BRPI0811530B1

BRPI0811530B1 - composição compreendendo indutor(es) de resposta fisiológica à dispersão ácido decanóico, superfície, solução, método ex vivo de tratamento ou inibição da formação de um biofilme sobre uma superfície

Info

Publication number: BRPI0811530B1
Application number: BRPI0811530A
Authority: BR
Inventors: G Davies David
Original assignee: Research Foundation Of State Univ Of New York
Priority date: 2007-05-14
Filing date: 2008-05-14
Publication date: 2019-01-02
Also published as: DE112008001301T5; WO2008143889A1; US8513305B2; JP2010529952A; CA2684150A1; US10653140B2; US20200275653A1; GB0920909D0; CN101801521B; CN101801521A; GB2463181B; US20130302390A1; US11452291B2; US20080317815A1; JP5548121B2; GB2463181A; BRPI0811530A2; DK200970201A; CA2684150C

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO INDUTOR(ES) DE RESPOSTA FISIOLÓGICA À DISPERSÃO ÁCIDO DECANÓICO, SUPERFÍCIE, SOLUÇÃO, MÉTODO EX VIVO DE TRATAMENTO OU INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DE UM BIOFILME SOBRE UMA SUPERFÍCIE.

Este pedido reivindica o benefício de Pedido de Patente Provisório N— de Série U.S. 60/917.791, depositado em 14 de maio de 2007, e 61/018.639, depositado em 2 de janeiro de 2008, que estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.

Esta invenção foi feita com o suporte do governo sob os números de concessão NSF MCB-0321672 e NIH RI 5 AI055521-01 outorgados por NIH e NSF. O governo possui alguns direitos nessa invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um método de indução de uma resposta fisiológica à dispersão em células bacterianas em um biofilme. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Devido à natureza compacta das estruturas de biofilme, o estado fisiológico reduzido presumido de bactérias em biofilme e a proteção conferida pelos polímeros de matriz de biofilme, os agentes químicos naturais e artificiais são incapazes de atacar e destruir adequadamente as populações de biofilmes infecciosas (Costerton e outros., Bacterial Biofilms in Nature and Disease, Annu. Rev. Microbiol. 41 :435-464 (1987); Hoiby e outros., The Immune Response to Bacterial Biofilms, In Microbial Biofilms, LappinScott e outros., eds., Cambridge: Cambridge University Press (1995)). A resistência aumentada a antibióticos é uma característica geral associada às bactérias em biofilmes. Quando ligadas, as bactérias exibem uma forte resistência, tornando as células de biofilme 10 a 1000 vezes menos suscetíveis a vários agentes antimicrobianos do que a mesma bactéria em cultura planctônica (flutuação livre). Por exemplo, cloro (como hipoclorito de sódio), um biocida oxidante considerado um dos agentes antibacterianos mais eficazes, foi mostrado para exigir um aumento de 600 vezes em concentração para exterminar as células de biofilme de Staphylococcus aureus quando compaPetição 870170030902, de 10/05/2017, pág. 13/153

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Petição 870170030902, de 10/05/2017, pág. 14/153 aureus Biofilm Cells to Disinfectants, Appl Environ Microbiol. 68:4194-200 (2002)). Várias hipóteses foram sugeridas para estimar a resistência extraordinária de bactérias em biofilmes a antibióticos inclusive: (i) taxas metabólicas e divisórias exibidas por bactérias de biofilme (particularmente aquelas dentro do biofilme); (ii) a matriz EPS de biofilme pode atuar como um adsorvente ou reagente, reduzindo a quantidade de agente disponível para interagir com as células de biofilme. Adicionalmente, a estrutura de biofilme pode reduzir fisicamente a penetração de agentes antimicrobianos impedindo o acesso a regiões do biofilme; (iii) as células de biofilme são fisiologicamente diferentes de bactérias planctônicas, que expressam fatores protetores específicos como bombas de efluxo de múltiplos fármacos e régulons de resposta ao estresse (Brown e outros., Resistance of Bacterial Biofilms to Antibiotics: A Growth-Rate Related Effect? J. Antimicrob. Chemotherapy 22:777- 783 (1988); Anwar e outros., Establishment of Aging Biofilms: Possible Mechanism of Bacterial Resistance to Antimicrobial Therapy, Antimicrob. Agents Chemother. 36: 1347-1351 (1992); Mah e outros., Mechanisms of Biofilm Resistance to Antimicrobial Agents, Trends Microbiol. 9:34-39 (2001); Sauer e outros., Pseudomonas aeruginosa Displays Multiple Phenotypes During Development as a Biofilm, J. Bacteriol. 184:1140-1 154 (2002); Stewart, P.S., Mechanisms of Antibiotic Resistance in Bacterial Biofilms, Int. J. Med. Microbiol. 292:107-1 13 (2002); Donlan e outros., Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Micro-organisms, Clinicai Microbiol. Reviews 15:167-193 (2002); Gilbert e outros., The Physiology and Collective Recalcitrance of Microbial Biofilm Communities, Adv. Microb. Physiol. 46:202-256 (2002); Gilbert e outros., Biofilms In vitro and In vivo: Do Singular Mechanisms Imply Cross-Resistance? J. Appl. Microbiol. Suppl. 98S-110S (2002)). Como os estudos moleculares detalhados apontam, vem se tornando claro que cada um desses fatores exerce uma função na resistência incomum de biofilmes a antimicrobianos. O tratamento inicial é geralmente eficaz no extermínio de bactérias apenas nas margens de microcolônias de biofilme. As bactérias dentro dessas microcolônias não são afetadas pelo antibiótico e formam um ninho de disseminação continuada da infecção.

Os biofilmes microbianos em infecções e em sistemas industriais apresentam problemas significativos devido a sua resistência a tratamento eficaz.

Descolamento é um termo generalizado usado para descrever a remoção de células (tanto individualmente como em grupos) de um biofilme ou substrato. Bryers, J. D., Modeling Biofilm Accumulation, In: Physiology Models in Microbiology. Bazin e outros., eds., Boca Raton, FL., Vol. 2, pp. 109-144 (1988) categorizou quatro mecanismos de descolamento distintos por meio dos quais as bactérias se desprendem-se de um biofilme. Esses são: abrasão, pastejo, erosão e descamação. Esses mecanismos foram descritos principalmente do ponto de vista do ambiente químico e físico que atua sobre as bactérias em biofilme. O descolamento ativo como um evento fisiologicamente regulado foi sugerido por muitos autores, porém poucos estudos foram realizados para demonstrar uma base biológica para o descolamento de bactérias de um biofilme.

Um estudo sobre a regulação fisiológica de descolamento foi realizado por Peyton e outros., Microbial Biofilms and Biofilm Reactors, Bioprocess Technol. 20: 187-231 (1995) sobre P. aeruginosa. Em seu trabalho, foi observado que a limitação de substrato resultou em uma redução na taxa de descolamento, aparentemente um resultado da redução de taxa de crescimento. Allison e outros., Extracellular Products as Mediators of the Formation and Detachment of Pseudomonas fluorescens Biofilms, FEMS Microbiol. Lett. 167: 179-184 (1998) mostrou que após a incubação prolongada, os biofilmes de P. fluorescens experimentaram o descolamento, coincidente com uma redução em EPS. Em Clostridium thermocellum, o início da fase estacionária foi correlacionado com o descolamento aumentado do substrato (Lamed e outros., Contact and Cellulolysis in Clostridium thermocellum via Extensive Superfície Organelles, Experientia 42:72-73 (1986)). Foi avaliado que a inanição pode resultar no descolamento por meio de um mecanismo desconhecido que permite que as bactérias busquem habitais mais ricos em nutrientes (0’Toole e outros., Biofilm Formation as Microbial Development, Ann. Rev. Microbiol. 54:49-79 (2000)).

