡시메틸, 에톡시메틸, 메틸카보닐, 에틸카보닐, 트리플루오로메틸카보닐, 트리플루오로(히드록시)에틸, 페닐카보닐, 벤질카보닐, 메톡시카보닐메틸, 에톡시카보닐에틸, 카복시메틸, 카복시프로필, 메틸카보닐옥시메틸, 페닐옥시, 페닐옥시메틸, 티에닐, 퓨릴 및 피리딜; 및,

    티에닐, 퓨릴, 피리딜, 메틸티오, 메틸술피닐, 메틸, 에틸, 이소프로필, 토실-부틸, 이소부틸, 펜틸, 헥실, 시아노, 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 클로로메틸, 디클로로메틸, 트리클로로메틸, 펜타플루오로에틸, 헵타플루오로프로필, 디플루오로클로로메틸, 디클로로플루오로메틸, 디플루오로에틸, 디플루오로프로필, 디클로에틸, 디클로프로필, 메톡시, 메틸렌디옥시, 에톡시, 프로폭시, n-부톡시, 히드록시메틸, 히드록시에틸 및 트리플루오로메톡시를 포함하는 그룹에서 독립적으로 선택된다.
11. 제 10항에서 개시한 일반식을 가지는 인자의 광학활성 이성질체.
12. 제 11항에 있어서.

    이성질체는 L-이성질체인 것을 특징으로 하는

    광학활성 이성질체.
13. 제 11항에 있어서

    이성질체는 D-이성질체인 것을 특징으로 하는

    광학활성 이성질체.
14. 하기 각 단계를 포함하는, 신호 인자의 활성을 조절하는 화합물(compound)의 동정(identification) 방법:

    a)신호인자와 화합물이 접촉하는 단계;

    b)화합물의 존재하에 신호 전달 인자의 활성을 측정하며, 이를 화합물 의 부재하에 얻어지는 신호 인자의 활성과 비교하는 단계; 및,

    c)신호 인자의 활성을 조절하는 화합물을 확인하는 단계.
15. 제 14항에 있어서,

    신호 인자는 자가유도체-2(autoinducer-2)인 것을 특징으로 하는

    방법.
16. 제 15항에 있어서,

    자가유도체-2는 4,5-디하이드록시-2,3-펜탄디온(4,5-dihydroxy-2,3- pentanedione)인 것을 특징으로 하는

    방법.
17. 제 15항에 있어서,

    자가유도체-2는 호모시스테인(homocystein)인 것을 특징으로 하는

    방법.
18. 제 14항에 있어서,

    접촉은 생체내(in vivo)에서 일어나는 것을 특징으로 하는

    방법.
19. 제 14항에 있어서,

    접촉은 생체외(in vitro)에서 일어나는 것을 특징으로 하는

    방법.
20. 제 14항에 있어서,

    조절은 신호인자의 활성을 증가시킴으로써 일어나는 것을 특징으로

    하는

    방법.
21. 제 14항에 있어서,

    조절은 신호인자의 활성을 감소시킴으로써 일어나는 것을 특징으로 하 는

    방법.
22. 제 14항에 있어서,

    화합물은 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는

    방법.
23. 제 14항에 있어서,

    화합물은 작은 분자인 것을 특징으로 하는

    방법.
24. 하기의 각 단계를 포함하는, 표본시료(sample)에서 자가유도체의 검출 방법:

    a) 외재성(exogenous) 자가유도체에 반응하여 검출될 만한 양의 빛을 생성하는 생합성 경로(biosynthetic pathway)를 가지고, 자가유도

