JP2003532698A - 細菌の増殖および病理発生を調節するための化合物ならびに方法 - Google Patents

細菌の増殖および病理発生を調節するための化合物ならびに方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、オートインデューサー2 の活性を調節するオートインデューサー2類似体および前記類似体を使って細菌の増殖および病理発生を調節する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （政府の利益に関する陳述） 米国政府は、全米科学財団から得た資金（助成金番号MCB-9506033 ）を使って
その一部がなされた本発明に、一定の権利を有する。
【０００２】 （発明の分野） 本発明は、ヒトおよび他の哺乳動物の細菌性疾患に関する。特に本発明は、細
菌の増殖および病理発生の調節に関与する新規シグナル伝達因子、そのシグナル
伝達因子の類似体および誘導体、ならびに前記類似体および誘導体を使って細菌
の増殖および病理発生を制御する方法を提供する。
【０００３】 （発明の背景） 細胞間協調は、多細胞生物に少なからぬ利益をもたらしており、原核生物など
の単細胞生物はこの利益を享受することができないと考えられていた。しかしこ
の20年間の研究により、原核生物は遺伝子発現を調節するような形で互いに連絡
することができ、それによって原核細胞は、仮にこの連絡がなければ真核生物に
独占されていたであろう利益を獲得できることが明らかになった。この能力は、
個体群密度が臨界値を越えた場合にのみ光生成に関与する遺伝子の発現を活性化
するVibrio fischeri （ビブリオ・フィッシェリ）やVibrio harveyi（ビブリオ
・ハーベイ）などの発光性海洋細菌に見いだされた。定数感知（quorum-sensing
）と呼ばれるこの現象は、今では、多くのグラム陰性菌における遺伝子調節の一
般的機構であると認識されており、この現象のおかげで、グラム陰性菌は、生物
発光、スウォーミング、バイオフィルム形成、タンパク質分解酵素の産生、抗生
物質の合成、遺伝子受容能の発達、プラスミド接合伝達、および胞子形成などと
いった活動を一斉に行うことができる。
【０００４】 定数感知細菌は、いくつの密度感知システムを持っているかによって2 種類に
分類される。どちらの種類も、オートインデューサーと呼ばれるシグナル伝達分
子を合成し、放出し、そのシグナル伝達分子に応答して、遺伝子発現を細胞密度
の関数として制御する。多数派に属する細菌は、オートインデューサーシンター
ゼをコードする一つの遺伝子と、オートインデューサーに対する応答を媒介する
転写活性化タンパク質をコードするもう一つの遺伝子とを含む単一の密度感知シ
ステムで、アシル- ホモセリンラクトンシグナルを利用する。前記二つの遺伝子
は、それぞれV.fischeriのluxIおよびluxRに相同である（Bassler およびSilver
man 、Hochら編「Two component Signal Transduction 」（1995）米国微生物学
会（ワシントンD.C.）の431 〜435 頁）。
【０００５】 オートインデューサー1 シグナル伝達因子を利用する多くの細菌は、その生活
環のある時点で、高等生物、すなわち植物および動物に関係する。例えば嚢胞性
線維症患者における日和見病原菌であるPseudomonas aeruginosa（緑膿菌）は、
オートインデューサー1 を使って様々なビルレンス決定因子を調節する。オート
インデューサー1 産生細菌の他の例には、Erwinia carotovora（エルウィニア・
カロトボラ）、Pseudomonas aureofaciens（シュードモナス・オーレオファシエ
ンス）、Yersinia enterocolitica （エルシニア・エンテロコリチカ）、Vibrio
harveyiおよびAgrobacterium tumefaciens （アグロバクテリウム・ツメファシ
エンス）などがある。E.carotovoraはある種の植物に感染し、その植物の細胞壁
を分解することにより、いわゆる「軟腐病」を引き起す。Yersinia enterocolit
ica はヒトでは胃腸病の原因となり、オートインデューサーを産生すると報告さ
れている。P.aureofaciensは、根での真菌増殖を遮断する抗生物質をオートイン
デューサーの制御下で合成する。
【０００６】 V.harveyi をはじめとするもう一方の種類に属する細菌は、1 つではなく2 つ
の独立した密度感知システムを持っている。V.harveyi は、種内連絡には種特異
性の高いシグナル伝達システム1 を利用し、種間連絡には種特異性の低いシグナ
ル伝達システム2 を利用する（Bassler ら,J.Bacteriol.179:4043-4045,1997 ）
。各システムは一対のセンサー- オートインデューサーを含み、シグナル伝達シ
ステム1 はセンサー1 およびオートインデューサー1 （AI-1）を利用し、シグナ
ル伝達システム2 はセンサー2 およびオートインデューサー2 （AI-2）を利用す
る（Bassler ら,Mol.Microbiol.13:273-286,1994）。オートインデューサー1 は
N-(3- ヒドロキシブタノイル)-L-ホモセリンラクトン（HSL ）であるが（Bassle
r ら,Mol.Microbiol.9:773-786,1993 参照）、オートインデューサー2 の構造は
まだ確定されておらず、その生合成に関与する遺伝子（群）も同定されていない
。
【０００７】 最近の研究により、定数感知は発光性海洋細菌間だけでなく病原性細菌間でも
起こり、そこでは細菌の病理発生に欠くことのできない因子であるビルレンス因
子の産生を調節していることが示されている。したがって、オートインデューサ
ー2 活性を持つ化合物を同定し特徴づけること、および天然のオートインデュー
サー2 の産生に必要なタンパク質をコードする遺伝子を同定し特徴づけることは
、当技術分野の進歩につながるだろう。このような進歩により、病原性細菌の制
御に役立つ化合物を同定する方法、従来の抗生物質処置を強化する方法、および
新しい抗微生物剤開発の新しいターゲットがもたらされるだろう。
【０００８】 （発明の要旨） 本出願人らは、いくつかの非発光病原体を含む多くの細菌が、V.harveyi のオ
ートインデューサー2 にそっくりな機能および物理的性質を持つシグナル伝達分
子を分泌することを、ここに発見した。本発明のAI-2シグナル伝達因子を産生す
る細菌には、Vibrio harveyi、Vibrio cholerae （コレラ菌）、Vibrio parahae
molyticus （腸炎ビブリオ）、Vibrio alginolyticus（ビブリオ・アルギノリチ
カス）、Pseudomonas phosphoreum （シュードモナス・ホスホレウム）、Yersin
ia enterocolitica 、Escherichia coli（大腸菌）、Salmonella typhimurium（
ネズミチフス菌）、Haemophilus influenzae（インフルエンザ菌）、Helicobact
er pylori （ヘリコバクター・ピロリ）、Bacillus subtilis （枯草菌）、Borr
elia burgfdorferi （ボレリア・ブルグドルフェリ）、Neisseria meningitidis
（髄膜炎菌）、Neisseria gonorrhoeae （淋菌）、Yersinia pestis （ペスト菌
）、Campylobacter jejuni（カンピロバクター・ジェジュニ）、Deinococcus ra
diodurans （デイノコックス・ラジオデュランス）、Mycobacterium tuberculos
is（結核菌）、Enterococcus faecalis （エンテロコッカス・フェカリス）、St
reptococcus pneumoniae（肺炎レンサ球菌）、Streptococcus pyogenes（化膿性
レンサ球菌）およびStaphylococcus aureus （黄色ブドウ球菌）などがある。
【０００９】 自由生活細菌は、それが宿主生物内で定着性（したがって潜在的に病原性）の
存在に移行する場合にのみ、この新規シグナル伝達分子を産生する。したがって
、このシグナル伝達遺伝子は、V.harveyi において発光遺伝子を刺激するだけで
なく、それを産生する細菌において病理発生に関係する遺伝子を刺激すると予想
される。本発明は、オートインデューサー2 シグナル伝達活性を持つ精製された
分子の他、その分子の合成型および細菌の増殖および病理発生を調節するその誘
導体を提供する。
【００１０】 もう一つの側面として、オートインデューサー2 受容体の活性を調節する方法
であって、オートインデューサー2 受容体をAI-2アゴニストまたはアンタゴニス
ト化合物と接触させることを含む方法を提供する。
【００１１】 もう一つの側面として、本発明は、オートインデューサー2 を含む細菌細胞ま
たはその抽出物を構造I 、II、III またはIVの化合物と接触させることによって
オートインデューサー2 活性を調節する方法を提供する。
【００１２】 さらにもう一つの側面として、本発明は、オートインデューサー2 受容体を構
造I 、II、III またはIVの化合物と接触させることによってオートインデューサ
ー2 受容体活性を調節する方法を提供する。
【００１３】 もう一つの側面として、本発明は、オートインデューサー2 産生細菌に感染し
た対象を同定し、その対象に構造I 、II、III またはIVの化合物を投与すること
によって細菌の増殖またはビルレンスを制御する方法を提供する。
【００１４】 さらにもう一つの側面として、本発明は、体内で細菌がオートインデューサー
2 を産生している対象を同定し、その対象に本発明のオートインデューサー2 の
阻害剤を投与することによって対象における細菌の増殖またはビルレンスを阻害
する方法を提供する。
【００１５】 もう一つの側面として、本発明は、化合物の存在下で得られるオートインデュ
ーサー2 の活性をその化合物の不在下で得られるオートインデューサー2 の活性
と比較することによってオートインデューサー2 の活性を調節する化合物を同定
する方法を提供する。
【００１６】 もう一つの側面として、本発明は、オートインデューサーに応答して検出可能
な量の光を生成する細胞または細胞抽出物をオートインデューサー類似体と接触
させ、オートインデューサー類似体の存在下および不在下で生成する光量を比較
することによってオートインデューサー類似体を同定する方法を提供する。
【００１７】 もう一つの側面として、本発明は、オートインデューサー2 を産生する細胞を
化合物と接触させ、オートインデューサー2 活性が細胞内に存在するかどうかを
決定することによってオートインデューサー2 の産生または活性を調節する化合
物を同定する方法を提供する。
【００１８】 もう一つの側面として、本発明は、（a ）オートインデューサー2 およびオー
トインデューサー2 受容体を化合物と接触させ、（b ）（a ）を、オートインデ
ューサー2 受容体へのオートインデューサー2 の結合に応答して光を生成する細
胞または細胞抽出物と接触させ、（c ）光生成に対する前記化合物の影響を測定
することによって、オートインデューサー2 受容体へのオートインデューサー2
の結合に影響を及ぼす化合物を同定する方法を提供する。
【００１９】 さらにもう一つの側面として、本発明は、（a ）オートインデューサー2 とオ
ートインデューサー2 受容体との間に形成される複合体を化合物と接触させて複
合体を解離させ、（b ）（a ）を、オートインデューサー2 受容体へのオートイ
ンデューサー2 の結合に応答して光を生成する細胞または細胞抽出物と接触させ
、（c ）光生成に対する前記化合物の影響を測定することによってオートインデ
ューサー2 受容体へのオートインデューサー2 の結合に影響を及ぼす化合物を同
定する方法を提供する。
【００２０】 さらにもう一つの側面として、本発明は、シデロフォアを産生する能力を持つ
細胞を構造I 、II、III またはIVの化合物と接触させることによって細菌細胞に
おけるシデロフォアの発現を調節する方法を提供する。
【００２１】 もう一つの側面として、本発明は、エキソポリサッカライドを産生する能力を
持つ細胞を構造I 、II、III またはIVの化合物と接触させることによって細胞に
おけるエキソポリサッカライド産生を調節する方法を提供する。
【００２２】 もう一つの側面として、本発明は、細菌コロニーを構造I 、II、III またはIV
の化合物と接触させることによって細菌のコロニー形態を調節する方法を提供す
る。
【００２３】 もう一つの側面として、本発明は、バイオフィルム形成能を持つ細菌を構造I
〜IVに示す化合物の任意の組合わせと接触させることによって細菌のバイオフィ
ルム形成を調節する方法を提供する。
【００２４】 もう一つの側面として、本発明は、S-アデノシルホモシステイン（SAH ）をLu
xSタンパク質と接触させることによってオートインデューサー2 を製造する方法
を提供する。
【００２５】 もう一つの態様として、本発明は、a ）S-アデノシルホモシステイン（SAH ）
を5'- メチルチオアデノシン/S- アデノシルホモシステインヌクレオシダーゼ（
pfs ）タンパク質と接触させてS-リボシルホモシステインを生成し、b ）a ）で
得たS-リボシルホモシステインをLuxSタンパク質と接触させてS-リボシルホモシ
ステインのオートインデューサー2 への変換を促進することによってオートイン
デューサー2 を製造する方法も提供する。
【００２６】 さらにもう一つの側面として、本発明は、（a ）少なくとも1 つの細胞をオー
トインデューサーと接触させてバイオマーカーの誘導を促進し、（b ）前記バイ
オマーカーを検出することによってオートインデューサー関連バイオマーカーを
検出する方法を提供する。
【００２７】 もう一つの側面として、本発明は、細菌細胞の増殖またはビルレンス因子の発
現を調節する方法であって、細菌細胞を、構造:
【化３０】 を含んでなる単離されたオートインデューサー2 類似体と接触させることを含む
方法を提供する。
【００２８】 さらに本発明は、抗生物質と微生物の定数感知経路の阻害剤とを含む相乗的抗
生組成物も提供する。
【００２９】 さらに本発明は、抗生物質と微生物の定量感知経路の阻害剤とを含む相乗的抗
生組成物を含む医療用デバイス、ならびに定数感知機構を持つ微生物が引き起す
温血動物における感染症を処置する方法であって、動物に治療有効量の前記相乗
的抗生組成物を投与することを含む方法も提供する。
【００３０】 さらに本発明は、抗生物質と微生物の定数感知経路の阻害剤またはその医薬的
に許容できる塩とを含む相乗的抗生組成物と、1 または複数の医薬的に許容でき
る担体、佐剤または賦形剤とを含む医薬組成物も提供する。
【００３１】 また本発明は、定数感知機構を持つ微生物が引き起す温血動物における感染症
を処置する方法であって、抗生物質と微生物の定数感知経路の阻害剤とを含む治
療有効量の相乗的抗生組成物を動物に投与することを含む方法も提供する。
【００３２】 さらに本発明は、バイオフィルム形成能を持つ細菌を、構造III または構造IV
に示す構造を持つ化合物と接触させることによってバイオフィルム形成を阻害す
る方法も提供する。
【００３３】 さらに本発明は、構造III または構造IVに示す構造を持つ少なくとも1 つの抗
微生物化合物を含む医療用デバイスであって、前記デバイスに前記化合物が補わ
れ、前記化合物が局所的抗微生物作用をもたらすのに十分な濃度で存在するよう
な医療用デバイスも提供する。
【００３４】 さらに本発明は、抗生物質と微生物の定数感知経路の阻害剤との相乗的抗生組
成物を少なくとも1 つは含んでいる医療用デバイスであって、前記組成物が局所
抗微生物作用をもたらすのに十分な濃度で存在するような医療用デバイスも提供
する。
【００３５】 さらに本発明は、抗生物質と微生物の定数感知経路の阻害剤またはその医薬的
に許容できる塩とを含む相乗的抗生組成物と、1 または複数の医薬的に許容でき
る担体、佐剤または賦形剤とを含有する少なくとも1 つの医薬組成物を含む医療
用デバイスであって、前記組成物が局所抗微生物作用をもたらすのに十分な濃度
で存在するような医療用デバイスも提供する。
【００３６】 本発明のさらなる特徴および利点は、図面、以下の詳細な説明および実施例を
参照することによって、よりよく理解されるだろう。
【００３７】 （発明の詳細な説明） 定義 「低級アルキル」とは1 〜約10個の炭素原子を持つアルキル基を指す。
【００３８】 「異性体」とは立体異性体を意味し、エナンチオマーおよびジアステレオマー
を包含する。
【００３９】 「天然供給源から精製」は、生物によって製造されたオートインデューサー2
類似体を包含し、S.typhimurium などの細菌の培養培地または細胞質から従来の
精製技術を使ってオートインデューサー2 類似体を単離することを包含する。
【００４０】 「感染性を阻害」は、当該処置によって利益を受けるであろう対象に初発感染
または二次感染するという病原性微生物の能力に影響を及ぼす方法を包含する。
【００４１】 「バイオマーカー」とは、既知の検鏡技術、組織学的技術または分子生物学的
技術によって同定することができる任意の細菌細胞成分を指す。このようなバイ
オマーカーは、例えば細胞表面上に存在する分子、タンパク質、核酸、リン酸化
事象、または細菌細胞の任意の分子的もしくは形態的特徴であって細菌がオート
インデューサーの存在下に置かれた時に変化するものであることができる。
【００４２】 「プローブ」は、試料中に存在する細菌バイオマーカーを検出するのに役立つ
核酸、タンパク質、小分子、または抗体であることができる。
【００４３】 本明細書で使用する「医療用デバイス」という用語は、その作動中に組織、血
液または他の体液と接触する面を持つデバイスを意味する。この定義の範囲には
、例えば外科用インプラント、縫合糸、創傷被覆材、手術用体外デバイス、例え
ば人工肺、血液ポンプ、血液センサー、血液の輸送に使用するチューブであって
、患者に戻る血液と接触するものなどが包含される。この定義の範囲には、ヒト
または動物の体内に血液と接触して植え込まれる内部人工器官、例えば血管また
は心臓に植え込まれる代用血管、ステント、ペースメーカーリード、心臓弁など
が包含される。またこの定義の範囲には、一時的に血管内で使用されるデバイス
、例えばモニタリングまたは修復を目的として血管または心臓に挿入されるカテ
ーテル、ガイドワイヤなども包含される。
【００４４】 「化合物」は、AI-2の活性に影響を及ぼすか、またはAI-2と結合するタンパク
質の活性に影響を及ぼす任意の薬剤、組成物または分子であることができる。例
えば本発明の化合物は、核酸、タンパク質、AI-2の類似体または小分子であるこ
とができる。「化合物」には、オートインデューサー2 受容体を調節する分子、
例えばLuxPまたはLuxQなどが包含される。例えば構造I 、II、III またはIVの化
合物は、細菌増殖または細胞外ビルレンス因子の発現が調節されるような形で、
LuxPタンパク質、LuxQタンパク質、LuxP-LuxQ 複合体、LuxP-AI-2 複合体、また
はLuxP-LuxQ-AI-2複合体の活性を調節することができる。このような化合物には
、AI-2が定数感知シグナル伝達システム2 のセンサーとして作用できないように
、AI-2と直接相互作用する阻害剤が包含される。例えば本発明の化合物は、4,5-
ジヒドロキシ-2- シクロペンテン-1- オンまたは4-ヒドロキシ-5- メチル-2H-フ
ラン-3- オンと直接相互作用することができる。
【００４５】 AI-2「阻害剤」とは、発光、細菌の増殖または病理発生のシグナルとして作用
するというオートインデューサーの能力を妨害する分子を指し、AI-2を分解する
分子またはAI-2に結合する分子を包含する。阻害剤には、細菌増殖と通常関係す
るタンパク質と相互作用することによってAI-2活性を調節する化合物も包含され
る。
【００４６】 AI-2の「活性」は、細菌の定数感知、増殖調節および病理発生においてシグナ
ル伝達因子として作用するというAI-2の能力の任意の側面を包含する。
【００４７】 「オートインデューサー2 類似体」とは、4-ヒドロキシ-5- メチル-2H-フラン
-3- オンの任意の立体異性体のオートインデューサー2 活性の少なくとも10％を
持つ任意の化合物を意味し、天然のオートインデューサー2 を包含する。
【００４８】 「シグナル伝達因子」、「シグナル伝達分子」、「オートインデューサー」、
より具体的には「オートインデューサー2 」または「AI-2」はいずれも、本発明
の新規シグナル伝達因子を指す。「オートインデューサー2 」および「AI-2」と
いう用語は、特に定数感知システム2 に関与するシグナル伝達分子を指す。「シ
グナル伝達因子」または「シグナル伝達分子」、「オートインデューサー」また
は「AI-2様分子」とは、広く本発明のシグナル伝達因子全体を指し、AI-2はその
一例である。
【００４９】 DNA に関して「単離された核酸分子」とは、当該DNA が由来する生物の天然の
ゲノムにおいて当該DNA に（5'方向および3'方向に）直接隣接している配列から
分離されているDNA 分子を指す。例えば「単離された核酸」は、プラスミドもし
くはウイルスベクターなどのベクターに挿入されたDNA 分子、または原核生物も
しくは真核生物のゲノムDNA に組込まれたDNA 分子からなることができる。「単
離された核酸分子」はcDNA分子からなることもできる。
【００５０】 「単離された核酸」とは、主に、上に定義した単離されたDNA 分子によってコ
ードされるRNA 分子を指す。また、この用語は、当該RNA 分子が「実質的に純粋
」な形で存在するように（「実質的に純粋」という用語は下で定義する）、天然
の状態（すなわち細胞または組織中）では当該RNA に付随しているであろうRNA
分子から十分に分離されたRNA 分子を指す場合もある。
【００５１】 「単離されたタンパク質」または「単離精製されたタンパク質」とは、主に、
本発明の単離された核酸分子の発現によって産生されるタンパク質を指す。また
、この用語は、「実質的に純粋」な形で存在するように、当該タンパク質に本来
付随しているであろう他のタンパク質から十分に分離されたタンパク質を指す場
合もある。
【００５２】 「実質的に純粋」とは、少なくとも50〜60重量％の当該因子（例えば病原性シ
グナル伝達因子、核酸、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質）を含む調製物に
ついていう。より好ましくは、上記調製物は少なくとも75重量％、最も好ましく
は90〜99重量％の当該因子を含む。純度は当該因子に適した方法（例えばクロマ
トグラフィー法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、HPLC分析
など）によって測定される。
【００５３】 「免疫特異的」とは、目的とするタンパク質の1 または複数のエピトープには
結合するが、抗原性生体分子の混合集団を含む試料中の他の分子を実質的に認識
および結合しない抗体についていう。
【００５４】 「特異的にハイブリダイズする」とは、当技術分野で一般に使用される所定の
条件でそのようなハイブリダイゼーションが可能となるように、十分に相補的な
配列を持つ2 つの一本鎖ヌクレオチド分子間の会合についていう（「実質的に相
補的」という場合もある）。特にこの用語は、あるオリゴヌクレオチドと、本発
明の一本鎖DNA またはRNA 分子内に含まれる実質的に相補的な配列とのハイブリ
ダイゼーションであって、前記オリゴヌクレオチドと非相補的な配列の一本鎖核
酸とのハイブリダイゼーションが実質的に排除されるようなハイブリダイゼーシ
ョンを指す。
【００５５】 「プロモーター領域」とは、コード領域の5'側もしくは3'側またはコード領域
内またはイントロン内に見いだされうる遺伝子の転写調節領域を指す。
【００５６】 「選択可能マーカー遺伝子」とは、発現したときに抗生物質耐性などの選択可
能な表現型を形質転換細胞に付与する産物をコードする遺伝子を指す。
【００５７】 「レポーター遺伝子」とは、標準的方法によって、直接的または間接的に、容
易に検出することができる産物をコードする遺伝子を指す。
【００５８】 「作動可能に結合」とは、コード配列の発現に必要な調節配列が、コード配列
の発現が可能になるようにコード配列に対してDNA 分子中の適当な位置に配置さ
れることを意味する。これと同じ定義が、発現ベクター中の転写単位および他の
調節要素（例えばエンハンサーまたは翻訳調節配列）の配置に適用される場合も
ある。
【００５９】 「オートインデューサー関連細菌バイオマーカー」とは、オートインデューサ
ーが調節、修飾、増強、阻害または誘導する任意の細菌細胞成分を指す。
【００６０】 「調節する」という用語はその通常の意味を持つが、増強、阻害および模倣と
いう用語の意味も包含する。また、本明細書で使用する「発現」という用語は、
LuxP、LuxQなどの遺伝子またはビルレンス因子をコードする遺伝子に関して使用
される場合、その通常の意味を持つが、遺伝子の転写、遺伝子から転写された機
能的mRNAの長寿命、そのmRNAの翻訳、および遺伝子産物の活性も包含する。「調
節」にはオートインデューサー2 シグナル伝達経路の阻害または活性化が包含さ
れる。
【００６１】 「抗体」にはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の完全な分子なら
びにその断片、例えばFab およびF(ab')2 などが包含される。例えばモノクロー
ナル抗体は、当業者に周知の方法によってタンパク質の抗原含有断片から作製さ
れる（Kohlerら,Nature,256:495,1975）。
【００６２】 「実質的に同じ」とは、タンパク質の性質（すなわちタンパク質の構造上の特
徴および/ または生物学的活性）に著しい影響を及ぼさない配列変異を持つ核酸
またはアミノ酸配列についていう。特に核酸配列の場合は、「実質的に同じ」と
いう用語は、コード領域および発現を支配する保存された配列についていい、主
に、同じアミノ酸をコードする縮重コドン、またはコードされるポリペプチド中
の保存的代替アミノ酸をコードする代替コドンについていう。アミノ酸配列の場
合、「実質的に同じ」という用語は、一般に、構造または機能の決定に関与しな
いポリペプチド中の領域における保存的置換および/ または変異を指す。アミノ
酸配列の比較には、「一致率」および「類似率」という用語も本明細書では使用
する。これらの用語は、ウィスコンシン大学から入手可能なUWGCG 配列解析プロ
グラムにおける定義と同様に定義され（Devereaux ら,Nucl.Acids Res.12:387-3
97,1984 ）、前記プログラムで使用されるパラメーターが、配列一致度および配
列類似度の比較にここで使用したパラメーターである。
【００６３】 「抗生物質」は、殺菌剤ならびに静菌剤を包含し、スルホンアミド類、抗尿路
感染症剤、 -ラクタム系抗生物質、セファロスポリン類、クラブラン酸誘導体、
アミノグリコシド類、テトラサイクリン類および関連抗菌剤、マクロライド類、
抗結核薬、抗トリ型結核菌剤、抗らい剤、抗真菌剤および抗ウイルス剤が包含さ
れる。
【００６４】 「スルホンアミド類」には、スルファニルアミド、スルファメトキサゾール、
スルファセタミド、スルファジアジン、スルフィソキサゾール、パラアミノ安息
香酸、およびトリメトプリム- スルファメトキサゾールなどが含まれる。
【００６５】 「キノロン類」とは、ナリジクス酸、シノキサシン、ノルフロキサシン、シプ
ロフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシン、ロメフロキサシン、フ
レロキサシン、ペフロキサシン、アミフロキサシンなどを意味する。
【００６６】 「抗尿路感染症剤」とは、メセナミン、ニトロフラントインなどを意味する。
【００６７】 「 -ラクタム系抗生物質」とは、ここではペニシリン類、セファロスポリン類
などを意味する。ペニシリン類の例は、ペニシリンG 、ペニシリンV 、メチシリ
ン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、ナフチリン、アンピシ
リン、アモキシシリン、カルベニシリン、カルベニシリンインダニル、チカルシ
リン、メズロシリン、ピペラシリン、バカンピシリンなどである。
【００６８】 「セファロスポリン類」とは、例えばセファロチン、セファゾリン、セファレ
キシン、セファドロキシル、セファマンドール、セフォキシチン、セファクロル
、セフロキシム、セフロキシムアキセチル、ロラカルベフ、セフォニシド、セフ
ォテタン、セフォラニド、セフォタキム、セフポドキシムプロキセチル、セフチ
ゾキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジム、セフェピム、モ
キサラクタムなどの化合物を意味する。カルバペネム類とは、ここでは、イミペ
ネム、メロペネム、アズトレオナム（イミペネム- シラスタチン）などのβ- ラ
クタム系抗生物質を意味する。
【００６９】 「クラブラン酸誘導体」とは、アモキシシリンとクラブラン酸およびチカルシ
リンとクラブラン酸の組合わせを意味する。
【００７０】 「アミノグリコシド類」とは、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラ
マイシン、アミカシン、ネチルマイシン、カナマイシン、ネオマイシンなどを意
味する。
【００７１】 「テトラサイクリン類」とは、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイク
リン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリ
ンなどを意味する。
【００７２】 「関連抗菌剤」とは、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、スペクチノ
マイシン、ポリミキシンB 、コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、RP59
500 、グリシルサイクリン類などを意味する。
【００７３】 「マクロライド類」とは、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロ
マイシンなどを意味する。
【００７４】 「抗結核薬」とは、イソニアジド、リファムピン、エタンブトール、ストレプ
トマイシン、ピラジンアミド、エチオナミド、アミノサリチル酸、シクロセリン
、カプレオマイシンなどを意味する。
【００７５】 「抗トリ型結核菌剤」用の薬物とは、ここでは、リファブチン、マクロライド
類、キノロン類、クロファジミン、アミカシンなどを意味する。
【００７６】 「抗らい剤」とは、ダプソンおよびスルホキソンナトリウムなどのスルホン類
、リファンピン、クロファジミン、サリドマイド、およびエチオナミドを意味す
る。
【００７７】 「抗真菌剤」とは、アンホテリシンB 、フルシトシン、イミダゾール類および
トリアゾール類、ケトコナゾール、ミコナゾール、イトラコンゾール、フルコナ
ゾールなどの全身性抗真菌剤を意味する。このカテゴリーにはグリセオフルビン
も含まれる。また、この用語は、クロトリマゾール、エコナゾール、ミコナゾー
ル、テルコナゾール、ブトコナゾール、シクロピロックスオラミン、ハロプロジ
ン、トルナフテート、ナフチフィン、テルビナフィンなどの局所抗菌剤、ならび
にニスタチン、アンホテリシンB 、ウンデシレン酸、安息香酸、サリチル酸、プ
ロピオン酸、カプリル酸およびヨウ化カリウムも意味する。
【００７８】 「抗ウイルス剤」とは、アシクロビル、ファムシクロビル、フォスカーネット
、ガンシクロビル、イドクスウリジン、ソリブジン、トリフルリジン、バラシク
ロビル、ビダラビン、ペンシクロビルなどの抗ヘルペスウイルス剤、ならびに新
しい薬剤、例えばラミブジン、FTC 、アデフォビル（PMEA）、ネビラピン、デラ
ビルジン、ロビライド（loviride）、サキナビル、インジナビルなどの抗HIV-1
剤、ラミブジン、ファムシクロビルおよびフィアルウリジン（fialuridine ）な
どの抗B 型肝炎ウイルス剤、シドフォビル（HPMPC ）およびロブカビル（lobuca
vir ）などの抗ヘルペスウイルス剤、アフォビルセン（afovirsen ）などの抗パ
ピローマウイルス剤、sICAM-1 、ピロダビル（pirodavir ）などの抗ライノウイ
ルス剤、GG167 などの抗インフルエンザウイルス薬、ジダノシン、スタブジン、
ザルシタビン、ジドブジンなどの抗レトロウイルス剤、ならびにアマンタジン、
インターフェロンα、リバビリンおよびリマンタジンなどの他の抗ウイルス剤を
意味する。
【００７９】 本発明により、本出願人らは、Salmonella typhimuriumおよびEscherichia co
liを含む病原性細菌のいくつかの株が産生する細胞外シグナル伝達因子の類似体
であって、これらの細菌の病理発生またはビルレンスに影響を及ぼす類似体を同
定した。また本出願人らは、天然シグナル伝達因子の生合成に関与する遺伝子を
同定し、クローン化した。オートインデューサー2 類似体の同定、および天然オ
ートインデューサー2 の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子のクロ
ーニングにより、細菌における定数感知に影響を及ぼすことを目的とする薬物設
計に新しい道が切り開かれる。定数感知を妨害するように設計された薬物は、新
しい種類の抗生物質を構成する。本発明はさらに、オートインデューサーを検出
する方法およびオートインデューサー2 活性を持つ化合物をインビトロで製造す
る方法も提供する。
【００８０】 AI-2シグナル伝達活性を持つ因子の調製 本発明シグナル伝達分子の初期の精製方法では、特異的シグナル伝達活性を持
つ分子を含む部分精製調製物が得られ、V.harveyi バイオアッセイで測定したと
ころ、約0.1 〜1.0mg の部分精製物質が発光を1000倍増大させると見積もられた
。シグナル伝達活性は有機溶媒には定量的には抽出されず、カチオン交換カラム
にもアニオン交換カラムにも結合しない。この分子は小さく（1,000kDa未満）、
極性であるが荷電はしてない有機因子である。活性は酸安定、塩基不安定であり
、80℃には耐熱性を示すが、100 ℃には耐熱性を示さない。本シグナル伝達分子
のこれらの特徴から、この分子は過去に記載されたどのオートインデューサーと
も異なることが明らかである。
【００８１】 本発明のシグナル伝達分子はその天然供給源、すなわちそれを産生する細菌か
ら精製することができる。例えばグルコースまたは他の糖類の添加、オスモル濃
度の増加、および/ またはpHの低下などによって培養培地を変更すると、Salmon
ellaおよび他の腸内細菌におけるシグナル伝達分子の産生量を増大させることが
でき、シグナル伝達分子をほぼ均一にまで精製することが可能になった。したが
って本分子は、現在では、腸内細菌（例えばE.coli、S.typhimurium ）の培養液
から、以下のプロトコールを使って、高度に精製されている。
【００８２】 シグナル産生腸内細菌の培養物を0.5 ％グルコースまたは他の糖を含むLBで終
夜培養する（37℃、曝気下）。0.5 ％のグルコースまたは他の糖を含む新しいLB
に、終夜培養物を1:100 の希釈率で接種する。希釈した培養物を指数期中期まで
培養する（3.5 時間、37℃、曝気下）。
【００８３】 細胞をペレット化する（10,000rpm 、10分、4 ℃）。培養培地を捨てる。元の
体積の1/10量の低オスモル濃度NaCl溶液（0.1M NaCl 水溶液）に細胞を再懸濁し
、洗浄する。
【００８４】 細胞を再びペレット化する（10,000rpm 、10分、4 ℃）。低オスモル濃度培養
液を捨てる。元の体積の1/10量の高オスモル濃度NaCl溶液（0.4M NaCl 水溶液）
に細胞を再懸濁する。その懸濁液を曝気しながら37℃で2 時間インキュベートす
る。この期間中に、シグナル伝達分子の産生および分泌の増加が起こる。
【００８５】 細胞をペレット化する（10,000rpm 、10分、4 ℃）。分泌されたシグナル伝達
分子を含む上清を集め、その上清を0.2M細菌フィルターを通して濾過することに
より、残存細胞を全て除去する。
【００８６】 水性濾液を、ロータリーエバポレーターにより、30℃で蒸発させる。乾燥した