A transição de um sistema de fluxo para um sistema de cultura em batelada foi observada por muitos laboratórios para resultar no descolamento de biofilme. Um laboratório observou o descolamento reproduzível de células de biofilme de P. aeruginosa quando o fluxo for interrompido em um sistema de cultura contínuo (Davies, D.G., Regulation of Matrix Polymer in Biofilm Formation and Dispersion, In Microbial Extracellular Polymeríc Substances, pp. 93-112, Wingender e outros., eds., Berlin: Springer (1999)).

A liberação de enzimas degradantes foi proposta por outros. Um tal exemplo é encontrado com o organismo gram-positivo Streptococcus mutans que produz uma enzima de liberação de proteína em superfície (SPRE), mostrada para mediar a liberação de proteínas do envelope celular (Lee e outros., Detachment of Streptococcus mutans Biofilm Cells by an Endogenous Enzymatic Activity, Infect. Immun. 64:1035-1038 (1996)). Boyd e outros., Role of Alginate Lyase in Cell Detachment of Pseudomonas aeruginosa, Appl Environ. Microbiol. 60:2355-2359 (1995) mostrou que a superexpressão de alginato liase causa a degradação de alginato. Quando uma cepa mucóide de P. aeruginosa foi induzida para superexpressar alginato liase, as células foram mais facilmente removidas por enxágue suave de meio sólido.

A regulação dependente de densidade celular também pode ser responsável pela liberação de enzimas que podem degradar os polímeros de matriz de biofilme permitindo que as bactérias dispersem-se de um biofilme. Foi observado no Centro de Engenharia de Biofilmes na Universidade do Estado de Montana, USA (Davies, D. G. and Costerton, J. W.) e nos laboratórios do Dr. Lapin-Scott na Universidade de Exeter, UK, que quando algumas bactérias (inclusive P. aeruginosa) atingem altas densidades celulares em agrupamentos de células de biofilme, as bactérias geralmente experimentam um evento de descolamento. Os mutantes de P. aeruginosa que eram desprovidos da capacidade de sintetizar o autoindutor de percepção de quorum 3OC12-HSL, eram suscetíveis ao descolamento após o tratamento com detergente suave (Davies e outros., The Involvement of Cell-to-Cell Signals in the Development of a Bacterial Biofilm, Science 280:295-298 (1998)). Outros investigadores demonstraram que as homosserina lactonas podem exercer uma função no descolamento. Lynch e outros., Investigation of Quorum Sensing in Aeromonas hydrophila Biofilms Formed on Stainless Steel,: In: Biofilms - The Good, the Bad and the Ugly, Wimpenny e outros., eds. Bioline, Cardiff, pp. 209-223 (1999) relatou um aumento no descolamento de Aeromonas hydrophila de biofilmes e Puckas e outros., A Quorum Sensing system in the Free-Living Photosynthetic Bacterium Rhodobacter sphaeroides, J. Bacteriol. 179:7530-7537 (1997) relatou que a produção de homosserina lactona estava negativamente correlacionada com a formação de agrupamento celular em Rhodobacter sphaeroides.

Foi identificado que os biofilmes de P. aeruginosa não se desenvolvem em estruturas de biofilme macroscópicas em frascos de cultura em batelada (na interface vidro-líquido). Ainda, quando o meio for continuamente bombeado através de tal frasco, (como em um quimiostato) um biofilme rico desenvolve-se completamente cobrindo a superfície vítrea. Quando o fluxo for interrompido em tal sistema, o biofilme é necrosado após vários dias, geralmente em torno de 72 h (Davies e outros., The Involvement of Cellto-CelI Signals in the Development of a Bacterial Biofilm, Science 280:295298 (1998)). A incapacidade de os biofilmes se desenvolverem em cultura em batelada foi observada em inúmeras bactérias gram-negativas e grampositivas bem como culturas misturadas de bactérias. Esse fenômeno demonstra que há algum aspecto de crescimento em batelada que é inibitório ao desenvolvimento de biofilme.

Durante o último estágio de desenvolvimento de biofilme, o perfil proteico das bactérias corresponde de maneira mais estreita ao perfil proteico de células planctônicas do que as bactérias em biofilmes do estágio anterior, denotada maturação II (veja figura 3 do pedido atual, e Sauer e outros., Pseudomonas aeruginosa Displays Multiple Phenotypes During Development as a Biofilm, J. Bacteriol. 184: 1140-1 154 (2002)).

Devido à natureza compacta de estruturas de biofilme, o estado fisiológico reduzido presumido de bactérias em biofilme e a proteção conferida pelos polímeros de matriz de biofilme, os agentes químicos naturais e artificiais atuais são incapazes de atacar e destruir adequadamente as populações de biofilmes infecciosas (Costerton e outros., Bacterial Biofilms in Nature and Disease, Annu. Rev. Microbiol. 41 :435-464 (1987); Hoiby e outros., The Immune Response to Bacterial Biofilms, In Microbial Biofilms, Lappin-Scott e outros., eds., Cambridge: Cambridge University Press (1995)).

A presente invenção refere-se à superação dessas e outras deficiências na técnica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um aspecto da presente invenção refere-se a uma composição. A composição compreende um ou mais indutores de dispersão que possuem a seguinte fórmula:

H₃C-(CH₂)P-CH_m —™ CH_mR, onde é uma ligação carbono-carbono simples ou dupla, m é 1 ou 2, n é 2 a 15, e R é um ácido carboxílico, um sal, um éster, ou uma amida, onde o éster ou amida é um isóstero ou bióstero do ácido carboxílico. A composição contém adicionalmente um ou mais componentes aditivos selecionados a partir do grupo que consiste em biocidas, tensoativos, antibióticos, antissépticos, detergentes, agentes quelantes, inibidor de fator de virulência, géis, polímeros, pastas, produtos comestíveis, e produtos mastigáveis. A composição é formulada de modo que quando esta estiver em contato com um biofilme produzido por um micro-organismo, onde o biofilme compreende uma matriz e micro-organismo sobre uma superfície, o indutor de dispersão atue seletivamente sobre o micro-organismo e possua uma resposta biológica adequada sem um efeito direto exigido sobre a matriz para dispersar o biofilme.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para tratar ou prevenir uma condição mediada por um biofilme em um indivíduo.

O método compreende proporcionar a um indivíduo portador de, ou suscetível a, uma condição mediada por um biofilme produzido por um microorganismo, por meio disso o biofilme compreende uma matriz e o microorganismo sobre uma superfície. O indutor de dispersão que é administrado ao indivíduo compreende:

H₃C-(CH₂)n-CH_m —— CHmR, onde é uma ligação carbono-carbono simples ou dupla, m é 1 ou 2, n é 2 a 15, e R é um ácido carboxílico, um sal, um éster, ou uma amida, onde o éster ou amida é um isóstero ou bióstero do ácido carboxílico, sob condições eficazes para o indutor de dispersão atuar seletivamente sobre o micro-organismo e possuir uma resposta biológica adequada sem um efeito direto exigido sobre a matriz. Como resultado, a condição mediada por um biofilme no indivíduo é tratada ou prevenida.

Um aspecto adicional da presente invenção refere-se a um método de tratamento ou inibição da formação de um biofilme sobre uma superfície. Esse método envolve proporcionar uma superfície que possui ou está suscetível à formação de um biofilme produzido por um micro-organismo, onde o biofilme compreende uma matriz e o micro-organismo sobre a superfície. O indutor de dispersão que é administrado à superfície compreende:

H₃C-(CH₂)_n-CH_m CnmR, onde é uma ligação carbono-carbono simples ou dupla, m é 1 ou 2, n é 2 a 15, e R é um ácido carboxílico, um sal, um éster, ou uma amida, onde o éster ou amida é um isóstero ou bióstero do ácido carboxílico, sob condições eficazes para o indutor de dispersão atuar seletivamente sobre o micro-organismo e possuir uma resposta biológica adequada sem um efeito direto exigido sobre a matriz. Como resultado, a formação do biofilme sobre a superfície é tratada ou inibida.