    체 경로(autoinducer pathway)에 관여하는 유전자 좌(gene loci)에 서 적어도 2개의 다른 변화(alteration)(첫번째 변화는 첫번째 자가 유도체의 검출을 저해하는 변화를 포함하고, 두번째 변화는 두번째 자가유도체의 생산을 저해하는 변화를 포함한다)를 포함하는 세균 또는 그의 추출물과 표본시료를 접촉하는 단계; 및,

    b) a)단계의, 세균 또는 그의 추출물에 의하여 생성되는 빛의 양을 측정하는 단계.
25. 제 24항에 있어서,

    유전자 좌에서의 첫번째 변화가 LuxN 유전자의 변화를 포함하는 것을 특징으로 하는

    방법.
26. 제 24항에 있어서,

    유전자 좌에서의 첫번째 변화가 자가 유전자-1의 검출을 저해하는 것 을 특징으로 하는

    방법.
27. 제 24항에 있어서,

    유전자 좌에서의 두번째 변화가 LuxS 유전자의 변화를 포함하는 것을 특징으로 하는

    방법.
28. 제 24항에 있어서,

    유전자 좌에서의 첫번째 변화가 내재성(endogenous) 자가 유전자-2의 검출을 저해하는 것을 특징으로 하는

    방법.
29. 제 24항에 있어서,

    시료의 존재하에 측정되는 빛의 양이 시료의 부재하에 측정되는 빛의 양(amount)보다 크다는 것으로 전기 시료에서의 자가유도체를 확인하 는

    방법.
30. 제 24항에 있어서,

    시료가 생물학적 액(biological fluid), 조직 균질액(tissue homogenate) 또는 자가유도체를 생산하는 것으로 예상되는 시험 세균 의 성장에 의하여 조정된 배지(conditioned medium)로부터 선택된 것 을 특징으로 하는

    방법.
31. 제 24항에 있어서,

    외재성 자가유도체는Vibrio harveyi, Vibrio cholerae, Vibrioparahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, Pseudomonas phsphoreum, Yersinia enterocolitica, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Bacillus subtilis, Borrelia burgfdorferi, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Yersinia pestis, Campylobacter jejuni, Deinococcus radiodurans, Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes및Staphylococcus aureus를 포함하는 그룹에서 선택되는 세균에 의하여 생산되는 것을 특징으로 하는

    방법.
32. 제 24항에 있어서,

    외재성 자가유도체가 자가유도체-2인 것을 특징으로 하는

    방법.
33. 제 24항에 있어서,

    세균이 생물발광(bioluminescent)하고, 자가유도체를 생산할 수 있는 모균주(parent strain)의 돌연변이인 것을 특징으로 하는

    방법.
34. 제 33항에 있어서,

    모균주가 비브리오 하베이인 것을 특징으로 하는

    방법.
35. 제 34항에 있어서,

    세균이 비브리오 하베이 균주 MM32인 것을 특징으로 하는

    방법.
36. 자가유도체 경로에 관여하는 유전자 좌(gene loci)에서 적어도 2개의 다른 변화(alteration)를 가지고 있으며, 유전자 좌에서의 첫번째 변화는 첫번째 자가유도체의 검출을 저해하는 변화를 포함하고, 유전자 좌에서의 두번째 변화는 두번째 자가유도체의 생산을 저해하는 변화를 포함하며, 자가유도체와 접촉하였을 때 생물발광하는 세균.
37. 제 36항에 있어서,

    유전자 좌에서의 첫번째 변화는 LuxN 유전자에서의 변화를 포함하는것을 특징으로 하는

    세균.
38. 제 36항에 있어서,

    유전자 좌에서의 첫번째 변화가 자가유도체-1의 검출을 저해하는 것을 특징으로 하는

    세균.
39. 제 36항에 있어서,

    유전자 좌에서의 두번째 변화는 LuxS 유전자에서의 변화를 포함하는 것을 특징으로 하는

    세균.
40. 제 36항에 있어서,

    유전자 좌에서의 두번째 변화가 내재성 자가유도체-2의 생산을 저해하 는 것을 특징으로 하는

    세균.
41. 제 24항에 있어서,

    세균이 생물발광하고, 자가유도체를 생산할 수 있는 비브리오 하베이 의 돌연변이인 것을 특징으로 하는

    방법.
42. 제 41항에 있어서,

    세균이 비브리오 하베이 균주 MM32인 것을 특징으로 하는

    세균.
43. 하기의 각 단계를 포함하는, 자가유도체의 활성을 조절하는 자가유도체의 유사체(analog)의 동정(identification) 방법:

    a) 자가유도체에 반응하여 검출될 만한 양의 빛을 생성하는 생합성 경 로(biosynthetic pathway)를 가지는 세균 또는 그의 추출물과 자가 유도체의 유사체(analog)가 접촉하는 단계; 및,

    b) 세균 또는 그의 추출물에 의하여, 자가유도체 존재하에 생성되는 빛의 양을 자가유도체의 유사체 존재하에 생성되는 양과 비교하여,빛의 생성량의 변화로서 자가유도체의 활성을 조절하는 자가유도체 의 유사체를 확인하는 단계.
44. 제 43항에 있어서,