濾液を元の体積の1/10量のクロロホルム：メタノール（70：30）で抽出する。
【００８７】 有機抽出物を、ロータリーエバポレーターにより、室温で蒸発させる。乾燥し
た抽出物を元の体積の1/100 量のメタノールに再溶解する。
【００８８】 部分精製されたシグナルを分取用逆相C18 カラムによる高速液体クロマトグラ
フィー（HPLC）にかける。0 〜100 ％アセトニトリル/ 水の直線的勾配を使って
、毎分5mL の流量で、分子を溶出させる。各5mL の30画分を集める。
【００８９】 HPLC画分をV.harveyi BB170 AL-2アッセイでアッセイし、活性画分をプールす
る。
【００９０】 C18 カラムから得られる産物は、シグナル伝達分子と小数の他の有機分子とを
含む。このシグナル伝達分子の精製調製物は、上述の部分精製物質（高浸透圧調
節物質ステップまたは最終HPLCステップを含まなかった調製物）より50〜100 倍
高い活性を持つ。すなわち1 〜10 gの物質がV.harveyi バイオアッセイで発光を
1000倍増大させる。
【００９１】 後のAI-2類似体の精製方法から、AI-2の新規インビトロ製造システムが確認さ
れた。したがって本発明は、クローン化し過剰発現させ精製したS.typhimurium
LuxSタンパク質を提供するだけでなく、AI-2をインビトロで製造する方法も提供
する。本発明は、質量スペクトル解析およびNMR 解析ならびにAI-2の活性を調節
する化合物のスクリーニングに役立つ純粋なAI-2を大量に製造するための機構を
提供する。さらに本発明は、AI-2合成のインビボ生合成経路を決定する方法を提
供する。インビトロAI-2類似体製造方法を下記実施例5 と図15に説明する。この
方法は、オートインデューサー分子を効率よく製造してさらなる研究を行うため
の新規手段になる。またこの方法は、商業的用途に利用するためにAI-2類似体を
大量に製造する手段にもなる。そのような用途には、例えば細菌増殖を増加させ
るために増殖培地にAI-2類似体を添加することなどがあるが、これに限るわけで
はない。かかる方法は、培養細菌からの抗生物質の製造にとりわけ有用である。
AI-2類似体は、好ましくは、本明細書の実施例5 に記載するインビトロ法によっ
て製造される。
【００９２】 AI-2類似体の用途 本明細書に記載のオートインデューサー2 類似体は、細菌における定数感知に
影響を及ぼすのに役立つ。かかる類似体は、V.harveyi バイオアッセイを使った
様々な試験化合物の大規模スクリーニングによって同定することができる。試験
化合物の存在下で起こるシグナル伝達活性の低下は、その化合物が、例えば1 ま
たは複数のビルレンス因子の発現に影響を及ぼすことによって、細菌の病理発生
を遮断できることを示す。
【００９３】 例えば、天然の化合物をスクリーニングして、オートインデューサー2 とその
受容体、例えばLuxPおよびLuxP-LuxQ などとの相互作用に対するそれらの効果を
調べることができる。
【００９４】 定数感知経路の諸成分がE.coliに同定されたので、これらの成分の1 または複
数の阻害を利用して、潜在的シグナル伝達分子阻害剤または類似体をスクリーニ
ングすることができる。本発明者らはler-lacZ受容体融合コンストラクトを作製
して、E.coli O157:H7（病原性株）におけるIII 型分泌遺伝子の発現の低下を直
接調べるのに使用した。また、同様の遺伝子座がS.typhimurium にも存在する。
【００９５】 したがって本発明は、天然オートインデューサー2 による選択した遺伝子の活
性を、阻害剤または相乗剤の存在下および不在下で測定することにより、4-ヒド
ロキシ-5- メチル-2H-フラン-3- オンなどのオートインデューサー2 類似体を選
択する方法を提供する。このようにして細菌の病理発生を調節する化合物を迅速
に選別することができる。
【００９６】 本発明の方法で同定された化合物は、さらに溶液状態で、または固形支持体へ
の結合後に、特異的DNA 配列の検出に通常応用される任意の方法、例えばPCR 、
オリゴマー制限法（Saiki ら,Bio/Technology,3:1008-1012,1985）、対立遺伝子
特異的オリゴヌクレオチド（ASO ）プローブ解析（Connerら,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,80:278,1983 ）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（OLA ）（
Landegren ら,Science,241:1077,1988）などによって、評価、検出、クローン化
、配列決定などを行うことができる。DNA 解析の分子技術については総説がある
（Landegren ら,Science,242:229-237,1988 ）。また、本発明のスクリーニング
方法には、LuxPまたはLuxQに結合する化学化合物を同定するためのコンビナトリ
アルケミストリー法も包含される。例えば、PlunkettおよびEllman「Combinator
ial Chemistry and New Drugs 」Scientific American,1997年4 月号の69頁を参
照されたい。
【００９７】 天然のオートインデューサー2 は、天然供給源から従来の精製技術を使って精
製するか、化学的手段によって合成的に得るか、または好ましくは、後述する本
発明のインビトロ法によって製造することができる。
【００９８】 本方法の一つでは、オートインデューサー2 受容体をAI-2アゴニストまたはア
ンタゴニストと接触させることにより、オートインデューサー2 受容体の活性を
調節する。この方法のさらなる態様では、式I 、II、III もしくはIVの化合物ま
たはその任意の組合わせを使用する。これらいずれかの態様のさらなる態様では
、オートインデューサー2 受容体がLuxPおよびLuxQからなる群より選択される。
上記いずれかの態様のさらなる態様では、AI-2受容体が細菌細胞上にあり、その
細菌細胞は温血宿主中にある。
【００９９】 上記いずれかの態様で調節される活性は、例えば細菌細胞増殖、細菌のビルレ
ンス、シデロフォア発現、細菌細胞におけるエキソポリサッカライド産生、細菌
のコロニー形態（例えば病原性細菌細胞が示すような滑らかなコロニー形態）、
バイオフィルム形成などであることができる。これらの態様は式I 、II、III お
よびIVから選択される化合物またはそれらの任意の組合わせを使って、また特に
4-ヒドロキシ-5- メチル-3(2H)- フラノンを使って、実施することができる。上
記いずれかの態様は、AI-2受容体がVibrio harveyi、Vibrio cholerae 、Vibrio
parahaemolyticus 、Vibrio alginolyticus、Pseudomonas phosphoreum 、Yers
inia enterocolitica 、Escherichia coli、Salmonella typhimurium、Haemophi
lus influenzae、Helicobacter pylori 、Bacillus subtilis 、Borrelia burgf
dorferi 、Neisseria meningitidis、Neisseria gonorrhoeae 、Yersinia pesti
s 、Campylobacter jejuni、Deinococcus radiodurans 、Mycobacterium tuberc
ulosis、Enterococcus faecalis 、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus
pyogenesおよびStaphylococcus aureus からなる群より選択される細菌細胞の一
部であるような態様で実施することができる。
【０１００】 さらに本発明は、病原性生物の感染性を阻害する方法、ならびに本発明のAI-2
類似体またはAI-2阻害剤を含む治療組成物も提供する。この方法では、天然AI-2
の活性を阻害する治療有効量の医薬組成物を対象に投与する。
【０１０１】 本発明の医薬組成物は、構造I 、II、III またはIVに示す化合物を含むことが
できる。このような化合物を含む組成物は、例えば、以下に例示するような細胞
外ビルレンス因子の転写活性化を防止することができる：アクセサリーコレラエ
ンテロトキシン（accessory cholera enterotoxin ）、アデニル酸シクラーゼ毒
素、アドヘシン、エアロリシン（aerolysin ）毒素、凝集物質、すなわちasa373
、Agr A 、B 、C 、D 、SigBなど、アルカリプロテアーゼ、α毒素、α溶血毒、
アルビオリシン（alveolysin）、炭疽毒素、APX 毒素、β毒素、ボツリヌス毒素
、束状線毛構造サブユニット、C2毒素、C3毒素、C5A ペプチダーゼ、心臓毒、走
化性、コレラ毒素、毛様体毒素、クロストリジウム細胞毒、クロストリジウム神
経毒、コラーゲン接着遺伝子、クリスタルエンドトキシン（crystal endotoxin
）、cyaA毒素、細胞溶解素、δ毒素、δ毒素、δ- リシン、ジフテリア毒素、嘔
吐毒素、内毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンA 、B 、C1、C2、C3、D 、E 、
G 、エンテロトキシン、表皮剥脱毒素、外毒素、外毒素A 、外毒素B 、外毒素C
、細胞外エラスターゼ、フィブリノゲン、フィブロネクチン結合タンパク質、す
なわちfnbA、線維状赤血球凝集素、フィンブリア、γ溶血毒、ゼラチナーゼ、す
なわちgelE、溶血毒、溶血毒B 、赤血球凝集素、ヒストリティコリシン（histol
yticolysin）、IGG 結合タンパク質A 、すなわちspaI、インチミン、インベイシ
ン（invasin ）、鉄シデロフォア類、イワノリシン（ivanolysin）、イワノリシ
ンO 、ランチビオティック修飾酵素、ランチビオティック構造タンパク質、レシ
チナーゼ、ler （LEE 遺伝子の正の調節因子）、ロイコトキシン、リポタンパク
質シグナルペプチダーゼ、リステリオリシンO 、M タンパク質、運動性、神経毒
、非フィンブリアアドヘシン類、浮腫因子、パーフリンゴリシンO 、透過酵素、
百日咳毒素、ホスホリパーゼ、線毛、プラスミドエンコーデッドレギュレーター
（plasmid-encoded regulator ）per 、ニューモリシン（pneumolysin ）、ポリ
-D- グルタミン酸莢膜、孔形成毒素、プロリンパーミアーゼ、RNAIII、RTX 毒素
、セリンプロテアーゼ、志賀毒素、シデロフォア/ 鉄獲得タンパク質、SigAプロ
テアーゼ、SpeA、SpeB、SpeC、Sta 毒素、Stb 毒素、ストレプトリシンO 、スト
レプトリシンS 、スーパー抗原、スーパーオキシドジスムターゼ、TCP 、破傷風
毒素、チオール活性化細胞溶解素、気管細胞溶解素、TSST毒素（TSST-1）、ウレ
アーゼ、および閉鎖帯毒素（zona occludens toxin）など。
【０１０２】 本発明は、天然のオートインデューサー2 によって活性化される経路の活性を
調節することによって細菌細胞増殖または細菌ビルレンス因子の発現に影響を及
ぼすオートインデューサー2 類似体を提供する。かかる経路には、例えばシデロ
フォアの産生および細菌コロニー形態の調節などがある。本発明のオートインデ
ューサー2 類似体は、AI-2と協調してまたはAI-2の代替物として作用することに
より、細菌増殖を増加させるために使用することができる。もう一つの選択肢と
して、オートインデューサー2 類似体は、LuxPまたはLuxQを含むオートインデュ
ーサー2 受容体への結合に関して天然のAI-2と競合することにより、AI-2を阻害
することもできる。
【０１０３】 また、LuxPまたはLuxQなどのオートインデューサー2 受容体は、ワクチンを開
発する際の共通の標的になる。LuxPまたはLuxQなどのオートインデューサー2 受
容体に対して産生させた抗体は、例えば、ビルレンスに関係する細菌経路の活性
化を阻害することができる。オートインデューサー2 受容体は、複数の病原体関
連疾患状態に対して対象を免疫化するために使用することができる共通の抗原性
決定基になる。特定の生物から単離したオートインデューサー2 受容体由来のポ
リペプチドまたはその抗原性断片を対象に投与することにより、異なる生物に関
係する他の疾患状態に対する保護免疫を付与することができる。例えば、V.chol
eraeから単離されたLuxPタンパク質に対して開発されたワクチンは、異なる種に
よって発現されたLuxPホモログと交差反応する能力を持つだろう。したがって本
発明の方法は、病原体関連疾患状態の処置に使用することができる。
【０１０４】 さらに本発明は、細胞の代謝、増殖または回復を促進するのに有効な濃度のオ
ートインデューサー2 類似体を細菌の培養物に添加することによって抗生物質ま
たはビルレンス因子などの細菌産物の産生を促進する方法も提供する。例えば、
抗生物質産生細菌は通例、対数増殖期のピーク近くでしか抗生物質を産生しない
。そのような細菌の培養物にオートインデューサー2 類似体を添加することは、
増殖初期に抗生物質産生を誘導する方法かつ/ または抗生物質産生量を増加させ
る方法になる。
【０１０５】 さらに本発明は、オートインデューサー2 を分解するまたはオートインデュー
サー2 の合成を阻害する因子を同定する方法も提供する。天然オートインデュー
サー2 の濃度は、細菌細胞増殖の対数期初期に最大に達し、その後、対数期後期
および定常期では減少する。これらのデータは、細菌増殖の特定の時点に、オー
トインデューサー2 を分解する機構が存在することを示している。本発明は、天
然オートインデューサー2 のレベルを制御する機構の同定を可能にする。例えば
、部分精製した細菌抽出物を単離したオートインデューサー2 に対してアッセイ
して、オートインデューサー2 を分解する画分を同定することができる。
【０１０６】 オートインデューサー2 類似体は、それらが調節する他の標的のスクリーニン
グにも使用することができる。任意の細菌種からクローン化プロモーター融合ラ
イブラリーを作製し、これらのライブラリーを使って、オートインデューサー2
類似体の存在下と不在下でのレポーター活性の相違についてスクリーニングする
だけで、シグナル伝達因子による影響を受ける遺伝子を同定することができる。
【０１０７】 シグナル伝達因子生合成に関与するタンパク質をコードする核酸の説明 出願人らは、V.harveyi 、S.typhimurium およびE.coliにおけるオートインデ
ューサー産生を担う新規タンパク質ファミリーをコードする遺伝子をクローン化
し、特徴づけた。このオートインデューサー産生遺伝子ファミリーのメンバーを
luxS、具体的にはE.coli、V.harveyi 、S.typhimurium およびE.coliについてそ
れぞれluxSV.h.、luxSS.t.およびluxSE.c.と名付け、それらの配列をそれぞれ配
列番号1 、配列番号2 ならびに配列番号3 および4 に示す（配列は5'から3'の方
向に記載されている）。対応するアミノ酸配列を配列番号10、配列番号11および
配列番号12にそれぞれ示す（図12にも記載する）。配列番号1 および2 は完全長
クローンを構成すると考えられるが、配列番号3 および配列番号4 は完全長クロ
ーンではない。
【０１０８】 本発明は、本明細書に記載のluxSコードタンパク質の配列、構造および機能的
特性を持つ、任意の細菌種由来のluxS遺伝子およびそれらがコードする酵素を包
含する。実施例3 で述べるように、相同な核酸配列は様々な細菌種に同定された
が、それらがluxS遺伝子であることは今まで認識されたことがなかった。他の細
菌種に由来するluxSヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を配列番号5 〜9 およ
び配列番号13〜17に示すが、これらにはHaemophilus influenzae、Helicobacter
pylori 、Bacillus subtilis 、Borrelia burgfdorferi およびVibrio cholera
e 由来の配列が含まれる。
【０１０９】 配列番号1 〜9 の変異体および天然の突然変異体はVibrio、Escherichia およ
びSalmonellaの様々な種または株に存在すると思われる（実際、E.coli DH5α株
はこの遺伝子の非機能的突然変異体を保有している）。そのような変異体はヌク
レオチド配列およびアミノ酸配列が異なると予想されるので、本発明は、コード
領域が、それぞれ配列番号1 〜9 に記載の（そして好ましくは配列番号1 〜9 の
コード領域を特に含む）ヌクレオチド配列および配列番号10〜17のアミノ酸配列
に対して、少なくとも約50〜60％の（好ましくは60〜80％の、最も好ましくは80
％を越える）配列ホモロジーを持つ、単離されたluxS核酸およびコードされるタ
ンパク質を提供する。これらのタンパク質およびそれらをコードする核酸には天
然の配列変異が存在すると思われるので、約40〜50％までの配列変異が認められ
てもなお本発明のLuxSコードタンパク質に特有な性質が保たれると予想される。
このような予想の理由は、一つには遺伝コードの縮重であり、また一つには、タ
ンパク質の性質をほとんど変化させない保存的アミノ酸配列変異の進化的成功が
知られていることである。したがってこのような変異体は互いに実質的に同じで
あると考えられ、本発明の範囲に包含される。
【０１１０】 ここで同定されたluxS遺伝子は、アシル- ホモセリンラクトンオートインデュ
ーサー類の産生に関与することが知られている他の遺伝子（luxI様（Fuqua ら,J
.Bacteriol.176,269-275,1994)、luxLM-ainS様（Bassler ら,1993,前掲；Gilson
ら,J.Bacteriol.177,6946-6951,1995 ））に対してホモロジーを持たない。細菌
ゲノムのデータベース解析を行うと、表1 に示すように、他の多くの細菌種がV.
harveyi 、S.typhimurium およびE.coli由来のluxSに相同なゲノムを持つことが
わかる。
【０１１１】
【表１】 V.harveyi 、S.typhimurium およびE.coliのluxSに突然変異を誘発すると、三
種の細菌全てにおいて、シグナル伝達分子が産生されなくなる。S.typhimurium
は、E.coli O157:H7 luxS E.c.遺伝子またはV.harveyi BB120 luxSV.h.遺伝子の
導入によって相補されて、シグナル伝達分子の完全な産生が回復する。これらの
結果から、E.coliおよびV.harveyi LuxSタンパク質はどちらもS.typhimurium の
細胞成分として機能してシグナル伝達分子を産生できることがわかる。E.coli O
157:H7 luxS E.c.またはV.harveyi BB120 luxSV.h.遺伝子の導入により、E.coli
DH5αは部分的に相補されて、天然のオートインデューサー2 を産生した。
【０１１２】 病原性は定数感知と関係している。病原性株と非病原性株の相違は、天然オー
トインデューサー2 の産生にある。例えば、E.coli O157:H7株はグルコースの有
無にかかわらず天然オートインデューサー2 を産生するが、E.coli K-12 株は、
好ましい炭素源の不在下では天然オートインデューサー2 を産生しない。さらに
、試験したE.coli O157 株は全て、非病原性E.coli株よりも高いシグナル伝達活
性を産生する。同様に、病原性S.typhimurium 14028 が産生するシグナル伝達活
性は、S.typhimurium LT2 よりもかなり高い。
【０１１３】 luxS核酸、コードされているタンパク質、および免疫特異的抗体の製造 核酸 ヌクレオチド配列情報、例えば配列番号1 〜9 のDNA などは、オリゴヌクレオ
チド合成による本発明の単離された核酸分子の製造を可能にする。合成オリゴヌ
クレオチドは、Applied Biosystems 38A DNAシンセサイザーまたは類似の装置
で使用されるホスホロアミダイト法によって製造することができる。得られたコ
ンストラクトは当技術分野で知られる方法、例えば高速液体クロマトグラフィー
（HPLC）などで精製することができる。現在のオリゴヌクレオチド合成法には固
有のサイズ制限があるので、長い二本鎖ポリヌクレオチド、例えば本発明のDNA
分子などは、段階的に合成しなければならない。そのような長い二本鎖分子は、
適当な相補性を持ついくつかの小さいセグメントとして合成することができる。
こうして製造された相補セグメントは、各セグメントが隣接セグメントの付着に
適した付着末端を持つように、アニールさせることができる。隣接セグメントは
付着末端をDNA リガーゼの存在下でアニールさせることによって連結することが
でき、よって1.8kb の二本鎖分子全体が構築される。このようにして構築された
合成DNA 分子は、次に適当なベクターにクローニングし、増幅することができる
。
【０１１４】 luxS核酸は、適当な生物学的供給源から既知の方法を使って単離することもで
きる。好ましい一態様として、ゲノムクローンをS.typhimurium もしくはE.coli
ゲノムのコスミド発現ライブラリーからゲノムクローンを単離するか、または他
の細菌ゲノムのコスミドライブラリーからゲノムクローンを単離する。
【０１１５】 配列番号1 〜9 のいずれかのタンパク質コード領域に対して適当なレベルの配
列ホモロジーを持つ核酸は、ハイブリダイゼーションおよび適当なストリンジェ
ンシーの洗浄条件の使用によって同定することができる。例えば、ハイブリダイ
ゼーションは、Sambrookらの方法により、5 ×SSC 、5 ×デンハート試薬、1.0
％SDS 、100 g/ml変性サケ精子フラグメントDNA 、0.05％ピロリン酸ナトリウム
および50％までのホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を使って行う
ことができる。37〜42℃で少なくとも6 時間ハイブリダイゼーションを行った後
、フィルターを以下のように洗浄する：（1 ）2 ×SSC および1 ％SDS 中、室温
で5 分；（2 ）2 ×SSC および0.1 ％SDS 中、室温で15分；（3 ）1 ×SSC およ
び1 ％SDS 中、37℃で30分〜1 時間；（4 ）1 ×SSC および1 ％SDS 中、溶液を
30分ごとに交換しながら、42〜65℃で2 時間。
【０１１６】 luxS核酸は、公開データベースで興味ある細菌ゲノム中のluxS配列を検索する
ことによって見いだし、その配列からPCR プライマーを設計し、遺伝子を染色体
から直接増幅し、そのPCR 産物をクローニングすることもできる。もう一つの選
択肢として、ある細菌ゲノムの完全な配列を利用できない場合は、本発明に記載
の配列または他の任意のluxS配列を使って縮重オリゴヌクレオチドを設計し、PC
R 増幅および染色体からのluxSのクローニングを行ってもよい。
【０１１７】 本発明の核酸は、任意の適当なクローニングベクターにDNA として維持するこ
とができる。好ましい態様として、適当なE.coli宿主細胞で増殖するpBluescrip
t （Stratagene（カリフォルニア州ラホーヤ））などのプラスミドクローニング
/ 発現ベクター中に、クローンを維持する。
【０１１８】 本発明のluxS核酸にはDNA 、RNA およびその断片が包含され、それらは一本鎖
でも二本鎖でもよい。したがって本発明は、本発明の核酸分子の少なくとも1 つ
の配列（例えば配列番号1 、2 または3 のDNA の選択されたセグメント）とハイ
ブリダイズすることができる配列を持つオリゴヌクレオチド（DNA またはRNA の
センス鎖またはアンチセンス鎖）を提供する。このようなオリゴヌクレオチドは
、luxS遺伝子または転写物の検出にプローブとして役立つ。
【０１１９】 タンパク質および抗体 本発明の完全長luxS遺伝子産物は、既知の方法に従って様々な形で製造するこ
とができる。タンパク質は、適当な供給源、例えばS.typhimurium 、E.coliまた
はV.harveyi などの培養細菌から精製することができる。
【０１２０】 完全長luxS核酸を利用することができる場合は、コードされているタンパク質
を、当技術分野で知られるインビトロ発現法によって製造することができる。好
ましい態様として、適当な発現系での発現によって、酵素を製造することができ
る。例えば、DNA 分子（配列番号1 または2 のDNA など）の一部または全部を、
E.coliなどの細菌細胞またはSaccharomyces cerevisiae（サッカロミセス・セレ
ビシェ）もしくは他の酵母などの真核細胞での発現に適したプラスミドベクター
に挿入することができる。かかるベクターは、前記宿主細胞における前記DNA の
発現に必要な調節要素を、前記宿主細胞における前記DNA の発現が可能になるよ
うな位置に含む。発現に必要なかかる調節要素としてはプロモーター配列、転写
開始配列、そして所望によりエンハンサー配列が挙げられる。
【０１２１】 組換え原核生物系または組換え真核生物系でのluxS遺伝子発現によって製造さ
れたタンパク質は、当技術分野で知られる方法によって精製することができる。
好ましい一態様として、市販の発現/ 分泌系を使用することにより、組換えタン
パク質を発現させた後、宿主細胞から分泌させて、周囲の培地から容易に精製す
ることができる。発現/ 分泌ベクターを使用しない場合は、代替方法として、ア
フィニティー分離により、例えば組換えタンパク質に特異的に結合する抗体との
免疫学的相互作用などによって、組換えタンパク質を精製する。このような方法
は、当業者一般に使用されている。
【０１２２】 上記の方法の一つによって製造された、本発明のluxS遺伝子がコードするタン
パク質は、標準的手法で分析することができる。例えば本タンパク質は、既知の
方法により、アミノ酸配列分析にかけることができる。酵素の安定性および生物
学的活性は、標準的方法によって、例えば様々な条件でシグナル伝達分子の産生
を触媒するタンパク質の能力によって決定することができる。
【０１２３】 本発明は、luxSがコードする本発明のタンパク質に免疫特異的に結合する能力
を持つ抗体も提供する。
【０１２４】 luxS核酸、コードされているタンパク質および免疫特異的抗体の用途 luxS核酸またはその断片は、（1 ）インサイチューハイブリダイゼーション、
（2 ）サザンハイブリダイゼーション、（3 ）ノーザンハイブリダイゼーション
、および（4 ）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）などの様々な増幅反応において、
luxS遺伝子のプローブとして使用することができる。またこれらは、他の細菌由
来の類縁遺伝子を同定するためのプローブとして使用することもできる。
【０１２５】 さらにluxS核酸は、実質的に純粋なコードされているタンパク質または選択さ
れたその一部を大量に製造するためにも使用できる。さらに、発現ベクターに挿
入されたクローン化遺伝子は、選択した任意の細菌種由来のシグナル伝達分子そ
のものをE.coli DH5αなどの組換え宿主で大量に製造するためにも使用すること
ができる。特定のluxS遺伝子をクローニングし、コードされているタンパク質を
大量に製造することにより、特定のオートインデューサーを大量に製造すること
が可能になる。これは、異なる種に由来するオートインデューサーの構造に相違
があるとすれば、その相違を決定するのにとりわけ役立つだろう。もう一つの選
択肢として、興味ある種に由来するシグナル伝達分子を、発現ベクター中のクロ
ーン化遺伝子を利用して大量に製造し、それを、ペトリプレートアッセイでの潜
在的標的のライブラリースクリーニングに使用することもできるだろう。
【０１２６】 精製されたluxS遺伝子産物またはその断片は抗体の産生に使用することができ
、この抗体は、培養細胞中の当該タンパク質の高感度検出試薬として役立つだろ
う。組換え技術により、選択したluxSコードタンパク質の一部または全部を含む
融合タンパク質を発現させることができる。完全長タンパク質またはそのタンパ
ク質の断片を効果的に使って、そのタンパク質の様々なエピトープに特異的な抗
体のアレイを作製し、よってそのタンパク質の検出感度をさらに向上させること
もできる。LuxSタンパク質の他の用途として、過剰産生によって結晶化に十分な
量を製造することが挙げられる。LuxSタンパク質の結晶構造に関する知見により
、天然オートインデューサー2 を生成するLuxS活性部位、したがってオートイン
デューサー2 類似体、LuxS阻害剤のコンピューター援用設計および合理的薬物設
計に利用することができるLuxS活性部位を決定することが可能になるだろう。
【０１２７】 LuxSコードタンパク質に特異的な抗体は、当該タンパク質を検出および定量す
るために設計された様々なアッセイに使用することができる。そのようなアッセ
イには、例えば（1 ）フローサイトメトリー解析、（2 ）細胞または組織におけ
るLuxSタンパク質の免疫化学的位置特定、ならびに（3 ）様々な細胞および組織
から得た抽出物の免疫ブロット解析（例えばドットブロット、ウェスタンブロッ
ト）などがあるが、これらに限るわけではない。また上述のように、抗体はタン
パク質の精製（例えばアフィニティーカラム精製、免疫沈降）にも利用すること
ができる。
【０１２８】 Vibrio harveyiスクリーニング株 本発明は、定数感知経路の阻害剤を同定するための、MM32というV.harveyi の
luxN- およびluxS- 株を提供する。この新しい株はluxN- （すなわちセンサー1-
）なので、AI-1はその増殖能または発光能に影響を及ぼさない。さらにMM32はAI
-2を産生することができないので、外因性AI-2またはその類似体の添加により、
AI-2の阻害剤を迅速に同定することができる。
【０１２９】 Lux 遺伝子L もしくはM またはLux 遺伝子S もしくはQ に個別の突然変異を持
つV.harveyi 株は、それぞれオートインデューサー1 またはオートインデューサ
ー2 を合成または検出する能力を欠く。センサー1-, センサー2+（LuxN-,LuxQ+
）であるBB170 株を使用することにより、様々な細菌でオートインデューサー2
を検出することができる。細胞密度を増加させた時の野生型、LuxN- およびLuxQ
- 表現型の光放射応答を図14に示す。
【０１３０】 上記の株は、キットの調製に理想的である。このようなキットは、1 または複
数の容器、例えばバイアル、チューブなどを受けるように区画化された保持具を
含み、各容器には本方法で使用される個別の要素の一つを含めることができる。
容器にはオートインデューサーの存在を検出する能力を持つ細菌株を含めること
ができる。この細菌株は、好ましくは、オートインデューサー2 の存在下でシグ
ナルを発する能力を持つ。より好ましくは、望ましい株は、AI-1を検出する能力
を欠き（センサー1-）、AI-2を合成する能力を欠く。したがって、このキットに
は、オートインデューサー2 ならびにオートインデューサー2 の阻害剤および定
数感知経路の同定用として、MM32と呼ばれるV.harveyi のluxN- およびluxS- 株
を含めることができる。
【０１３１】 細菌バイオマーカーの検出方法 本発明は、オートインデューサー2 類似体を使って細菌中の細菌バイオマーカ
ーを同定し、その発現を調節する方法を提供する。この方法は、周囲環境のオー
トインデューサー濃度の上昇に応答して抗原性決定基または他のバイオマーカー
を発現させると考えられる病原性細菌のバイオマーカーの同定にとりわけ有用で
ある。したがって本発明は、細菌をオートインデューサー2 類似体に曝露し、標
識核酸または他の生体分子（例えば抗体）を使ってバイオマーカーの存在に関す
るアッセイを行うことにより、かかるバイオマーカーを同定する方法を提供する
。
【０１３２】 この方法は、例えば感染症を検出するためのスクリーニングに使用することが
できる。また、本発明の方法を使って、オートインデューサーとの接触後の細菌
細胞における差次的遺伝子発現を、異なる細胞における遺伝子の発現を比較する
ことによって、解析することもできる。
【０１３３】 上記の物質は、キットの調製に理想的である。このようなキットは、1 または
複数の容器、例えばバイアル、チューブなどを受けるように区画化された保持具
を含み、各容器には本方法で使用される個別の要素の一つを含めることができる
。本発明のキットには、単離されたオートインデューサー2 を含む第1 容器を含
めることができる。単離されたオートインデューサー2 は、標的細菌におけるバ
イオーマーカーの発現を調節するために使用することができる。例えば、オート
インデューサー2 を使って、特定のバイオマーカーの発現を誘導し、それをプロ
ーブによって同定することができる。したがって本キットには、検出可能に標識
することができるプローブを含む第2 容器を含めることができる。また本キット
には、ラベル（酵素ラベル、蛍光ラベルまたは放射性核種ラベルなど）に結合し
たビオチン結合タンパク質（例えばアビジンまたはストレプトアビジン）などの
レポーターを含む第3 容器を含めてもよい。他のレポーターおよびラベルも、当
技術分野ではよく知られている。例えば、本発明のキットには、本明細書に記載
する核酸ハイブリダイゼーション解析を実施するのに必要な試薬類、または標的
に結合する抗体の検出に必要な試薬類を含めることができる。
【０１３４】 バイオフィルム形成の調節 細菌は固体表面に付着して、バイオフィルムと呼ばれる粘滑な被膜を形成する
ことができる。この被膜は、エキソポリマー（通例、多糖類）および他の生体高
分子の高度に水和されたマトリックスである。コロニー形成固着細菌に関するバ
イオフィルム型の存在様式は、多くの環境でバイオマスのかなりの部分を占める
。時には、バイオフィルムに関連する細菌形態の方がプランクトン様（自由遊泳
性）の細菌形態より数桁多い場合もある。プランクトン様の存在から表面に固着
した状態での増殖への移行は、栄養素欠乏状態または高オスモル濃度状態での長
期間増殖を含む多くの環境因子に応答して起こる。バイオフィルムは、一つの細
菌種からなる場合も複数の細菌種を含む場合もあり、これらは組織化して、群落
全体に利益を与える高次構造（例えば水/ 栄養素チャネル、細胞柱、微小コロニ
ーの斑点を覆われた密な単層など）を形成することができる。バイオフィルムコ
ロニーは、バイオフィルムの異なる領域における空間的に異なる遺伝子発現など
、協調的代謝応答を示す。バイオフィルムにより、細菌は、過酷な環境でも生き
残ることができる。
【０１３５】 多くの持続性および慢性細菌感染症の根源には、細菌バイオフィルムがある。
したがって、バイオフィルム関連細菌のコロニー形成の予防およびバイオフィル
ム関連細菌の根絶は、現代医学の一大目標である。単細胞とは異なり、バイオフ
ィルム形成は、ほとんどの殺菌処置への曝露に耐えることができる。バイオフィ
ルムでは、細胞外マトリックス（糖衣）が、例えば界面活性剤および抗生物質な
どの殺菌剤から微生物を保護し隔離する障壁となる。ある研究では、バイオフィ
ルム培養物は、同じ細菌のプランクトン様培養物を根絶するのに必要な用量の20
倍を超える抗生物質に耐えることができた。これは、内在する微生物を、例えば
抗体および食細胞による抗原プロセシングなどの宿主防御機構からも遮蔽する。
【０１３６】 バイオフィルム関連感染症は、数多くの疾患状態に関連づけられている。前立
腺炎、骨髄炎、敗血症性関節炎および嚢胞性線維症などがその例である。これら
の疾患の一部（例えば敗血症性関節炎）では、バイオフィルムが宿主の表面構造
の破壊を引き起しうる。これらの状態の多くでは、バイオフィルムが、慢性およ
び再発性感染症（敗血症）をもたらしうる細菌のレザバーとなる。バイオフィル
ム形成は、人工骨、心臓弁およびペースメーカーなどの生体インプラントの合併
症でもありうる。バイオフィルム形成はインプラントの機能を損ない、重篤な骨
または関節感染症を引き起しうる。
【０１３７】 定数感知はバイオフィルム形成に強い影響を持つので、定数感知遮断剤はバイ
オフィルムの形成を妨害し、表面に既に形成されているバイオフィルムの範囲を
かなり減少させることができる。したがって、オートインデューサー2 （AI-2）
の構造、および構造I 、II、III またはIVなどのAI-2の類似体の構造を明らかに