Outro aspecto do presente pedido refere-se a uma solução que compreende:

um indutor de dispersão que possui a seguinte fórmula: H₃C-(CH₂)_n-CH_m —— CH_mR, onde é uma ligação carbono-carbono simples ou dupla, m é 1 ou 2, n é 4 a 7, e R é um ácido carboxílico, onde o dito indutor está presente em uma concentração menor que 0,5 por cento, em peso, e onde a dita solução possui um pH maior que 5.

Um aspecto adicional da presente invenção refere-se a uma composição que compreende: um componente selecionado a partir a partir de um ou mais entre os grupos que consistem em biocidas, tensoativos, antibióticos, antissépticos, detergentes, agentes quelantes, inibidores de fator de virulência, géis, polímeros, pastas, produtos comestíveis e produtos mastigáveis. Ademais, a composição inclui um indutor de dispersão que compreende:

H₃C-(CH₂)n-CH_m ™ CH_mR, onde é uma ligação carbono-carbono simples ou dupla, m é 1 ou 2, n é 4 a 7, e R é um ácido carboxilico. O indutor é formulado em uma forma não-salina.

A presente invenção também refere-se a uma solução que inclui um isômero cis de ácido 2-decenoico, onde a solução é selecionada a partir do grupo que consiste em um creme para pele, uma pasta de dentes, e um enxaguante bucal e onde a solução é substancialmente isenta do isômero trans de ácido 2-decenoico.

Outra forma do presente pedido refere-se a uma solução que compreende: um isômero cis de ácido 2-decenoico, onde a solução é selecionada a partir do grupo que consiste em um creme para a pele, uma pasta de dentes, e um enxaguante bucal e onde a dita solução é isenta do isômero trans.

Outra forma do presente pedido consiste em um método que compreende fornecer lentes de contato e uma solução que compreende um indutor de dispersão em uma concentração menor que 0,5%, em peso, sendo que o dito indutor compreende:

H₃C-(CH₂)_n-CH_m CH_mR, onde é uma ligação carbono-carbono simples ou dupla, m é 1 ou 2, n é 4 a 7, e R é um ácido carboxilico, um sal, um éster, ou uma amida, onde o éster ou amida é um isóstero ou bióstero do ácido carboxilico. As lentes de contato são então tratadas com a dita solução.

Uma forma adicional da presente invenção consiste em um método que envolve apresentar um indivíduo com uma condição de pele e uma solução que possui um pH maior que 5, onde a solução compreende um indutor de dispersão em uma concentração menor que 0,5%, em peso, do dito indutor que compreende:

H₃C-(CH₂)_n-CH_rn — CH_mR, onde é uma ligação carbono-carbono simples ou dupla, m é 1 ou 2, n é 4 a 7, e R é um ácido carboxílico, um sal, um éster, ou uma amida, onde o éster ou amida é um isóstero ou bióstero do ácido carboxílico. A condição da pele é então tratada com a solução.

Aspectos adicionais da presente invenção referem-se a métodos de: tratar indivíduos com queimaduras; tratar e/ou prevenir placa dentária, cáries, doença gengival, e infecção oral; limpar e/ou desinfetar as lentes de contato; tratar e/ou prevenir acne ou outras infecções cutâneas associadas ao biofilme sobre a pele de um indivíduo, e tratar e/ou prevenir uma doença crônica associada ao biofilme em um indivíduo. Os métodos envolvem administrar o indutor de dispersão de acordo com a presente invenção, sob condições eficazes para executar cada respectiva tarefa. Vantajosamente, o indutor de dispersão de biofilme é altamente bioativo sobre os microorganismos dentro do biofilme, e, portanto, a formulação farmaceuticamente aceitável não precisa ser química ou mecanicamente ativa para dissolver a matriz diretamente. Assim, a composição pode possuir um pH suave e ser não-irritante.

A presente invenção também refere-se a uma composição que compreende um ou mais indutores de dispersão e um ou mais componentes aditivos. Esses componentes aditivos são selecionados a partir do grupo que consiste em biocidas, tensoativos, antibióticos, antissépticos, detergentes, agentes quelantes, inibidores do fator de virulência, géis, polímeros, pastas, produtos comestíveis, e produtos mastigáveis. A composição é formulada de modo que quando essa entre em contato com um biofilme produzido por um micro-organismo, onde o biofilme compreende uma matriz e microorganismo sobre uma superfície, o indutor de dispersão atue seletivamente sobre o micro-organismo e possui uma resposta biológica adequada sem um efeito direto exigido para dissolver a matriz.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método de tratamento ou prevenção de uma condição mediada por um biofilme em um indivíduo. Esse método envolve fornecer um indivíduo portador, ou suscetível a, uma condição mediada por um biofilme produzido por um microorganismo, de acordo com esse o biofilme compreende uma matriz e o micro-organismo sobre uma superfície. O indutor de dispersão é administrado ao indivíduo sob condições eficazes para que o indutor de dispersão atue seletivamente sobre o micro-organismo e possua uma resposta biológica adequada sem um efeito direto exigido sobre a matriz, por meio da qual a condição mediada por um biofilme no indivíduo é tratada ou prevenida.

Uma modalidade adicional do presente pedido refere-se a um método de tratamento ou inibição da formação de um biofilme sobre uma superfície. Esta envolve proporcionar uma superfície que possui ou está suscetível à formação de um biofilme produzido por um micro-organismo, de modo que o biofilme compreenda uma matriz e o micro-organismo sobre a superfície. Um indutor de dispersão é administrado à superfície sob condições eficazes para que o indutor de dispersão atue seletivamente sobre o micro-organismo e possua uma resposta biológica adequada sem um efeito direto exigido sobre a matriz, de modo que a formação do biofilme sobre a superfície seja tratada ou inibida.

A presente invenção atende o problema de biofilme induzindo artificialmente as bactérias a se submeterem a um processo fisiológico de dispersão de biofilme. A capacidade de induzir a dispersão irá permitir o controle de biofilmes diretamente e irá aprimorar os tratamentos existentes com biocida, antibióticos tópicos, detergentes, etc. Os exemplos de situações onde a dispersão artificial poderia ser benéfica incluem a limpeza de lentes de contato e dos dentes, atividade antisséptica aprimorada dentro de casa, em indústria, e na comunidade médica e atividade bactericida aumentada para tratamentos antibióticos existentes como com pacientes infectados por Pseudomonas aeruginosa.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As figuras 1A-B são representações esquemáticas de biofilme tratado com um antibiótico e/ou um indutor de dispersão. Como mostrado na figura 1A, após o tratamento, apenas as células sobre a superfície do biofil me são exterminadas pelo antibiótico. A figura 1B é uma representação esquemática de um biofilme induzido para dispersão juntamente com tratamento com antibiótico. As células dispersas são completamente exterminadas durante o tratamento.

As figuras 2A-C mostram o efeito da adição de meio de cultura gasto extraído com clorofórmio (CSM) que contém um composto indutor de dispersão, para desenvolver biofilmes de Pseudomonas aeruginosa. A figura 2A mostra o crescimento de biofilme em cultura contínua sobre uma lâmina de vidro em uma célula de fluxo. A figura 2B mostra a mesma área de biofilme 5 minutos após a adição do indutor de dispersão. A figura 2C mostra a desagregação completa de biofilme após 30 minutos de tratamento inicial com o indutor de dispersão.