    자가유도체는 내재성 자가유도체인 것을 특징으로 하는

    방법.
45. 제 43항에 있어서,

    자가유도체는 외재성 자가유도체인 것을 특징으로 하는

    방법.
46. 제 43항에 있어서,

    자가유도체는 자가유도체-2인 것을 특징으로 하는

    방법.
47. 제 43항에 있어서,

    접촉은 생체외(in vitro)에서 일어나는 것을 특징으로 하는

    방법.
48. 제 43항에 있어서,

    접촉은 생체내(in vivo)에서 일어나는 것을 특징으로 하는

    방법.
49. 제 43항에 있어서,

    조절은 자가유도체의 활성을 저해시킴으로써 일어나는 것을 특징으로 하는

    방법.
50. 제 43항에 있어서,

    조절은 자가유도체의 활성을 증가시킴으로써 일어나는 것을 특징으로 하는

    방법.
51. 제 43항에 있어서,

    유사체는 리보스 유도체(ribose derivative)를 포함하는 것을 특징으 로 하는

    방법.
52. 제 43항에 있어서,

    세균은 자가유도체 경로에 관여하는 유전자 좌에서 적어도 하나의 변 화를 추가로 포함하며, 전기 변화는 자가유도체의 생산 또는 검출을 저해하는 것을 특징으로 하는

    방법.
53. 제 52항에 있어서,

    유전자 좌에서의 변화가 LuxS 유전자에서의 변화를 포함하는 것을 특 징으로 하는

    방법.
54. 제 52항에 있어서,

    유전자 좌에서의 변화가 내재성 자가유도체-2의 생산을 저해하는 것을 특징으로 하는

    방법.
55. 제 52항에 있어서,

    유전자 좌에서의 변화가 LuxN 유전자에서의 변화를 포함하는 것을 특 징으로 하는

    방법.
56. 제 52항에 있어서,

    유전자 좌에서의 변화가 자가유도체-1의 검출을 저해하는 것을 특징으 로 하는

    방법.
57. 제 49항에 있어서,

    변화는 LuxN 및 LuxS 좌에서 일어난 것을 특징으로 하는

    방법.
58. 제 49항에 있어서,

    세균이 비브리오 하베이 균주 MM32인 것을 특징으로 하는

    방법.
59. S-아데노실호모시스테인(S-adenosylhomocysteine, SAH)이 자가유도체-2로의 전환(conversion)을 증진시키는 시간과 조건에서, S-아데노실호모시스테인과 LuxS단백질과의 접촉을 포함하는 자가유도체-2를 생산하는 방법.
60. 제 59항에 있어서,

    자가유도체-2의 생산은 생체외(in vitro)에서 일어나는 것을 특징으로 하는

    방법.
61. 제 59항에 있어서,

    자가유도체-2의 생산은 생체내(in vivo)에서 일어나는 것을 특징으로 하는

    방법.
62. 제 59항에 있어서,

    5´메틸티오아데노신/S-아데노실호모시스테인 뉴클레오시다제(5′ methylthioadenosine/S-adenosylhomocysteine nucleosidase, pfs)단백 질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

    방법.
63. 제 62항에 있어서,

    자가유도체-2는 4,5-디하이드록시-2,3-펜탄디온(4,5-dihydroxy-2,3- pentanedione)인 것을 특징으로 하는

    방법.
64. S-리보실호모시스테인(S-ribosylhomocysteine, SRH)이 자가유도체-2로의 전 환을 촉진하기 위한 시간과 조건에서, S-리보실호모시스테인과 LuxS폴리펩티드의접촉을 포함하는 자가유도체-2를 생산하는 방법.
65. 제 64항에 있어서,