することで、本発明は、バイオフィルム形成を調節することによる細菌感染症の
新しい阻害方法を提供する。
【０１３８】 さらに本発明は、AI-2が細菌のバイオフィルム形成を調節することを示すデー
タも提示する。オートインデューサー1 活性およびオートインデューサー2 活性
を欠くV.harveyi のヌル突然変異株（AI-1-,AI-2- ）は、野生型、AI-1-,AI-2+
およびAI-1+,AI-2-V.harveyiとは異なり、バイオフィルムを生成しない。AI-1、
AI-2またはSalmonella AI-2 を培地に添加すると、（AI-1-,AI-2- ）V.harveyi
はバイオフィルムを生成できるようになる。したがって本発明は、細菌細胞をオ
ートインデューサー2 またはオートインデューサー2 類似体と接触させることに
よってバイオフィルム形成を調節する方法を提供する。
【０１３９】 さらに、定数感知遮断剤がバイオフィルム形成を阻害するという予想外の発見
から、他の系（例えばプロテアーゼ産生）で定数感知遮断を示す化合物も、バイ
オフィルム形成を阻害することが示唆される。
【０１４０】 もう一つの態様として本発明は、表面からバイオフィルムを除去する方法であ
って、当該表面を本発明の化合物で処理することを含む方法を提供する。この表
面は、好ましくは、バイオフィルムを除去するのが特に困難な水性液体分配シス
テム、例えば飲料水分配システムまたは歯科用空気- 水システムに接続された供
給ラインなどの内側である。化合物は好ましくは単独で、または他の物質、例え
ば従来の洗剤もしくは界面活性剤などと一緒に、当該表面に適用される。
【０１４１】 本発明のさらなる態様は、本発明の化合物を殺菌剤と共に含む抗菌組成物であ
る。この抗菌組成物では、本発明の化合物はバイオフィルムの除去を助け、殺菌
剤は細菌を死滅させる。本抗菌組成物は、表面に噴霧および/ または塗布するた
めの溶液または懸濁液の形態であることが好ましい。
【０１４２】 さらにもう一つの側面として、本発明は、物品上でのバイオフィルム形成を阻
害および/ または防止するために、本発明の化合物をコーティングおよび/ また
は含浸した物品を提供する。この物品は、材料全体に本発明の化合物が分布した
プラスチックでできていることが好ましい。
【０１４３】 相乗的抗生組成物 さらなる一態様として本発明は、抗生物質と、微生物の定数感知経路の阻害剤
またはその医薬的に許容できる塩と、1 または複数の医薬的に許容できる担体、
佐剤または賦形剤とを含む相乗的抗生組成物を提供する。
【０１４４】 本発明の相乗的抗生組成物は、定数感知機構を持つ微生物によって起こる温血
動物の感染症を処置するために使用することができ、その場合は治療有効量の本
発明相乗的抗生組成物を当該動物に投与する。
【０１４５】 驚くべきことに、本発明者らは、1 経路または複数経路の定数感知経路に対す
る阻害剤を、定数感知機構を持つ微生物に対して有効な抗生物質と併用すること
により、治療効果を得るために通常必要な抗生物質の量が減少することを見いだ
した。また、この併用によって抗生物質の治療有効量が低下するため、通常は無
効であると考えられていた微生物に対して、有効かつ安全と考えられる濃度で薬
効を持つようになる場合もある。したがって本発明のもう一つの側面は、抗生物
質と微生物の定数感知経路の阻害剤とを含む相乗的抗生組成物に関する。「相乗
的」とは、ここでは、定数感知阻害剤の併用により、温血動物中の処置対象微生
物を殺滅するのに必要な抗生物質量（殺菌剤の場合）または処置対象微生物の増
殖を停止させるのに必要な抗生物質量（静菌剤の場合）が低下すること、または
定数感知阻害剤の併用により、動物中の通常は有効でない微生物に対して抗生物
質が有効になることを意味する。
【０１４６】 「微生物の定数感知経路の阻害剤」とは、ここでは、オートインデューサーの
産生またはオートインデューサーに対する応答のいずれかを阻害することができ
る阻害剤を意味する。かかる阻害剤はAI-1、AI-2およびペプチド媒介定数感知経
路の1 または複数を阻害することができる。例えば、AI-2経路（図13に図示）の
阻害剤は、V.harveyi のLuxP、LuxSおよびLuxQ遺伝子ならびに他の種におけるそ
れらのホモログに由来するタンパク質に結合するか、またはその産生を阻害する
分子である。AI-1、AI-2およびペプチド媒介感知経路の阻害剤を検出するための
アッセイをそれぞれ実施例6 、4 および7 に記載する。AI-2経路の場合は、AI-1
の効果に対する感受性を欠くV.harveyi 突然変異株の生物発光を阻害剤が阻害す
るという事実によって、阻害剤を見いだす。AI-1経路の阻害剤も、V.fischeriの
生物発光を阻害するというその能力によって測定される。最後に、ペプチド媒介
定数感知経路の阻害剤は、Staphylococcus aureus がコンフルエントの状態まで
増殖したこの細菌のコロニーとして産生するビルレンス因子 -毒素量の産生を減
少させる能力によって検出される。
【０１４７】 AI-1定数感知経路の阻害剤の例は、N-アシル側鎖が修飾されているN-アシル-L
- ホモセリンラクトン類の類似体、具体的には、構造V ：
【化３１】 の修飾N-ブチリル-L- ホモセリンラクトン化合物、または構造VI：
【化３２】 の修飾N-(3- オキソドデカノイル)-L-ホモセリンラクトン化合物 ［式中、R1〜R22 は、C1〜C4アルキル、水素原子、ヒドロキシ、アミノ、および
チオールからなる群より独立して選択され、 R22 〜R23 は独立して酸素または硫黄原子であり、かつ、 R24 〜R28 は独立して水素またはハロゲン原子である］ である。これらの分子はDaviesらの国際公開第98/58075号パンフレット（1998年
12月23日公開）に記載されている。
【０１４８】 AI-1定数感知経路の阻害剤の他の例は、構造VII ：
【化３３】 のハロゲン化フラノン類である。
【０１４９】 これらのハロゲン化フラノン類は、底生海洋大型藻類D.pulchra （デリセア・
プルクラ）によって産生される。このような阻害剤の具体例の一つは、4-ブロモ
-5-(ブロモメチレン)-3-(1- ヒドロキシブチル)-2-(5H)- フラノンである。これ
らの分子はManefield ら,Microbiology,145,283-291(1999) に記載されている。
【０１５０】 AI-2媒介定数感知経路の阻害剤の例としては構造I 、II、III およびIVの化合
物が挙げられる：
【化３４】 ［式中、C2は、水素、ヒドロキシル、C1-5アルキル、C2-5アルケニル、C2-5アル
カノイル、C2-5アルカノイルオキシ、ヘテロアリールから選択される少なくとも
1 つの置換基にさらに結合しているか、または酸素原子もしくはC3と共に二重結
合を形成し、C3は、水素、ヒドロキシル、C1-5アルキル、C2-5アルケニル、C2-5 アルカノイル、C2-5アルカノイルオキシから選択される少なくとも1 つの置換基
にさらに結合しているか、または酸素原子もしくはC2と共に二重結合を形成し、
C4は、水素、C1-5アルキル、C2-5アルカノイル、C2-5アルカノイルオキシから選
択される少なくとも1 つの置換基にさらに結合しているか、または酸素原子もし
くはC5と共に二重結合を形成し、C5は、水素、C1-5アルキル、C2-5アルカノイル
、C2-5アルカノイルオキシから選択される少なくとも1 つの置換基にさらに結合
しているか、または酸素原子もしくはC4と共に二重結合を形成し、C2、C3、C4ま
たはC5のうち少なくとも1 つは、ヒドロキシル、C1-5アルキル、C2-5アルケニル
、C2-5アルカノイル、およびヘテロアリールから選択される置換基に結合してお
り、構造I の環内に存在する炭素- 炭素二重結合は多くとも1 つである］、
【化３５】 ［式中、R はC1-5アルコキシル基である］、
【化３６】 ［式中、X は酸素、硫黄または窒素原子であり、R1a は水素、ヒドロキシ、アル
キル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ、チオ、またはアリールであり、
R1b は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ、
メルカプト、チオ、またはアリールであるか、またはR1a およびR1b はC2に結合
した同じ原子を含んでC2との二重結合を形成することができ、R2は水素、アルキ
ル、またはハロゲンであり、R3は水素、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシ
ル、アミノ、チオ、またはアリールであり、X が窒素である場合、R4は水素また
はアルキルであり、X が酸素または硫黄である場合、R4は存在せず、C4およびC5 はさらに二重結合によって連結されていてもよい］、
【化３７】 ［式中、X は酸素、硫黄または窒素であり、R7a は水素、ヒドロキシ、アルキル
、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ、チオ、もしくはアリールであり、R7 b は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ、メ
ルカプト、チオ、もしくはアリールであるか、またはR7a およびR7b は全体とし
て二重結合を形成することができ、R6は水素、アルキル、またはハロゲンであり
、R7は水素、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ、チオ、または
アリールであり、X が窒素である場合、R8は水素であり、X が酸素または硫黄で
ある場合、R8は存在せず、C4およびC5はさらに二重結合によって連結されていて
もよい］。
【０１５１】 ペプチド媒介定数感知分子の阻害剤の例としては、Staphylococcus aureus ag
r （アクセサリー遺伝子調節因子）システムの有効な阻害剤であるStaphylococc
us epidermidis（表皮ブドウ球菌）の化学修飾フェロモンが挙げられる。これら
の阻害剤には構造VIIIおよびIXの分子が含まれる：
【化３８】 （cyclo-SVCASYF ） （cyclo-DSV(DAPA)ASYF ）。
【０１５２】 これらの修飾フェロモン類は、Ottoら,FEBS Letters,450,257-262(1999) に記
載のS.aureus株における -毒素の産生を阻害するのに、特に有効だった。
【０１５３】 ペプチド媒介定数感知の他の阻害剤には、構造： (cyclo)-YSTCDFIM （X ） (cyclo)-GVNACSSLF （XI） (cyclo)-GVNASSSLF （XII ）または (cyclo)-GVNA(DAPA)SSLF （XIII） の化合物がある。これら4 つの構造において、C 末端カルボニルは、1 ）システ
イン残基の硫黄原子とチオラクトンを形成するか（YSTCDFIMおよびGVNACSSLF ）
、2 ）第1 セリン残基の酸素原子とラクトン基を形成するか（GVNASSSLF ）、3
）ジアミノプロピオン酸（DAPA）残基のアミノ基とアミド結合を形成する（GVNA
(DAPA)SSLF）。これらの分子の合成およびこれらの分子の活性は、Mayvilleら,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA,96,1218-1223(1999)に記載されている。
【０１５４】 本相乗的抗生組成物のさらなる態様として、阻害剤がAI-1定数感知経路を阻害
するものが挙げられる。この態様のうち、さらに具体的な態様として、上記構造
VII のハロゲン化2(5H)-フラノンであるもの、または阻害剤が上記構造VIIIの修
飾N-ブチリル-L- ホモセリンラクトンもしくは上記構造IXの修飾N-(3- オキソド
デカノイル)-L-ホモセリンラクトンであるものが挙げられる。
【０１５５】 もう一つの態様は、相乗的抗生組成物の阻害剤がAI-2定数感知経路を阻害する
阻害剤であるもの、さらには上記構造III またはIVで表される阻害剤であるもの
である。さらなる一態様では阻害剤が2-エチル-4- ヒドロキシ-5- メチル-3(2H)
- フラノンである。AI-2阻害剤を含む組成物のもう一群の態様は、1 ）抗生物質
がペニシリン類であるもの、さらにはそのペニシリン類がアンピシリンであるも
の、2 ）抗生物質がキノリン類であるもの、さらにはそのキノリン類がシプロフ
ロキサシンであるもの、3 ）抗生物質がバンコマイシンであるもの、および4 ）
抗生物質がスルホンアミド類であるもの、さらにはそのスルホンアミド類がスル
フィソキサゾールであるものである。
【０１５６】 阻害剤がペプチド媒介定数感知経路を阻害するものである相乗抗生組成物は、
本相乗的組成物のもう一つの態様を構成する。この態様には、上記構造（VIII）
および（IX）の阻害剤を含むもの、あるいは上記構造（X ）〜（XIII）の阻害剤
を含むものが包含される。
【０１５７】 本相乗的抗生化合物のさらにもう一群の態様は、1 ）抗生物質がペニシリン類
であるもの、さらにはそのペニシリン類がアンピシリンであるもの、2 ）抗生物
質がキノリン類であるもの、さらにはそのキノリン類がシプロフロキサシンであ
るもの、3 ）抗生物質がバンコマイシンであるもの、および4 ）抗生物質がスル
ホンアミド類であるもの、さらにはそのスルホンアミド類がスルフィソキサゾー
ルであるものである。
【０１５８】 本医薬組成物のさらなる態様は、医薬組成物中の阻害剤および抗生物質の同一
性によって決定すると、本発明の相乗的抗生組成物について上述した態様に準じ
る。
【０１５９】 本発明のさらにもう一つの側面は、定数感知機構を持つ微生物によって引き起
される温血動物の感染症を処置する方法であって、前記動物に、治療有効量の本
発明の相乗的抗生組成物を投与することを含む方法に関する。本方法で投与され
る抗生物質の量が、仮に阻害化合物が存在しないとした場合に投与される量より
も、通常少なくなることは理解されるだろう。ある微生物による感染症の処置に
通常必要な量は、実施例8 の抗生物質感受性アッセイを使って決定することがで
き、また既知の抗生物質の場合は、編集主幹J.Hardman およびL.Limbard 「Good
man and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics」第9 版、McGr
aw-Hill （ニューヨーク）1996年（特に1027〜1223頁）などの資料を調べること
によっても決定することができる。もちろんこの方法で投与される相乗的抗生組
成物は、本発明の医薬組成物の形態であることができる。また、相乗的抗生化合
物は、下記実施例8 に記載するようなスクリーニングによって、その相乗的抗生
組成物が当該微生物に対して実際に活性を持つことが示されているのであれば、
当該抗生物質のみによる処置には本来不応性であるだろう定数感知経路を持つ微
生物に感染した温血動物にも投与することができる。
【０１６０】 この方法のさらなる態様として、Streptococcus pyogenesが引き起こす温血動
物の感染症を処置する方法、特に投与される阻害剤がAI-2定数感知経路を阻害す
るものである方法が挙げられる。後者の態様のうち、さらなる態様として、抗生
物質がバンコマイシンである方法、抗生物質がキノリン形抗生物質、例えばシプ
ロフロキサシンである方法、または抗生物質がスルホンアミド、例えばスルフィ
ソキサゾールである方法が挙げられる。
【０１６１】 本方法のさらにもう一つの態様として、Staphylococcus aureus が引き起こす
温血動物の感染症を処置する方法、特に阻害剤がAI-2定数感知経路を阻害するも
のである方法が挙げられる。後者の態様のうち、さらなる態様として、抗生物質
がペニシリン類である方法、特に抗生物質がアンピシリンである方法が挙げられ
る。
【０１６２】 医療用デバイス もう一つの態様として、本発明の化合物および相乗的抗生組成物は、医療用デ
バイスでの細菌細胞増殖および/ またはバイオフィルム形成を阻害するために使
用することができる。経皮デバイス（カテーテルなど）および植込み型医療用デ
バイス（例えばペースメーカー、代用血管、ステント、および心臓弁）は一般に
細菌感染巣となる。デバイス表面に付着しコロニー形成するという一部の微生物
の傾向は、このような感染を助長し、デバイスの使用に関係する罹病率および死
亡率を上昇させる。したがって、医師は細菌コロニー形成を受けにくい表面の開
発に大きな関心をもっている。
【０１６３】 本発明の相乗的抗生組成物は、非侵襲的および侵襲的な医学的処置に関係する
医療用デバイスを製造するために使用される基材上での細菌細胞増殖およびバイ
オフィルム形成を阻害するために使用することができる。かかる基材としては、
管、シート、棒、および以下にあげるような多くの医療用デバイスでの使用に適
した形状を持つ物品が挙げられる：代用血管、大動脈グラフト、動脈、静脈また
は血管チューブ、血管ステント、透析膜、チューブまたはコネクター、人工肺チ
ューブまたは人工肺膜、手術器具、限外濾過膜、大動脈内バルーン、ステント、
血液バッグ、カテーテル、縫合糸、軟組織または硬組織プロテーゼ、合成プロテ
ーゼ、人工心臓弁、組織接着剤、心臓ペースメーカーリード、人工臓器、気管内
チューブ、コンタクトレンズまたは眼内レンズなどの眼用レンズ、血液取り扱い
器材、アフェレーシス器材、診断用およびモニタリング用カテーテルおよびセン
サー、バイオセンサー、歯科用デバイス、薬物送達システム、またはあらゆる種
類の体内インプラント。例えば関節鏡視下手術は、通例、手術の侵襲性を最小限
に抑えるような医療用デバイスを使って行われる。そのようなデバイスには、例
えば側頭骨および頭蓋底の限られた空間への唯一のアクセスを喉頭科医に提供す
る超細マイクロ光ファイバー内視鏡がある。もう一つの例として、植え込まれた
ステントの存在に起因する細菌感染症を防止する本発明の組成物を補足したステ
ントを構築することができる。ステントは、気管- 気管支系、胆管肝臓系、食道
腸系、および尿路系を含む組織の管腔の開通を維持するために使用される。Tart
aglia に対する米国特許第5,637,113 号明細書には、外面がポリマーフィルムの
シートで覆われたステントが記載されている。本発明の場合は、前記フィルムに
本発明の化合物または組成物を添加するか、前記フィルムを本発明の化合物また
は組成物でコーティングすることができる。もう一つの選択肢として、ステント
の製造に使用する材料に本発明の組成物を含浸させることもできる。
【０１６４】 医療用デバイスにはさらに、例えば1 または複数の抗体、鎮痛剤、抗凝固剤、
抗炎症性化合物、抗微生物組成物、サイトカイン、薬物、増殖因子、インターフ
ェロン、ホルモン、脂質、脱灰骨または骨形成タンパク質、軟骨誘導因子、オリ
ゴヌクレオチドポリマー、多糖類、ポリペプチド、プロテアーゼ阻害剤、血管収
縮剤または血管拡張剤、ビタミン、ミネラル、安定剤などを補足してもよい。本
明細書にいう「補足」には、本発明の化合物または相乗的抗生組成物を含浸、注
入、コーティング、被覆、積層、浸透、付着または結合した医療用デバイスが包
含される。生体材料を医療用デバイスに固定化する方法は、米国特許第5,925,55
2 号明細書で論じられている。医療用デバイスの表面に抗微生物組成物をコーテ
ィングする方法は、他にも、米国特許第4,895,566 号明細書（pKa が6 未満であ
る負に荷電した基とその負荷電基に結合した陽イオン性抗生物質を持つ医療用デ
バイス基材）、米国特許第4,917,686 号明細書（抗生物質を膨潤剤に溶解し、そ
れを医療用デバイスの表面材料のマトリックスに吸収させる）、米国特許第4,10
7,121 号明細書（イオノゲン性ヒドロゲルで医療用デバイスを構築した後、抗生
物質を吸収またはイオン的に結合させる）、米国特許第5,013,306 号明細書（医
療用デバイスのポリマー表面層に抗生物質を積層する）、米国特許第4,952,419
号明細書（インプラントの表面にシリコーン油の被膜を施した後、そのシリコー
ン被膜保持表面を抗生物質粉末と接触させる）に記載されている。さらに米国特
許第5,902,283 号には、デバイスの露出面に抗微生物剤が浸透してデバイス材料
全体に含浸するように、医療用デバイスを抗微生物剤でコーティングする方法が
開示されている。
【０１６５】 とりわけ外科用インプラント、縫合糸および創傷被覆材などの医療用デバイス
を医薬でコーティングことが望ましいことは、当技術分野では十分な資料によっ
て裏付けられている。そのような被覆デバイスは理論的には、様々な疾患を処置
するための医療的介入部位に医薬または治療薬を局所送達する手段となりうる。
例えば、抗生物質でコーティングされた外科用インプラントまたは縫合糸は、抗
生物質を植込み部位または縫合部位に直接局所送達することになり、よって外科
的介入後の感染症の発症を減少させることができる。したがって本発明の化合物
および相乗的抗生組成物は、組織誘導再生（GTR ）法での植込みに使用される医
療用デバイスを、組織再生部位における感染症を予防または寛解することによっ
て補足することができる。かかるデバイスおよび方法は、現在、侵襲的手術後の
組織再生を加速するために医学分野の技術者によって使用されている。例えば非
吸収性膜または生体吸収性膜を使って、組織の構成および構造マトリックスを形
成する細胞の創傷領域での再増殖を促進することにより、組織再生を加速する。
本発明の化合物および相乗的抗生組成物は、組織再生部位での細菌増殖を阻害す
るために使用することができる。例えば化合物または相乗的抗生組成物を使用し
て、生体再吸収性ポリマー、浸出性溶媒および本発明の化合物または相乗的組成
物を含む組成物を、ヒトまたは他の哺乳動物における歯周組織再生が必要な部位
に、前記組成物がその部位で治療有効量の化合物または相乗的組成物を放出する
ことによって細菌細胞増殖を有効に阻害するように設置することにより、ヒトま
たは下等動物における歯周組織再生を促進することができる。
【０１６６】 さらに、本発明の化合物または組成物を補足した医療用デバイスは、組織工学
のプロセス中に組織増殖を促進するのにも役立つ。「組織工学」とは、身体の組
織および器官を生成、増強または置換するための、合成または天然材料を組み合
わせた生物学的補綴デバイスの生成、設計および製作を意味する。したがって本
発明の化合物または組成物を補足した医療用デバイスには、再生が必要な部位に
植え込むと機能的なヒト組織の再生を誘導する細胞含有デバイスまたは無細胞デ
バイスが包含される。上述のように、生体材料誘導組織再生法を使用することに
より、例えば胃潰瘍またはクローン病の症状を処置するために消化路組織におけ
る細胞増殖を促進することができる。本発明の化合物または相乗的組成物を使用
することにより、創傷部位またはかかる修復を必要とする他の組織で再構成組織
が増殖して三次元構造を形成するのを、その部位での病原性細菌細胞増殖を阻害
することによって促進することができる。化合物または相乗的抗生組成物は、化
合物または相乗的抗生組成物が組織再生中に徐放されるように、植込み時にデバ
イスに含めるか、またはデバイスそのものに化合物または相乗的抗生組成物を含
浸させることができる。
【０１６７】 本発明の化合物または相乗的抗生組成物は、体内患部組織の機能を代償するよ
うに設計された体外または体内ヒト組織含有医療用デバイスに含めることができ
る。このアプローチでは、身体から細胞を単離し、それらを構造マトリックス上
または構造マトリックス内に置き、その新しいシステムを体内に植え込むか、ま
たはそのシステムを体外で使用する。本発明の化合物または相乗的抗生組成物は
、細菌増殖を阻害することによってマトリックスに含まれる組織の増殖を促進す
るために、上記マトリックスに含めることができる。例えば、本発明の化合物ま
たは相乗的抗生組成物は、代用血管での細菌細胞増殖およびバイオフィルム形成
を阻害するために、細胞で裏打ちされた（cell-lined）代用血管に含めることが
できる。本発明は、例えば上皮組織、軟骨および骨、中枢神経系組織、筋、肝臓
、および膵島（インスリン産生）細胞などの生産物における組織修復、組織再生
および組織工学を強化するために使用することができると考えられる。
【０１６８】 具体例の一つは、熱傷および潰瘍の処置に治療法として用いられる代用植皮片
の増殖の促進に本発明を使用することである。熱傷患者は植皮術に起因する感染
症に特にかかりやすい。熱傷患者への移植時に移植片が細菌感染を含まないよう
に、植皮片の組織工学に際して、本発明の化合物または相乗的抗生組成物を含め
ることができる。感染の可能性をさらに最小限に抑えるために、本発明の化合物
または相乗的抗生組成物を移植部位に含めることもできる。したがって本発明は
、組織片の製造および応用における細菌細胞増殖およびバイオフィルム形成を、
有効量の本発明化合物または相乗的抗生組成物を使用することによって阻害する
ことを包含する。
【０１６９】 上記に加えて、または別の態様として、本発明の相乗的抗生組成物を生分解性
担体に組み込んでもよい。例えば、そのような担体は米国特許第5,788,979 号明
細書に記載されている。化合物または組成物の時間制御放出は担体自体の分解ま
たは崩壊に帰することができる。ゆえに、担体がレザバーから持続的に拡散して
徐々に溶解することによって薬物または他の薬剤が分配または放出（すなわち宿
主から解放）されるまでは、薬物または他の薬剤は担体内に捕捉されたままであ
る。このようにした場合、化合物または組成物は全身的に作用するよりは局所的
に作用する傾向を示す。
【０１７０】 さらに、本発明の相乗的抗生組成物を創傷治癒の促進に使用することも考えら
れる。例えば米国特許第6,117,485 号には、対象の負傷組織を処置するための起
泡性組織シーラントが記載されている。このシーラントは本発明の化合物または
組成物を含むように処方することができる。このシーラントは、傷害を受けた組
織、器官または血管からの血液または体液の損失をかなり減少させるまたは防止
するのに役立ち、同時に感染に対する障壁にもなる。
【０１７１】 さらに本発明の相乗的抗生組成物は、個人衛生用の製品またはデバイスの中ま
たは表面での細菌細胞増殖およびバイオフィルム形成を阻害するために使用でき
ると考えられる。セッケン、練り歯磨、デンタルフロス、洗濯洗剤または保湿ロ
ーションは、本発明の化合物または相乗的抗生組成物を含めることが有益と思わ
れる家庭用製品の例である。さらに、かかる化合物または組成物は、歯ブラシ、
舌圧子などといった個人衛生用デバイス、または組織と接触するような他の任意
のデバイスに含めることができる。
【０１７２】 以下の記載は、本発明のこの側面の実施に関わる一般的方法の説明である。具
体的材料を挙げるが、これは単に説明のためであって、本発明を限定しようとす
るものではない。別段の表示がない限り、Sambrookら「Molecular Cloning 」コ
ールドスプリングハーバー研究所（1989）（以下「Sambrookら」という）または
Ausubel ら編「Current Protocols in Molecular Biology」John Wiley & Sons
（1998）（以下「Ausubel ら」という）に記載されているような一般的クローニ
ング法を使用する。
【０１７３】 （実施例） 実施例1 −Escherichia coliおよびSalmonella typhimuriumにおける定数感知 アッセイ条件 V.harveyi レポーター株BB170 （定数感知表現型センサー1 - , センサー2 +
を持つ）は、シグナル伝達システム2 によってのみlux 発現を誘導することがで
きる。V.harveyi BB152 株から調製した無細胞使用済み培養液（これはオートイ
ンデューサー2 類似体を含む）を10％添加すると、発光量をほぼ1000倍増大させ
、図1 ではこの増加を100 ％活性に標準化している。
【０１７４】 E.coli AB1157 株およびS.typhimurium LT2 株をそれぞれLBブロス中または0.
5 ％グルコースを含むLBブロス中で8 時間増殖させ、E.coliまたはS.typhimuriu
m 細胞を増殖培地から除去した。10％無細胞培養液を添加すると、V.harveyi BB
152 からの培養液と同様に、レポーター株BB170 における発光が、最大に誘導さ
れた（図1A）。具体的に述べると、V.harveyi BB152 活性との比較でE.coli AB1
157 は106 ％、S.typhimurium は237 ％だった。
【０１７５】 対照実験として、グルコースを添加しないLB中で増殖させたE.coliおよびS.ty
phimurium はシグナル伝達因子を産生せず、10％の0.5 ％グルコース含有LB培地
を含むブランク溶液も同様だった。グルコース、アミノ酸、cAMP、酢酸、ホモセ
リンラクトン、 -ケトグルタル酸および排泄されることが知られている他のケト
酸は活性を持たなかった。
【０１７６】 同様の実験をV.harveyi レポーター株BB886 （センサー1 + , センサー2 - ）
で行った。V.harveyi BB886 は、シグナル伝達システム2 検出器を介して作用す
るシグナル伝達分子に対する応答に欠損を持つが、その他の点は野生型の株であ
る（Bassler ら,Mol.Microbiol.13:273-286,1994）。図1Bは、V.harveyi BB120
から調製した無細胞使用済み細胞液によって、V.harveyi BB886 が100 ％（標準
化した値）活性化されることを示している。V.harveyi BB120 はシステム1 オー
トインデューサーN-(3- ヒドロキシブタノイル)-L-ホモセリンラクトンを産生す
る（Bassler ら,1993,前掲）。S.typhimurium LT2 およびE.coli AB1157 無細胞
培養液をV.harveyi BB886 株に添加したところ、対照レベルから5 ％および1 ％
の増加が起こった（図1B）。図1Aおよび図1Bの結果を総合すると、E.coliおよび
S.typhimurium によって産生されるシグナル伝達分子は、特異的にV.harveyi シ
グナル伝達システム2 を介して作用し、他の未同定の経路によるのではないこと
がわかる。
【０１７７】 図2 は、シグナル伝達分子の分泌には、生きたE.coli AB1157 およびS.typhim
urium LT2 が必要であることを示している。
【０１７８】 グルコースを含むLB培地でのE.coli AB1157 およびS.typhimurium LT2 の増殖
は、単に何らかの既存の発光誘導阻害剤を除去するだけではない。洗浄したE.co
liおよびS.typhimurium 細胞を発光アッセイに直接加えた。
【０１７９】 0.5 ％グルコースを含むLBで、E.coli AB1157 およびS.typhimurium LT2 を8
時間増殖させ、遠心分離によって細胞を取り除き、細胞ペレットを洗浄し、滅菌
V.harveyi 発光アッセイ培地に再懸濁した。実験の開始時に、E.coli AB1157 ま
たはS.typhimurium LT2 細胞（1 ×106 細胞）を、希釈したV.harveyi BB170 培
養物に添加した。
【０１８０】 洗浄したE.coli AB1157 またはS.typhimurium LT2 細胞の存在は、V.harveyi
BB170 でのLux 発現を完全に誘導した（図2 、各系列の左側のバー）（それぞれ
821 倍および766 倍）。アッセイに添加する前に短波長紫外線で死滅させた同じ
洗浄E.coliまたはS.typhimurium 細胞試料は発光を刺激しなかった（図2 、各株
の右側のバー）。総合すると、これらの結果は、E.coli AB1157 およびS.typhim
urium LT2 細胞が実験中に刺激因子そのものを産生することを示している。
【０１８１】 E.coli DH5αはシグナル伝達活性を産生しない。E.coliおよびSalmonellaの臨
床分離株もシグナル伝達化合物を産生する。Salmonellaの臨床分離株10株と、E.
coli O157 の病原性分離株5 株をアッセイしたところ、全株が活性を産生した。
このシグナルは、細胞外に単純拡散するグルコース代謝の何らかの正常副産物で
あることも考えられた。しかしこれは当てはまらない。なぜなら、本発明者らが
示す通り、E.coli AB1157 およびS.typhimurium LT2 と同じようにグルコース資
化能を持つE.coli DH5αはシグナル伝達活性を産生しないからである。図1Aは、
E.coli AB1157 およびS.typhimurium LT2 とは異なり、0.5 ％グルコースを含む
LB中で8 時間増殖させたE.coli DH5αから調製した無細胞培養液を10％添加して
も、V.harveyi BB170 における光生成は刺激されないことを示している。同様に
、洗浄したE.coli DH5αの生細胞または死細胞を発光アッセイに含めても、V.ha
rveyi BB170 が刺激されて光を生成することはない（図2 ）。E.coli DH5αが活
性を産生できないことは、この高度に馴化した株にはシグナル伝達活性の産生ま
たは搬出に必要な遺伝子または遺伝子群が欠けていることを示している。本発明
者らは、E.coliの他の実験室株もシグナル伝達活性についてアッセイした（表1
）。細胞外シグナルの産生が完全に欠損しているのはE.coli DH5αだけだった。
【０１８２】 V.harveyi 、S.typhimurium およびE.coliの無細胞培養液によるV.harveyi レ
ポーター株BB170 での発光の誘導を示す。無細胞培養液を、記載した通りV.harv
eyi 、S.typhimurium およびE.coliの様々な株から調製し、レポーター株V.harv
eyi BB170 での光生成を刺激を刺激することができるシグナル伝達物質の産生に
ついて調べた。V.harveyi の刺激レベルを100 ％に標準化した。5 時間時点のデ
ータを示す。
【０１８３】
【表２】 グルコースはS.typhimurium LT2 によるシグナル伝達因子の産生および分解を
調節する。グルコースを加えずにLB中で増殖させたS.typhimurium LT2 およびE.
coli AB1157 細胞の無細胞培養液はレポーター株における発光の発現を刺激しな
かったことから、シグナルの生成にはグルコースの代謝が必要であることが示さ
れた。本発明者らは他の炭水化物を試験し、一般にPTS 糖（Postmaら「Escheric
hia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology」F.C.Niehardt編、
米国微生物学会（ワシントン,D.C. ）、1996年の1149〜1174頁参照）の存在下で
増殖させることにより、E.coli AB1157 およびS.typhimurium LT2 はシグナル産
生することができるようになる。試験した糖のなかでは、グルコースでの増殖が
最も高いレベルの活性の合成を誘導した。他の炭素源、例えばTCA 回路中間体お
よびグリセロールでの増殖は、シグナル伝達活性の有意な産生を誘導しなかった
。
【０１８４】 本発明者らは、細胞がシグナルを産生し続けるのに、グルコースの存在が必要
かどうかを調べた。図3 は、制限グルコース濃度（0.1 ％）および非制限グルコ
ース濃度（0.5 ％）を含むLB中で増殖させたS.typhimurium LT2 で得た結果を示
す。図3Aは、グルコースが制限的である場合、S.typhimurium LT2 は指数期中期
（4 時間増殖後）にシグナルを産生するが、グルコースが培地から欠乏すると、
シグナル伝達活性の産生を停止することを示している。図3Bは、グルコースが制
限的にならない場合には、S.typhimurium LT2 が産生する総活性は高くなり、指
数期の全体にわたってシグナル伝達活性の産生が続き、増殖6 時間で最大活性に
達することを示している。さらにこの図は、指数期中期細胞によって合成される
シグナル伝達活性は、細胞が定常期に達する時点までに分解されることも示して
いる。制限グルコース条件の場合は定常期では活性は残っていなかったが、グル
コースが豊富に存在する場合は、活性が24％だけ残った。増殖培地中のグルコー
ス濃度を増やしてもこれらの結果は変化しなかった。すなわち活性は指数増殖期
中期に分泌され、使用済み培養液中に残っている活性は定常期までに著しく低下
した。
【０１８５】 要するに、この実施例に記載した結果は、E.coliおよびS.typhimurium が、V.