A figura 3A é uma representação esquemática do ciclo de vida de um biofilme. 1, As bactérias planctônicas são transportadas (de maneira ativa e passiva) para o substrato. 2, As moléculas da superfície celular interagem com o substrato resultando em fixação de superfície reversível 3. Alterações fenotípicas na célula bacteriana resultam em modificações de superfície celular e na produção de substâncias poliméricas extracelulares, que firmam as células de maneira irreversível à superfície 4. As alterações fisiológicas continuam com alterações no metabolismo, sinalização célula-célula e morfologia à medida que ocorre a maturação do biofilme. 5, As células liberam enzimas degradantes para digerir o material de polímero de matriz e alterar os apêndices de superfície à medida que ocorre o descolamento do biofilme. A série de fotomicrografias na parte inferior da figura 3B mostra, em ordem, fotomicrografias em contraste de fase dos cinco estágios de desenvolvimento de biofilme por P. aeruginosa desenvolvido em cultura contínua em uma célula de fluxo e visualizado por microscopia. (Sauer e outros., Pseudomonas aeruginosa Displays Multiple Phenotypes During Development as a Biofilm, J. Bacteriol. 184:1 140-1 154 (2002), que está incorporado por meio desse a título de referência em sua totalidade).

As figuras 4A-B são fotomicrografias em contraste de fase de biofilme 20 induzido por dispersão por cessação de fluxo. A figura 4A mostra o desenvolvimento precoce de biofilme sob condições de fluxo, enquanto a figura 4B é o mesmo local após o fluxo ser interrompido durante 72 h.

A figura 5 é um gráfico que mostra o efeito de extração com clorofórmio sobre a atividade de dispersão do meio usado. Os biofilmes foram cultivados durante seis dias em cultura contínua em meio EPRI em reatores de tubo de biofilme (Sauer e outros., Pseudomonas aeruginosa Displays Multiple Phenotypes During Development as a Biofilm, J. Bacteriol. 184: 1140-1154 (2002), que está incorporado por meio desse em sua totalidade) e tratados com meio usado* (controle) e meio usado* extraído com clorofórmio (CSM). A dispersão celular foi determinada como a densidade óptica de efluente de cultura coletado na extremidade de tubos de cultura. A barra de erros representa o desvio-padrão para os três experimentos em duplicata.

A figura 6A mostra microcolônias de biofilmes de P. aeruginosa desenvolvidos em cultura contínua demonstrando uma resposta de dispersão nativa. Durante o estágio de dispersão de desenvolvimento de biofilme, as bactérias tornam-se capazes de se movimentar dentro de agrupamentos celulares e sair do meio líquido através de uma ruptura na parede da microcolônia. Cada fotomicrografia mostra uma microcolônia cuja parte interna foi esvaziada dessa maneira. A seta indica o local de um espaço vazio. Imagens obtidas em 1000 x de ampliação; a barra representa 10 pm. A figura 6B é uma imagem de luz transmitida, e a figura 6C é uma imagem fluorescente que mostra a dependência de tamanho de resposta de dispersão. As microcolônias de biofilme desenvolvidas em cultura contínua possuem dimensões de mais de 40 pm de diâmetro x 10 pm de espessura mostram dispersão (3 à esquerda). As microcolônias abaixo dessa dimensão mínima permanecem sólidas (*2 fotomicrografias à direita). A fluorescência indica a presença de células (repórter lacZ sobre o cromossomo). Todas as imagens possuem o mesmo tamanho relativo em 500 x de ampliação; as barras representam 40 pm. As setas indicam áreas vazias dentro da microcolônia.

As figuras 7A-D mostram o tratamento de biofilmes maduros de P. aeruginosa com meio usado, CSM e ácido c/s-2-decenoico. Como mostrado na figura 7A, em 30 min, os biofilmes desenvolvidos em tubo de silico ne foram expostos ao meio usado ou meio fresco. As bactérias em efluente foram coletadas continuamente durante 100 min e a densidade celular determinada por ODeoo· Como mostrado na figura 7B, o biofilme desenvolvido em cultura contínua em tubo de silicone durante 4 dias e trocado para meio fresco durante 1 h, ou CSM durante 1 h. Os conteúdos extrudados de tubo de controle mostram o biofilme intacto. Os conteúdos extrudados de biofilme tratado com CSM mostram dispersão. As fotomicrografias mostram a adição de CSM ao biofilme maduro desenvolvido em cultura contínua em uma célula de fluxo montada em microscópio, como mostrado na figura 7C. A desagregação de microcolônia é mostrada para começar em 7 minutos. Após 30 min de exposição, a microcolônia desagregou-se completamente. As células dispersas eram ativamente móveis (não-visíveis em imagem estática), indicando uma alteração em fenótipo comparadas às células em microcolônia intacta (antes da adição de CSM). Como mostrado na figura 7D, a adição de 10 μΜ de ácido c/s-2-decenoico (c/s-DA) ao biofilme maduro desenvolvido em cultura contínua em uma célula de fluxo montada em microscópio. A desagregação de microcolônia é mostrada para começar em 11 minutos. A desagregação completa de microcolônia é mostrada dentro de 30 min de exposição. Os biofilmes de controle tratados com o fluido transportador não foram afetados pelo tratamento em até 1 h.

As figuras 8A-B mostram o desenvolvimento de biofilme na presença contínua de CSM diluído em EPRI modificado para concentração de meio usado. A espessura média (figura 8A) e área de superfície de biofilmes desenvolvidos na presença de CSM (figura 8B) são significativamente menores que aquelas de biofilmes não-tratados. Barras cinzas, biofilmes tratados com CSM. Barras pretas, biofilmes desenvolvidos na ausência de indutor de dispersão. As barras de erros representam um desvio-padrão para 20 microcolônias aleatoriamente selecionadas.

A figura 9 mostra a dispersão de biofilmes bacterianos diferentes por CSM P. aeruginosa utilizando o bioensaio de dispersão em placa microtitulação. O eixo geométrico Y indica o número de células liberadas dentro do meio líquido de 16 poços em duplicata em 3 experimentos em duplicata, a14 pós o tratamento durante 1 h com CSM ou controle de transportador (-), contendo meio estéril. A linha hachurada indica o nível de dispersão em amostras de controle de transportador. Todas as diferenças entre as amostras de CSM e controles são estatisticamente significativas no valor-P indicado como determinado pelo teste-T de Student.

As figuras 10A-C mostram um bioensaio de dispersão em placa microtitulação.

A figura 10A mostra as densidades ópticas de células liberadas de poços de placa microtitulação contendo biofilme. Barra branca, amostra de controle tratada apenas com EPRI. Barra cinza, amostra tratada com CSM. As barras pretas representam biofilmes tratados com frações HPLC em fase reversa C-18 de CSM eluído em um gradiente de acetonitrila de 2% a 75%. Os resultados são a média de 16 poços em duplicata, as barras de erros representam um desvio-padrão. Os resultados do teste-T de Student mostram P < 0,001 para CSM e amostras de HPLC em 22 minutos. A figura 10B mostra o bioensaio de dispersão de biofilme em placa microtitulação comparando várias concentrações de ácido c/s-2-decenoico com o meio usado. As densidades ópticas de células liberadas de poços de placa de microtitulação contendo biofilme. Os poços de controle negativo continham P. aeruginosa tratada com 10% de etanol em EPRI. A barra cinza representa os biofilmes tratados com o meio usado. As barras pretas representam biofilmes tratados com concentrações crescentes de ácido c/s-2-decenoico em 10% de etanol. Os resultados são a média de 16 poços em duplicata, as barras de erros representam um desvio-padrão. O teste-T de Student indicou P < 0,001 para todas as amostras de ácido c/s-2-decenoico comparado com o controle. A figura 10C mostra a estrutura de ácido c/s-2-decenoico.