    자가유도체-2는 4,5-디하이드록시-2,3-펜탄디온인 것을 특징으로 하는

    방법.
66. 하기의 각 단계를 포함하는 자가유도체-2를 생산하는 방법:

    a) S-아데노실호모시스테인이 S-리보실호모시스테인으로의 전환을 촉 진하기 위한 시간과 조건에서, S-아데노실호모시스테인(SAH)와 5´ 메틸티오아데노신/S-아데노실호모시스테인 뉴클레오시다제(pfs)단 백질을 접촉; 및,

    b) S-리보실호모시스테인이 자가유도체-2로의 전환을 촉진하기 위한 시간과 조건에서, a)단계에서 얻어진 S-리보실호모시스테인과 LuxS 단백질을접촉.
67. 제 66항에 있어서,

    자가유도체-2는 4,5-디하이드록시-2,3-펜탄디온인 것을 특징으로 하는

    방법.
68. 하기의 각 단계를 포함하는 자가유도체-관련 세균의 생물표지자(biomarker)를 검출하는 방법:

    a) 세균의 생물표지자의 유도를 촉진하기 위한 시간과 조건에서, .적 어도 하나의 세균과 자가유도체가 접촉하는 단계; 및,

    b) 세균의 생물표지자를 검출하는 단계.
69. 제 68항에 있어서,

    자가유도체는 자가유도체-2인 것을 특징으로 하는

    방법.
70. 제 69항에 있어서,

    자가유도체-2는 4,5-디하이드록시-2,3-펜탄디온인 것을 특징으로 하는

    방법.
71. 제 68항에 있어서,

    생물표지자는 핵산(nucleic acid)인 것을 특징으로 하는

    방법.
72. 제 68항에 있어서,

    생물표지자는 단백질인 것을 특징으로 하는

    방법.
73. 제 68항에 있어서,

    생물표지자는 항원(antigen)인 것을 특징으로 하는

    방법.
74. 제 73항에 있어서,

    항원은 세균 병원성(bacterial pathogeneicity)을 나타내는 것을 특징 으로 하는

    방법.
75. 제 68항에 있어서,

    생물표지자는 인산화된 단백질인 것을 특징으로 하는

    방법.
76. 제 68항에 있어서,

    검출은 탐침(probe)에 의한 것을 특징으로 하는

    방법.
77. 제 76항에 있어서,

    탐침은 핵산인 것을 특징으로 하는

    방법.
78. 제 76항에 있어서,

    탐침은 항체(antibody)인 것을 특징으로 하는

    방법.
79. 제 78항에 있어서,

    항체는 다클론(polyclonal)인 것을 특징으로 하는

    방법.
80. 제 78항에 있어서,

    항체는 단클론(monoclonal)인 것을 특징으로 하는

    방법.
81. 제 76항에 있어서,

    탐침은 검출될 수 있도록 표식(label)된 것을 특징으로 하는

    방법.
82. 제 68항에 있어서,

    세균이Vibrio harveyi, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, Pseudomonas phosphoreum, Yersinia enterocolitica, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Bacillus subtilis, Borrelia burgfdorferi, Neisseria meningitides, Neisseria gonorrhoeae, Yersinia pestis, Campylobacter jejuni, Deoinococcus radiodurans, Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes및Staphylococcus aureus를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징 으로 하는

    방법.
83. LuxP단백질과 목적화합물(target compound)의 접촉 및 전기 화합물이 LuxP에의 결합을 검출하는 것을 포함하는, LuxP단백질에 결합하는 목적 화합물의 검출 방법.
84. 제 83항에 있어서,