harveyi に存在する特定の一定数感知システムを刺激するシグナル伝達物質を産
生することを示している。他の多くの細菌が既にこのような活性についてアッセ
イされているが、この因子の産生について陽性であると同定された種は稀だった （Bassler ら,1997,前掲）。さらに、ここに示すように、E.coliおよびS.typh
imurium シグナルは強力であり、これらの細菌はV.harveyi が産生する活性に等
しい活性を産生する。定常期までにE.coliおよびS.typhimurium シグナルが分解
することは、これらの細菌における定数感知が低細胞密度に合わせて調整されて
いることを示し、このことからE.coliおよびS.typhimurium の定数感知は、シグ
ナルに対する応答が定常期まで持ち越されないように調節されることが示唆され
る。さらに、E.coliおよびS.typhimurium における定数感知は、いくつかの環境
因子による影響を受ける。シグナルの産生および分解は、増殖期に感応するだけ
でなく、細胞の代謝活性にも感応する。これらの結果は、E.coliおよびS.typhim
urium の定数感知シグナルが2 つの機能を持つことを示している。すなわちこの
シグナルは、細胞がその増殖相および環境の代謝ポテンシャルを互いに伝達しあ
うことを可能にしている。
【０１８６】 E.coliおよびS.typhimurium における定数感知の調節を理解することは、病理
発生における群落構造および細胞- 細胞相互作用を理解する上で重要である。自
然環境では、分散がクリティカルなので、病原性E.coliおよびS.typhimurium は
決して定常期には到達しないだろう。したがって、E.coliおよびS.typhimurium
における定数感知が低細胞密度で機能することは適切である。この状況は、定数
感知システムが高細胞密度でのみ作動する発光性海洋共生生物V.fischeriとは対
照的であり、細胞密度は、宿主の特定の光器官内に存在するという指標となる。
V.fischeriの特異的定数感知システムとE.coliおよびS.typhimurium の特異的定
数感知システムとは、各生物が存在する生息場所に適した調節を受けるようであ
る。どちらの場合も、定数感知は、細菌が環境内で自由生活しているのではなく
宿主内に存在することを連絡するのに役立つだろう。E.coliシステムおよびS.ty
phimurium システムにはさらに複雑な点がある。なぜなら、これらの細菌は、細
胞密度情報と代謝キューの両方を定数感知回路に流すからである。ここでも、グ
ルコースまたは他の代謝産物の存在量に関する情報を中継するシグナルが、自由
生活様式から宿主に内在する様式への移行を起こすべきであることを、細菌に伝
達するのだろう。
【０１８７】 本発明者らが試験したどの条件でも、本実施例に記載したシグナル伝達活性は
、有機溶媒中に定量的には抽出されず、カチオン交換カラムにもアニオン交換カ
ラムにも結合しない。このシグナルは、小さく（分子量1000未満）、極性である
が荷電はしていないと思われる有機化合物であることが、予備的な特徴づけによ
って示されている。この活性は酸安定および塩基不安定であり、80℃までは耐熱
性を示すが、100 ℃には耐性を示さない。E.coli、S.typhimurium およびV.harv
eyi シグナルの精製を以下の実施例に詳述する。
【０１８８】 実施例2 −Salmonella typhimuriumにおけるオートインデューサー産生の調節 この実施例では、V.harveyi センサー1 - , センサー2 + レポーター株におけ
るlux 発現を刺激する細胞外因子AI-2をS.typhimurium LT2 が産生する条件を解
明する。S.typhimurium によるシグナル伝達分子の産生は、細菌が資化すると培
地のpHが低下するような好ましい炭水化物での増殖中に起こる。好ましい炭素源
の不在下で増殖培地のpHが低下すると因子の産生が制限されることから、細胞は
pHの変化と炭素源の資化との両方によって影響を受けることがわかる。シグナル
伝達活性は細胞が定常期に達する時期までに分解され、活性の分解にはタンパク
質合成が必要である。適当な炭素源での増殖後に浸透圧ショックを与えると、S.
typhimurium 培養液中に存在する活性の量が著しく増加する。この活性の増加は
、オートインデューサーの合成の誘導および活性の分解の抑制によるものである
らしい。E.coliおよびS.typhimurium は、V.fischeriのLuxRに相同なSdiAと呼ば
れるタンパク質を持っている（Wangら,EMBO J.10:3363-3372,1991 ；Ahmer ら,J
.Bacteriol.180:1185-1193,1998 ）。SdiAは細胞外因子に応答すると提唱されて
おり（Sitnikovら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:336-341,1996 ；Garcia-Lara ら
,J.Bacteriol.178:2742-2748,1996 ）、S.typhimurium においてビルレンス因子
産生を制御することが明らかにされている（Ahmer ら,1998,前掲）。下記の解析
は、AI-2オートインデューサーシグナル伝達活性がSdiA経路を介して機能しない
ことを示している。
【０１８９】 S.typhimurium LT2 はオートインデューサー様活性を産生する。実施例1 は、
S.typhimurium およびE.coli株が、V.harveyi におけるlux 発現を刺激するシグ
ナル伝達活性を産生し、そのシグナル伝達活性がもっぱらV.harveyi 定数感知シ
ステム2 を介して作用することを証明している。図4 は、V.harveyi システム2
レポーター株BB170 （センサー1 - , センサー2 + ）における発光の誘導を示す
。対照実験は、V.harveyi の特徴的な定数感知挙動を示している（●）。V.harv
eyi が放射する1 細胞あたりの光は、新しい培地への希釈直後に、1/1000未満に
急激に低下する。培地中に臨界濃度の内因性オートインデューサー（AI-2）が蓄
積した状態に相当する臨界細胞密度では、1 細胞あたりの発光が指数的にほぼ3
桁増加して、希釈前のレベルを再び達成する。
【０１９０】 V.harveyi BB152 （AI-1-,AI-2+ ）から調製した無細胞培養液を10％添加した
ところ、レポーター株は希釈後も高レベルの光出力を維持した（○）。光出力の
増加は、V.harveyi BB170 細胞がV.harveyi BB152 株から調製した無細胞培養液
中のAI-2の存在に応答したためである（Bassler ら,1993,前掲）。同様に、LB＋
0.5 ％グルコースで増殖させたS.typhimurium LT2 の無細胞培養液を添加すると
、レポーター株における発光が対照レベルと比較して約800 倍誘導された（■）
。これらの条件では、S.typhimurium LT2 はV.harveyi AI-1に似た活性を産生し
なかった。また、LB＋0.5 ％グルコースにはAI-1活性もAI-2活性もない（実施例
1 参照）。
【０１９１】 環境因子はS.typhimurium におけるオートインデューサーの産生および分解に
影響を与える。S.typhimurium におけるオートインデューサー産生の制御は、記
載のある他の定数感知システムとは異なる。図5Aは、S.typhimurium におけるオ
ートインデューサー産生の調節に関する3 つの重要な側面を表している。第1 に
、S.typhimurium をグルコースの不在下にLB中で6 時間増殖させた場合は、オー
トインデューサー活性は観察されない。第2 に、グルコースの存在下で6 時間増
殖させると、オートインデューサーがかなり産生される（レポーター株を760 倍
活性化）。第3 に、S.typhimurium 培養を定常期まで増殖させると、活性は検出
できるものの著しく低下する（レポーター株を33倍活性化）。
【０１９２】 本発明者らは、オートインデューサー産生に有利な条件およびオートインデュ
ーサー分解に有利な条件を理解するために、S.typhimurium LT2 にいくつかの異
なる処理を施した。図5Bに示す実験では、0.5 ％グルコースを含むLB中で6 時間
前培養することによって、S.typhimurium 細胞におけるシグナル産生を誘導した
。本発明者らはこれらの条件でグルコースが欠乏しないことを明らかにしている （Surette およびBassler,1998）。増殖誘導期の後、培養液を除去し、細胞の
一部を図2 に記載の様々な条件で再懸濁し、2 時間インキュベートした。これら
の処置をそれぞれ行った後、無細胞液を調製し、BB170 での活性を調べた。
【０１９３】 図5Bに示す結果では、実験の開始時点でS.typhimurium はオートインデューサ
ー産生を前誘導されていたこと、すなわちそれらの無細胞培養液はレポーター株
を760 倍活性化したことに注意することが重要である。図5Bは、前増殖培養液を
これらの細胞から除去し、細胞をグルコースを含まないLBに再懸濁するか、0.1M NaCl （低張条件）に再懸濁するか、または43℃で2 時間熱ショックを加えると
、オートインデューサー産生は全くまたは極めて少量しか起こらなかったことを
示している。これらの結果は上記の処理がオートインデューサー産生の終結をも
たらすか、または新たに放出されたオートインデューサーの分解をもたらすか、
またはその両方であることを示している。
【０１９４】 上記の結果とは対照的に、前誘導した細胞を新鮮なLB＋グルコースに再懸濁す
ると、高レベルのオートインデューサー産生が持続した（レポーターを735 倍活
性化）。同様に、酸性pHはオートインデューサーの持続的産生を促進し（600 倍
活性化）、高張浸透圧ショック（0.4M NaCl ）は1300倍のレポーター誘導を引き
起した。AI-2活性の増加は、既にAI-2を活発に産生していたpH5.0 液または0.4M
NaCl 浸透圧ショック液にだけ観察された。すなわち、前培養中にグルコースを
含めなかった場合は、同一の2 時間処理後も測定できる活性は産生されなかった
。
【０１９５】 S.typhimurium 細胞をLB＋グルコースから0.4M NaCl に移すと、試験した他の
条件で観察されたレベルよりはるかに高いレベルまで、AI-2活性の蓄積が起こっ
た。以下に、0.4M NaCl に再懸濁したS.typhimurium 細胞が、生合成および/ ま
たはオートインデューサーの放出を増加させ、さらにこれらの細胞は放出された
活性の相当量を分解しないらしいことを示す。AI-2産生量の同様の増加は、S.ty
phimurium 細胞を0.4M NaCl 、0.4M KClまたは0.8Mショ糖に再懸濁した時にも起
こることから、AI-2産生に対するNaClの効果は浸透圧効果であり、イオン効果で
はないことがわかる。S.typhimurium 細胞に対するこの明白な浸透圧ショック効
果は極めて有用である。なぜなら、これを利用すれば、分解による損失がない状
態で、オートインデューサー活性の最大放出量を測定することができるからであ
る。
【０１９６】 S.typhimurium におけるシグナル産生に対するグルコースの効果。実施例1 で
は、S.typhimurium が定数感知シグナル因子を産生するには、グルコースの持続
的存在が必要であることを示した。糖資化は増殖速度を上昇させると同時に培地
のpHも低下させるので、本発明者らは、S.typhimurium によるシグナル産生に対
するグルコース代謝、pH低下および細胞数増加の効果を、さらに解析した。図6
に示す実験では、制限濃度（0.1 ％）および非制限濃度（1.0 ％）のグルコース
を含む増殖中のS.typhimurium LT2 培養におけるシグナル産生、増殖速度、およ
びpHを測定した。図6 に示すデータでは、様々な時点で、無細胞培養液および
対応する0.4M NaCl 浸透圧ショック液に産生されたオートインデューサーのレベ
ルを測定し、1 ×109 細胞に標準化した。図5 とは異なり、この実験での細胞は
シグナル生産を前誘導されないことに注意すべきである。
【０１９７】 図6 は、0.4M NaCl 浸透圧ショック液で観察されるオートインデューサーの産
生および消失パターンが、無細胞培養液で観察されるパターンによく似ているこ
とを示している。しかし、オートインデューサーが産生される各時点で、浸透圧
ショック液中に検出される活性は、対応する無細胞培養液中に検出される活性よ
りもはるかに高い。制限グルコース（0.1 ％）条件では（図6A、6Cおよび6E）、
S.typhimurium は2 〜4 時間の間にシグナル伝達活性を産生する（バー）。しか
し、グルコースは4 時間で完全に枯渇し、この時点で因子の産生は停止する（図
6A）。これに対し、細胞を1.0 ％グルコース中で増殖させた場合（図6B、6Dおよ
び6F）、グルコースは実験の全体にわたって常に培地中に存在する（図6B）。こ
れらの条件では、細胞が活性を12時間にわたって合成し続ける。図5 に示した結
果および実施例1 で報告した結果と同様に、24時間時点に定常期から得た無細胞
培養液または浸透圧ショック液には、グルコース濃度とは無関係に、活性はほと
んど観察されなかった。
【０１９８】 S.typhimurium は、高グルコース培地でも低グルコース培地でも指数期中はほ
ぼ同じ速度で増殖する。むしろ実際には、高グルコース培地で増殖したS.typhim
urium 培養は、低グルコース培地でのS.typhimurium 増殖によって達成される細
胞密度に到達しない（図6Cおよび6D）。この培養ではおそらく、グルコース資化
の増加によって起こるpHの劇的な低下によって、細胞増殖が阻害されるのだろう
。これらの結果から、1 ％グルコースを含むLBの方がS.typhimurium によって産
生される活性のレベルが高いことは、細胞数が高いためではなく、グルコース代
謝によってシグナル産生の誘導が起こるためであることがわかる。
【０１９９】 図6Eおよび6Fは、各時点における低および高グルコース培養物のpHを示す。低
グルコース条件（図6E）では、細胞がグルコースを資化するにつれて培養物のpH
がまず低下する。しかし、グルコースの完全な枯渇と同時に、pHは上昇し始める
。対照的に、高グルコース条件では、培地のpHはpH5 未満に低下する（図6F）。
図6 に示す実験では、グルコース異化とpH低下の両方が同時に起こることから、
これらの因子の一方または両方がS.typhimurium によるシグナル産生を担うこと
が示唆される。
【０２００】 グルコース代謝と低pHはどちらも独立してS.typhimurium におけるシグナル産
生を制御する。S.typhimurium によるシグナル産生におけるグルコース代謝から
の寄与と、低pHからの寄与とを識別するために、本発明者らは、0.5 ％グルコー
スを含むLB中で、培養物のpHを7.2 に保って増殖させたS.typhimurium が産生す
る活性（図7A）を、pHを5.0 に保ってグルコースなしのLB中で増殖させたS.typh
imurium が産生する活性（図7B）と比較した。ここでも本発明者らは、無細胞培
養液中および0.4M NaCl 浸透圧ショック液中に存在するシグナルを測定した。図
3 に示したデータと同様に、無細胞培養液中に観察されるシグナルのレベルは、
0.4M浸透圧ショック液に観察されるシグナルのレベルより低かった。
【０２０１】 S.typhimurium をpH7.2 のLB＋0.5 ％グルコース中で増殖させると、検出され
る定数感知シグナルの量は6 時間にわたって増加した。0.4M NaCl 浸透圧ショッ
ク液では、6 時間時点で、V.harveyi レポーター株BB170 の光生成が約550 倍刺
激されていた。図7Aは、8 時間にわたってpHが7.15〜7.25の間に保たれ、その後
培地のpHはもはや減少せず、おそらくは細胞がグルコースを消耗し尽くしたため
に、増加し始めたことを示している。本発明者らは、実験期間中pHを増加させ続
けた。図には各時点の細胞数も示す。pH7.2 では、細胞は迅速に増殖し、高細胞
密度に達した。
【０２０２】 ここに記載した解析と同様の時間経過の解析では、グルコースを含まない中性
pHのLBで増殖させた場合に、S.typhimurium がシグナルを何も産生しないことが
示されている（実施例1 参照）。しかしS.typhimurium は、pH5.0 で増殖させる
と、グルコースの不在下でも定数感知因子を一過性に産生していた（図7B）。シ
グナルは4 時間産生され、約450 倍の受容体刺激が、0.4M NaCl 浸透圧ショック
液で達成された最大活性だった。5 時間では極めてわずかなシグナルしか製造さ
れておらず、6 時間の培養後には、シグナルは完全に消失した。図7Bはこの実験
でのpHが5.0 〜5.2 に維持されたことを示している。
【０２０３】 S.typhimurium オートインデューサー分解装置の予備的特徴づけ。S.typhimur
ium LT2 によって産生される定数感知活性は、定常期が始まるまでに分解される
。本発明者らの決定によると、LB＋グルコースで6 時間増殖させた細胞から得た
無細胞培養上清および0.4M NaCl 浸透圧ショック液に含まれる活性は30℃で少な
くとも24時間は安定であることから、これらの無細胞液には分解活性は存在しな
いことがわかる。さらに、活発に産生を行っているS.typhimurium から調製した
無細胞培養液（すなわちLB＋グルコースで6 時間増殖させた培養から得られるも
の）を、因子が既に分解されたS.typhimurium から調製した無細胞培養液（すな
わちLB＋グルコースで12または24時間増殖させた培養から得られるもの）と混合
しても、活性の分解は起こらない。この結果は、分解活性は放出されないがその
かわり、細胞と結合していることを示している。
【０２０４】 図5 に、オートインデューサーを活発に放出しているS.typhimurium 細胞を0.
1M NaCl に移してもさらなるオートインデューサーの産生は起こらないことを示
した。しかし同じ細胞を0.4M NaCl に移すと、さらに大量のオートインデューサ
ー産生が観察された。この結果から、低オスモル濃度がオートインデューサー分
解機構を誘導するシグナルであるかもしれないことが示唆される。オスモル濃度
がS.typhimurium におけるオートインデューサーの産生および分解に影響を与え
る機構の解析に着手するために、本発明者らは、高および低オスモル濃度でS.ty
phimurium がシグナルを産生および分解する際のタンパク質合成の必要を調べた
。図5 の凡例に示すように、S.typhimurium LT2 株を0.5 ％グルコースを含むLB
中で増殖させて、シグナル産生の最大誘導を達成させた後、タンパク質合成の存
在下および不在下に0.1Mまたは0.4M NaCl で処理した。無細胞液を調製し、シグ
ナル伝達活性について調べた。無細胞浸透圧ショック液の半分にはクロラムフェ
ニコール（Cm）を含めたので、活性アッセイではV.harveyi JAF305をレポーター
株として使用した。このV.harveyi 株はCmr カセットをluxN遺伝子内に持ってお
り、その表現型はV.harveyi BB170 と同じ表現型センサー1 - , センサー2 + で
ある。
【０２０５】 細胞を0.4M NaCl に再懸濁した場合、S.typhimurium が産生し放出するシグナ
ルの量は200 分間増加し続けた（図8A、□）。この後、無細胞浸透圧ショック液
中に存在するシグナル伝達活性のレベルはいくらか減少したことから、放出され
たシグナルの一部が分解されたことが示唆された。S.typhimurium 細胞を0.1M N
aCl に再懸濁すると、著しく異なる結果が得られた（図8B、□）。この場合、S.
typhimurium は、0.4M NaCl に再懸濁した細胞が産生する量に等しい活性を、初
期の時点で産生した。しかし、120 分では既に無細胞低オスモル濃度液には活性
が残っていなかった。この結果は、低オスモル濃度条件では、放出された活性が
迅速に分解されることを示している。無細胞培養液では活性の分解が認められな
いことから、低オスモル濃度無細胞液からの活性の消失は、シグナル伝達分子の
化学的不安定性によるものではないことがわかる。
【０２０６】 高オスモル濃度条件では、細胞をCmで処理してタンパク質合成を阻害すると、
無処理細胞と比較して約1/4 の活性しか産生されなかった。図8Aの■は、Cmの存
在下で起こったレポーター株の誘導は300 倍であり、これに対して無処理細胞の
場合（図8A、□）は1200倍の誘導が起こったことを示している。S.typhimurium
を低オスモル濃度に再懸濁した場合（図8B）は、Cmの不在下（□）で産生される
活性の約3/4 をCmの存在下（■）で産生した。Cmの存在下では、放出された活性
は高オスモル濃度では300 分まで分解されず、また低オスモル濃度では一部しか
分解されなかった。
【０２０７】 AI-2シグナル分解が高オスモル濃度によって阻害されないことを示すために、
本発明者らは、0.4M NaCl 無細胞浸透圧ショック液に含まれる活性を、0.1M NaC
l に2 時間再懸濁しておいたS.typhimurium 細胞に加えた。図8 に示すように、
これらは因子を分解することができる細胞である。表3 は、これらのS.typhimur
ium 細胞が、高オスモル濃度でインキュベートされている間に、98％を越えるシ
グナル伝達活性を分解したことを示している。またこの表は、0.4M NaCl 中でイ
ンキュベートしておいたS.typhimurium 細胞（これらはシグナルを活発に産生し
ている細胞である）が、活発に分解を行っている細胞から得た0.1M NaCl インキ
ュベーション液に再懸濁すると、もはや活性を放出しなくなったことも示してい
る。さらに、活性および不活性0.4Mおよび0.1M無細胞浸透圧液とを混合しても、
0.4M液中の活性の分解は起こらなかった。
【０２０８】
【表３】 a 0.5 ％グルコースを含むLB中でS.typhimurium を6 時間増殖させた。細胞を
ペレット化し、0.1Mまたは0.4M NaCl に2 時間再懸濁した。無細胞液を調製し、
活性を調べた。
【０２０９】 b 0.1M NaCl 中で2 時間インキュベートしておいたS.typhimurium 細胞をペレ
ット化し、0.4M NaCl に2 時間懸濁した細胞から得た透明浸透圧ショック液中に
含まれる活性に再懸濁した。2 時間のインキュベーション後に無細胞液を調製し
、シグナル伝達活性をアッセイした。
【０２１０】 c 0.4M NaCl 中に2 時間懸濁しておいたS.typhimurium 細胞をペレット化し、
0.1M NaCl に2 時間懸濁した細胞から得た透明浸透圧ショック液中で2 時間イン
キュベーションした。2 時間のインキュベーション後に無細胞液を調製し、シグ
ナル伝達活性をアッセイした。
【０２１１】 LuxRホモログSdiAはAI-2オートインデューサーに対する応答には関与しない。
E.coliおよびS.typhimurium にはV.fischeriのluxRに相同な遺伝子が同定されて
おり、sdiAと呼ばれている。2 つの報文から、E.coliでは、SdiAは、無細胞培養
液中に存在する因子（Garcia-Lara ら,1996,前掲）およびいくつかのホモセリン
ラクトンオートインデューサー（Sitnikovら,1996,前掲）に応答して起こる細胞
分裂遺伝子座ftsQAZの発現をいくらか調節することが示唆されている。E.coliゲ
ノム配列の完成によってE.coliにはLuxIホモログが存在しないことが明らかにな
ったので、その存在が仮定されている可溶性因子の生合成を担う遺伝子座は決定
されていない。最近になって、S.typhimurium におけるSdiAの過剰発現は、S.ty
phimurium ビルレンスプラスミド上にあるいくつかのORF の発現に影響を与える
ことが示された（Ahmer ら,1998,前掲）。E.coli研究の場合と同様に、S.typhim
urium 中のSdiA活性も細胞外因子によって調節されると提唱されている。
【０２１２】 本発明者らがS.typhimurium およびE.coliで特徴づけたAI-2オートインデュー
サーは、SdiAを介して作用する可能性があった。本発明者は、E.coliおよびS.ty
phimurium でSdiAによって調節される遺伝子に対して、AI-2が影響を持つかどう
かを検証した。E.coliでは、ftsQ1p2p-lacZ レポーターを、またS.typhimurium
ではrck::MudJ 融合物を、sdiA+ およびsdiA- のバックグラウンドで測定した。
本発明者らは、LB、0.4M NaCl 、S.typhimurium LT2 およびE.coli O157 から得
たAI-2活性を含む0.4M NaCl 浸透圧ショック液、ならびにE.coli DH5αから得た
0.4M NaCl 浸透圧ショック液の添加効果を調べた。上記実施例1 で示したように
、DH5 αは本発明者らの増殖条件ではAI-2活性を産生しない。
【０２１３】 E.coli実験では、MC4100およびMC4100/pMS209 （間違った向きにftsQ1p2pを含
有しているもの）が測定可能なガラクトシダーゼ活性を持たないことを確認した
。MC4100/pMS207 （ftsQ1p2p-lacZ 融合物を含むもの）によって産生されるガラ
クトシダーゼのレベルはほぼ20〜30ミラー（Miller）単位であり、この活性レベ
ルはここで試験したどの条件でも変化しなかった。融合物のこの活性レベルは先
に報告されたレベルと同等だった（Sitnikovら,1996,前掲；Garcia-Lara ら,199
6,前掲）。S.typhimurium SdiA研究では、Ahmer ら（1998，前掲）と同様に、sd
iA+ バックグラウンドで約30ミラー単位のrck::MudJ 活性を得た。このレベルは
sdiA- バックグラウンドでは10単位に低下した。E.coliまたはS.typhimurium 由
来のAI-2の添加後もβ- ガラクトシダーゼ産生に変化は起こらなかった。これら
の結果は、SdiAの活性を調節する細胞外因子があるとしても、本発明者らが試験
した条件では、それはAI-2ではないことを示している。
【０２１４】 E.coliおよびS.typhimurium における定数感知。本発明者らは、S.typhimuriu
m によって産生される細胞外シグナル伝達因子の検出を可能にする異種バイオア
ッセイを開発した。この因子は定数感知細菌V.harveyi のAI-2の作用を模倣し、
特異的にV.harveyi シグナル伝達システム2 検出器LuxQを介して作用する。ftsQ
およびrck プロモーターへのlacZ融合物を使った結果は、AI-2定数感知因子が、
本発明者らのアッセイ条件で、少なくともこれらの遺伝子の調節については、Sd
iAにシグナルを伝達しないことを示している。したがってAI-2定数感知システム
には、これまでに研究されたものとは異なるS.typhimurium およびE.coliシグナ
ル伝達経路が関与している。
【０２１５】 S.typhimurium LT2 は、V.harveyi が産生する活性にほぼ等しい量の活性を産
生し、10％S.typhimurium 無細胞培養液を添加すると約800 倍のV.harveyi レポ
ーター株BB170 刺激が起こる。lux 誘導のタイミングおよびS.typhimurium シグ
ナルに対するV.harveyi の応答曲線の形状は、自らのAI-2に応答するV.harveyi
のものと区別できない。さらに本発明者らは、V.harveyi AI-2とS.typhimurium
シグナル分子の両方を、同じ精製法で部分精製することに成功している。これら
2 つの結果から、本発明者らは、S.typhimurium シグナル伝達分子がV.harveyi
のAI-2と同一であるか、またはV.harveyi のAI-2に極めて近い関係にあると考え
るに至った。
【０２１６】 S.typhimurium におけるシグナルの産生および分解は増殖条件によって調節さ
れる。本発明者らは、この実施例で、S.typhimurium LT2 のシグナル伝達活性の
調節をさらに特徴づける。S.typhimurium 培養上清でのシグナル伝達活性の蓄積
は、細胞がリッチな培地中のグルコースを活発に利用している指数期中期に最大
になる。これらの増殖条件では、グルコースの利用が、培養物のpHの急激な低下
を伴う。これらの結果は、グルコース代謝または低pHがS.typhimurium LT2 によ
る定数感知因子の産生を誘導することを証明しており、グルコースと酸性度の両
方が独立したオートインデューサー産生シグナルを生成することを示している。
グルコースの存在下で、pHを維持しない場合は、おそらくpHの低下と適当な炭素
源の存在の両方がS.typhimurium における定数感知の調節に寄与するのだろう。
また、これらの結果は、中性pHでのグルコースの存在下および低pHでのグルコー
スの不在下では、定常期前にオートインデューサーの産生が停止することも示し
ている。したがって、オートインデューサーの産生を停止するようにという指示
をS.typhimurium に出すために、酸性条件とグルコースの不在とを組み合わせる
必要はない。
【０２１７】 グルコースに加えて、他のいくつかの炭水化物での増殖も、シグナル伝達活性
の産生を誘導する。これらの炭水化物にはPTS 糖（フルクトース、マンノース、
グルシトール、およびグルコサミン）も非PTS 糖（ガラクトースおよびアラビノ
ース）も含まれる。これらの発見により、オートインデューサー生合成の調節に
PTS が独占的に役割を果たしているという可能性は排除される。S.typhimurium
LT2 をいくつかの他の炭素源（酢酸、グリセロール、クエン酸およびセリン）で
増殖させても、シグナル伝達活性の有意な蓄積は観察されない。実施例1 は、こ
のシグナルが、S.typhimurium によって分泌されることが知られているいくつか
の物質（混合酸発酵の主要産物など）のいずれでもないことを示している。細胞
がシグナル伝達分子の産生を正確に調節すること、そして好ましい炭水化物で増
殖している時はその産生が有利になることは、明らかである。シグナル伝達分子
を同定し、生合成遺伝子をクローニングすることによって、この調節過程のさら
なる理解が促進されるだろう。
【０２１８】 この実施例は、他の定数感知システムとは対照的に、S.typhimurium シグナル
が定常期では蓄積しないことを示している。この調節には、オートインデューサ
ーの産生と分解がどちらも寄与している。この実施例では、オートインデューサ
ーの産生を、無細胞液中に存在するシグナル伝達活性の増加として確認している
。活性の増加は、生合成されたオートインデューサーの放出、貯蔵されたオート
インデューサーの放出、オートインデューサーの分解の抑制、またはこれらの組
合わせによって起こりうる。本発明者らは、オートインデューサー分解を、無細
胞液からのシグナル伝達活性の消失と定義する。この消失は、オートインデュー
サーの破壊、オートインデューサーの再取込み、またはこれらの活動の組合わせ
によるだろう。オートインデューサーの産生と分解は、条件によっては同時に起
こりうる。これらの発見は、シグナルと、おそらくはシグナルに対する応答とが
定常期まで持続しないように、S.typhimurium における定数感知が調節されるこ
とを示している。シグナル産生には好ましい炭水化物を使用する必要があるので
、S.typhimurium における定数感知は、細胞密度と、環境の増殖ポテンシャルと
の両方を測定するために使用することができる。
【０２１９】 オスモル濃度はS.typhimurium におけるシグナルの産生および分解に影響を及
ぼす。シグナルを活発に産生しているS.typhimurium 細胞は、0.4M NaCl 浸透圧
ショックなどの特殊な環境処理によって、そのシグナル産生をさらに刺激するこ
とができる。このことは、いくつかの独立した調節経路がオートインデューサー
合成に情報を流すことを示している。0.4M NaCl に再懸濁すると、オートインデ
ューサーを産生するS.typhimurium 細胞は、タンパク質を合成できる場合に、タ
ンパク質合成が遮断されている場合よりも、かなり高い活性を示す。さらにシグ
ナルの分解にもタンパク質合成が要求される。
【０２２０】 これらの結果にはいくつかの意味が含まれている。第1 に、Cmの存在下で、高
オスモル濃度に再懸濁したS.typhimurium と低オスモル濃度に再懸濁したS.typh
imurium はどちらも同等量の活性を産生する。この結果は、グルコースの存在下
での増殖後に、S.typhimurium 細胞は、所定のシグナル伝達活性産生能（および
/ または既に合成された活性の細胞からの放出能）を持つことを示している。第
2 に、高オスモル濃度培地に細胞を再懸濁すると、シグナル産生量が増大して、
このレベルをはるかに上回るが、これにはタンパク質合成が必要である。高オス
モル濃度は、S.typhimurium がシグナルの産生および/ または放出に必要な生合
成装置をより多く合成するように誘導する環境キューの一つであるらしい。第3
に、低オスモル濃度は、最初に活性の放出を引き起した後、迅速な分解をもたら
すが、Cmの存在下ではこの分解が起こらなかったことから、これにはタンパク質
合成が必要である。これらの結果は、環境がオートインデューサー産生に有利な
条件から（LB＋好ましい炭水化物または高オスモル濃度）からオートインデュー
サー産生に有利でない条件（低オスモル濃度、または好ましい炭素源の不在）に
変化したことを意味している。この環境変化は、S.typhimurium をして、シグナ
ル伝達活性の分解に必要なタンパク質を合成させる。
【０２２１】 S.typhimurium 細胞を0.4M NaCl 中でインキュベートしたところ、活性の有意
な分解は200 分まで起こらなかった。この結果は、必要な分解タンパク質がこれ
らの条件では合成されないか、あるいは分解装置は組立てられるが、その活性が
高オスモル濃度によって阻害されることを示している。活性を分解するように誘
導した細胞は高オスモル濃度で活性の分解を行うことができるので、高オスモル
濃度はシグナル分解を阻害しないことを、実験結果は示している。したがって、
高NaCl試料における活性の持続は、分解機構が合成されないために起こるのであ
って、その活性が阻害されるために起こるのではない。
【０２２２】 S.typhimurium 細胞がオートインデューサーを産生する場合およびS.typhimur
ium 細胞がオートインデューサーを分解する場合を正確に決定することは困難で
ある。なぜなら両方の過程が同時に起こりうるからである。しかし、高オスモル
濃度では分解が全くまたはほとんど起こらず、低オスモル濃度では総合的にみれ
ばシグナル産生細胞からシグナル分解細胞への細胞の変換が起こり、分解にはタ
ンパク質合成が必要とされるようである。分解は細胞に付随する過程であること
が予備的特徴づけによって示されている。なぜなら、オートインデューサー活性
は無細胞培養上清中で長期間にわたって安定だからである。さらに、活性を不活
性無細胞培養液または活性および不活性高および低オスモル濃度無細胞液と混合
しても、オートインデューサーの分解は促進されない。
【０２２３】 Salmonellaの病理発生における定数感知の役割。S.typhimurium LT2 によるシ
グナル産生およびシグナル分解の調節に関してここに記載した知見は、Salmonel
laの病理発生における定数感知の役割を示唆している。シグナル産生に有利な条
件（栄養素豊富、高オスモル濃度および低pH）は、腸内病原体がその宿主と初め
て相互作用するときに直面しそうな条件である。シグナルの分解に有利な条件
（栄養素不足、低オスモル濃度）は、病原体が宿主から出た時におそらく直面す
るであろう条件である。宿主における最初のコロニー形成は、この細胞- 細胞シ
グナル伝達システムを介して連携した細胞集団間での協調的努力であるといえる
。本発明者らがまだ調べていない他のキューも、S.typhimurium における定数感
知を調節している可能性がある。これらは、病理発生に関与する独立したまたは
一部重複したシグナル伝達経路に相当するかもしれない。これらの仮説を検証す
るために、本発明者らはS.typhimurium 突然変異体を単離しているところである
。最後に、Salmonellaの病理発生は、宿主と代謝活性細菌との相互作用の動的過
程である。病理発生における定数感知の役割に合致して、本発明らが得た証拠は
、この定数感知システムが定常期には機能していないことを示唆している。本発
明者らは、シグナル伝達分子が定常期には産生されないこと、そして既存のシグ
ナルは分解されることを明らかにした。S.typhimurium が宿主付随的存在と自由
生活的存在の間を移行するには、おそらく定数感知が不可欠なのだろう。
【０２２４】 実施例3 −Escherichia coli、Salmonella typhimuriumおよびVibrio harveyi
における定数感知：オートインデューサー産生を担う新しい遺伝子ファミリー V.harveyi 、E.coliおよびS.typhimurium におけるAI-2産生を担う遺伝子（そ
れぞれluxSV.h.、luxSE.c.およびluxSS.t.という）は互いに高度に相同であり、
オートインデューサー産生に関与する新しいタンパク質ファミリーを規定すると
考えられる。これらの遺伝子はゲノム配列決定プロジェクトによって多くの細菌
に同定されているが、それらの遺伝子には今までどの生物でも機能の帰属はなさ
れていない。luxS遺伝子はオートインデューサー産生に関与することが知られて
いる他のどの遺伝子ともホモロジーを持っていない。
【０２２５】 V.harveyi におけるAI-2産生を担う遺伝子の同定とクローニング 先の実施例は、他の多くのE.coli株と異なり、E.coli DH5α株は、V.harveyi
によって検出することができるAI-2シグナル分子を産生しないことを示している
。そこで本発明者らは、V.harveyi AI-2産生遺伝子をクローニングするための突
然変異体としてE.coli DH5αを利用することができると考えた。野生型V.harvey
i BB120 ゲノムDNA のライブラリーをE.coli DH5α株に導入し、得られた形質転
換体をV.harveyi BB170 AI-2検出バイオアッセイでAI-2産生についてスクリーニ
ングした。ライブラリーはそれぞれが約25kbのV.harveyi ゲノムDNA を含む2500
個のクローンからなった。このバイオアッセイでレポーター株を300 倍以上刺激
するDH5 αクローンが5 つ確認された。
【０２２６】 5 つのAI-2産生E.coli DH5αクローンから得た組換えコスミドDNA を、制限酵
素分析とサザンブロット法によって解析した。5 つのコスミドは全て、同一のV.