A figura 11 mostra a dispersão de diferentes biofilmes bacterianos por ácido c/s-2-decenoico utilizando o bioensaio de dispersão em placa microtitulação. O eixo geométrico Y indica o número de células liberadas no meio líquido de 16 poços em duplicata em 3 experimentos em duplicata, após o tratamento durante 1 h com 0,01 μΜ de ácido c/s-2-decenoico (CDA), ou controle de veículo (-), contendo meio + 10% de etanol. A linha hachura15 da indica o nível de dispersão em amostras de controle de veículo. Todas as diferenças entre as amostras tratadas com ácido c/s-2-decenoico e controles são estatisticamente significativamente em valor-P indicado como determinado pelo teste-T de Student.

As figuras 12A-C mostram a análise espectral de CSM P. aeruginosa e ácido c/s-2-decenoico. A figura 12A mostra picos de massa iônica de produto para a molécula 171 M/Z detectada em fração de CSM HPLC ativa e para ácido c/s-2-decenoico sintético. O eixo geométrico Y indica intensidade; O eixo geométrico X indica M/Z em modo iônico positivo. A amostra de CSM é compatível com picos de ácido c/s-2-decenoico sintético. Notase que em espectrometria de massas, a intensidade pico não é uma indicação direta de concentração. A figura 12B mostra o espectro GC-MS de CSM P. aeruginosa e ácido c/s-2-decenoico. O Pico de amostra de CSM em 15,9 minutos indica o transportador de solvente. O eixo geométrico Y indica intensidade; O eixo geométrico X indica o tempo em minutos. A figura 12C mostra o espectro de FT-IR de CSM P. aeruginosa e ácido c/s-2-decenoico. O eixo geométrico Y indica a absorbância; O eixo geométrico X indica centímetros recíprocos.

A figura 13 mostra a adição de 10 μΜ de ácido c/s-2-decenoico (c/s-DA) ao biofilme maduro desenvolvido em cultura contínua em uma célula de fluxo montada em microscópio. A desagregação de microcolônia é mostrada para começar em 11 minutos. A desagregação completa de microcolônia é mostrada dentro de 15 minutos de exposição. Os biofilmes de controle tratados com fluido transportador não foram afetados pelo tratamento em até 1 h.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Um aspecto da presente invenção refere-se a uma composição.

A composição inclui um ou mais indutores de dispersão que compreendem:

H₃C-(CH₂)n-CH_m — CH_mR, onde é uma ligação carbono-carbono simples ou dupla, m é 1 ou 2, n é 2 a 15, e R é um ácido carboxílico, um sal, um éster, ou uma amida, onde o éster ou amida é um isóstero ou bióstero do ácido carboxílico.

A composição contém adicionalmente um ou mais componentes aditivos selecionados a partir do grupo que consiste em biocidas, tensoativos, antibióticos, antissépticos, detergentes, agentes quelantes, inibidores de fator de virulência, géis, polímeros, pastas, produtos comestíveis, e produtos mastigáveis. A composição é formulada de modo que quando esta estiver em contato com um biofilme produzido por um micro-organismo, onde o biofilme compreende uma matriz e micro-organismo sobre uma superfície, o indutor de dispersão atue seletivamente sobre o micro-organismo e possua uma resposta biológica adequada sem um efeito direto exigido sobre a matriz para dispersar o biofilme. Ao obter esse resultado, o indutor de dispersão da presente invenção pode atuar, de preferência, diretamente sobre a matriz. Alternativamente, o indutor de dispersão pode atuar sobre o micro-organismo que, por sua vez, atua para dissolver a matriz. Esse efeito também pode envolver a não-dependência de um efeito desejado sobre a matriz. Tipicamente, o indutor de biofilme não terá diretamente nenhum efeito sobre a matriz ou estará presente em uma concentração onde nenhum efeito direto sobre a matriz é evidente. Por outro lado, a faixa de concentrações eficazes sugere um mecanismo de resposta bioquímica nos micro-organismos, onde o indutor de dispersão simula uma composição de comunicação intercelular. A composição atua para induzir uma resposta de dispersão pelas bactérias, que, por sua vez, é responsável pela liberação das bactérias do biofilme. Adicionalmente, a composição é capaz de atuar sobre as bactérias que não se encontram em um biofilme (bactérias planctônicas), induzir essas bactérias a preparar uma resposta fisiológica que previne a formação de um biofilme. Os componentes adicionais de uma composição podem ser destinados à dissolução ou remoção da matriz da superfície ou substrato. Por exemplo, a composição pode compreender um dentifrício adaptado para remover de maneira abrasiva a placa dos dentes.

O grupo R do indutor acima pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em:

Alternativamente, R pode ser homosserina lactona ou um grupo furanona. A composição também inclui um componente aditivo como um ou mais entre biocidas, tensoativos, antibióticos, antissépticos, detergentes, agentes quelantes, inibidores de fator de virulência, géis, polímeros, pastas, produtos comestíveis ou produtos mastigáveis.

O indutor de dispersão da presente invenção compreende desejavelmente 7 a 10 átomos de carbono. Prefere-se que esse indutor seja um ácido carboxílico (por exemplo, um ácido graxo monoinsaturado). É ainda mais preferido que o indutor de dispersão compreenda:

CH₃-(CH₂)_n-CH=CHCOOH

As formas não-salinas adequadas desse indutor de dispersão são os seguintes respectivos isômeros cis e trans:

Desses, prefere-se o isômero cis.

Outros ácidos alcanoicos adequados incluem ácido hexanoico, ácido heptanoico, ácido octanoico, ácido nonanoico, ácido decanoico, ácido undecanoico, ácido dodecanoico, ácido tridecanoico, ácido tetradecanoico, ácido pentanoico, ácido hexadecanoico, ácido heptadecanoico, ácido octadecanoico, e ácido nonadecanoico.

Ácidos alcenoicos úteis incluem ácido 2-hexanoico, ácido 2heptenoico, ácido 2-octenoico, ácido 2-nonenoico, ácido 2-undecenoico, ácido 2-dodecenoico, ácido 2-tridecenoico, ácido 2-tetradecenoico, ácido 2pentadecenoico, ácido 2-hexadecenoico, ácido 2-heptadecenoico, ácido 2octadecenoico, e ácido 2-nonadecenoico. Esses podem ser isômeros cis ou trans.

A composição da presente invenção pode ser formulada em inúmeras faixas de pH, para tratar tipos diferentes de bactérias, conforme exposto a seguir: 1,5 a 4,5 para bactérias acidofílicas; 4,5 a 8,0 para bactérias tolerantes a ácido; 6,8 a 7,4 para bactérias relativas a pH substancialmente neutro; e 8,0 a 9,8 para bactérias tolerantes a álcali. Um pH essencialmente neutro é particularmente desejado para indivíduos com refluxo ácido. A concentração do indutor de dispersão pode ser 0,01 μΜ a 30 mM.

A composição pode ser completa ou substancialmente (ou seja, menos de 10%, em peso) isenta de etanol e/ou isenta de formaldeído.

Uma superfície (ou substrato) coberta com a composição tam bém é incluída pela presente invenção.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método de tratamento ou prevenção de uma condição mediada por um biofilme em um indivíduo. O método compreende fornecer um indivíduo portador, ou suscetível a, de uma condição mediada por um biofilme produzido por um microorganismo, de modo que o biofilme compreenda uma matriz e o microorganismo sobre uma superfície. Um indutor de dispersão que é administrado ao indivíduo compreende:

H₃C-(CH₂)n-CH_m CH_mR, onde -***-* é uma ligação carbono-carbono simples ou dupla, m é 1 ou 2, n é 2 a 15, e R é um ácido carboxílico, um sal, um éster, ou uma amida, onde o éster ou amida é um isóstero ou bióstero do ácido carboxílico, sob condições eficazes para o indutor de dispersão atuar seletivamente sobre o micro-organismo e possuir uma resposta biológica adequada sem um efeito direto exigido sobre a matriz. Como resultado, a condição mediada por um biofilme no indivíduo é tratada ou prevenida. O método de dispersão do biofilme pode incluir adicionalmente a administração ao biofilme, em conjunto com a administração do indutor de dispersão, um tratamento antimicrobiano. O tratamento pode ser a administração de biocidas (por exemplo, peróxido de hidrogênio), tensoativos, antibióticos, antissépticos, detergentes, agentes quelantes, inibidores de fator de virulência, géis, polímeros, pastas, produtos comestíveis, produtos mastigáveis, tratamento ultrassônico, tratamento com radiação, tratamento térmico, e/ou tratamento mecânico.