    목적 화합물은 자가유도체-2인 것을 특징으로 하는

    방법.
85. 제 83항에 있어서,

    목적 화합물은 자가유도체-2의 유사체인 것을 특징으로 하는

    방법.
86. 제 83항에 있어서,

    검출은 생체내(in vivo)에서 일어나는 것을 특징으로 하는

    방법.
87. 제 83항에 있어서,

    검출은 생체외(in vitro)에서 일어나는 것을 특징으로 하는

    방법.
88. 바이오필름(biofilm) 형성이 가능한 세균과 바이오필름 형성 조절이 가능한 화합물과의 접촉을 포함하며, 전기 화합물이 자가유도체-2의 활성을 조절하는, 세균성 바이오필름 형성을 조절하는 방법.
89. 제 88항에 있어서,

    화합물은 자가유도체-2의 유사체인 것을 특징으로 하는

    방법.
90. 제 88항에 있어서,

    화합물은 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는

    방법.
91. 제 88항에 있어서,

    화합물은 작은 분자인 것을 특징으로 하는

    방법.
92. 제 88항에 있어서,

    접촉은 생체내(in vivo)에서 일어나는 것을 특징으로 하는

    방법.
93. 제 88항에 있어서,

    접촉은 생체외(in vitro)에서 일어나는 것을 특징으로 하는

    방법.
94. 제 88항에 있어서,

    조절은 바이오필름 형성을 저해시킴으로써 일어나는 것을 특징으로

    하는

    방법.
95. LuxQ단백질과 상호작용을 하여 발광유전자 luxCDACE를 포함하는 비브리오 하베이 오페론의 발현을 유도하는 세균의 세포외 신호 인자의 생합성에 필요한 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
96. 제 95항에 있어서,

    Vibrio harveyi, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemol;yticus, Vibrio alginolyticus, Pseudomonas phosphoreum, Yersinia enterocolitica, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Bacillus subtilis, Borrelia burgfdorferi, Neisseria meningitides, Neisseria gonorrhoeae, Yersinia pestis, Campylobacter jejuni, Deinococcus radiodurans, Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes및Staphylococcus aureus를 포함하는 그룹으 로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

    분리된 핵산 분자.
97. 제 95항에 있어서,

    약 150 과 200개의 아미노산 잔기 사이를 가지는 폴리펩티드를 암호화 하는

    핵산분자.
98. 제 95항에 있어서,

    암호화된 폴리펩티드가 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 서열번호:14, 서열번호:15, 서열번호:16, 서열번호:17및 서열번호:11 내지 17의 둘 또는 그 이상의 비교로부터 유도된 보존서열(consensus sequence)을 포함하는 그룹에서 선택된 서열과 대체적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는

    핵산분자.
99. 제 95항에 있어서,

    서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 서 열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8, 서열번호:9 및 서열번호:1-9의 둘 또는 그 이상의 비교로부터 유도된 보존서열을 포함하는 그룹에서 선 택된 서열과 대체적으로 동일한 서열을 가지는

    핵산분자.
100. 제 95항의 핵산 분자를 포함하는 삽입체(insert)를 가지는 벡터를 포함하는 재조합 DNA분자.
101. 제 95항의 핵산분자의 발현에 의하여 생산되는 폴리펩티드.
102. 하기의 서열을 포함하는 그룹에서 선택된 서열을 가지는 분리된 핵산 분자:

     a) 서열번호:1;

     b) 서열번호:1의 변이체(variant);

     c) 서열번호:1의 자연 돌연변이체(natural variant);

     d) 서열번호:1 또는 그의 상보적 서열(complement)과 혼성화(hybridize)하고, 서열번호:1에 의하여 암호화된 폴리펩티 드와 대체적으로 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 서열; 및,

     e) 아미노산 서열번호:10을 가지는 폴리펩티드의 일부나 전부를 암호 화하는 서열.
103. 하기의 서열을 포함하는 그룹에서 선택된 서열을 가지는 분리된 핵산 분자:

     a) 서열번호:2;

     b) 서열번호:2의 변이체;

     c) 서열번호:2의 자연 돌연변이체;

     d) 서열번호:2 또는 그의 상보적 서열과 혼성화하고, 서열번호:2에 의하여 암호화된 폴리펩티드와 대체적으로 동일한 폴리펩티드를 암 호화하는 서열; 및,