harveyi ゲノム制限断片のオーバーラップしたサブセットを含んでたことから、
本発明者らは同じ遺伝子座を数回クローニングしたことがわかった。pBB2929 と
名付けた一つのコスミドを選択してさらなる解析を行った。コスミドpBB2929 に
対してトランスポゾンTn5 を使ってランダム突然変異誘発を行い、次に、Tn5 挿
入を持つコスミドのプールをE.coli DH5αに形質導入した。962 株のE.coli DH5
α/ ｐBB2929::Tn5 株をAI-2産生能の喪失について試験した。pBB2929 中にTn5
挿入を持つ4 つのE.coli DH5α株が、AI-2を産生できないことが確認された。pB
B2929 におけるこれらのTn5 挿入の位置をマッピングし、4 つのトランスポゾン
挿入の全てが、同じ2.6kb のHindIII V.harveyi ゲノムDNA 断片中に存在するこ
とを見いだした（図9A）。
【０２２７】 コスミドpBB2929 をHindIII で消化し、その結果得た8 断片をpALTER（Promeg
a ）に両方向にサブクローニングした。それらのpALTERサブクローンをE.coli D
H5αに形質導入し、次に、AI-2産生について試験した。AI-2産生能を持つ唯一の
株は、Tn5 突然変異で同定された2.6kb のHindIII 断片を含んでいた。この断片
を配列決定したところ、オープンリーディングフレーム（ORF ）を一つだけ同定
することができたが、その位置は、AI-2産生を消失させた4 つのTn5 挿入の地図
上の位置と一致した。本発明者らはこのORF をLuxSV.h.と名付けた（図9A）。
【０２２８】 V.harveyi 中のluxSV.h の突然変異誘発。本発明者らはluxSV.h.のヌル突然変
異がV.harveyi におけるAI-2産生に及ぼす効果を解析した。LuxSV.h.遺伝子にマ
ッピングされた4 つのTn5 挿入と、luxSV.h.遺伝子座に隣接する対照Tn5 挿入と
を、V.harveyi BB120 染色体の相当する位置に導入することにより、それぞれMM
37、MM30、MM36、MM38およびMM28株を作製した（図9A）。サザンブロット法を使
って、5 つのTn5 挿入が全て、V.harveyi 染色体中に正しく配置されていること
を確認した。4 つのV.harveyi luxSV.h.::Tn5 挿入株をAI-2産生能について試験
したところ、4 株全てが同じ結果を与えた。
【０２２９】 図10A に、野生型対照Tn5 挿入株MM28および代表的luxSV.h.::Tn5 挿入株の一
つMM30のAI-2産生表現型を示す。V.harveyi MM28およびMM30を高細胞密度に達す
るまで増殖させた後、無細胞培養液を調製した。それらの培養液を、そのAI-2活
性について、AI-2検出株BB170 における発光を誘導する能力によってアッセイし
た。図10A は、対照Tn5 挿入株MM28から得た培養液の添加によってレポーターに
おける発光が780 倍誘導され、一方、luxSV.h.::Tn5 挿入株MM30から得た培養液
はレポーターにおける発光の発現を誘導しなかったことを示している。したがっ
て、V.harveyi におけるluxSV.h.中のヌル突然変異は、AI-2産生を消失させる。
【０２３０】 S.typhimurium オートインデューサー産生突然変異体の同定と解析。S.typhim
urium におけるAI-2産生を担う遺伝子を同定するために、MudJトランスポゾンを
使ってS.typhimurium LT2 にランダム突然変異誘発を行った（Maloy ら,1996,前
掲）。10,000個のS.typhimurium LT2 挿入突然変異体を、V.harveyi BB170 バイ
オアッセイで、AI-2産生についてアッセイした。指数期中期の培養液に検出可能
なAI-2を持たないS.typhimurium MudJ挿入突然変異体（CS132 株）を1 つ同定し
た。
【０２３１】 図10B に、S.typhimurium LT2 株と、対応するMudJ挿入株CS132 のAI-2産生表
現型を示す。各株をグルコース含有LB中で指数期中期まで増殖させ、無細胞培養
液を調製し、AI-2についてアッセイした。S.typhimurium LT2 培養液はレポータ
ー株を500 倍誘導したが、CS132 株から得た培養液はAI-2活性を持っていなかっ
た。さらにCS132 株は、本発明者らがS.typhimurium におけるAI-2産生を誘導す
ると先に報告したどの増殖条件でも、AI-2を産生しなかった（非掲載データ）。
【０２３２】 S.typhimurium CS132 におけるMudJの挿入部位を、PCR 増幅後に、トランスポ
ゾンに隣接する110bp の染色体DNA を配列決定することによって決定した。この
配列を使ってデータベースのDNA ホモロジー検索を行った。この配列は、ygaGと
呼ばれる機能未知のオープンリーディングフレーム（Blattnerら,1997,前掲）に
相当するE.coli MG1655 ゲノム中のある部位と一致した（89/105bpが一致）。染
色体では、E.coli ygaG 遺伝子には、gshA遺伝子とemrB遺伝子が隣接している（
図9B）。ygaG遺伝子は当該遺伝子のすぐ上流に位置する自分自身のプロモータ
ーから転写されることから、ygaG遺伝子はgshAと同じオペロンに含まれてはいな
いことがわかる。emrB遺伝子は反対方向に転写される。本発明者らはE.coli O15
7:H7およびE.coli MG1655 の染色体からygaG領域をPCR で増幅し、それら2 つの
E.coli ygaG 遺伝子をpUC19 にクローニングした。
【０２３３】 S.typhimurium およびE.coli AI-2 - 突然変異体の相補性。E.coli O157:H7 y
gaG 遺伝子およびV.harveyi luxSV.h.遺伝子が、AI2 - 株S.typhimurium CS132
およびE.coli DH5αにおけるAI-2産生を回復させることができるかどうかを調べ
た。図11A に、野生型V.harveyi BB120 、E.coli O157:H7およびS.typhimurium
LT2 によって産生されるAI-2活性を示す。この図では、V.harveyi BB120 無細胞
培養液中に存在するAI-2活性のレベルを100 ％に標準化し、E.coliおよびS.typh
imurium から得られる無細胞培養液中の活性をこれと比較した。この実験では、
V.harveyi BB120 と比較して、E.coli O157:H7は1 ．5 倍、S.typhimurium LT2
は1.4 倍（すなわちそれぞれ150 ％および141 ％）のAI-2活性を産生した。
【０２３４】 図11B および11C は、S.typhimurium CS132 およびE.coli DH5αに関するAI-2
相補性の結果を示す。図11B は、E.coli O157:H7 ygaG 遺伝子をS.typhimurium
CS132 に導入することにより、AI-2産生が野生型S.typhimurium の産生レベル以
上に回復したこと（すなわち209 ％活性）を証明している。図11A および図11B
のデータを比較すると、S.typhimurium 中のE.coli ygaG 遺伝子は、E.coli O15
7:H7が生体内で産生する量を超えるAI-2産生をもたらしたことがわかる。V.harv
eyi LuxSV.h.遺伝子をS.typhimurium に導入すると、野生型V.harveyi BB120 が
産生するレベルよりわずかに低い（すなわちV.harveyi BB120 のレベルの73％）
AI-2産生が起こった。図11C は、E.coli DH5αも、クローン化E.coli O157:H7お
よびV.harveyi BB120 AI-2産生遺伝子によって相補されて、AI-2を産生したこと
を示している。しかし、E.coli O157:H7 ygaG およびV.harveyi BB120 luxSV.h. をE.coli DH5αに導入した場合は、それぞれV.harveyi BB120 AI-2活性の31％
および43％しか得られなかった。図11B および図11C は対照ベクターがこの相補
性実験では活性をもたらさなかったことを示している。
【０２３５】 V.harveyi 、E.coliおよびS.typhimurium 由来のAI-2産生遺伝子の解析。V.ha
rveyi BB120 由来のAI-2産生遺伝子LuxSV.h.、およびE.coli O157:H7、E.coli M
G1655 およびE.coli DH5αのygaG遺伝子座を配列決定した。ygaG ORFによってコ
ードされる翻訳タンパク質配列を図12に示し、V.harveyi の翻訳LuxSタンパク質
配列と整列する。ボールド体でない下線付きのアミノ酸は、V.harveyi LuxSタン
パク質とは異なるE.coliタンパク質中の残基である。E.coliのygaG遺伝子座は互
いに高度に相同であり、V.harveyi のLuxSタンパク質とも高度に相同である。E.
coli MG1655 （配列番号25）およびE.coli O157:H7（配列番号11）YgaGタンパク
質は、V.harveyi BB120 （配列番号10）のLuxSと77％および76％一致する。E.co
li O157:H7由来のygaGに関して本発明者らが決定したDNA 配列は、E.coli MG165
5 ygaG遺伝子に関して報告されている（本発明者らの）配列とは、5 つの部位で
異なる。これらの変化のうち4 つはサイレントであり、残りの1 つはE.coli O15
7:H7タンパク質のアミノ酸残基103 に保存的なAla からVal への変異をもたらす
。
【０２３６】 E.coli MG1655 およびE.coli O157:H7にygaG遺伝子座が同定されたことにより
、E.coli DH5αにおけるAI-2産生欠損を調べることが可能になった。E.coli DH5
αはygaG遺伝子を持っている。なぜなら本発明者らは、本発明者らがE.coli MG1
655 およびE.coli O157:H7からygaG遺伝子を増幅する際に使ったものと同じプラ
イマーを使って、E.coli DH5αの染色体からygaG領域をPCR 増幅することができ
たからである。E.coli DH5α ygaG プロモーターを調べたところ、それはE.coli
MG1655 と同じであることがわかった。これは、E.coli DH5αにおけるAI-2欠損
が、単にygaGの転写の減少によるものではないことを示している。しかし、E.co
li DH5α ygaG コード領域の配列解析により、1 つのG-C 塩基対欠失と、1 つの
T →A トランスバージョンとが、それぞれ第222 塩基対および第224 塩基対に存
在することがわかった。G/C 欠失に起因するフレームシフト突然変異は、E.coli
DH5αタンパク質の早期切断を引き起す。図12は、切断型E.coli DH5αタンパク
質が111 アミノ酸であり、一方、E.coli MG1655 およびE.coli O157:H7タンパク
質は171 残基であることを示している。フレームシフト後はタンパク質の末尾ま
で20の改変アミノ酸が翻訳される。本発明者らが行った相補性実験の結果（図11
）は、E.coli DH5αにおけるAI-2産生欠損が、ygaGのトランスでの発現に対して
劣性であることを証明しており、これは、欠損の原因がE.coli DH5α ygaG 遺伝
子中のフレームシフトによって起こったヌル突然変異であることと合致する。
【０２３７】 本発明者らは、S.typhimurium CS132 のAI-2産生機能を不活化するMudJに隣接
している（本発明者らが得た）配列を使って、S.typhimurium データベースを検
索した。完全な一致（110/110bp ）がS.typhimurium LT2 ゲノム配列データベー
ス（ワシントン大学Genome Sequencing Center（セントルイス））中のフラグメ
ントB ＿TR7095.85-T7に同定された。しかし、このS.typhimurium LT2 データベ
ースygaG配列（配列番号26）は不完全である（図12）。翻訳配列は第8 アミノ酸
残基から始まるE.coli配列およびV.harveyi 配列と一致する。翻訳配列から、S.
typhimurium タンパク質はV.harveyi のLuxSと75％同一であることがわかる。S.
typhimurium 配列をV.harveyi LuxSタンパク質と整列するために、本発明者らは
データベース配列中の3 つの明らかなフレームシフトエラーを修正した。S.typh
imurium については現時点では注釈なしの生の配列データしか利用できないこと
を考えると、本発明者らは、S.typhimurium タンパク質はさらに7 個のアミノ酸
を含み、フレームシフト突然変異は配列決定エラーであると予想する。E.coli用
に設計したプライマーを使ってS.typhimurium 14028 またはS.typhimurium LT2
のygaG遺伝子をPCR 増幅する試みは不成功に終わったので、本発明者らはS.typh
imurium 遺伝子の完全配列をまだ得ていない。
【０２３８】 上述した結果は、本発明者らが同定し解析した遺伝子が、オートインデューサ
ー産生を担う新規タンパク質ファミリーをコードすることを示している。本明細
書でLuxSと呼ぶこの新しい遺伝子ファミリーのメンバーは互いに高度に相同であ
るが、他の同定された遺伝子とは相同でない。LuxS遺伝子にコードされている産
物は、本発明のシグナル伝達分子の合成に不可欠なステップを触媒する。
【０２３９】 実施例4 −センサー1 - ,AI-2 - V.harveyi レポーター株の構築 lux 遺伝子luxL、luxM、luxN、luxSおよびluxQのそれぞれのV.harveyi ヌル突
然変異体は、一つの特定オートインデューサーを産生することができないか、ま
たは一つの特定オートインデューサーに応答することができないが、それでも光
は生成する。なぜなら、いずれの場合も、一つの定数感知システムは作動できる
状態を保っているからである。luxN,luxS 二重V.harveyi 突然変異体は外からAI
-2を添加しないと光を放射しない。なぜなら、この突然変異体はAI-1に応答せず
、AI-2を産生しないからである。
【０２４０】 V.harveyi LuxS遺伝子をpLAFR2と呼ばれる広宿主域可動性コスミドにのせてE.
coli DH5にクローニングした。このコンストラクトは、E.coli DH5に、AI-2産生
を回復させる。クロラムフェニコール耐性（Cmr ）カセットを内部の制限部位に
導入することにより、標識付きのヌル突然変異をluxS遺伝子に導入した。luxS中
のこの部位へのCmr カセットの配置により、E.coli DH5におけるAI-2産生は排除
された。
【０２４１】 luxS::Cmr ヌル対立遺伝子をV.harveyi BB170 株の染色体上に導入した。BB17
0 株はluxN中にTn5Kanr を持ち、AI-1には応答しない。二重突然変異体を構築す
るために、pLAFR2中にV.harveyi luxS::CMr 構造を持つE.coli DH5（pLAFR2はテ
トラサイクリン耐性を持つ）、tra ドナープラスミドpRK2013 を持つE.coli DH5
α、およびV.harveyi レシピエント株BB170 の定常期培養物を混合することによ
って、三親接合を行った。luxS::Cmr 突然変異体対立遺伝子と、染色体上の野生
型luxS対立遺伝子との交換は相同組換えによって起こる。V.harveyi 中のエキソ
ゲノートコスミドは、第2 の不和合プラスミドpPH1JIの導入によって排除した。
これは、pPH1JIを含んでいるE.coli DH5αを、luxS::Cmr コスミドを含んでいる
V.harveyi BB170 レシピエントと接合させ、アンピシリン（E.coliドナーの対抗
染色用）、クロラムフェニコール（突然変異体luxS::Cmr 対立遺伝子の遺伝用）
およびゲンタマイシン（プラスミドpPH1JIの維持用）を含むプレートで、接合完
了体を選択することによって達成した。サザンブロット解析法を使って、エキソ
ゲノートpLAFR2コスミドが排除されていること、およびluxS::Cmr 構造がV.harv
eyi のゲノムの対応する位置に導入されていることを確認した。次に、ゲンタマ
イシン選択の不在下で増殖させることにより、pPH1JIコスミドを排除した。
【０２４２】 LuxN,LuxS 二重突然変異体がAI-2に応答することの確認。luxNおよびluxSに突
然変異を持つV.harveyi 株は、外から添加されたAI-2に応答して光を生成するよ
うに刺激されるが、AI-1には応答しない。このことをV.harveyi AI-1およびAI-2
への応答に関する発光アッセイで確認した。表現型がAI-1+ ,AI-2 - であるV.ha
rveyi MM30株（luxS::Tn5 ）および表現型がAI-1- 、AI-2+ であるV.harveyi BB
152 株 （luxM::Tn5 ）をそれぞれAI-1およびAI-2の供給源として使用した。こ
れらの株の培養液中に存在するAI-1およびAI-2を、V.harveyi LuxN,LuxS 二重突
然変異体レポーター株の光生成の刺激について試験した。このアッセイでは、MM
30もしくはBB152 からのオートインデューサー調製物または滅菌培地対照をマイ
クロタイタープレートのウェルに加えた後、V.harveyi レポーター株を添加した
。その結果起こる光生成を、化学発光モードの液体シンチレーションカウンター
によってモニターした。V.harveyi luxN,luxS レポーター株における光生成の最
大刺激を、センサー1 + , センサー2 - V.harveyi BB886 株およびセンサー1 -
, センサー2 + V.harveyi BB170 株が生成する光量と比較した。これらの2 つの
V.harveyi 株は、それぞれAI-1活性およびAI-2活性のレポーターとして、このア
ッセイでは常用する。
【０２４３】 マイクロタイターアッセイでのAI-2の至適濃度の決定。上述のスクリーニング
は、96穴マイクロタイターアッセイ用に最適化されるだろう。このスクリーニン
グはAI-2の阻害剤を同定するための阻害剤アッセイに使用されるだろう。精製ま
たは合成AI-2が、新たに構築されたレポーター株を含むマイクロタイターウェル
に添加され、阻害剤を含むウェルからの光放射の低下によって阻害が測定される
だろう。このアッセイは、感度が最大になるようなマイクロタイターウェル中の
細胞濃度およびAI-2濃度を決定することによって最適化されるだろう。至適AI-2
濃度は、所定の細胞濃度で単位時間あたり半最大値の光出力を刺激する濃度だろ
う。初期実験はこの濃度範囲で行って、光出力の最大変化をもたらすAI-2濃度の
範囲を決定する。AI-1および非自己刺激性センサー1 + , センサー2 - 突然変異
体（BB886 ）を使った同様の実験では、このアッセイがわずか100nM のAI-1濃度
にも感度を持ち、光放射は6 桁にわたって線形（自己刺激株からの光放射は3 桁
にわたって線形）であることがわかった。同様の結果は、自己刺激せずしたがっ
てバックグラウンド光放射が0 であるような新しいレポーター株を使うと、AI-2
についても同様の結果が予想される。マイクロタイターウェルからの光放射は、
化学発光モードのWallac Trilux 液体シンチレーションカウンター1450-021型で
測定されるだろう。この装置は16プレートを収容するので、1 回につき1536個の
独立した濃度実験が可能だろう。
【０２４４】 実施例5 −AI-2のインビトロ合成法：AI-2の精製および同定 オートインデューサー2 がアシル- ホモセリンラクトンではないことは、数系
統の証拠が示している。オートインデューサー2 は、V.harveyi 由来のAI-1のよ
うなアシル- ホモセリンラクトンオートインデューサーの単離に使用される従来
の技術では精製できない。他のアシル- ホモセリンラクトンオートインデューサ
ーとは異なり、AI-2活性は有機溶媒に定量的には抽出されない。さらにオートイ
ンデューサー2 は、カチオン交換カラムにもアニオン交換カラムにも結合できな
い。オートインデューサー2 のこの特徴づけは、これが1000kDa 未満の分子量を
持ち、極性ではあるが非荷電であるらしい有機化合物であることを示している。
AI-2活性は酸安定、塩基不安定であり、約80℃までの加熱には耐えるが、100 ℃
の加熱には耐えない。同定されたluxS遺伝子が、HSL オートインデューサーの産
生に関与することが知られている他の遺伝子に対してホモロジーを持たないこと
も、このAI-2オートインデューサー群が新規であることを示している。
【０２４５】 したがって本発明は、クローン化し、過剰発現させ、精製したS.typhimurium
LuxSタンパク質を提供するだけでなく、AI-2をインビトロで製造する方法も提供
する。本発明は、質量スペクトル分析およびNMR 分析に役立ち、AI-2の活性を調
節する化合物のスクリーニングに役立つ、純粋なAI-2を大量に生成するための機
構を提供する。さらに本発明は、AI-2合成のためのインビボ生合成経路を決定す
る方法も提供する。
【０２４６】 本発明で同定された様々なluxS遺伝子のゲノム位置の解析により、luxS遺伝子
は染色体の一部位に一貫して存在するのではなく、典型的に特定の遺伝子に近接
して認められるわけでもないことが示される。しかし、ある例では、luxS遺伝子
は2 つの遺伝子（metKおよびpfs ）と共に3 遺伝子オペロン中に存在する第3 の
遺伝子である。E.coli、Salmonellaおよび他の多くの細菌では、MetKおよびPfs
はS-アデノシルメチオニン（SAM ）のホモシステインおよびオートインデュー
サー2 への変換に関与している（図15）。MetKはメチオニンを一炭素代謝の重要
な補因子であるSAM に変換する。SAM はDNA 、RNA および様々な細胞タンパク質
をメチル化し、いくつかのSAM 依存性メチルトランスフェラーゼはこのステップ
で作用する。S-アデノシルホモシステイン（SAH ）は、メチル基がSAM からその
基質に転移することによって生じる。SAH はSAM 依存性メチルトランスフェラー
ゼを強く阻害する。したがって、細菌はSAH を酵素Pfs によって迅速に分解する
。「pfs 」という名称は、酵素5'- メチルチオアデノシン/S- アデノシルホモシ
ステインヌクレオシダーゼ（MTA/SAH ヌクレオシダーゼともいう）をコードする
ことが最近決定されたE.coliゲノム中のオープンリーディングフレームを指す。
この系では、この酵素はS-アデノシルホモシステイン（SAH ）中のグリコシド結
合を切断する。したがって、Pfs はSAH をアデニンとS-リボシルホモシステイン
とに変換する。最終ステップでは、S-リボシルホモシステインが切断を受けてホ
モシステインおよびオートインデューサー2 を生成する。ホモシステインはメチ
ル化を受けて、MetKによってSAM に変換されうるメチオニンを生成した後、この
経路に再び入っていくことができる。
【０２４７】 SAH の異化は代謝中間体（アデニンおよびホモシステイン）を再利用するため
のサルベージ経路である。しかし一部の細菌は、アデノシンをSAH から直接除去
してホモシステインを生成することによって、SAH を排除する。この第2 の機構
を利用する細胞はオートインデューサー2 を産生しない。図15に示すこの経路で
、S-リボシルホモシステインから4,5-ジヒドロキシ-2- シクロペンテン-1- オン
または4-ヒドロキシ-5- メチル-2H-フラン-3- オンへの変換を担う酵素はこれま
で同定も、クローニングも、精製もされていなかった。
【０２４８】 LuxSは図15に示す経路に関与し、SAM およびSAH はAI-2産生に関与する。AI-2
の構造は4,5-ヒドロキシ-2- シクロペンテン-1- オンまたは4-ヒドロキシ-5- メ
チル-2H-フラン-3- オンであることができ、その場合、LuxSはS-リボシルホモシ
ステインに作用するまだ特徴付けがなされていない酵素である。第2 に、LuxSは
中間体の一つに作用してAI-2を生成するのかもしれない。LuxSは既知の経路から
の分岐点に相当するのだろう。
【０２４９】 LuxSがSAM からAI-2への変換に関与することを確認するために、S.typhimuriu
m LuxSタンパク質をコードする遺伝子をクローン化し、過剰発現させ、S.typhim
urium LuxSタンパク質を精製した。このタンパク質をS.typhimurium luxSヌル突
然変異体から調製した透析無細胞抽出物と組み合わせて使用することにより、SA
M およびLuxSタンパク質の添加が透析したLuxS- 細胞抽出物にAI-2産生を回復さ
せうることを示した。10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0 、透析したS.typhimur
ium LuxS- 細胞抽出物およびSAM を含む反応混合物を調製した。精製LuxSタンパ
ク質をこれらの混合物の一部に添加した。反応系を室温で60分間インキュベート
した後、分子量カットオフ5000のセントリコンで遠心分離した。5000未満の分子
量を持つ物質を既述の標準V.harveyi バイオアッセイに添加した。SAM を加えた
透析LuxS- 細胞抽出物またはSAM が添加されていないLuxSタンパク質含有抽出物
はAI-2活性を産生しなかった。しかし、同じ抽出物にLuxSタンパク質およびSAM
を加えたものはAI-2を産生し、バイオアッセイにおける光生成を500 倍以上刺激
した。
【０２５０】 さらなる研究により、SAM はLuxSの直接の基質ではないこと、そしてLuxSはSA
M からSAH への変換に続いて起こるステップで作用するに違いないことがわかっ
た（図15）。SAM をLuxSタンパク質に直接加えてもAI-2は産生されないが、SAM
をLuxS- 抽出物と共にプレインキュベートし、濾過し、続いてその濾液にLuxSタ
ンパク質を添加すると、活性は産生されることが確認された。重要なことに、こ
れらの研究は、SAM がLuxSによって利用されてAI-2を生成できるようになる前に
、SAM が細胞抽出物中の要素と反応しうることを示している。おそらく細胞抽出
物中に存在するSAM 依存性メチルトランスフェラーゼがSAM をメチル供与体とし
て利用し、その過程でSAM をSAH に変換するのだろう。これを検証するために、
インビトロアッセイでSAM の代わりにSAH を使用した。インビトロアッセイにSA
H を添加すると、SAM を添加した時よりはるかに多量のAI-2産生が起こった。こ
の結果は、この経路ではLuxSがSAM からSAH への変換後に機能することを示して
いる。この場合もLuxSタンパク質に直接SAH を添加しただけではAI-2活性の産生
には不十分であり、SAH を透析LuxS- 抽出物とプレインキュベートした後、濾過
し、次にその濾液にLuxSタンパク質を添加することによって、AI-2産生が起こる
。おそらくSAH はS-リボシルホモシステインに変換された後、LuxSが作用したAI
-2を生成するのだろう。
【０２５１】 図15に示す提案経路は二次代謝産物を再利用するためのサルベージ経路ではな
く、むしろAI-2を産生するための経路である。本発明によれば、AI-2はリボース
の誘導体である。V.harveyi において、AI-2の主要センサーであるLuxPがE.coli
およびS.typhimurium リボース結合タンパク質のホモログであることは、注目に
値する。
【０２５２】 実施例6 −AI-1媒介定数感知経路の阻害剤に関するバイオアッセイ オートインデューサー1 定数感知システム検出用の定量的アッセイは、M.Mane
field らの先の報文Microbiol 145,283-291 （1999）に見いだされる。
【０２５３】 このバイオアッセイの一例では、構造VII のハロゲン化フラノンなどの試験化
合物をエタノールに溶解して、このアッセイに使用する。
【０２５４】 A.Eberhardら,Arch Microbiol 146,35-40(1986) の方法に従って製造したV.fi
scheriのAI-1オートインデューサー、合成OHHL（N-3-( オキソヘキサノイル)-L-
ホモセリン) を、酢酸エチルに溶解してアッセイに使用する。[3H]OHHLはH.Kapl
anら,J Label Compd Radiopharm 22,387-395(1985)の方法に基づいて製造する。
【０２５５】 生物発光は、液体シンチレーションカウンターで相対発光単位として定量する
。OHHL（10nM〜100nM OHHL）および試験化合物（100 μM まで）を希釈培地（OD
600 ＜0.0005）10mLに添加した後、試料100 μL の発光応答を三連で測定する。
対照処理には、適当な濃度のエタノール溶媒を組み込む。適当な培地中の10ml培
養物のOD600 を誘導期から指数増殖期を経て定常期まで追跡することによって、
増殖をモニターする。
【０２５６】 実施例7 −ペプチド媒介定数感知機構の阻害剤に関するバイオアッセイ ペプチド媒介定数感知システム検出用のアッセイは、M.Ottoら,FEBS Lett.450
,257-262(1999)に記載の先の報告に基づいている。S.epidermidis Tue3298 （DS
M ）は野生型試験株であり、プロモーター試験プラスミドの宿主である。 -毒素
産生に関する試験を行うS.aureus株は、S.aureus Newman 、8325-4、SA113 、AT
CC12600 、RN4220、およびOttoら(1999)のATCC33591 である。S.aureus RN6390
はプロトタイプ株であり、この株から以下の突然変異株が派生した：arg::getM
突然変異を持つ同質遺伝子突然変異体宿主S.aureus RN6911 「agr-」、sar::Tn9
17LTV1突然変異を持つ「sar-」、およびsar::Tn917LTV1突然変異とagr::tetM 突
然変異の両方を持つA.L.Cheungら,J.Clin.Invest.94,1815-1822(1994) の「agr-
/sar- 」。S.epidermidis Tue3298 に挿入されたプロモーター試験プラスミドは
、R.Brueckner ら,EMBO J.4 2950-2300(1985) のプロモーターレスpUB112 cat遺
伝子をマルチクローニングサイトに近接して含んでおり、トランスポゾンTn551
由来のエリスロマイシン耐性遺伝子ermBを保持している。プラスミドpRB594P3は
、上記マルチクローニングサイトのBamHI 部位に、S.epidermidis ATCC14990 の
agrP3 領域のBamHI 消化PCR 産物を挿入することによって構築される。
【０２５７】 TSB またはBM（「基礎培地」1 ％トリプトン（Difco ）、0.5 ％酵母エキス（
Gibco BRL ）、0.5 ％NaCl、0.1 ％K2HPO4、0.1 ％グルコース）で増殖させたS.