Um aspecto adicional da presente invenção refere-se a um método de tratamento ou inibição da formação de um biofilme sobre uma superfície. Esse método envolve fornecer uma superfície que possui ou está suscetível à formação de um biofilme produzido por um micro-organismo, onde o biofilme compreende uma matriz e o micro-organismo sobre a superfície. Um indutor de dispersão que é administrado à superfície compreende:

H₃C-(CH₂)_n-CH_m CH_mR, onde é uma ligação carbono-carbono simples ou dupla, m é 1 ou 2, n é 2 a 15, e R é um ácido carboxílico, um sal, um éster, ou uma amida, onde o éster ou amida é um isóstero ou bióstero do ácido carboxilico, sob condições eficazes para o indutor de dispersão atuar seletivamente sobre o micro-organismo e possuir uma resposta biológica adequada sem um efeito direto exigido sobre a matriz. Como resultado, a formação do biofilme sobre a superfície é tratada ou inibida.

Em uma modalidade, a superfície que será tratada inclui dispositivos médicos invasivos, como cateteres, respiradouros, e ventiladores. Ademais, a superfície pode estar em dispositivos médicos implantados, inclusive stents, válvulas artificiais, juntas, pinos, implantes ósseos, suturas, grampos, marca-passos, e outros dispositivos temporários ou permanentes. O indutor de dispersão da presente invenção também pode estar incluído em cola cirúrgica. Em outra modalidade, a superfície que será tratada inclui drenos, tubos, eletrodomésticos, bancadas, cortinas de chuveiro, argamassa, banheiros, instalações industriais de produção de alimentos e bebidas, pisos, e equipamento de processamento de alimentos. Em uma modalidade adicional, a superfície que será tratada é uma superfície trocadora de calor ou uma superfície de filtro. Assim, o tratamento fornece um meio para reduzir o grau de sujando biológico do trocador de calor ou filtro. Em uma modalidade final, a superfície que será tratada é uma estrutura marinha que inclui botes, píeres, plataformas petrolíferas, portas de entrada de água, peneiras, e portas de visualização. A superfície pode ser alternativamente associada a um sistema para tratamento e/ou distribuição de água (por exemplo, um sistema de tratamento e/ou distribuição de água potável, um sistema de tratamento de água de piscina e termal, um sistema de tratamento e/ou distribuição de água em operações de fabricação, e um sistema de tratamento e/ou distribuição de água dental). A superfície também pode estar associada a um sistema de perfuração, armazenamento, separação, refinamento e/ou distribuição de petróleo (por exemplo, um trem de separação de petróleo, um recipiente de petróleo, tubos de distribuição de petróleo, e equipamento de perfuração de petróleo). O indutor de dispersão também pode ser incluído em formulações destinadas à redução ou eliminação de depósitos de biofilme ou biofouling em meio poroso, como com formações geológicas dotadas de petróleo e gás. O tratamento pode ser realizado aplicando um revestimento, como tinta, à superfície.

O método de inibição da formação de um biofilme sobre uma superfície pode envolver ainda a administração à superfície, em conjunto com a administração do indutor de dispersão, um tratamento antimicrobiano. O tratamento pode ser a administração de biocidas, tensoativos, antibióticos, antissépticos, desinfetantes, remédios, detergentes, agentes quelantes, inibidores do fator de virulência, tratamento ultrassônico, tratamento com radiação, tratamento térmico, e tratamento mecânico. Em uma modalidade, o indutor de dispersão e o tratamento antimicrobiano são administrados simultaneamente. Em outra modalidade, o indutor de dispersão e tratamento antimicrobiano são administrados separadamente.

O indutor de dispersão pode ser impregnado em uma superfície para inibir a formação de um biofilme sobre a superfície. Alternativamente, o indutor de dispersão pode estar em um copolimero ou um revestimento de gel sobre a superfície.

A presente invenção também refere-se a um método de tratamento de indivíduos com queimaduras. O método envolve a administração do indutor de dispersão de acordo com a presente invenção, sob condições eficazes para tratar queimaduras no indivíduo. Uma aplicação específica da invenção proporciona um curativo tópico para pacientes com queimadura compreendendo moléculas indutoras de dispersão ou seus análogos naturais ou sintéticos para impedir o desenvolvimento de biofilmes infecciosos ou para dispersar as células de biofilmes infecciosos existentes.

A presente invenção refere-se ainda a um método de tratamento e/ou prevenção de placa dentária, cáries, doença gengival, doença periodontal, e infecção oral em um indivíduo. O método envolve o tratamento da cavidade oral do indivíduo com o indutor de dispersão de acordo com a presente invenção. O tratamento pode ser realizado com um dentifrício, enxaguante bucal, fio dental, goma, fitas, pasta de dentes, uma escova de dente contendo o indutor de dispersão, e outras preparações contendo o indutor de dispersão. A composição também pode conter outros compostos conhecidos nas técnicas dentárias que são tipicamente adicionadas às composições dentárias. Por exemplo, a composição indutora de dispersão também pode incluir fluoreto, agentes de dessensibilização, agentes antitártaro, agentes antibacterianos, agentes de remineralização, agentes de branqueamento, e agentes anticáries.

A quantidade de indutor de dispersão presente irá variar dependendo da composição dentária que contém o indutor de dispersão. Foi descoberto que o indutor de dispersão é ativo sobre uma grande faixa de concentrações contra bactérias orais. Por exemplo, o indutor de dispersão pode estar presente em uma quantidade que varia de 0,1 nM a 10 mM. Entretanto, concentrações inferiores e superiores podem ser usadas dependendo da composição dentária, os outros componentes presentes na composição indutora de dispersão, e vários outros fatores avaliados pelos versados na técnica. As propriedades conhecidas do indutor de dispersão, como suas características de ácido graxo e sua hidrofobicidade, irão ajudar um versado na técnica a determinar quanto do indutor de dispersão deve ser usado, determinar como o composto irá interagir quimicamente com outros componentes, e fornecer outras informações úteis sobre o composto.

As aplicações dentárias específicas e composições dentárias são contempladas nessa invenção. Nesse aspecto, a invenção refere-se a uma escova de dentes que contém uma composição indutora de dispersão. As escovas de dentes, como será conhecido na técnica, contêm uma pluralidade de cerdas e um suporte sólido sobre o qual as cerdas são montadas, em que o suporte sólido inclui uma cabeça de escova que possui uma pluralidade de furos para tufos que recebem as cerdas. As variações e modificações da escova de dentes básica são bem-conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, a Patente No. U.S. 7.251.849, incorporada aqui a título de referência em sua totalidade.

O indutor de dispersão dessa invenção possui uma fórmula química conforme apresentado acima. Os componentes adicionais que podem ser incluídos nas composições indutoras de dispersão também são apresentados acima. A composição indutora de dispersão pode ser incorporada nas várias partes da escova de dentes por meios conhecidos na técnica. Por exemplo, a composição indutora de dispersão pode estar contida nos furos para tufos da escova de dentes. Veja, Patente No. U.S. 5.141.290, aqui incorporada a título de referência em sua totalidade, por exemplo, de como uma composição pode estar contida dentro dos furos para tufos de uma escova de dentes. Alternativamente, a composição indutora de dispersão pode ser revestida ou incrustada nas cerdas da escova de dentes.