     e) 아미노산 서열번호:11을 가지는 폴리펩티드의 일부나 전부를 암호 화하는 서열.
104. 하기의 서열을 포함하는 그룹에서 선택된 서열을 가지는 분리된 핵산 분자:

     a) 서열번호:4;

     b) 서열번호:4의 변이체;

     c) 서열번호:4의 자연 돌연변이체;

     d) 서열번호:4 또는 그의 상보적 서열과 혼성화하고, 서열번호:4에 의하여 암호화된 폴리펩티드와 대체적으로 동일한 폴리펩티드를 암 호화하는 서열; 및,

     e) 아미노산 서열번호:12을 가지는 폴리펩티드의 일부나 전부를 암호 화하는 서열.
105. 벡터와 제 102, 103 또는 104항의 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 삽입체를 포함하는 재조합 DNA분자.
106. 제 102, 103 또는 104항의 어느 한 항의 핵산 분자의 발현에 의하여 생산되는 폴리펩티드.
107. 하기의 각 단계를 포함하는, LuxQ단백질과 상호 작용하여 발광유전자 luxCDABE를 포함하는 비브리오 하베이 오페론의 발현을 유도하는 세균의 세포외 신호 인자의 정제방법:

     a) 배양 배지에서 신호 분자를 생산하는 세균의 성장;

     b) 배양 배지로부터 세균의 분리;

     c) 세균으로부터 신호분자의 분비와 생산을 허용하는 조건하에, 고삼 투압 용액에서 세균의 배양;

     d) 고삼투압 용액으로부터 세균의 분리; 및

     e) 고삼투압 용액에서 전기 인자의 정제.
108. 제 107항에 있어서, 하기의 각 단계를 추가로 포함하는 방법:

     a) 고삼투압 용액에서 수분이 제거된 시료의 비극성 화합물로부터 극성 화합물의 분리; 및,

     b) 극성 화합물의 역상 HPLC(reverse-phase High Performance Liquid Chromatography) 분석.
109. 제 107항에 있어서,

     고삼투압 용액은 적어도 0.4M의 단가 염(monovalent salt)을 포함하는것을 특징으로 하는

     방법.
110. 제 109항에 있어서,

     0.4 내지 0.5M의 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 것을 특징으로 하는

     방법.
111. 제 107항에 있어서,

     글루코스, 프럭토스, 만노스, 글루시톨, 글루코사민, 갈락토스 및 아 라비노스를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 탄수화물을 함유하는 배 양배지에서 세균의 성장을 추가로 포함하는

     방법.
112. 제 107항의 방법에 의하여 생산되는 정제된 신호분자.
113. 외재성(exogenous) 자가유도체에 반응하여 검출될 만한 양의 빛을 생성하는생합성 경로(biosynthetic pathway)를 가지고, 자가유도체 경로(autoinducer pathway)에 관여하는 유전자 좌(gene loci)에서 적어도 2개의 다른 변화(alteration)(첫번째 변화는 첫번째 자가유도체의 검출을 저해하는 변화를 포함하고, 두번째 변화는 두번째 자가유도체의 생산을 저해하는 변화를 포함한다)를 포함하는 세균 또는 그의 추출물을 함유하는 하나 또는 그 이상의 컨테이너 수단(container means)을 엄밀하게 제한하여 수용하기 위하여 분획(compartmentalized)되어 있는 운반 수단(carrier means)을 포함하는 키트(kit).
114. 제 113항에 있어서,

     유전자 좌에서의 첫번째 변화가 LuxN 유전자에서의 변화를 포함하는 것을 특징으로 하는

     키트.
115. 제 113항에 있어서,

     유전자 좌에서의 첫번째 변화가 자가유도체-1의 검출을 저해하는 것을 특징으로 하는

     키트.
116. 제 113항에 있어서,

     유전자 좌에서의 두번째 변화가 LuxS 유전자에서의 변화를 포함하는 것을 특징으로 하는

     키트.
117. 제 113항에 있어서,

     유전자 좌에서의 두번째 변화가 내재성 자가유도체-2의 생산을 저해하 는 것을 특징으로 하는

     키트.