epidermidis 細胞を、C.Sizemoreら,Mol.Gen Genet.227,377-384(1991)に記載さ
れているように、ガラスビーズにより、20mM Tris-HCl （pH7.8 ）中で破砕する
。細胞片を遠心分離（10分、5000×g ）によって除去する。その粗製細胞抽出物
をさらに10500 ×g で1 時間の追加の超遠心分離にかけることによって膜画分を
調製する。細胞を100 ℃で5 分間煮沸し、遠心分離（10分、5000×g ）すること
によって、表面結合タンパク質を単離する。表面タンパク質は、細胞をリソスタ
フィンと共に37℃で10分間インキュベートし、遠心分離（10分、5000×g ）する
ことによって単離する。染色体スタフィロコッカスDNA は、J.Mamur,J.Mol.Biol
.3,208-218(1961)の方法に従って調製する。タンパク質は、Bio-Rad Protean II
xiチャンバーと16cmの分離長とを使用して、H.Schaegger,H.Anal.Biochem.166,3
68-379(1987)に従ってトリシン-SDS-PAGE によって分離する。
【０２５８】 粗製ペプチドは、検出器としてLambda Max 481型を装着したWaters 600マルチ
ソルベントデリバリーシステムで単離する。半定量的カラム（Nucleosil C18 、
4 ×250mm ；5m；Grom、Herrenberg（ドイツ））は、流速3.5ml/分の直線的勾配
（45分で10-100％B/A ；溶媒A ：0.1 ％トリフルオロ酢酸（TFA ）水溶液、溶媒
B ：0.1 ％TFA アセトニトリル溶液）で溶出させる。検出波長は214nm とする。
ジメチルスルホキシド（DMSO）に再溶解した精製ペプチドの濃度は、Kontron HP
LCシステムでの分析HPLCと、Kroma System 2000 ソフトウェアとを使って決定す
る。分析カラム（Spherisorb ODS2 2 ×100mm ；5 μM ；Grom,Herrenberg （ド
イツ））は、流速250 μl/分の直線的勾配（30分で0-100 ％B/A ；溶媒A ：0.1
％TFA 水溶液、溶媒B ：0.1 ％TFA アセトニトリル溶液）で溶出させる。検出波
長は214nm とする。既知量の（無修飾）ペプチドDSVCASYFを基準として使用する
。Pharmacia Resource PHE 1mlカラムを1.5 カラム体積の直線的勾配（0-100 ％
B/A ；溶媒A ：0.1 ％TFA 水溶液、溶媒B ：0.1 ％TFA アセトニトリル溶液）で
溶出させる。S.epidermidis δ- 毒素は、AEKTA エクスプローラー100 システム
（Amersham Pharmacia Biotech（ドイツ・フライブルク））で同じ条件を使って
溶出させる。単離したδ- 毒素をESI-MSによって化学的に分析する。
【０２５９】 CAT 活性はW.V.Shaw（1975）Methods Enzymol.43,737-755の方法に従って決定
する。アッセイ混合物には、100mM Tris-HCl（pH7.8 ）、0.1mM アセチル- 補酵
素A および0.4mg の5,5'- ジチオビス-2- ニトロ安息香酸（DTNB/ml ）を含めた
。アッセイは96穴マイクロタイタープレートで、SpectraMax340 マイクロタイタ
ープレートリーダー（Molecular Devices （米国カリフォルニア州サニーベール
））とSpectraMaxPro ソフトウェアとを使って行う。細胞抽出物（5 μl ）およ
び100 ％エタノール中の5mM クロラムフェニコール（5 μl ）（または対照群で
は5 μl の100 ％エタノール）を90μl のアッセイ混合物に加える。必要に応じ
て細胞抽出物を20mM Tris-HCl （pH7.8 ）で1:10または1:100 に希釈する。412n
m での吸収を15秒ごとに20分間測定する。得られた曲線の直線部分を使ってCAT
活性を決定する（DTNBの吸収係数＝13600 l/M ）。比活性を計算するために、Bi
o-Rad DC界面活性剤含有試料用プロテインアッセイ（Bio-Rad Laboratories Gmb
H （ドイツ・ミュンヘン））を使って、細胞抽出物のタンパク質含量を決定する
。
【０２６０】 セミドライ法を使ってSDS-ポリアクリルアミドゲルをニトロセルロース膜（Sc
hleicher and Schuell BA83 ）にブロットする。ブロットを5 ％脱脂乳で終夜ブ
ロッキングする。第1 抗体を1:20,000（抗- - 毒素）または1:40,000（抗プロテ
インA ）の濃度で2 時間適用する。洗浄後、ブロットをAmersham Pharmacia製の
抗IgG 結合HRP （1:5000）と共に1 時間インキュベートする。希釈液は全てTris
緩衝食塩水（TBS ：10mM Tris-HCl （pH7.4 ）、150mM NaCl）で調製する。シグ
ナルは、ECL 検出システム（Amersham Pharmacia Biotech（ドイツ・フライブル
ク））を使って検出する。
【０２６１】 ヒツジ血寒天ベース（Oxoid ）を使用し、そこに5 ％脱フィブリンヒツジ血を
添加することによって、血液プレートを調製する。試料をフィルター上にスポッ
トし、それを乾燥させた後、寒天プレートにのせ、37℃で少なくとも24時間イン
キュベートする。
【０２６２】 実施例8 −抗生物質感受性アッセイ 抗微生物剤感受性試験は、1977年1 月に公表された米国臨床検査標準委員会（
National Committee for Clinical Laboratory Standards＝NCCLS ）の標準法「
ブロス希釈法（微量希釈）［Broth Dilution Procedure (Microdilution)］」（
改訂版）に従って行った。この方法では細菌増殖の完全な阻害に必要な最小発育
阻止量（MIC ）が得られる。抗生物質の希釈系列を使用し、全てのウェルが一定
に保たれた濃度の阻害剤化合物を含むようにして、MIC を決定した。さらに、こ
の感受性試験を行う前に、阻害剤化合物を適当な阻害剤スクリーニングで試験し
た（例えばAI-2阻害剤2-エチル-4- ヒドロキシ-5- メチル-3(2H)- フラノンにつ
いて図32を参照されたい）。阻害活性がスクリーニングによって証明されたら、
阻害剤を抗生物質活性についても試験した。実験は0.1ml/ウェルの最終体積を使
って96穴マイクロタイタープレートで行った。アッセイはMueller-Hintonブロス
、Todd-Hewitt ブロスまたはニュートリエントブロス（Difco ）を使って行った
。細菌接種物をStreptococcus pyogenes ATCC19615またはStaphylococcus aureu
s ATCC 25923の対数期終夜培養物から調製した。培養物の濁度を食塩水で0.05マ
クファーランド標準液に調節し（107CFU/ml ）、この接種物のうち5 μl を各ウ
ェルに加えた。阻害剤化合物は、原液を水に溶解することによって調製した。定
数阻害剤化合物の作業用保存液は、原液を細菌用ブロスで希釈することによって
作製した。これらの実験では抗生物質のナトリウム塩を使用した。原液（10mg/m
l ）は、秤量した抗生物質を水またはDMSOに溶解することにより、製造者の説明
通りに調製した。抗生物質は全て一連のウェルに2 倍段階希釈液として添加して
、100 g/ml〜0.1 g/mlの範囲の最終濃度にした。唯一つの例外は、最終用量を30
0 g/ml〜2.5 g/mlの範囲としたスルフィソキサゾールである。細菌用ブロスを希
釈剤として使用した。使用した抗生物質濃度の範囲は、抗生物質単独の場合のMI
C およびそれ未満になるように選択した。培養物を密封し、37℃で20時間インキ
ュベートした。600nm での吸光度の分光光度測定によって、MIC 値を決定した。
MIC 値はチューブ中の試験生物の99％の増殖を完全に阻害する抗生物質の最低濃
度と定義する。抗生物質および定数阻害剤化合物のMIC を抗生物質を単独で使用
して測定したMIC と比較することによって、MIC 濃度の変化倍率を決定した。
【０２６３】 上記の抗微生物アッセイを使用したところ、定数阻害剤化合物2-エチル-4- ヒ
ドロキシ-5- メチル-3(2H)- フラノンと、バンコマイシン、シプロフロキサシン
またはスルフィソキサゾールとの併用は、試験株に対して著しい相乗作用を示し
た。定数阻害化合物は、細胞増殖を阻害しなかった（図33）。バンコマイシンの
最小発育阻止濃度（MIC ）は、単独では約100 g/mlだった。濃度5 g/mlの阻害剤
化合物と併用した場合、バンコマイシンのMIC はほぼ同じだったが、12.5 g/ml
の定数阻害剤化合物と併用すると、MIC は約1.6 マイクログラム/ ミリリットル
になった。定数阻害剤化合物の濃度を50 g/ml に増やしても、バンコマイシンの
MIC は同じだった。最後に、阻害剤単独の場合は、MIC は100 g/mlより高かった
。同じ試験株に対して、シプロフロキサシンは単独で0.8 g/mlのMIC を持つ。濃
度25 g/ml の同じ定数阻害剤分子との併用により、シプロフロキサシンは0.4 g/
mlのMIC を示した。阻害剤単独で試験すると、MIC はやはり100 g/mlより高かっ
た。同じ試験株に対して、スルフィソキサゾールは、約300 マイクログラム/ ミ
リリットルのMIC を示したが、濃度100 マイクログラム/ ミリリットルの定数阻
害剤化合物の存在下では約100 g/mlのMIC を示した。この場合も、阻害剤化合物
は、単独では100 マイクログラム/ ミリリットルより高いMIC を示した。他の試
験株Staphylococcus aureus に対して、アンピシリンは1.6 g/mlのMIC を持った
が、阻害剤化合物（25 g/ml ）の存在下ではこの抗生物質は0.4 g/mlのMIC を持
った。
【０２６４】 実施例9 −ハロゲン化フラノン類の単離 構造VII のハロゲン化フラノン類の多くは、R.de Nys,Tetrahedron 49,11213-
11220 （1993）によって確立されたプロトコールによって、それぞれの宿主細菌
から抽出される。藻類組織を凍結し、凍結乾燥し、ジクロロメタンで抽出し、減
圧下で濃縮する。純粋な化合物は、この粗製抽出物から、バキューム液体クロマ
トグラフィーおよびHPLCによって単離し、1Hおよび13C NMR 分光法によって同定
する。
【０２６５】 実施例10−ペプチド定数感知機構の阻害剤の製造 式： (cyclo)-YSTCDFIM、 (cyclo)-GVNACSSLF 、 (cyclo)-GVNASSSLF 、および (cyclo)-GVNA(DAPA)SSLF ［式中、C 末端カルボニル基はシステイン残基の硫黄原子とチオラクトンを形成
するか（YSTCDFIMおよびGVNACSSLF ）、第1 セリン残基の酸素原子とラクトン基
を形成するか（GVNASSSLF ）、またはジアミノプロピオン酸（DAPA）残基のアミ
ノ基とアミド結合を形成する（GVNA(DAPA)SSLF）] の環状ペプチドを、トリチル樹脂（PepChem ：Clausen およびGoldammer （ドイ
ツ・チュービンゲン））で、Fmoc/tBu法を使って合成する。ペプチドの配列はDS
VXASYFであり、位置X はシステイン（C ）、セリン（S ）または1,3-ジアミノプ
ロピオン酸（Dpr ）である。対応する環状ペプチド合成用の保護アミノ酸は、Fm
oc-Cys (Mmt)-OH 、Fmoc-Ser(Trt)-OH（どちらもジクロロメタン中TFA:TIS で切
断可能）およびFmoc-Dpr(Dde)-OH（ヒドラジンで切断可能）である。環状ペプチ
ドはM Ottoら(1998)FEBS Lett.424,89-94 に従って合成し、精製する。ペプチド
の純度（＞90％）はRP-C18クロマトグラフィーおよびESI-MSによって制御する。
【０２６６】 実施例11−AI-2類似体の特徴づけおよび生合成 さらに本発明は、純粋なAI-2のインビトロ大量製造法も提供する。図15に示す
ように、SAH はAI-2のLuxS依存的生合成における前駆体である。さらにLuxSは直
接的にはSAH に作用しない。LuxSの作用に先立って、透析細胞抽出物中の酵素が
まずSAH に作用して、SAH をPfs によってS-リボシルホモシステインに変換しな
ければならない。したがって、LuxSの基質はS-リボシルホモシステインである。
【０２６７】 LuxSがS-リボシルホモシステインに作用することを確認するために、Pfs 酵素
を精製し、それを使ってSAH をS-リボシルホモシステインに変換することができ
る。この目的を達するために、S.typhimurium 14028 からpfs 遺伝子が過剰発現
ベクターpLM-1 に挿入された状態でクローニングされている。Pfs 酵素を過剰発
現させ、精製したPfs にSAH を加えてS-リボシルホモシステインを生成させる。
SAH からS-リボシルホモセリンへの変換は、逆相HPLC分析によって確認されるだ
ろ う（SAH はUV活性であるが、S-リボシルホモシステインはUV不活性である）
。次に、Pfs によって産生されたS-リボシルホモシステインを精製したLuxSに加
える。インキュベーション後に、混合物を分子量カットオフ5000のセントリコン
で濾過する。濾液を既述のV.harveyi バイオアッセイでAI-2活性について試験す
る。
【０２６８】 LuxPまたはLuxQ活性の調節 LuxPまたはLuxQなどのオートインデューサー2 受容体の活性を調節する化合物
および方法を提供することは、本発明の一つの目的である。本発明の化合物には
LuxPまたはLuxQと相互作用するものが含まれる。具体的に述べると本発明は、Lu
xPまたはLuxQタンパク質を調節し、その結果として、細菌細胞増殖を調節するか
、または細菌のビルレンスに関係する因子の発現の調節によって細菌の病原性を
調節する方法を提供する。本発明の方法では、LuxPまたはLuxQをペンテノマイシ
ン（pentenomycin）またはその誘導体と、LuxP活性またはLuxQ活性が調節される
ように接触させる。ペンテノマイシンは、抗生物質活性を持つことが既に確認さ
れている。本研究は、AI-2によって開始される生化学的経路の活性化の阻害剤と
してペンテノマイシンが作用することを示すデータを初めて提示するものである
。ペンテノマイシンおよびその誘導体の化学構造（下記参照）は、本研究で同定
されたオートインデューサー2 の構造に似ている。
【０２６９】
【化３９】 ペンテノマイシン （−）ペンテノマイシン 本発明は、細菌の増殖および病原性を調節するためのAI-2の誘導体および類似
体の合理的設計の基礎を提供する。このような類似体および誘導体は、オートイ
ンデューサー2 シグナル伝達経路に関与するLuxPまたはLuxQなどのタンパク質の
活性を調節するために使用することができる。
【０２７０】 本発明のオートインデューサー2 （AI-2）分子は、V.cholerae、S.typhimuriu
m およびE.coliなどの病原性細菌のluxP遺伝子のホモログによってコードされる
タンパク質LuxPと相互作用することができる。次に、AI-2-LuxP 複合体は、luxQ
遺伝子によってコードされるタンパク質産物であるLuxQと相互作用することがで
きる。AI-2-LuxP-LuxQ相互作用は、発光に関与する遺伝子の発現を活性化するこ
とによって、Vibrio属などの細菌における発光を促進することができる。また、
AI-2-LuxP-LuxQ相互作用は、細菌の病原性に必要な生化学経路の活性化にも関連
づけられている。したがって本発明は、ペンテノマイシンなどのAI-2類似体を使
ってAI-2-LuxP-LuxQ相互作用を調節することによって、細菌遺伝子発現を制御し
、細菌の病原性を調節する方法を提供する。例えば、AI-2類似体はLuxPまたはLu
xQタンパク質への結合に関して内因性AI-2と競合し、よって当該タンパク質の活
性を調節する手段になることができる。
【０２７１】 さらに本発明は、V.harveyi 発光アッセイでAI-2活性化発光を阻害する能力を
持つAI-2類似体の例を提供する（図16〜18参照）。これらのAI-2類似体が抗微生
物活性を持つことまたはAI-2によって開始される生化学経路の活性化の阻害剤と
して作用することは、今まで示されたことがなかった。このような類似体の例に
は、以下の化合物がある。
【０２７２】
【化４０】 cis-ジャスモン 2- ペンチル-2- シクロペンテン-1- オン
【化４１】 2,3-ジメチル-2- シクロペンテン 4S-アセトキシ-2- シクロペンテン -1-オン -1-オン
【化４２】 2-アセチルシクロペンタノン
【化４３】 3-メチル-2- シクロペンテン-1- オン。
【０２７３】 図16にAI-2類似体のスクリーニングアッセイの結果を示す。図16のパネルA お
よびB は、試験株BB170 に対して化合物6 、9 、15および18（パネルA ）ならび
に化合物3 、4 、7 および13（パネルB ）を使った6 時間アッセイの結果を示し
ている。図16のパネルC およびD は、対照株JAF78 に対する同じ化合物の効果を
示している。BB170 株は4.5 時間からアッセイ系にAI-2を合成し始める。アッセ
イの開始時に生成する光は、定常期から希釈した細胞から持ち越されたAI-2から
の光である。JAF78 株は光生成が「固定（locked on ）」されており、オートイ
ンデューサーの有無に左右されない。経時的な光量の増加は、細胞集団密度の増
加を反映している。化合物6 、9 、15および18は、BB170 では6 時間の時点で光
放射を無化合物対照の約1/100 に減少させたが、JAF78 では光放射に有意な変化
は起こらなかった（パネルA およびC ）。各処理から平板培養した細胞を直接計
数したところ、細胞の生存度には有意な相違がないことがわかった。化合物3 、
4 、7 および13ではどちらの株でも光放射の有意な相違が生じなかった（パネル
B およびD ）。
【０２７４】 luxOによる発現調節。オートインデューサー2 が存在しない低細胞密度では、
LuxQセンサーはキナーゼとして作用する。このセンサーは保存されたHis 残基を
自己リン酸化し、そのホスホリル基を、付属する応答調節因子ドメイン中の保存
されたAsp 残基に転移させる。このように、最初のリン酸基転移は分子内で起こ
る。次に、LuxQセンサーからリン酸基リレータンパク質LuxUの保存されたHis 残
基への分子間リン酸基転移が起こる。最終ステップでは、ホスホリル基が、応答
調節タンパク質LuxO中の保存されたAsp に転移される。LuxOはホスホリル化によ
って活性化される。LuxOの機能は、luxCDABEGHオペロンの抑制を引き起すことで
ある。したがって低細胞密度では、細菌は光を生成することができない。オート
インデューサー2 が存在する高細胞密度では、LuxQ活性が変化して、キナーゼ活
性からホスファターゼ活性に転換する。このセンサーは、このモードではシステ
ムからリン酸を排除する。このセンサーのホスファターゼ活性により、LuxO- リ
ン酸が迅速に除去され、脱リン酸化型のLuxOは不活性である。したがって高細胞
密度では、luxCDABEGHの抑制が起こらず、細菌は光を放射する。
【０２７５】 V.harveyi は、この複雑な定数感知システム、具体的にいうとluxPQ/AI-2定数
感知回路を利用して、種間の連絡をとる。したがってV.harveyi は、自分自身の
細胞集団密度を監視するだけでなく、他の細菌の細胞集団密度も監視する。この
能力ゆえに、V.harveyi は、単独で存在するかまたは共同体として存在するかに
基づいて挙動を調節することができる。AI-2シンターゼをコードする遺伝子luxS
は、E.coli、S.typhimurium 、Salmonella typhi（チフス菌）、Vibrio cholera
e 、Yersinia pestis 、Staphylococcus aureus 、Streptococcus pyogenes、En
terococcus faeclais およびBacillus subtilis を含む広範囲にわたるグラム陰
性菌およびグラム陽性菌で、AI-2産生を指定している高度に保存された遺伝子フ
ァミリーに属する。したがって、様々な細菌種がAI-2を種間連絡に利用すること
ができる。さらに本研究は、AI-2の存在が、最終的に様々な遺伝子の抑制解除（
すなわち活性化）に至るカスケードを開始させることも示している。AI-2活性を
下流の遺伝子要素の抑制解除/ 活性化も調節されるように調節するための化合物
および方法を提供することは、本発明の一つの目的である。この目的を達成する
ために、本研究では、LuxOが、シデロフォアの産生を含む下流の標的遺伝子の転
写ならびにコロニー形態を活性化することを示す（表4 および図20）。これらは
、V.harveyi において定数感知調節を受けるLux 以外の表現型の最初の例であり
、AI-2定数感知が潜在的に病原性の表現型を制御することを明確に示している。
【０２７６】 本研究では、luxO（LuxOタンパク質をコードする遺伝子）および/ またはrpoN
（σ54タンパク質をコードする遺伝子）中の突然変異を調べて、それらがV.harv
eyi におけるシデロフォア産生に影響を及ぼすかどうかを決定した。Schwynおよ
びNeilandsのクロマズロールS アッセイを使って、様々なV.harveyi 株によって
放出されるシデロフォアを測定した。このS アッセイでは、キレートしている鉄
イオンを消費済培養液中に存在するシデロフォアに奪われてクロマズロールS が
失った時にクロマズロールS が起こす色の変化を光学的に評価することによって
、シデロフォアを定量的に測定する。E.coliおよびV.choleraeを含む多くの細菌
種におけるシデロフォア産生の調節は、鉄取込み調節（ferric uptake regulati
on：Fur ）タンパク質の制御下にある。これらの場合、鉄リッチな条件では、Fu
r タンパク質はFe(II)イオンを結合し、シデロフォアの生合成および輸送に必要
な遺伝子の転写を抑制する。これらの遺伝子の抑制解除は鉄欠乏期に、Fur がFe
(II)を結合していない時に起こる。表4 に示す結果は、LuxOおよびσ54がシデロ
フォア産生の活性化に関与することを示している。
【０２７７】
【表４】 a 野生型V.harveyi rpoN遺伝子をプラスミドpBNL2090からlac プロモーターの
制御下で発現させた（表4 ）。 b シデロフォア産生は、クロマズロールS アッセイ（SchwynおよびNeilands,1
987 ）を使って測定した。シデロフォア単位はPayne （1994）の方法に従って計
算し、式：100 ×［(OD630( 培地対照) −OD630(使用済培養液))/OD600( 細胞培
養) ］を使って細胞数に関して標準化した。表中の値は3 回の独立した実験の平
均±SEM である。
【０２７８】 AB最少培地で増殖させた場合、野生型株BB120 、-luxO 株JAF78 およびrpoN::
Cmr ヌル株BNL240は全て同等量のシデロフォア（3 〜8 単位）を産生する。これ
に対して、JAF548では活性化luxO D47E の存在によりシデロフォア産生が50単位
に増加する。この結果は、ホスホLuxOがシデロフォア産生を活性化することを示
している。luxO D47E バックグラウンドでrpoNを破壊すると（BNL244株）、シデ
ロフォア産生が野生型レベル（4 単位）まで低下する。これは、Lux 調節に関し
て上に示した機構と同様に、野生型σ54が存在する場合はホスホLuxOがシデロフ
ォア産生を制御することを示している。野生型rpoNをluxO D47E,rpoN::Cmr 株に
トランスに導入すると欠損が相補される。この場合、シデロフォア産生は25単位
に増加して、luxO D47E 株のそれに近づいた。これらの結果は、活性型のLuxOが
σ54と共にシデロフォア産生の調節に関与することを証明している。
【０２７９】 シデロフォア産生表現型の他に、構成的に活性化されたLuxOを持つV.harveyi
突然変異体（すなわちLuxO D47E またはLuxN L166R）はコロニー形態が変化して
、V.choleraeに関して記載されている皺状のコロニー形態およびVibrio parahae
molyticus に関して記載されている不透明なコロニー形態に似た形態を構成的に
示すことも、本研究は示している。V.choleraeでは、皺状表現型は、エキソポリ
サッカライドであるルゴースポリサッカライド（rugose polysaccharide ）の産
生に必要なvps と呼ばれる大きな遺伝子クラスターを必要とする。V.parahaemol
yticusでは、OpaRと呼ばれるV.harveyi LuxR転写活性化タンパク質のホモログが
、不透明表現型への転換に関与する。Vibrio cholerae は下痢性疾患コレラの原
因生物であり、V.choleraeの皺状変異体はエキソポリサッカライドマトリックス
を産生することが示されている。ルゴースポリサッカライド（rugose polysacch
aride ）は、塩素、生体酸（bioacid ）ならびに酸化ストレスおよび浸透圧スト
レスなどの様々な作用因に対する耐性を付与することが示されている。また、皺
状表現型はバイオフィルム形成を促進し、よって水性環境での生物の生存を増強
する。
【０２８０】 図20は、様々なV.harveyi 株のコロニー形態を示す写真である。野生型V.harv
eyi およびrpoN::Cmr ヌル株のコロニーは平滑でガラスのような外観を持つが、
luxO D47E 株には皺があり不透明である。この図は、活性化luxO D47E タンパク
質によって起こるコロニー形態表現型が、野生型rpoNの存在に依存することを示
している。なぜなら、BNL244株（luxO D47E,rpoN::Cmr ）は野生型の平滑なコロ
ニー形態を持つからである。V.choleraeの皺状株の場合と同様に、V.harveyi lu
xO D47E 突然変異体も液体培養で増殖させると菌膜を形成する。菌膜形成は野生
型rpoNにも依存する。LuxO D47E 株JAF548の代わりに「固定」LuxN L166R株JAF5
49を使った場合も、同じ結果が得られた。LuxOまたはLuxNにおける単一のアミノ
酸変化が、シデロフォア産生およびコロニー形態を含む様々な表現型に影響を及
ぼしうるという事実は、LuxOおよびσ54が複数の標的遺伝子の調節に関与するこ
とを示している。
【０２８１】 さらに、AI-2媒介応答の阻害をV.harveyi バイオアッセイで測定した。化合物
QXP031をV.harveyi テスター株および対照株に対して試験した。図21に示すよう
に、化合物QXP031は、表示した濃度で、生物発光強度によってモニターされるV.
harveyi でのAI-2媒介ルシフェラーゼ発現を特異的に阻害した。これらの結果は
、細胞数および対照株に見られたごくわずかな効果に対して標準化したものであ
る。様々な薬物濃度を薬物なしの対照と比較した場合の生物発光強度の倍率を、
図21の各バーの上に表示する。
【０２８２】 また、ビルレンス因子の発現に対する本発明化合物の効果をCAMPアッセイで測
定した。多くの連鎖球菌は、スタフィロコッカスβ- リシンと相乗的に作用して
、ヒツジ血を含有するトリプチカーゼ大豆寒天プレート上の赤血球を溶解する拡
散性の細胞外タンパク質（CAMP）を産生する。赤血球の溶血は、多くの病原性細
菌におけるビルレンス応答の重要な成分である。S.aureusβ- リシン産生株の直
線的ストリークを一本作る。試験対象である連鎖球菌をそのS.aureusストリーク
に対して垂直に画線する。終夜培養の後、陽性の試験結果は、スタフィロコッカ
スβ- リシンとストレプトコッカスCAMP因子の両方が拡散した領域での完全な溶
血を示す矢印状のゾーンを特徴とする。S.aureusおよびS.pyogenes病原性細菌を
使ったCAMPアッセイで、化合物QXP031を試験した。QXP031の適用により、図22に
示すように負のCAMPスコアが得られた。
【０２８３】 プロテイナーゼ活性は、多くの病原性細菌におけるビルレンス応答の重要な成
分である。脱脂乳含有寒天プレートを使って、様々な細菌中のプロテイナーゼ活
性を評価することができる。タンパク質分解活性は試験接種物を取巻く透明ゾー
ンとして評価される。透明ゾーンは、寒天プレート中に懸濁されたミルクタンパ
ク質のプロテイナーゼによる分解の結果である。ミルクタンパク質が破壊されて
いない領域は乳白色の外観を保つ。図23に、QXP031によるS.pyogenesタンパク質
分解活性の阻害を示す。
【０２８４】 したがって本発明は、かかる標的に対するAI-2の効果を調節するための化合物
および方法を提供する。本発明は、構造I 、II、III またはIVの化合物およびそ
れらの化合物を含む医薬組成物、ならびに本発明の化合物および組成物を使って
AI-2の活性およびAI-2と相互作用するタンパク質の活性を調節することにより細
菌の増殖およびビルレンスを調節する方法を提供する。したがって本発明は、例
えば本発明の化合物を利用して細菌増殖を阻害することによって、細菌増殖を制
御するための機構を提供する。さらに本発明は、細菌増殖を制御するためだけで
なく、例えばシデロフォア産生およびルゴースポリサッカライド（rugose polys
accharide ）産生などの細菌のビルレンスおよび病原性と関係する表現型の発現
に関与する経路も制御するための機構を提供する。
【０２８５】 実施例12−バイオフィルム阻害 マイクロタイター型のアッセイを使って、バイオフィルム形成を測定した。グ
ルコースを補足したABまたはLB培地を使って、96穴マイクロタイタープレートで
、自由遊泳性（プランクトン様）細菌を培養した。バイオフィルムは通例、液相
と気相の界面にウェルの壁に沿って形成された。インキュベーションの終了時に
、クリスタルバイオレット溶液（0.1 ％ストック）をウェルに分注して、付着細
胞および非付着細胞の両方を染色した。次に、ウェルを脱イオン水で洗浄して非
付着細胞を除去し、結合しているクリスタルバイオレットを200 マイクロリット
ルの水で可溶化した。600nm での吸光度測定値（A600）を使って、バイオフィル
ムに付着したクリスタルバイオレット色素量を定量した。その旨表示した場合は
、培養の開始時に合成AI-2をウェルに添加した。
【０２８６】 様々な遺伝子型のV.harveyi を、外因性AI-2の不在下で、バイオフィルム形成
について試験した（図26）。MM32株（LuxN-,LuxS- ）は、野生型V.harveyi （BB
120 株）またはLuxNに不活化突然変異を含むV.harveyi インジケーター株BB170
よりも多くのバイオフィルムを形成した。これらの結果は、グルコースを含むAB
培地を使用するか（パネルA ）グルコースを補足したLB培地（パネルB ）を使用
するかとは関係なく、同じだった。これらの観察結果は、内因的なAI-2の合成を
排除するとV.harveyi はより多くのバイオフィルムを産生することを示唆してい
る。
【０２８７】 図26に示すように、V.harveyi の株を使って、バイオフィルム形成に対する外
因性4-ヒドロキシ-5- メチル-2H-フラン-3- オンの効果を調べた。グルコースを
補足したLB培地中の初期自由遊泳細菌培養物に、様々な量の合成AI-2を添加し、
インキュベーションの終了時にバイオフィルム形成を測定した。その結果、AI-2
が全V.harveyi 株におけるバイオフィルム形成に影響を及ぼすこと、そして各遺
伝子型で結果に再現性があることがわかった。MM32株では低用量のAI-2によりバ
イオフィルム形成が遮断される。これに対して、同じ低用量のAI-2を野生型V.ha
rveyi （BB120 株）またはV.harveyi インジケーター株BB170 に添加すると、生
成するバイオフィルムの量が増える。より高濃度のAI-2は、試験した全てのV.ha
rveyi 株でバイオフィルムの形成を刺激した。
【０２８８】 バイオフィルム形成に対するAI-2の効果をPseudomonas aeruginosa（ATCC2785
3 ）でも評価した（図27）。Pseudomonas aeruginosaによるバイオフィル形成は
嚢胞性線維症患者の肺気量の低下と関係するので、この生物によるバイオフィル
ム形成は特に興味深い。培地としてグルコースを含むAB培地を使用し、外因性合
成AI-2を添加したところ、P.aeruginosaによるバイオフィルム形成のレベルに用
量依存的な増加が起こった。その大きさとAI-2に対する用量応答は、この系では
pH依存的であることがわかった。
【０２８９】 材料および方法 菌株および培地。使用した細菌株ならびにそれらの遺伝子型および表現型を表
5 に示す。
【０２９０】
【表５】 ルリアブロス（LB）は1 リットルあたりバクトトリプトン（Difco ）10g 、酵
母エキス（Difco ）5gおよびNaCl 10gを含んだ（Sambrookら,1989 ）。オートイ
ンデューサーバイオアッセイ（AB）培地の処方は、先に報告されている（Greenb
erg ら,Arch.Microbiol.120:87-91,1979）。LM培地（L-Marine）は1 リットルあ
たりNaCl 20g、バクトトリプトン10g 、バクト酵母エキス5g、および寒天15g を
含む（Bassler ら,1994,前掲）。本明細書の記載と同様のAI-2産生の調節は、Sa
lmonella enterica （サルモネラ・エンテリカ）Serovar Typhimurium （血清型
チフィムリウム）の独立した臨床分離株であるATCC株Salmonella enterica Sero
var Typhimurium 14028 および他の9 つのSalmonella enterica 血清型（Typhim
urium 以外）でも観察された。
【０２９１】 S.typhimurium LT2 の増殖条件および無細胞培養液の調製。S.typhimurium LT
2 は、LBブロス中30℃で振とうしながら一晩増殖させた。翌日、終夜培養物30μ
l を新しいLBブロス3ml に接種した。追加の炭素源を含む培養物では、接種時に
、20％滅菌原液を指定の最終濃度になるように加えた。細胞の継代に続いて、培
養管を30℃、200rpmで、本文に示した期間、振とうさせた。無細胞培養液は、微
量遠心機にて15,000rpm で5 分間の遠心分離を行って培地から細胞を除去するこ
とによって調製した。透明になった上清を、8000×g で1 分間の遠心分離によっ
て0.2 μm 酢酸セルロースSpin Xフィルター（CoStar（マサチューセッツ州ケン
ブリッジ））に通した。試料は−20℃で保存した。本明細書に記載した結果と同
様の結果は、S.typhimurium を37℃で増殖させた場合にも得られた。V.harveyi
株からの無細胞培養液の調製は、既に報告されている（Bassler ら,1993,前掲；
Bassler ら,1997,前掲）。
【０２９２】 密度依存的生物発光アッセイ。V.harveyi レポーター株BB170 （センサー1 -
, センサー2 + ）（Bassler ら,1993,前掲）をAB培地中、30℃で12時間増殖させ
、新しいAB培地で1:5000希釈した。Wallac1409型液体シンチレーションカウンタ
ー（Wallac Inc. （メリーランド州ゲーサーズバーグ））で増殖中の様々な時点
で光生成量を定量することにより、発光を細胞密度の関数として測定した。細胞
密度は、発光の測定に使用したものと同じ細胞試料を希釈し、その希釈液をLM固
形培地に塗布し、そのプレートを30℃で一晩インキュベートし、その結果生じた
コロニーを翌日計数することによって測定した。相対発光単位は( カウント数・
分-1・ml-1×103)/(コロニー形成単位・ml-1）である。V.harveyi またはS.typh
imurium 株から得た無細胞培養上清は、最初の測定時に、最終濃度が10％(v/v)
になるように加えた。対照実験では、無細胞培養液の代わりに、10％(v/v) のAB
培地、LB培地、または0.5 ％グルコースを含有するLB培地を加えた。
【０２９３】 S.typhimurium オートインデューサー活性アッセイ。S.typhimurium LT2 が放
出する定数感知シグナル伝達活性を、様々な条件で増殖させた後にアッセイした
。上述のように増殖させ収集したS.typhimurium LT2 から得た無細胞培養液10μ
l を96穴マイクロタイタープレートに加えた。V.harveyi レポーター株BB170 を
上述のように一晩増殖させ、希釈した。S.typhimurium 無細胞培養液を含むウェ
ルに90μl の希釈V.harveyi 細胞を加えた。陽性対照ウェルには、V.harveyi BB
152 （AI-1- ,AI-2 + ）（Bassler ら,1993,前掲）から得た無細胞培養液10μl
を含めた。30℃、200rpmの回転式振とう機でマイクロタイタープレートを振とう
した。マイクロタイタープレート用Wallac1450型Microbeta Plus液体シンチレー
ションカウンター（Wallac Inc. （メリーランド州ゲーサーズバーグ））を使っ
て、1 時間毎に光生成量を測定した。これらの実験では、各時点で細胞密度を測
定しなかった。その代わり、光生成量の増加がシグナル伝達活性によるものであ
って増殖培地成分によるものではないことを保証するために、無細胞培養液を含
むウェルでV.harveyi が生成した発光量を、10μl の同じ増殖培地のみを含むウ
ェルでV.harveyi が生成した量と比較した。データは、増殖培地のみで得られた
値と比較した刺激倍率として報告する。
【０２９４】 S.typhimurium におけるシグナル生成を制御する因子。上述のように、0.5 ％
のグルコースを含むLB中でS.typhimurium LT2 を6 時間増殖させた。指数期中期
の培養物を数等分した。その一つを定常期まで増殖させた（振とうしながら30℃
で24時間）。残りの培養物では、微量遠心機中、15,000rpm で5 分の遠心分離に
よって、細胞をLB- グルコース増殖培地から除去した。得られた細胞ペレットを
LB、LB+0.5％グルコース、pH5.0 のLB、または0.1M NaCl もしくは0.4M NaCl （
水溶液）に、OD600 が2.0 になるように再懸濁した。再懸濁した細胞を30℃また
は43℃で2 時間振とうした。定常期培養物および様々な培地または浸透圧ショッ
ク液に再懸濁してインキュベートした細胞から無細胞液を調製した。それらの無
細胞液を、上述のS.typhimurium 活性アッセイでシグナル伝達活性について試験
した。
【０２９５】 S.typhimurium によるオートインデューサー産生に対する増殖期、pH、グルコ
ース濃度およびオスモル濃度の効果。制限濃度（0.1 ％）および非制限濃度（1.