Outras partes da escova de dentes também podem ser revestidas ou incrustadas com a composição indutora de dispersão, inclusive quaisquer partes da escova de dentes que suplementam as cerdas e são designadas para entrar em contato com a cavidade oral. Por exemplo, é comum as escovas de dentes possuírem pás de borracha, limpadores de língua, ou outras partes estendidas a partir da cabeça com a finalidade de entrarem em contato com o dente, língua, gengivas, ou outras áreas da cavidade oral. Essas partes podem ser incrustadas com a composição indutora de dispersão e, opcionalmente, um tensoativo, biocida, e/ou outro aditivo discutido acima.

Para ajudar a controlar a liberação do indutor de dispersão a partir da escova de dentes, a composição indutora de dispersão pode conter um agente que interage com o indutor de dispersão para auxiliar a liberação controlada. O agente pode interagir com o indutor de dispersão de maneira que a liberação seja acelerada ou prolongada, dependendo do uso desejado. O nível de liberação controlada também pode depender de quão fácil ou dificilmente o indutor de dispersão adere-se à parte da escova de dentes que é aplicada. Em uma modalidade preferida, o indutor de dispersão é lentamente liberado da escova de dentes ao longo de escovações repetidas. Os agentes que permitem a liberação lenta de um ingrediente ativo são bemconhecidos pelos versados na técnica.

A liberação controlada também pode ser realizada encapsulando o indutor de dispersão em um sistema encapsulado que permite uma liberação controlada. Nessa modalidade, a composição indutora de dispersão está, de preferência, sob a forma de uma pluralidade de pequenas microesfe ras que encapsulam o indutor de dispersão. As microesferas podem possuir um revestimento externo de material dissolúvel que permite a liberação lenta do indutor de dispersão ao longo de escovações repetidas. As microesferas adequadas incluem aquelas mostradas na Patente No. U.S. 5.061.106, aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.

Essa invenção também refere-se a uma composição de pasta de dentes que contém (a) fluoreto e/ou um agente de remineralização; (b) um veículo oralmente aceito; e (c) uma composição indutora de dispersão. O indutor de dispersão dessa invenção possui uma fórmula química como apresentado acima. Os componentes adicionais que podem ser incluídos nas composições indutoras de dispersão também são apresentados acima. Geralmente, as pastas de dentes também contêm lauril sulfato de sódio ou outros sulfatos.

O fluoreto em suas várias formas é um ingrediente ativo comum em pasta de dentes para prevenir as cáries e promover a formação de esmalte dental e ossos. Qualquer fonte de fluoreto, como sais de fluoreto, pode ser usada na pasta de dentes dessa invenção. De preferência, o fluoreto é fluoreto de sódio (NaF) ou monofluorofosfato de sódio (Na₂PO3F). Tipicamente, a quantidade de fluoreto presente na pasta de dentes varia de 100 a 5000 partes por milhão de íon de fluoreto, de preferência, 1000 a 1100 partes por milhão.

Em alguns casos, prefere-se substituir ou suplementar o fluoreto com um agente de remineralização. A remineralização, no contexto de uso dental, geralmente refere-se ao tratamento dos dentes para prevenir cáries, ou reduzir a chance de ocorrência, e, de outro modo, realçar os dentes de modo que esses possam retornar para seu estado saudável original. Embora o fluoreto possa ser considerado um agente de remineralização, outros agentes geralmente tomam o lugar do fluoreto ou fluoreto suplementar para fornecer a pasta de dentes com propriedades de limpeza ou remineralização mais fortes. Os agentes de remineralização comuns são sais de cálcio, como fosfato de cálcio, sulfato de cálcio, sulfato de cálcio anidro, hemi-hidrato de sulfato de cálcio, di-hidrato de sulfato de cálcio, malato de cálcio, tartarato de cálcio, malonato de cálcio, e succinato de cálcio. Os nanocristais de hidroxiapitata e compostos de zinco também foram mostrados como agentes de remineralização eficazes.

O veículo oralmente aceito pode ser qualquer veículo conhecido na técnica que pode ser usado para entregar o fluoreto e/ou agente de remineralização, e o indutor de dispersão aos dentes de um paciente. O veículo oralmente aceito também pode ser glicerina, propileno glicol, polietileno glicol, triglicerídeo, diglicerídeo, óleo mineral, óleos orgânicos, óleos essenciais, óleos vegetais graxos, e combinações desses. Geralmente esses veículos são usados em combinação com água ou um solvente à base de água.

A composição de pasta de dentes pode conter outros componentes de pastas de dentes bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, a composição de pasta de dentes pode conter bicarbonato de sódio, enzimas, vitaminas, ervas, compostos de cálcio como fosfossilicato de cálcio e sódio, agentes de coloração, e/ou agentes flavorizantes. Os agentes de dessensibilização também podem ser adicionados. Como conhecido na técnica, os agentes de dessensibilização podem reduzir a sensibilidade nos dentes tratando as sensibilidades causadas pela desmineralização ou supressão dos sintomas de sensibilidade ao dessensibilizar os nervos. A composição também pode conter um agente antibacteriano ou um agente antiplaca. Preferese que os agentes antibacterianos sejam incluídos na composição para prevenir a gengivite, periodontite, e outras doenças orais. Os agentes antibacterianos adequados incluem triclosano, cloreto de zinco, clorexidina, cloreto de benzotônio, e cloreto de cetilpiridínio.

Essa invenção também refere-se a uma composição oral para tratar e/ou prevenir placa dentária, doenças gengivais, doenças periodontais, e/ou infecção oral. A composição oral contém um veículo oralmente aceito e uma composição indutora de dispersão. O indutor de dispersão dessa invenção possui uma fórmula química como apresentado acima. Os componentes adicionais que podem ser incluídos nas composições indutoras de dispersão também são apresentados acima.

A composição oral pode ser várias composições no campo de higiene dental conhecidas na técnica. Por exemplo, a composição oral pode ser um enxaguante bucal, spray para hálito, dentifrício, limpador de dentes em forma de pó, fitas de branqueamento, ou pasta profilática. Como é conhecido na técnica, os enxaguantes bucais são comumente usados para ajudar a remover partículas mucosas e alimentos na cavidade oral ou garganta. Os enxaguantes bucais contêm tipicamente componentes antissépticos e/ou antiplaca para exterminar a placa bacteriana que causa cárie, gengivite, e mau hálito. Esses também podem conter componentes anticárie, como fluoreto, para proteção contra cáries. Os componentes de enxaguante bucal adequados podem ser encontrados na Patente No. U.S. 5.968.480, aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.

Também, os mesmos componentes antissépticos, antiplaca, e anticáries ou similares podem ser usados em sprays para hálito, dentifrícios, inclusive dentifrícios em gel, limpadores de dentes em forma de pó, fitas de branqueamento, e pastas profiláticas. As composições de spray para hálito adequadas são descritas na Patente No. U.S. 7.297.327; as composições de limpadores de dentes em forma de pó adequadas, como aquelas usadas em composições de branqueamento de dentes, são descritas na Patente No. U.S. 5.989.526; as fitas de branqueamento adequadas são descritas na Patente No. U.S. 6.514.483; e os dentifrício e composições de pasta profilática, inclusive abrasivos dentários, são descritos na Patente No. U.S. 5.939.051, que estão todas aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade.

Os ingredientes de veículo oralmente aceito são similares àqueles discutidos acima. Entretanto, o veículo oralmente aceito irá variar dependendo da consistência desejada e produto final desejado da composição oral. Por exemplo, um enxaguante bucal está sob uma forma líquida, então veículos líquidos, tipicamente veículos que possuem uma alta porcentagem de água, devem ser usados. Por outro lado, um dentifrício em gel deve estar sob a forma de um gel e pode utilizar agentes gelificantes ou outros veículos que permitem que o produto final esteja sob a forma de um gel. O veículo oralmente aceito deve possuir propriedades que permitem que a composição indutora de dispersão seja entregue enquanto também proporciona o produ27 to final com a consistência desejada.