0 ％）のグルコースを含むLB培地中、30℃で、S.typhimurium LT2 を様々な時間
増殖させた。本文に特定していた時点で、S.typhimurium 培養物の希釈液をLB平
板培地に播き、翌日コロニー数を数えることによって、細胞数を決定した。2 つ
の培養物のpHを測定し、各培養物中に残っているグルコースのパーセンテージを
、実施例1 に記載のトリンダー（Trinder ）法によって決定した。LBグルコース
培養物から上述のように無細胞培養液を調製した。無細胞培養液の調製に使った
ものと同じ細胞を0.4M NaCl 浸透圧ショック液に再懸濁し、200rpm、30℃で2 時
間振とうした。本発明者らは、オートインデューサーの産生にはこのタイミング
が最適であることを確認した。微量遠心機中、15,000rpm で5 分間の遠心分離に
よって、浸透圧ショック液から細胞を除去した。無細胞培養液に関する記載と全
く同様にして、再懸濁細胞から無細胞浸透圧ショック液を調製した。無細胞培養
液と無細胞浸透圧ショック液のシグナル伝達活性をどちらも上述のようにアッセ
イした。pHを7.2 に保った実験では、pH7.2 の50mM MOPS を含むLB＋0.5 ％グル
コース中で細胞を増殖させた。pHは1M MOPS （pH7.2 ）を使って15〜30分ごとに
調節した。pH5.0 で行った実験では、LBブロスを1M NaOH でpH5.0 〜5.2 に維持
した。
【０２９６】 S.typhimurium LT2 によるシグナルの産生、放出および分解におけるタンパク
質合成の必要。0.5 ％のグルコースを含むLB中、30℃で、OD600 が2.5 になるま
で、S.typhimurium LT2 を前培養した（約6 〜8 時間）。培養物を4 等分した。
そのうちの2 つを100 μg/mlのCmで室温にて5 分間処理し、次に15,000rpm で5
分間の遠心分離によって細胞を収集した。Cm処理細胞ペレットの一方を、30μg/
mlのCmを含む0.1M NaCl に再懸濁し、もう一つのペレットを30 g/ml のCmを含む
0.4M NaCl に再懸濁した。これらのペレットはそれぞれOD600 が最終的に2.0 に
なるように再懸濁した。残り2 つの分割培養物はCmでは処理しなかった。その代
わりに、これら2 つの分割物の細胞を遠心分離によって収集し、Cm処理細胞に関
する記載と全く同様に、0.1Mおよび0.4M NaCl に再懸濁した。細胞懸濁液を振と
うしながら30℃でインキュベートした。本文に示した時点で、細胞懸濁液から1.
5ml を取り出し、上述の操作によって無細胞浸透圧ショック液を調製した。
【０２９７】 SdiAが調節する遺伝子発現に対するオートインデューサーの効果の解析。ftsQ
1pおよびftsQ2pプロモーター（Wangら,1991,前掲）を含む配列を、E.coli MG165
5 染色体DNA から次のプライマーを使って増幅した： ftsQ1p，5'-CGGAGATCTGCGCTTTCAATGGATAAACTACG-3'、 ftsQ2p，5'-CGCGGATCCTCTTCTTCGCTGTTTCGCGTG-3'。
【０２９８】 増幅産物は両ftsQプロモーターおよびftsQ遺伝子の最初の14コドンを含み、BamH
I 部位とBlgII 部位とが隣接している。このftsQ1p2p PCR産物をベクターpMLB10
34（Silhavy ら「Experiments with Gene Fusions 」Cold Spring Harbor Press
,1984 ）のBamHI 部位にクローニングして、ftsQのプロモーター、リボゾーム結
合部位および開始コドンを含むlacZ融合物を得た。向きの正しいクローンpMS207
およびftsQ1p2pインサートを反対向きに含有するクローンpMS209を、さらなる解
析のために選択した。両インサートを配列決定して、PCR 反応中にエラーが導入
されていないことを確かめた。
【０２９９】 E.coliでのftsQ調節については、プラスミドpMS207およびpMS209をE.coli MC4
100 株（Silhavy ら,1984,前掲）に導入し、100mg/L のアンピシリンを含むLB中
、曝気しながら30℃で、形質転換体を一晩増殖させた。rck 調節については、10
0mg/L のカナマイシンを含むLB中、曝気しながら30℃で、S.typhimurium BA1105
株 （rck::MudJ ）およびBA1305株（rck::MudJ sdiA）を一晩増殖させた。それ
ら終夜培養物を新しい培地で20倍希釈し、さらに4.5 時間増殖させた。この時点
で、各培養物を5 等分し、次に挙げる液体の一つを10％（v/v ）の量で各分割物
に加えた：LB、0.4M NaCl 、S.typhimurium LT2 、E.coli O157 またはE.coli D
H5α株（陰性対照）から得た0.4M浸透圧ショック液。浸透圧ショック液は、0.5
％のグルコースを含むLB中でS.typhimurium LT2 およびE.coliを6 時間前培養し
た後、上述のようにして調製した。細胞懸濁液を30℃で2 時間インキュベートし
た後、試料に対して標準的なガラクトシダーゼ反応を行った（Miller「A Short
Course in Bacterial Genetics」Cold Spring Harbor Laboratory Press,1992）
。
【０３００】 無細胞培養液の調製。E.coli AB1157 株およびDH5 α株ならびにS.typhimuriu
m LT2 株を、本文中に指定した濃度のグルコースを含むLBブロス中、曝気しなが
ら30℃で一晩増殖させた。翌朝、終夜増殖に使用した濃度と同じ濃度のグルコー
スを含有する新しいLB培地を1:100 の希釈率で終夜増殖培養物に投入した。新し
い培養物を曝気しながら30℃で様々な時間増殖させた。無細胞培養液は、微量遠
心機中15,000rpm で5 分間の遠心分離によって増殖培地から細胞を除去すること
によって調製した。透明になった培養液を0.2 μm HT Tuffrynフィルター（Gelm
an）に通し、-20 ℃で保存した。V.harveyi オートインデューサー2 を含む無細
胞培養液は、V.harveyi BB152 株（オートインデューサー1 - , オートインデュ
ーサー2 + ）から調製した。オートインデューサー1 を含有する培養液の調製に
は、V.harveyi BB120 （オートインデューサー1 + , オートインデューサー2 +
）を使用した。どちらの場合も、AB（オートインデューサーバイオアッセイ）培
地（Bassler ら,1993,前掲）中、曝気しながら30℃で、V.harveyi 株を増殖させ
た。V.harveyi からの無細胞培養液は、E.coliおよびS.typhimurium に関する上
述の記載と全く同様にして、終夜培養物から調製した。
【０３０１】 シグナル伝達分子の産生に関するアッセイ。E.coli、S.typhimurium およびV.
harveyi 株からの無細胞培養液を、V.harveyi レポーター株BB170 またはBB886
における発光を誘導することができるシグナル伝達物質の存在について試験した
。このアッセイでは、上述のように増殖させ収集したE.coli AB1157 、E.coli D
H5αおよびS.typhimurium LT2 株から得た無細胞培養液10μl を、96穴マイクロ
タイタープレートに加えた。V.harveyi レポーター株BB170 またはBB886 はAB培
地中、曝気しながら30℃で16時間増殖させ、新しいAB培地で1:5000に希釈し、90
μl の希釈細胞をE.coliおよびS.typhimurium 無細胞培養液を含むウェルに加え
た。陽性対照ウェルには、V.harveyi BB152 株（オートインデューサー1 - , オ
ートインデューサー2 + ）またはV.harveyi BB120 株（オートインデューサー1 + , オートインデューサー2 + ）からの無細胞培養液10μl を含めた。陰性対照
ウェルには滅菌増殖培地10μl を含めた。マイクロタイタープレートを30℃、17
5rpmの回転式振とう機で振とうした。Wallac1450型Microbeta Plus液体シンチレ
ーションカウンターを化学発光モードで使って、光生成量を毎時間、測定した。
V.harveyi 細胞密度は、発光の測定に使用したものと同じ細胞試料を希釈し、そ
の希釈液をLM固形培地（Bassler ら,1993,前掲）に塗布し、そのプレートを30℃
で一晩インキュベートし、その結果生じたコロニー数を翌日数えることによって
測定した。
【０３０２】 活性アッセイ用のE.coliおよびS.typhimurium 生細胞およびUV死滅細胞の調製
。0.5 ％のグルコースを含むLB中、曝気しながら30℃で、E.coli AB1157 、E.co
li DH5αおよびS.typhimurium LT2 培養物を8 時間増殖させた。それらの培養物
を微量遠心機中、15,000rpm で5 分間の遠心分離にかけ、細胞ペレットから増殖
培地を吸引除去した。細胞ペレットをAB培地に再懸濁し、激しく混合することに
よって洗浄した。細胞を再び15,000rpm で5 分間の遠心分離にかけた。AB洗浄培
地を取り出して捨て、細胞を新しいAB培地に再懸濁した。各細胞懸濁液を希釈し
て1 ×106 細胞/10 μl にし、マイクロタイタープレートのウェルに各10μl を
加えた。細胞の半分は短波長紫外線で10cmの距離から15分間処理した。UV処理し
た細胞をプレートに播き、インキュベートし、翌日になっても増殖が起こらない
ことを確かめることによって判定したところ、この処理は全細胞を死滅させるの
に十分だった。次に、E.coliおよびS.typhimurium の生または死細胞を含むウェ
ルに90μl の希釈V.harveyi レポーター株BB170 を加え、先の項で説明したとお
りに活性アッセイを行った。
【０３０３】 S.typhimurium LT2 培養液中のグルコースの分析。S.typhimurium から調製し
た無細胞培養液中のグルコース濃度は、トリンダーアッセイ（Diagnostic Chemi
cals Ltd. ）を使用し、グルコース標準液をLB培地中に調製した点を除いて製造
者の推奨する方法で決定した。アッセイの感度は、0.002 ％グルコース未満だっ
た。LB培地または消費済LB培養液中には妨害物質は存在しなかった。
【０３０４】 細菌株、培地および組換えDNA 技術。V.harveyi BB120 は野生型株である（Ba
ssler ら,1997,前掲）。S.typhimurium LT2 株はK.Hughes博士（ワシントン大学
）から入手した。S.typhimurium 14028 はATCC 14028株、生物名：Salmonella c
holeraesuis （ブタコレラ菌）である。E.coli O157:H7はPaddy Gibb博士（カル
ガリー大学）から分譲された臨床分離株である。ルリアブロス（LB）は1 リット
ルあたりバクトトリプトン（Difco ）10g 、酵母エキス（Difco ）5gおよびNaCl
10gを含んだ。オートインデューサーバイオアッセイ（AB）培地の処方は、先に
報告されている（Greenberg,E.P.,Hastings,J.W.およびUlitzur,S.(1979 ）Arch
.Microbiol.120,87-91）。その旨を表示した箇所では、グルコースを20％滅菌原
液から最終濃度が0.5 ％になるように加えた。抗生物質は次の濃度で使用した（
mg/L）：アンピシリン（Amp ）100 、クロラムフェニコール（Cm）10、ゲンタマ
イシン（Gn）100 、カナマイシン（Kn）100 およびテトラサイクリン（Tet ）10
。DNA の単離、制限酵素分析およびE.coliの形質転換は、Sambrookらが記述して
いるように行った。サザンブロット解析用のプローブは、AmershamのMultiprime
DNAラベリングシステムを使って標識した。配列決定は、Applied Biosystems配
列決定装置を使って行った。V.harveyi BB120 ゲノムライブラリーは、既述のよ
うにコスミドpLAFR2に構築した（Bassler ら,1993,前掲）。クローン化したV.ha
rveyi 遺伝子のTn5 突然変異誘発法、およびTn5 突然変異遺伝子をV.harveyi 染
色体に挿入するための対立遺伝子置換法は、既に報告されている（Bassler ら,1
993,前掲）。
【０３０５】 生物発光アッセイ。V.harveyi レポーター株BB170 （センサー1 - 、センサー
2 + ）を使ったAI-2バイオアッセイについては上記の実施例で述べた。AI-2活性
について試験しようとするV.harveyi 、E.coliまたはS.typhimurium 株から、上
述のようにして無細胞培養液を調製し、10％(v/v) の濃度でアッセイした。AI-2
活性は、バックグラウンドに対するレポーター株の誘導倍率として、またはV.ha
rveyi BB120 （野生型）無細胞培養液から得られる活性に対するパーセンテージ
として報告する。
【０３０６】 S.typhimurium LT2 におけるAI-2産生遺伝子の突然変異誘発および解析。S.ty
phimurium LT2 のMudJ挿入突然変異体は、ファージP22 デリバリーシステムを使
って、既述のように作製した（Maloy,S.R.,Stewart,V.J. およびTaylor,R.K. （
1996）「Genetic analysis of pathogenic bacteria: a laboratory manual」Co
ld Spring Harbor Laboratory Press （ニューヨーク州コールドスプリングハー
バー））。S.typhimurium 挿入突然変異体を、0.5 ％のグルコースを含むLB中で
指数期中期まで増殖させた後、V.harveyi BB170 バイオアッセイを使って、AI-2
産生について試験した。S.typhimurium におけるAI-2産生機能を不活化するMudJ
挿入部位を、挿入接合部にある染色体DNA のPCR 増幅および配列決定によって同
定した。2 段階増幅法を使用した（Caetano-Annoles,G.（1993）Meth.Appl.3,85
-92 ）。第1PCR反応では、任意プライマー：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNN
NACGCCC-3'と、MudJ特異的プライマー：5'-GCACTACAGGCTTGCAAGCCC-3' を使用し
た。次に、このPCR 反応液1 μl を、第2 の任意プライマー（5'-GGCCACGCGTCGA
CTAGTCA-3'）ともう一つのMudJ特異的プライマー（5'-TCTAATCCCATCAGATCCCG-3'
）とを使用する第2PCR増幅に、テンプレートとして使用した。第2 反応で得たPC
R 産物を精製し、配列決定した。
【０３０７】 E.coli MG1655 、E.coli O157:H7およびE.coli DH5α AI-2 産生遺伝子のクロ
ーニングおよび配列決定。S.typhimurium LT2 MudJスクリーニングで得たDNA 配
列を使って、対応するE.coli領域を同定するために、E.coli MG1655 ゲノム配列
を検索した（Blattnerら,Science 277,1453-1462,1997 ）。配列決定プロジェク
トから同定された遺伝子はygaGという名称を持っていた。ygaG遺伝子に隣接し制
限部位を組み込んだプライマーを設計し、それらを使って、E.coli MG1655 、E.
coli O157:H7およびE.coli DH5α ygaG 遺伝子を増幅した。使用したプライマー
は、5'-GTGAAGCTTGTTTACTGACTAGATC-3' および5'-GTGTCTAGAAAAACACGCCTGACAG-3
' である。PCR 産物を精製し、消化し、pUC19 にクローニングした。いずれの場
合も、3 つの独立した反応から得たPCR 産物をクローニングし、配列決定した。
【０３０８】 本発明は上に説明し例示した態様に限定されず、特許請求の範囲内で変形およ
び変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 V.harveyi における発光を誘導するE.coli AB1157 およびS.typh
imurium LT2 無細胞培養液由来のシグナル伝達物質。E.coli、S.typhimurium お
よびV.harveyi 株由来の無細胞培養液中に存在するシグナル伝達物質に対するV.
harveyi レポーター株BB170 （センサー1 - , センサー2 + ）（図1A）およびBB
886 （センサー1 + , センサー2 - ）（図1B）の応答を示す。各レポーター株の
明るい培養物を新鮮な培地に1:5000希釈し、希釈培養物の増殖中に1 細胞あたり
の光生成量を測定した。実験の開始時に無細胞培養液または滅菌増殖培地を10％
（v/v ）の最終濃度になるように加えた。5 時間時点のデータを示し、V.harvey
i 無細胞使用済み培養液を加えた場合に得られる活性に対するパーセントとして
表す。それぞれの株に使用した略号はV.h ＝Vibrio harveyi、S.t ＝Salmonella typhimuriumおよびE.c ＝Escherichia coliである。
【図２】 E.coliおよびS.typhimurium 生細胞によるオートインデューサー
2 シグナル伝達分子の分泌。E.coli AB1157 およびS.typhimurium LT2 が産生し
分泌するシグナル伝達物質（E.coli DH5はこれを産生、分泌しない）に対するV.
harveyi レポーター株BB170 （センサー1 - , センサー2 + ）の応答を示す。V.
harveyi レポーター株BB170 をAB培地に1:5000希釈し、増殖中の1 細胞あたりの
光出力をモニターした。実験の開始時に1 ×106 個のE.coli AB1157 、S.typhim
urium LT2 またはE.coli DH5洗浄再懸濁生細胞（左側、白いバー）またはUV殺滅
細胞（右側、黒いバー）を加えた。データは5 時間時点でV.harveyi BB170 が示
す内因性発光レベルの活性化倍率として表す。それぞれの株に使用した略号はS.
t ＝Salmonella typhimuriumおよびE.c ＝Escherichia coliである。
【図３】 S.typhimurium LT2 によるオートインデューサー2 シグナル伝達
活性の産生および分解に対するグルコース欠乏の影響。0.1 ％グルコース（図3A
）または0.5 ％グルコース（図3B）を含むLB培地でS.typhimurium LT2 を増殖さ
せた。指定した時間に無細胞培養液を調製し、発光刺激アッセイでのシグナル伝
達活性（バー）および残存グルコース濃度（○）をアッセイした。各時点の細胞
数は、S.typhimurium LT2 を希釈してLB培地上に播き、翌日にコロニー数を数え
ることによって決定した（□）。シグナル伝達活性は、V.harveyi 無細胞使用済
み培養液を加えたときに得られる活性に対するパーセントとして記載する。これ
らのデータは、発光刺激アッセイにおける5 時間時点に相当する。グルコース濃
度は、グルコース残存率（％）として表す。細胞数は細胞/ml ×10-9である。記
号＼＼は8 時間以降の時間軸が縮尺通りに描かれていないことを示している。
【図４】 V.harveyi およびS.typhimurium が産生するAI-2に対するV.harv
eyi の応答曲線。V.harveyi レポーター株BB1170（センサー1 - , センサー2 +
）を、V.harveyi 株BB152 （AI-1-,AI-2+ ）が産生する外因性AI-2の添加および
S.typhimurium LT2 が産生する外因性AI-2の添加に対する応答について調べた。
レポーター株の明るい培養物を1:5000希釈し、実験の開始時に10％(v/v) の増殖
培地（●）、AB中で終夜増殖させたV.harveyi BB152 の無細胞培養液（○）、ま
たはLB＋0.5 ％グルコースで6 時間増殖させたS.typhimurium LT2 の無細胞培養
液（■）を加えた。RLU は相対発光単位を意味し、( カウント・分-1×10-3)/(
コロニー形成単位・ml1)と定義される。
【図５】 S.typhimurium におけるオートインデューサー産生に影響を及ぼ
す条件。S.typhimurium LT2 に様々な処置を施した後、無細胞培養液または浸透
圧ショック液を調製した。これらの調製物をV.harveyi AI-2レポーター株BB170
の希釈培養物に10％(v/v) の濃度で添加した後、光出力を測定した。活性化倍率
は、特定したS.typhimurium 調製物の添加後にリポーターが生成した光のレベル
を、増殖培地のみを添加した場合のレポーターの光出力で割った値である。図5A
のバーは、以下の処置を施した後にS.typhimurium から調製した無細胞系を表す
：LB 6h ＝LB中30℃で6 時間増殖、LB+Glc 6h ＝LB＋0.5 ％グルコース中30℃で
6 時間増殖、LB+Glc 24h＝LB＋0.5 ％グルコース中30℃で24時間増殖。図5Bに記
載の実験ではいずれも、0.5 ％グルコースを含むLB中30℃で6 時間、S.typhimur
ium を前培養した後、ペレット化し、以下の条件で2 時間再懸濁した：LB＝LB中
30℃、LB+Glc＝LB＋0.5 ％グルコース中30℃、LB pH5＝pH5.0 のLB中30℃、0.4M
NaCl ＝0.4M NaCl 中30℃、0.1M NaCl ＝0.1M NaCl 中30℃、および熱ショック
43°＝LB＋0.5 ％グルコース中43℃。これらの2 時間処理後に、各試料から無細
胞液を調製し、アッセイした。
【図６】 制限濃度および非制限濃度のグルコースにおけるS.typhimurium
シグナル伝達活性。S.typhimurium LT2 を、制限濃度（0.1 ％）および非制限濃
度（1.0 ％）のグルコースの存在下に、LB中で増殖させた。無細胞培養液中に存
在する活性（黒いバー）を、表示した時間にアッセイし、1 ×109 細胞が産生す
る活性に標準化した。同じ細胞から調製した0.4M NaCl 浸透圧ショック液で測定
されるシグナル伝達活性の増加分を、黒いバーの上の白いバーで示す。これらの
データも1 ×109 細胞に標準化されている。制限グルコースの場合のシグナル伝
達活性を図6A、6Cおよび6Eに示し、非制限グルコースの場合のシグナル伝達活性
を図6B、6Dおよび6Fに示す。図6Aおよび6Bにはグルコース残存率（％）（△）も
示し、図6Cおよび6Dには細胞数（□）を示し、図6Eおよび6Fには各時点でのpH（
○）を示す。
【図７】 S.typhimurium によるシグナル産生に対するグルコースおよびpH
の影響。0.5 ％グルコースを含むpH7.2 のLB培地で細胞を増殖させた場合（図7A
、バー）および追加の炭素源を含まないpH5.0 のLBで細胞を増殖させた場合（図
7B、バー）にS.typhimurium LT2 が放出する定数感知シグナルを測定した。無細
胞培養液中（黒いバー）および0.4M NaCl 浸透圧ショック液中（黒いバーの上の
白いバー）に存在するシグナルのレベルを、表示した時点で測定した。どちらの
パネルでも、○は培地のpHを表し、□は様々な時点での細胞数を表す。
【図８】 S.typhimurium LT2 において、高いオスモル濃度はシグナル放出
を誘導し、低いオスモル濃度はシグナル分解を誘導する。0.4M NaCl および0.1M
NaCl に再懸濁したS.typhimurium LT2 が放出する定数感知シグナルを、タンパ
ク質合成の存在下および不在下で測定した。0.5 ％グルコースを含むLB中で6 時
間、S.typhimurium LT2 を前培養した。細胞を収集し、30 g/ml のCmの存在下ま
たは不在下で、表示した時間、0.4M NaCl （図8A）または0.1M NaCl （図8B）に
再懸濁した。どちらのパネルでも、□はCmの不在下で測定された活性を表し、■
はCmの存在下で測定した活性を表す。
【図９】 V.harveyi およびE.coli MG1655 のluxSおよびygaG遺伝子。図9A
はTn5 挿入法で規定したV.harveyi luxSV.h.染色体領域の制限酵素地図を表す。
AI-2産生機能を破壊するTn5 挿入部位およびluxSV.h.座の外にある対照Tn5 挿入
部位を示している（▼）。図9BはE.coli MG1655 染色体中のygaG領域を表す。こ
のORF にはemrB遺伝子およびgshA遺伝子が隣接している。各遺伝子の転写の方向
を水平方向の矢印で示している。S.typhimurium LT2 におけるAI-2産生を消失さ
せた対応するMudJ挿入位置を垂直方向の矢印で示す。H 、R 、P およびB はそれ
ぞれHindIII 、EcoRI 、PstIおよびBamHI 制限部位を表す。
【図１０】 V.harveyi 株およびS.typhimurium 株のオートインデューサー
産生表現型を示す図。V.harveyi 株およびS.typhimurium 株から無細胞培養液を
調製し、V.harveyi BB170 バイオアッセイでAI-2活性について試験した。図10A
：luxSv.h.の外にTn5 挿入を持つ野生型V.harveyi MM28（WTと表記）およびluxSV.h. ::Tn5 突然変異株MM30（luxS- と表記）のAI-2産生表現型。図10B ：野生型
S.typhimurium LT2 （WTと表記）およびygaG::MudJ挿入突然変異株CS132 （ygaG- と表記）のAI-2産生表現型。活性は、滅菌培地を加えた場合と比較したV.harv
eyi BB170 レポーター株の発光発現の誘導倍率として表す。
【図１１】 S.typhimurium CS132 およびE.coli DH5αにおけるAI-2産生の
相補性を示すグラフ。E.coli株およびS.typhimurium 株の無細胞培養液をバイオ
アッセイでAI-2活性について試験した。これらの液中に存在する活性を、野生型
V.harveyi BB120 が産生する活性と比較した。図では、BB120 の活性レベルを10
0 ％に標準化した。図11A ：野生型V.harveyi BB120 、E.coli O157:H7およびS.
typhimurium LT2 の無細胞液中のAI-2活性。図11B ：S.typhimurium CS132 （yg
aG::MudJ）の相補性。図11C ：E.coli DH5αの相補性。パネルB およびC におい
て、トランス位にあるAI-2産生遺伝子は以下の通りである：ベクター対照（表記
：none）、E.coli O157:H7 ygaG 、およびV.harveyi BB120 luxSV.h.。E.coliお
よびV.harveyi をそれぞれE.c.およびV.h.と略記する。
【図１２】 LuxSタンパク質配列およびYgaGタンパク質配列の整列を示す図
。AI-2産生タンパク質ファミリーの翻訳タンパク質配列を示す。本発明者らはV.
harveyi BB120 のluxSV.h.遺伝子（配列番号10）およびE.coli MG1655 （配列番
号25）、E.coli O157:H7（配列番号11）およびE.coli DH5α（配列番号26）のyg
aG遺伝子（本明細書では新たにluxSE.c.と命名）の配列を決定した。S.typhimur
ium LT2 ygaG（本明細書では新たにluxSS.t.と命名）部分配列はS.typhimurium
データベースから得たものである。LuxSV.h.タンパク質と同一でないアミノ酸残
基はボールド体ではなく下線を引いてある。E.coli DH5αDNA 配列中のフレーム
シフト突然変異の位置を「* 」で表す。フレームシフト後に翻訳される20の改変
アミノ酸残基を枠で囲んである。
【図１３】 Vibrio harveyiのハイブリッド定数感知回路の略図。AI-1およ
びAI-2回路は独立して刺激されるが、それらの光発現のシグナルは統合される。
しかし、各経路は独立して光を生成する能力も持つ。そのため、LuxNセンサーま
たはLuxQセンサー中の相互突然変異を使って、それぞれAI-2またAI-1に特異的な
レポーターを構築することができる。
【図１４】 V.harveyi 野生型およびlux 調節突然変異体の応答表現型を表
すグラフ。最初に、無細胞培養液（10％）を加えるか、または何も加えなかった
（N.A.）。野生型、無細胞培養液（AI-1+AI-2 ）、LuxS- 無細胞培養液（AI-1）
、LuxM- 無細胞培養（AI-2）。相対発光単位はcpm ×103/CFU/mlと定義する。
【図１５】 オートインデューサー2 （AI-2）の生合成経路の略図。
【図１６】 AI-2類似体の発光スクリーニングアッセイの結果を示す棒グラ
フ。図16のパネルA およびB は、試験株BB170 に対して化合物6 、9 、15および
18（パネルA ）ならびに化合物3 、4 、7 および13（パネルB ）を使って行った
6 時間アッセイの結果を表す。図16のパネルC およびD は、対照株JAF78 に対す
る同じ化合物の効果を示す。
【図１７】 V.harveyi 発光アッセイでAI-2の活性を阻害する類似化合物の
構造例。これらの化合物の構造から、これらの化合物の阻害活性にはC2位および
C3位が重要であることがわかる。
【図１８】 V.harveyi 発光アッセイでのAI-2活性に対する化合物QXP009、
QXP010、QXP015およびQXP018の効果を示す棒グラフ。
【図１９】 化合物およびV.harveyi 発光アッセイでのAI-2活性に対するそ
れらの効果の一覧。
【図２０】 V.harveyi におけるコロニー形態のσ54およびLuxOによる調節
を示す写真。これらの写真には様々なV.harveyi 株の平滑なコロニー形態および
皺状のコロニー形態が示されている。各V.harveyi 株はLMブロス中30℃で一晩増
殖させた。各細菌株をLMプレートに画線し、30℃で24時間増殖させ、写真撮影し
た。細菌株の呼称は以下の通りである：wt＝BB120 、luxO D47E ＝JAF548、rpoN
::Cmr ＝BNL240、およびluxO D47E,rpoN::Cmr ＝BNL244。BNL240およびBNL244に
は1mM L-グルタミンをブロスおよびプレートに補足した。
【図２１】 V.harveyi テスター株における生物発光強度に対する化合物QX
P031の効果を示す図。結果は細胞数および対照株に対して標準化している。これ
らの結果は、様々な化合物QXP031濃度でAI-2阻害の結果として最高15000 分の1
まで生物発光の特異的に減少したことを示している。
【図２２】 化合物QXP031によるCAMP発現の阻害を示すCAMPアッセイを示す
図。水平方向のストリークはS.aureus 25923であり、垂直方向のストリークはS.
pyogenes 19615である。薬物なしのDMSO対照または化合物QXP031を含むフィルタ
ーディスクをプレートに適用し、嫌気的に37℃で一晩培養した。化合物なしの対
照は、矢印形をした完全なβ溶血の領域によって示される陽性CAMPスコアを与え
る。QXP031の適用は、完全な溶血の阻害をもたらす。
【図２３】 化合物QXP031（(R)-4-アセトキシ- シクロペンタ-2- エノン）
によるミルクタンパク質のタンパク質分解の阻害を示す図。脱脂乳含有プレート
にS.pyogenes 19615を含むトップアガーを重層した。化合物を含まないDMSO対照
または化合物QXP031を含むフィルターディスクをプレートに適用し、嫌気的に37
℃で一晩培養した。図23に示すように、タンパク質分解が阻害されたQXP031含有
ディスク周辺ゾーン以外は、S.pyogenesプロテアーゼ活性により、プレート全体
が透明である。
【図２４】 合成4-ヒドロキシ-5- メチル-2H-フラン-3- オンによる生物発
光の誘導を示す図。V.harveyi のMM32インジケーター株（LuxS- 、LuxN- ）を様
々な用量のAI-2と共にインキュベートし、6 時間のインキュベーション中の様々
な時点で生物発光シグナルを測定した。
【図２５】 野生型V.harveyi （BB120 株）、MM32株（LuxN- 、LuxS- ）お
よびV.harveyi インジケーター株BB170 （LuxN- ）のバイオフィルム形成を示す
図。グルコースを補足したAB培地（ABG ；パネルA ）またはグルコースを補足し
たLB培地（LBG ；パネルB ）を使って、各細菌株をバイオフィルム形成について
試験した。600nm での吸光度測定値（A600）を使って、バイオフィルムに付着し
たクリスタルバイオレットの量を測定した。
【図２６】 様々な量の4-ヒドロキシ-5- メチル-2H-フラン-3- オンに応答
して起こるV.harveyi のバイオフィルム形成を示す図。各アッセイにおけるAI-2
の最終濃度を示す。
【図２７】 AI-2に応答して起こるPseudomonas aeruginosaのバイオフィル
ム形成を示す図。グルコースを補足したAB培地（LBG ）を使って、Pseudomonas
aeruginosa（ATCC27853 ）をバイオフィルム形成について試験した。600nm での
吸光度測定値（A600）を使って、バイオフィルムに付着したクリスタルバイオレ
ットの量を測定した。凡例の用量はアッセイにおけるAI-2の最終濃度を表す。
【図２８】 内因的に産生されたオートインデューサー2 から生じる生物発
光シグナルに対するQXP-048 （2-メトキシ-2,4- ジフェニル-3(2H)- フラノン）
の効果を測定するBB170 アッセイを示す図。アッセイの開始時にQXP-048 を25μ
g/mlの最終濃度で加えた。
【図２９】 外因性オートインデューサー2 からのシグナルに対するQXP-04
8 の効果を測定するBB170 アッセイを示す図。アッセイの開始時に外因性合成オ
ートインデューサー2 を25μg/lmの最終濃度で加えた。アッセイの開始時にQXP-
048 を25μg/mlの最終濃度で加えた。
【図３０】 化合物QXP-048 の阻害能をさらに確認するためのMM32アッセイ
を示す図。アッセイの開始時に外因性合成オートインデューサー2 を25μg/mlの
最終濃度で加えた。アッセイの開始時にQXP-048 を25μg/mlの最終濃度で加えた
。
【図３１】 化合物QXP-035 による生物発光の阻害を示す図。BB170 に基づ
くAI-2依存的生物発光アッセイに様々な量のQXP-035 を使用し（凡例にμg/mlの
単位で表示する）、生物発光に対する効果を経時的にモニターした。
【図３２】 細胞増殖に対する化合物QXP-035 （2-エチル-4- ヒドロキシ-5
- メチル-3(2H)- フラノン）の効果を示す図。2.4 μg/mlまたは2.5mg/mlの化合
物QXP-035 の存在下でStreptococus pyogenes ATCC19615 を増殖させた。600nm
での吸光度を定期的に測定することによって細胞増殖をモニターした。
【図３３】 AI-2受容体に対する阻害化合物（A 欄）および刺激化合物（B
欄およびC 欄）の例。
【図３４】 AI-2受容体に対する刺激化合物の例。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/215 Ａ６１Ｋ 31/215 ４Ｃ０３１ 31/341 31/341 ４Ｃ０３７ 31/351 31/351 ４Ｃ０５６ 31/357 31/357 ４Ｃ０６２ 31/381 31/381 ４Ｃ０８４ 31/42 31/42 ４Ｃ０８６ 31/43 31/43 ４Ｃ２０６ 31/496 31/496 ４Ｈ００６ 38/00 45/06 45/06 Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｃ 49/395 Ｃ０７Ｃ 49/395 49/597 49/597 49/647 49/647 69/145 69/145 Ｃ１２Ｐ 7/26 Ｃ１２Ｐ 7/26 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ０７Ｄ 215/56 // Ｃ０７Ｄ 215/56 261/16 261/16 307/12 307/12 307/20 307/20 307/58 307/32 307/60 Ｚ 307/33 309/10 307/58 317/20 307/60 317/34 309/10 333/32 317/20 499/68 Ｂ 317/34 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｚ 333/32 Ｃ１２Ｒ 1:63 499/68 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ０７Ｄ 307/32 Ｅ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｑ Ｃ１２Ｒ 1:63） Ｇ Ｔ Ｃ Ｐ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 ユニバーシティー・テクノロジーズ・イン ターナショナル・インコーポレイテッド カナダ国 Ｔ２Ｌ ２Ｋ７ アルバータ州 カルガリー サーティーファースト ス トリート エヌ．ダブリュ．3553 スイー ト 130 (72)発明者 バスラー、ボニー、エル． アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08542、プリンストン、パイン ストリー ト 39 (72)発明者 ダメル、キャロル、エス． アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92026、エスコンディド、フェアクレスト ウェイ 28677 (72)発明者 シャウダー、ステファン アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08540、プリンストン、プロスペクト ア ベニュー 120、アパートメント．ジー− １ (72)発明者 ショカット、ケヴァン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94129、サンフランシスコ、リジェット アベニュー 726エー (72)発明者 ステイン、ジェフリー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92129、サン ディエゴ、サマンサ アベ ニュー 13525 (72)発明者 シュレット、マイケル、ジー． カナダ ティー３ジー ２アール９ アル バータ州、カルガリー、エヌ．ダブリュ ー．、ホークウッド ブールバード 58 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 FB13 GC10 4B063 QA01 QA05 QQ06 QQ21 QQ41 QQ61 QQ67 QQ79 QQ89 QR32 QR35 QR39 QR48 QR55 QR75 QS32 QS33 QS34 QS36 QX01 QX02 QX10 4B064 AC36 CA21 CB07 CC01 DA01 DA13 4B065 AA55X AC20 BA30 CA43 CA44 CA46 4C023 FA07 4C031 PA01 PA02 4C037 CA09 DA06 DA07 EA05 EA10 FA10 JA05 KA02 4C056 AA01 AB01 AC01 AD01 AE03 FA03 FB13 FC01 4C062 AA01 AA19 4C084 AA01 AA02 AA17 AA20 BA01 BA08 BA17 BA25 BA28 CA59 DA44 DC50 MA02 NA14 ZB351 ZB352 4C086 BA03 BA07 BC29 BC50 BC67 CC04 MA03 MA05 NA14 ZB35 4C206 CB12 CB14 CB15 CB21 CB23 CB24 CB25 DA04 MA03 MA05 ZB35 4H006 AA03 AB81 BJ10 BR70 KD10

Claims (124)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 オートインデューサー2 受容体の活性を調節する方法であっ
    て、オートインデューサー2 受容体をAI-2アゴニストまたはアンタゴニスト化合
    物と接触させることを含む方法。
  2. 【請求項２】 化合物が 【化１】 ［式中、X は酸素、硫黄または窒素であり、 R1a は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ
    、チオ、またはアリールであり、 R1b は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ
    、メルカプト、チオ、またはアリールであるか、またはR1a およびR1b は全体と
    して二重結合を形成することができ、 R2は水素、アルキル、またはハロゲンであり、 R3は水素、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ、チオ、または
    アリールであり、 X が窒素である場合、R4は水素であり、X が酸素または硫黄である場合、R4は
    存在せず、 C4およびC5はさらに二重結合によって連結されていてもよい］ の構造、または 【化２】 ［式中、C2は、水素、ヒドロキシル、C1-5アルキル、C2-5アルケニル、C2-5アル
    カノイル、C2-5アルカノイルオキシ、ヘテロアリールから選択される少なくとも
    1 つの置換基にさらに結合しているか、または酸素原子もしくはC3と共に二重結
    合を形成し、C3は、水素、ヒドロキシル、C1-5アルキル、C2-5アルケニル、C2-5 アルカノイル、C2-5アルカノイルオキシから選択される少なくとも1 つの置換基
    にさらに結合しているか、または酸素原子もしくはC2と共に二重結合を形成し、
    C4は、水素、C1-5アルキル、C2-5アルカノイル、C2-5アルカノイルオキシから選
    択される少なくとも1 つの置換基にさらに結合しているか、または酸素原子もし
    くはC5と共に二重結合を形成し、C5は、水素、C1-5アルキル、C2-5アルカノイル
    、C2-5アルカノイルオキシから選択される少なくとも1 つの置換基にさらに結合
    しているか、または酸素原子もしくはC4と共に二重結合を形成し、C2、C3、C4ま
    たはC5のうち少なくとも1 つは、ヒドロキシル、C1-5アルキル、C2-5アルケニル
    、C2-5アルカノイル、およびヘテロアリールから選択される置換基に結合してお
    り、環内に存在する炭素- 炭素二重結合は多くとも1 つである］ の構造、または 【化３】 ［式中、R はC1-5アルコキシル基である］ の構造を含む請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 オートインデューサー2 受容体がLuxPおよびLuxQからなる群
    より選択される請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 オートインデューサー2 受容体がLuxPである請求項３の方法
    。
  5. 【請求項５】 オートインデューサー2 受容体がLuxQである請求項３の方法
    。
  6. 【請求項６】 AI-2受容体が細菌細胞上に見いだされる請求項１の方法。
  7. 【請求項７】 細菌細胞が温血性宿主に見いだされる請求項６の方法。
  8. 【請求項８】 調節される活性が細菌細胞増殖である請求項７の方法。
  9. 【請求項９】 化合物が式： 【化４】 ［式中、X は酸素、硫黄または窒素であり、 R1a は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ
    、チオ、またはアリールであり、 R1b は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ
    、メルカプト、チオ、またはアリールであるか、またはR1a およびR1b は全体と
    して二重結合を形成することができ、 R2は水素、アルキル、またはハロゲンであり、 R3は水素、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ、チオ、または
    アリールであり、 X が窒素である場合、R4は水素であり、X が酸素または硫黄である場合、R4は
    存在せず、 C4およびC5はさらに二重結合によって連結されていてもよい］ で表される請求項８の方法。
  10. 【請求項１０】 化合物が式： 【化５】 で表される請求項９の方法。
  11. 【請求項１１】 細菌細胞が、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、コ
    レラ菌（Vibrio cholerae ）、腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus ）、ビ
    ブリオ・アルギノリチカス（Vibrio alginolyticus）、シュードモナス・ホスホ
    レウム（Pseudomonas phosphoreum ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersin
    ia enterocolitica ）、大腸菌（Escherichia coli）、ネズミチフス菌（Salmon
    ella typhimurium）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、ヘリコバ
    クター・ピロリ（Helicobacter pylori ）、枯草菌（Bacillus subtilis ）、ボ
    レリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgfdorferi ）、髄膜炎菌（Neisseria
    meningitidis）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae ）、ペスト菌（Yersinia pesti
    s ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、デイノコック
    ス・ラジオデュランス（Deinococcus radiodurans ）、結核菌（Mycobacterium
    tuberculosis）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis ）、
    肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿性レンサ球菌（Streptococ
    cus pyogenes）および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus ）からなる群よ
    り選択される請求項８の方法。
  12. 【請求項１２】 活性が細菌のビルレンスである請求項６の方法。
  13. 【請求項１３】 化合物が式： 【化６】 ［式中、X は酸素、硫黄または窒素であり、 R1a は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ
    、チオ、またはアリールであり、 R1b は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ
    、メルカプト、チオ、またはアリールであるか、またはR1a およびR1b は全体と
    して二重結合を形成することができ、 R2は水素、アルキル、またはハロゲンであり、 R3は水素、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ、チオ、または
    アリールであり、 X が窒素である場合、R4は水素であり、X が酸素または硫黄である場合、R4は
    存在せず、 C4およびC5はさらに二重結合によって連結されていてもよい］ で表される請求項１２の方法。
  14. 【請求項１４】 化合物が式： 【化７】 で表される請求項１３の方法。
  15. 【請求項１５】 細菌細胞が、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、コ
    レラ菌（Vibrio cholerae ）、腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus ）、ビ
    ブリオ・アルギノリチカス（Vibrio alginolyticus）、シュードモナス・ホスホ
    レウム（Pseudomonas phosphoreum ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersin
    ia enterocolitica ）、大腸菌（Escherichia coli）、ネズミチフス菌（Salmon
    ella typhimurium）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、ヘリコバ
    クター・ピロリ（Helicobacter pylori ）、枯草菌（Bacillus subtilis ）、ボ
    レリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgfdorferi ）、髄膜炎菌（Neisseria
    meningitidis）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae ）、ペスト菌（Yersinia pesti
    s ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、デイノコック
    ス・ラジオデュランス（Deinococcus radiodurans ）、結核菌（Mycobacterium
    tuberculosis）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis ）、
    肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿性レンサ球菌（Streptococ
    cus pyogenes）および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus ）からなる群よ
    り選択される請求項１３の方法。
  16. 【請求項１６】 活性がシデロフォア発現である請求項６の方法。
  17. 【請求項１７】 活性がシデロフォア発現の阻害である請求項１６の方法。
  18. 【請求項１８】 化合物が式： 【化８】 ［式中、X は酸素、硫黄または窒素であり、 R1a は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ
    、チオ、またはアリールであり、 R1b は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ
    、メルカプト、チオ、またはアリールであるか、またはR1a およびR1b は全体と
    して二重結合を形成することができ、 R2は水素、アルキル、またはハロゲンであり、 R3は水素、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ、チオ、または
    アリールであり、 X が窒素である場合、R4は水素であり、X が酸素または硫黄である場合、R4は
    存在せず、 C4およびC5はさらに二重結合によって連結されていてもよい］ で表される請求項１６の方法。
  19. 【請求項１９】 細菌細胞が、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、コ
    レラ菌（Vibrio cholerae ）、腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus ）、ビ
    ブリオ・アルギノリチカス（Vibrio alginolyticus）、シュードモナス・ホスホ
    レウム（Pseudomonas phosphoreum ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersin
    ia enterocolitica ）、大腸菌（Escherichia coli）、ネズミチフス菌（Salmon
    ella typhimurium）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、ヘリコバ
    クター・ピロリ（Helicobacter pylori ）、枯草菌（Bacillus subtilis ）、ボ
    レリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgfdorferi ）、髄膜炎菌（Neisseria
    meningitidis）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae ）、ペスト菌（Yersinia pesti
    s ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、デイノコック
    ス・ラジオデュランス（Deinococcus radiodurans ）、結核菌（Mycobacterium
    tuberculosis）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis ）、
    肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿性レンサ球菌（Streptococ
    cus pyogenes）および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus ）からなる群よ
    り選択される請求項１６の方法。
  20. 【請求項２０】 調節される活性が細菌細胞におけるエキソポリサッカライ
    ド産生である請求項６の方法。
  21. 【請求項２１】 エキソポリサッカライド産生がルゴースポリサッカライド
    （rugose polysaccharide ）産生である請求項２０の方法。
  22. 【請求項２２】 化合物が式： 【化９】 ［式中、X は酸素、硫黄または窒素であり、 R1a は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ
    、チオ、またはアリールであり、 R1b は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ
    、メルカプト、チオ、またはアリールであるか、またはR1a およびR1b は全体と
    して二重結合を形成することができ、 R2は水素、アルキル、またはハロゲンであり、 R3は水素、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ、チオ、または
    アリールであり、 X が窒素である場合、R4は水素であり、X が酸素または硫黄である場合、R4は
    存在せず、 C4およびC5はさらに二重結合によって連結されていてもよい］ で表される請求項２０の方法。
  23. 【請求項２３】 調節される活性が細菌のコロニー形態である請求項６の方
    法。
  24. 【請求項２４】 調節される活性が平滑なコロニー形態の形成である請求項
    ２３の方法。
  25. 【請求項２５】 細菌細胞が病原性細菌細胞である請求項２４の方法。
  26. 【請求項２６】 化合物が式： 【化１０】 ［式中、X は酸素、硫黄または窒素であり、 R1a は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ
    、チオ、またはアリールであり、 R1b は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ
    、メルカプト、チオ、またはアリールであるか、またはR1a およびR1b は全体と
    して二重結合を形成することができ、 R2は水素、アルキル、またはハロゲンであり、 R3は水素、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ、チオ、または
    アリールであり、 X が窒素である場合、R4は水素であり、X が酸素または硫黄である場合、R4は
    存在せず、 C4およびC5はさらに二重結合によって連結されていてもよい］ で表される請求項２３の方法。
  27. 【請求項２７】 調節される活性がバイオフィルム形成である請求項６の方
    法。
  28. 【請求項２８】 化合物が式： 【化１１】 ［式中、X は酸素、硫黄または窒素であり、 R1a は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ
    、チオ、またはアリールであり、 R1b は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ
    、メルカプト、チオ、またはアリールであるか、またはR1a およびR1b は全体と
    して二重結合を形成することができ、 R2は水素、アルキル、またはハロゲンであり、 R3は水素、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ、チオ、または
    アリールであり、 X が窒素である場合、R4は水素であり、X が酸素または硫黄である場合、R4は
    存在せず、 C4およびC5はさらに二重結合によって連結されていてもよい］ で表される請求項２７の方法。
  29. 【請求項２９】 化合物が式： 【化１２】 で表される請求項２８の方法。
  30. 【請求項３０】 オートインデューサー2 の活性を調節する化合物を同定す
    る方法であって、 （a ）オートインデューサー2 を化合物と接触させること、 （b ）化合物の存在下でオートインデューサー2 の活性を測定し、化合物の存在
    下で得られるオートインデューサー2 の活性を、化合物の不在下で得られるオー
    トインデューサー2 の活性と比較すること、および （c ）オートインデューサー2 の活性を調節する化合物を同定すること、 を含む方法。
  31. 【請求項３１】 オートインデューサー2 が4-ヒドロキシ-5- メチル-2H-フ
    ラン-3- オンである請求項３０の方法。
  32. 【請求項３２】 接触がインビボで行われる請求項３０の方法。
  33. 【請求項３３】 接触がインビトロで行われる請求項３０の方法。
  34. 【請求項３４】 調節がオートインデューサー2 の活性を増加させることに
    よって行われる請求項３０の方法。
  35. 【請求項３５】 調節がオートインデューサー2 の活性を減少させることに
    よって行われる請求項３０の方法。
  36. 【請求項３６】 化合物がポリペプチドである請求項３０の方法。
  37. 【請求項３７】 化合物が小分子である請求項３０の方法。
  38. 【請求項３８】 化合物が核酸である請求項３０の方法。
  39. 【請求項３９】 オートインデューサー2 の活性を調節するオートインデュ
    ーサー2 類似体を同定する方法であって、 （a ）オートインデューサー2 に応答して検出可能な量の光を生成する生合成経
    路を含む細菌細胞またはその抽出物をオートインデューサー類似体と接触させる
    こと、 （b ）オートインデューサー2 の存在下で細菌細胞またはその抽出物が生成する
    光の量を、オートインデューサー2 およびオートインデューサー2 類似体の存在
    下で生成する量と比較すること を含み、ここで、光生成量の変化は、オートインデューサー2 の活性を調節する
    オートインデューサー2 類似体の指標となる方法。
  40. 【請求項４０】 オートインデューサー2 が内因性オートインデューサー2
    である請求項３９の方法。
  41. 【請求項４１】 オートインデューサー2 が細菌細胞中で合成されるか、ま
    たはその抽出物によって合成される請求項３９の方法。
  42. 【請求項４２】 オートインデューサー2 が外因性オートインデューサー2
    である請求項３９の方法。
  43. 【請求項４３】 接触がインビトロで行われる請求項３９の方法。
  44. 【請求項４４】 接触がインビボで行われる請求項３９の方法。
  45. 【請求項４５】 細菌細胞またはその抽出物をオートインデューサー2 と接
    触させることをさらに含む請求項３９の方法。
  46. 【請求項４６】 調節がオートインデューサー2 活性の阻害によって行われ
    る請求項３９の方法。
  47. 【請求項４７】 調節がオートインデューサー2 活性の増進によって行われ
    る請求項３９の方法。
  48. 【請求項４８】 類似体がリボース誘導体を含んでなる請求項３９の方法。
  49. 【請求項４９】 細菌細胞またはその抽出物が、さらに、オートインデュー
    サー経路に関与する遺伝子座に少なくとも1 つの明瞭な変化を含み、その変化が
    オートインデューサーの産生または検出を阻害する、請求項３９の方法。
  50. 【請求項５０】 遺伝子座中の変化がLuxS遺伝子中の変化を含む請求項４９
    の方法。
  51. 【請求項５１】 遺伝子座中の変化がオートインデューサー2 の産生を阻害
    する請求項４９の方法。
  52. 【請求項５２】 遺伝子座中の変化がLuxN遺伝子中の変化を含む請求項４９
    の方法。
  53. 【請求項５３】 遺伝子座中の変化がオートインデューサー1 の検出を阻害
    する請求項４９の方法。
  54. 【請求項５４】 変化がLuxNおよびLuxS遺伝子座中にある請求項４９の方法
    。
  55. 【請求項５５】 細菌細胞がビブリオ・ハーベイ（V.harveyi ）MM32株であ
    る請求項４９の方法。
  56. 【請求項５６】 オートインデューサー2 の産生または活性を調節する化合
    物を同定する方法であって、 オートインデューサー2 を産生する細菌細胞を化合物と接触させること、およ
    び オートインデューサー2 活性が細菌細胞中に存在するかどうかを決定すること
    、 を含む方法。
  57. 【請求項５７】 オートインデューサー2 活性がオートインデューサー2 産
    生の阻害を検出することによって決定される請求項５６の方法。
  58. 【請求項５８】 オートインデューサー2 活性がオートインデューサー2 の
    存在下で生成するシグナルを検出することによって決定される請求項５７の方法
    。
  59. 【請求項５９】 オートインデューサー2 のアンタゴニストを検出する請求
    項５８の方法。
  60. 【請求項６０】 レポーター細菌株からの発光の変化を検出する請求項５９
    の方法。
  61. 【請求項６１】 細菌株がビブリオ（Vibrio）属の細菌株である請求項６０
    の方法。
  62. 【請求項６２】 細菌株が種ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）の細菌
    株である請求項６１の方法。
  63. 【請求項６３】 細菌株がビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）BB170 で
    ある請求項６２の方法。
  64. 【請求項６４】 細菌株がビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）MM32であ
    る請求項６２の方法。
  65. 【請求項６５】 オートインデューサー関連細菌バイオマーカーを検出する
    方法であって、 （a ）少なくとも1 つの細菌細胞を、細菌バイオマーカーの誘導が促進されるよ
    うな条件下で、細菌培養マーカーの誘導が促進されるような時間にわたって、オ
    ートインデューサー分子と接触させること、および （b ）細菌バイオマーカーを検出すること、 を含む方法。
  66. 【請求項６６】 オートインデューサーがオートインデューサー2 である請
    求項６５の方法。
  67. 【請求項６７】 オートインデューサー2 が4-ヒドロキシ-5- メチル-2H-フ
    ラン-3- オンである請求項６５の方法。
  68. 【請求項６８】 オートインデューサー2 受容体へのオートインデューサー
    2 の結合に影響を及ぼす化合物を同定する方法であって、 （a ）オートインデューサー2 およびオートインデューサー2 受容体を化合物と
    接触させて、オートインデューサー2 をオートインデューサー2 受容体に結合さ
    せること、 （b ）（a ）を、オートインデューサー2 受容体へのオートインデューサー2 の
    結合に応答して光を生成する生合成経路を含む細胞または細胞抽出物と接触させ
    ること、ならびに （c ）光生成に対する化合物の効果を測定すること、 を含み、化合物の存在下で起こる光生成を化合物の不在下で起こる光生成と比較
    したときの変化によって、当該化合物は、オートインデューサー2 受容体へのオ
    ートインデューサー2 の結合に影響を及ぼす化合物であることが同定される方法
    。
  69. 【請求項６９】 化合物が競合阻害剤および自殺阻害剤からなる群より選択
    される請求項６８の方法。
  70. 【請求項７０】 オートインデューサー2 受容体がluxPおよびluxNからなる
    群より選択される請求項６８の方法。
  71. 【請求項７１】 化合物の不在下でオートインデューサー2 にオートインデ
    ューサー2 受容体との複合体を形成させる請求項６８の方法。
  72. 【請求項７２】 オートインデューサー2/オートインデューサー2 受容体複
    合体が固形支持体に結合される請求項６８の方法。
  73. 【請求項７３】 固形支持体がカラムマトリックスおよびマイクロタイター
    プレートのウェルからなる群より選択される請求項７２の方法。
  74. 【請求項７４】 オートインデューサー2/オートインデューサー2 受容体複
    合体がアミド基、エステル基およびエーテル基からなる群より選択される結合に
    よって固形支持体に結合される請求項７３の方法。
  75. 【請求項７５】 オートインデューサー2 を製造する方法であって、S-アデ
    ノシルホモシステイン（SAH ）をLuxSタンパク質と接触させ、よってS-アデノシ
    ルホモシステインをオートインデューサー2 に変換することを含む方法。
  76. 【請求項７６】 オートインデューサー2 の製造がインビトロで行われる請
    求項７５の方法。
  77. 【請求項７７】 オートインデューサー2 の製造がインビボで行われる請求
    項７５の方法。
  78. 【請求項７８】 5'- メチルチオアデノシン/S- アデノシルホモシステイン
    ヌクレオシダーゼタンパク質（pfs ）をさらに含む請求項７５の方法。
  79. 【請求項７９】 オートインデューサー2 が4-ヒドロキシ-5- メチル-2H-フ
    ラン-3- オンである請求項７５の方法。
  80. 【請求項８０】 オートインデューサー2 を生成する方法であって、S-リボ
    シルホモシステイン（SRH ）をLuxSポリペプチドと接触させ、よってS-リボシル
    ホモシステインをオートインデューサー2 に変換することを含む方法。
  81. 【請求項８１】 オートインデューサー2 が4-ヒドロキシ-5- メチル-2H-フ
    ラン-3- オンである請求項８０の方法。
  82. 【請求項８２】 請求項８０の方法によって製造される単離されたオートイ
    ンデューサー2 。
  83. 【請求項８３】 オートインデューサー2 を製造する方法であって、 （a ）S-アデノシルホモシステイン（SAH ）を5'- メチルチオアデノシン/S- ア
    デノシルホモシステインヌクレオシダーゼ（pfs ）タンパク質と接触させ、よっ
    てS-アデノシルホモシステインをS-リボシルホモシステインに変換すること、
    （b ）（a ）で得たS-リボシルホモシステインをLuxSタンパク質と接触させ、よ
    ってS-リボシルホモシステインをオートインデューサー2 に変換すること、 を含む方法。
  84. 【請求項８４】 オートインデューサー2 が4-ヒドロキシ-5- メチル-2H-フ
    ラン-3- オンである請求項８３の方法。
  85. 【請求項８５】 請求項８３の方法によって製造される単離されたオートイ
    ンデューサー2 。
  86. 【請求項８６】 オートインデューサー関連バイオマーカーを検出する方法
    であって、 （a ）少なくとも1 つの細胞を、バイオマーカーの誘導が促進されるような条件
    下で、バイオマーカーの誘導が促進されるような時間にわたって、オートインデ
    ューサー分子と接触させること、および （b ）バイオマーカーを検出すること、 を含む方法。
  87. 【請求項８７】 オートインデューサーがオートインデューサー2 である請
    求項８６の方法。
  88. 【請求項８８】 オートインデューサー2 が4-ヒドロキシ-5- メチル-2H-フ
    ラン-3- オンである請求項８７の方法。
  89. 【請求項８９】 抗生物質と微生物の定数感知経路の阻害剤とを含む相乗的
    抗生組成物。
  90. 【請求項９０】 阻害剤がAI-1定数感知経路を阻害する請求項８９の相乗的
    抗生組成物。
  91. 【請求項９１】 阻害剤が 【化１３】 ［式中、R1はハロゲン原子、アセトキシ基またはヒドロキシ基であり、 R2は水素原子またはブロモ基であり、 R3は水素原子またはブロモ基であり、 R4はブロモ基またはヨード基である］ の構造を持つハロゲン化2(5H)-フラノンである請求項８９の相乗的抗生組成物。
  92. 【請求項９２】 AI-1定数感知経路を阻害する阻害剤が、 【化１４】 の構造を持つ修飾N-ブチリル-L- ホモセリン化合物、または 【化１５】 の構造を持つ修飾N-(3- オキソドデカノイル)-L-ホモセリンラクトン化合物 ［上記の構造において、R1〜R21 は、C1〜C4アルキル基、水素原子、ヒドロキシ
    基、アミノ基またはチオール基から選択され、 R22 およびR23 は酸素原子であっても硫黄原子であってもよく、ならびに、 R24 〜R28 は水素原子またはハロゲン原子である］ である請求項９０の相乗的抗生組成物。
  93. 【請求項９３】 阻害剤がAI-2定数感知経路を阻害する請求項８９の相乗的
    抗生組成物。
  94. 【請求項９４】 AI-2定数感知経路を阻害する阻害剤が、 【化１６】 ［式中、X は酸素、硫黄または窒素であり、 R1a は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ
    、チオ、またはアリールであり、 R1b は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ
    、メルカプト、チオ、またはアリールであるか、またはR1a およびR1b は全体と
    して二重結合を形成することができ、 R2は水素、アルキル、またはハロゲンであり、 R3は水素、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ、チオ、または
    アリールであり、 X が窒素である場合、R4は水素であり、X が酸素または硫黄である場合、R4は
    存在せず、 C4およびC5はさらに二重結合によって連結されていてもよい］ の構造、または 【化１７】 ［式中、C2は、水素、ヒドロキシル、C1-5アルキル、C2-5アルケニル、C2-5アル
    カノイル、C2-5アルカノイルオキシ、ヘテロアリールから選択される少なくとも
    1 つの置換基にさらに結合しているか、または酸素原子もしくはC3と共に二重結
    合を形成し、C3は、水素、ヒドロキシル、C1-5アルキル、C2-5アルケニル、C2-5 アルカノイル、C2-5アルカノイルオキシから選択される少なくとも1 つの置換基
    にさらに結合しているか、または酸素原子もしくはC2と共に二重結合を形成し、
    C4は、水素、C1-5アルキル、C2-5アルカノイル、C2-5アルカノイルオキシから選
    択される少なくとも1 つの置換基にさらに結合しているか、または酸素原子もし
    くはC5と共に二重結合を形成し、C5は、水素、C1-5アルキル、C2-5アルカノイル
    、C2-5アルカノイルオキシから選択される少なくとも1 つの置換基にさらに結合
    しているか、または酸素原子もしくはC4と共に二重結合を形成し、C2、C3、C4ま
    たはC5のうち少なくとも1 つは、ヒドロキシル、C1-5アルキル、C2-5アルケニル
    、C2-5アルカノイル、およびヘテロアリールから選択される置換基に結合してお
    り、環内に存在する炭素- 炭素二重結合は多くとも1 つである］ の構造、または 【化１８】 ［式中、R はC1-5アルコキシル基である］ の構造を含む請求項９３の相乗的抗生組成物。
  95. 【請求項９５】 阻害剤が5-メチル-2- エチル-4- ヒドロキシ-3(2H)- フラ
    ノンである請求項９４の相乗的抗生組成物。
  96. 【請求項９６】 阻害剤が2,5-ジメチル-4- ヒドロキシ-3(2H)- フラノンで
    ある請求項９５の相乗的抗生組成物。
  97. 【請求項９７】 阻害剤がペプチド媒介定数感知経路を阻害する請求項８９
    の相乗的抗生組成物。
  98. 【請求項９８】 抗生物質がアンピシリンである請求項９７の相乗的抗生組
    成物。
  99. 【請求項９９】 阻害剤が、 【化１９】 の構造、または 【化２０】 の構造、または (cyclo)-YSTCDFIM、 (cyclo)-GVNACSSLF 、 (cyclo)-GVNASSSLF 、もしくは (cyclo)-GVNA(DAPA)SSLF の構造 ［最後に挙げた4 つの構造では、C 末端カルボニル基は、 システイン残基の硫黄原子とチオラクトンを形成するか（YSTCDFIMおよびGVNA
    CSSLF ）、 第1 セリン残基の酸素原子とラクトン基を形成するか（GVNASSSLF ）、または ジアミノプロピオン酸（DAPA）残基のアミノ基とアミド結合を形成する（GVNA
    (DAPA)SSLF）］ で表される請求項９７の相乗的抗生組成物。
  100. 【請求項１００】 抗生物質がペニシリン、キノリン、バンコマイシンおよ
    びスルホンアミドからなる群より選択される請求項９７の相乗的抗生組成物。
  101. 【請求項１０１】 抗生物質がアンピシリン、シプロフロキサシンおよびス
    ルフィソキサゾールからなる群より選択される請求項１００の相乗的抗生組成物
    。
  102. 【請求項１０２】 抗生物質と微生物の定数感知経路の阻害剤またはその医
    薬的に許容できる塩とを含む相乗的抗生組成物および1 または複数の医薬的に許
    容できる担体、佐剤または賦形剤を含む医薬組成物。
  103. 【請求項１０３】 定数感知経路がAI-1定数感知経路である請求項１０２の
    組成物。
  104. 【請求項１０４】 阻害剤が 【化２１】 ［式中、R1はハロゲン原子、アセトキシ基またはヒドロキシ基であり、 R2は水素原子またはブロモ基であり、 R3は水素原子またはブロモ基であり、 R4はブロモ基またはヨード基である］ の構造を持つハロゲン化2(5H)-フラノンである請求項１０３の組成物。
  105. 【請求項１０５】 AI-1阻害剤が、 【化２２】 の構造を持つ修飾N-ブチリル-L- ホモセリンラクトン化合物、または 【化２３】 の構造を持つ修飾N-(3- オキソドデカノイル)-L-ホモセリンラクトン化合物 ［上記の構造において、R1〜R21 は、C1〜C4アルキル基、水素原子、ヒドロキシ
    基、アミノ基またはチオール基から選択され、 R22 およびR23 は酸素原子であっても硫黄原子であってもよく、ならびに、 R24 〜R28 は水素原子またはハロゲン原子である］ である請求項１０３の組成物。
  106. 【請求項１０６】 阻害剤がAI-2定数感知経路を阻害する請求項１０２の組
    成物。
  107. 【請求項１０７】 AI-2定数感知経路を阻害する阻害剤が、 【化２４】 ［式中、X は酸素、硫黄または窒素であり、 R1a は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ
    、チオ、またはアリールであり、 R1b は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ
    、メルカプト、チオ、またはアリールであるか、またはR1a およびR1b は全体と
    して二重結合を形成することができ、 R2は水素、アルキル、またはハロゲンであり、 R3は水素、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ、チオ、または
    アリールであり、 X が窒素である場合、R4は水素であり、X が酸素または硫黄である場合、R4は
    存在せず、 C4およびC5はさらに二重結合によって連結されていてもよい］ の構造、または 【化２５】 ［式中、C2は、水素、ヒドロキシル、C1-5アルキル、C2-5アルケニル、C2-5アル
    カノイル、C2-5アルカノイルオキシ、ヘテロアリールから選択される少なくとも
    1 つの置換基にさらに結合しているか、または酸素原子もしくはC3と共に二重結
    合を形成し、C3は、水素、ヒドロキシル、C1-5アルキル、C2-5アルケニル、C2-5 アルカノイル、C2-5アルカノイルオキシから選択される少なくとも1 つの置換基
    にさらに結合しているか、または酸素原子もしくはC2と共に二重結合を形成し、
    C4は、水素、C1-5アルキル、C2-5アルカノイル、C2-5アルカノイルオキシから選
    択される少なくとも1 つの置換基にさらに結合しているか、または酸素原子もし
    くはC5と共に二重結合を形成し、C5は、水素、C1-5アルキル、C2-5アルカノイル
    、C2-5アルカノイルオキシから選択される少なくとも1 つの置換基にさらに結合
    しているか、または酸素原子もしくはC4と共に二重結合を形成し、C2、C3、C4ま
    たはC5のうち少なくとも1 つは、ヒドロキシル、C1-5アルキル、C2-5アルケニル
    、C2-5アルカノイル、およびヘテロアリールから選択される置換基に結合してお
    り、環内に存在する炭素- 炭素二重結合は多くとも1 つである］ の構造、または 【化２６】 ［式中、R はC1-5アルコキシル基である］ の構造を含む請求項１０６の組成物。
  108. 【請求項１０８】 阻害剤が5-メチル-2- エチル-4- ヒドロキシ-3(2H)- フ
    ラノンである請求項１０７の医薬組成物。
  109. 【請求項１０９】 阻害剤が2,5-ジメチル-4- ヒドロキシ-3(2H)- フラノン
    である請求項１０７の医薬組成物。
  110. 【請求項１１０】 阻害剤が2-メトキシ-2,4- ジフェニル-3(2H)- フラノン
    である請求項１０７の医薬組成物。
  111. 【請求項１１１】 阻害剤がペプチド媒介定数感知経路を阻害する請求項１
    ０２の医薬組成物。
  112. 【請求項１１２】 阻害剤が、 【化２７】 の構造、または 【化２８】 の構造、または (cyclo)-YSTCDFIM、 (cyclo)-GVNACSSLF 、 (cyclo)-GVNASSSLF 、もしくは (cyclo)-GVNA(DAPA)SSLF の構造 ［最後に挙げた4 つの構造では、C 末端カルボニル基は、 システイン残基の硫黄原子とチオラクトンを形成するか（YSTCDFIMおよびGVNA
    CSSLF ）、 第1 セリン残基の酸素原子とラクトン基を形成するか（GVNASSSLF ）、または ジアミノプロピオン酸（DAPA）残基のアミノ基とアミド結合を形成する（GVNA
    (DAPA)SSLF）］ で表される請求項１１１の医薬組成物。
  113. 【請求項１１３】 抗生物質がペニシリン、キノリン、バンコマイシンおよ
    びスルホンアミドからなる群より選択される請求項１１１の医薬組成物。
  114. 【請求項１１４】 抗生物質がアンピシリン、シプロフロキサシンおよびス
    ルフィソキサゾールからなる群より選択される請求項１１３の医薬組成物。
  115. 【請求項１１５】 定数感知機構を持つ微生物が引き起す温血動物における
    感染症を処置する方法であって、動物に治療有効量の請求項８９の相乗的抗生組
    成物を投与することを含む方法。
  116. 【請求項１１６】 微生物 が化膿性レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）である請求項１１５の方法。
  117. 【請求項１１７】 抗生物質がペニシリン、キノリン、バンコマイシンおよ
    びスルホンアミドからなる群より選択される請求項１１６の方法。
  118. 【請求項１１８】 抗生物質がアンピシリン、シプロフロキサシンおよびス
    ルフィソキサゾールからなる群より選択される請求項１１７の方法。
  119. 【請求項１１９】 微生物が黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus ）で
    ある請求項１１５の方法。
  120. 【請求項１２０】 ペニシリンがアンピシリンである請求項１１９の方法。
  121. 【請求項１２１】 阻害剤がAI-2定数感知経路を阻害する請求項１１９の方
    法。
  122. 【請求項１２２】 【化２９】 ［式中、X は酸素、硫黄または窒素であり、 R1a は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ
    、チオ、またはアリールであり、 R1b は水素、ヒドロキシ、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ
    、メルカプト、チオ、またはアリールであるか、またはR1a およびR1b は全体と
    して二重結合を形成することができ、 R2は水素、アルキル、またはハロゲンであり、 R3は水素、アルキル、アシル、アミド、ヒドロキシル、アミノ、チオ、または
    アリールであり、 X が窒素である場合、R4は水素であり、X が酸素または硫黄である場合、R4は
    存在せず、 C4およびC5はさらに二重結合によって連結されていてもよい］ の構造を含んでなる少なくとも1 つの抗微生物化合物を含み、かつ前記化合物が
    局所的抗微生物効果をもたらすのに十分な濃度で存在する医療用デバイス。
  123. 【請求項１２３】 請求項８９に記載の少なくとも1 つの相乗的抗生組成物
    を含み、かつ前記組成物が局所的抗微生物効果をもたらすのに十分な濃度で存在
    する医療用デバイス。
  124. 【請求項１２４】 請求項１０２に記載の少なくとも1 つの医薬組成物を含
    み、かつ前記組成物が局所的抗微生物効果をもたらすのに十分な濃度で存在する
    医療用デバイス。
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