A composição oral também pode estar sob a forma de goma de mascar, uma fita para hálito, um losango ou uma pastilha para hálito. A goma de mascar é tipicamente uma combinação de uma fase insolúvel em água, ou base de goma, e uma fase solúvel em água de adoçantes, flavorizante e/ou corante comestível. Outros componentes também podem ser adicionados à goma, inclusive aditivos refrescantes de hálito como zinco e sais de fosfato, aditivos de branqueamento de dentes como sílica, e aditivos de redução de placa para moderar a placa dentária. As composições de goma adequadas podem ser encontradas na Patente N^os U.S. 6.416.744 e 6.592.849, ambas estão aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade.

As fitas para hálito são similares à goma de mascar, exceto pelo fato de que as fitas são designadas para se dissolver na boca, geralmente absorvidas pela língua. As fitas podem entregar ingredientes bioativos para refrescar a boca bem como ingredientes bioativos funcionais, como vitaminas, minerais, suplementos, produtos farmacêuticos e vacinas.

Losangos e pastilhas para hálito possuem tipicamente um formato discóide contendo um agente terapêutico em uma base flavorizada. A base pode ser um açúcar cristal duro, gelatina glicerinada ou combinação de açúcar com mucilagem suficiente para fornecer a forma necessária da composição. O indutor de dispersão pode representar o agente terapêutico, ou esse pode ser adicionado além dos agentes terapêuticos conhecidos na técnica. As composições de losango e pastilha para hálito adequadas são descritas na Patente No. U.S. 7.025.950, aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.

A composição oral também pode estar sob a forma de uma preparação de limpeza para um aparelho dentário que é colocado na cavidade oral. Ao aparelhos dentários como dentaduras, isoladores dentais, e alguns tipos de aparelhos ortodônticos são colocados na cavidade oral durante um período de tempo, e então periodicamente removidos para limpeza. A composição de limpeza usada para limpar os aparelhos dentários deve funcionar de maneira habitual para limpar o aparelho, porém também pode conter agentes terapêuticos que podem ajudar a tratar ou prevenir placa dentária, doenças gengivais, doenças periodontais, e infecção oral quando os aparelhos dentários estiverem em contato com a cavidade oral. As composições de limpeza como limpadores efervescentes feitos com misturas alcalinas contendo compostos à base de cloro e similares são conhecidos na técnica. As composições de limpeza adequadas de aparelhos dentários são descritas na Patente No. U.S. 3.936.385, aqui incorporada a título de referência em sua totalidade. O indutor de dispersão pode ser adicionado às composições de limpeza de maneira que permita revestir o aparelho dentário mediante contato. Após o aparelho dentário ser introduzido na cavidade oral, o indutor de dispersão pode interagir com os dentes e outros elementos da cavidade oral de maneira terapeuticamente eficaz, ou seja, para prevenir a placa dentária, doenças gengivais, doenças periodontais, e/ou infecção oral.

Esta invenção também refere-se a um artigo para uso oral compreendendo um artigo dentário e um indutor de dispersão. O indutor de dispersão possui a fórmula química apresentada acima, e é revestido, encapsulado, ou impregnado no artigo dentário. Componentes adicionais que podem ser incluídos nas composições indutoras de dispersão também são apresentados acima.

Vários artigos dentários conhecidos na técnica podem ser usados nessa modalidade da invenção. Em uma modalidade, o artigo dentário é um fio dental. Qualquer fibra conhecida na técnica pode ser usada no fio dental. As fibras adequadas incluem poliamidas (como náilon), poliésteres, polipropilenos, politetrafluoroetilenos, celulose, e algodão. As fibras de náilon e politetrafluoroetileno são as fibras mais comuns usadas em fio dental e representam as fibras preferidas. Os fios dentais adequados são descritos na Patente N^os U.S. 6.270.890 e 6.289.904, ambas estão aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade. A composição indutora de dispersão pode ser impregnada na fibra, revestida sobre a fibra, ou de outro modo incorporada no fio dental.

O fio dental pode ser revestido ou impregnado com uma cera ou outra substância hidrofóbica para facilidade de uso durante o processo de passagem do fio dental. As ceras adequadas incluem ceras microcristalinas, cera virgem, ceras de parafina, ceras de carnaúba, e ceras de polietileno. A composição indutora de dispersão pode ser revestida sobre o fio dental como parte da camada de cera, como uma segunda camada ou camada adicional em conjunto com a camada de cera, ou aplicada à fibra como discutido acima.

O artigo dental pode ser um palito de dente que é impregnado ou revestido com a composição indutora de dispersão. Os palitos de dente podem ser feitos a partir de produtos naturais, como madeira, ou componentes artificiais, inclusive vários plásticos. Os palitos de dente adequados são descritos na Patente No. U.S. 7.264.005, aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.

O artigo dental também pode ser um aparelho dentário como um aspirador dental, bloco de oclusão, isolador dental, estabilizador de língua, defletor de língua, ou qualquer outra peça de equipamento dentário que um dentista ou assistente de dentista pode usar na boca de um paciente. Uma discussão de aparelhos dentários pode ser encontrada na Patente N^os U.S. 4.865.545 e 5.152.686, ambas estão aqui incorporadas a título de referência. A parte do aparelho dentário que entra em contato com a cavidade oral de um paciente pode ser revestida com a composição indutora de dispersão.

O artigo dentário também pode ser uma construção dentária, tal como veneers, coroas, blocos, (onlays), ou pontes que são colocados sobre os dentes. As construções dentárias são tipicamente feitas de ligas de metal, porcelana, cerâmica, amálgama, polímeros de acrilato, ou uma combinação desses materiais. As construções dentárias adequadas são descritas na Patente No. U.S. 7.229.286, aqui incorporada a título de referência em sua totalidade. A composição indutora de dispersão pode ser incrustada na composição usada para fazer a construção dentária. Alternativamente, a composição indutora de dispersão pode ser revestida sobre a construção dentária após essa ser preparada.

Essa invenção também refere-se a uma composição aquosa a plicada à cavidade oral com o uso de um artigo dentário, compreendendo água e uma composição indutora de dispersão. Vários artigos dentários são fixados ou designados para serem usados com uma linha de água de modo que a água possa ser distribuída pelo artigo dentário, e então direcionada a partir do artigo dentário até a cavidade oral de um indivíduo. Os artigos dentários adequados incluem água de equipamentos odontológicos, aparelhos de jato de água, e similares.

Embora água da rede pública ou água purificada possa ser usada nesses tipos de dispositivos dentários, a fonte de água também pode ser suplementada com aditivos de modo que a água distribua os aditivos na cavidade oral do indivíduo quando usados com o artigo dentário. Nesse caso, o aditivo suplementado com a água é uma composição indutora de dispersão.

Linhas de água de aparelhos odontológicos e aparelhos de jato de água são conhecidos na técnica e comumente usados por dentistas e assistentes de dentistas. Uma discussão de tipos diferentes de linhas de água de aparelhos odontológicos e suas diferentes aplicações pode ser encontrada na Patente No. U.S. 5.785.523, aqui incorporada a título de referência em sua totalidade. Os aparelhos de jato de água são descritos na Patente No. U.S. 4.257.433, aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.

A presente invenção também refere-se a um método de limpeza e/ou desinfecção de lentes de contato. O método envolve tratar as lentes de contato com uma solução de limpeza e/ou desinfecção contendo o indutor de dispersão de acordo com a presente invenção. A lente de contato pode ser tratada dessa maneira enquanto é armazenada em solução ou enquanto usada in vivo. Alternativamente, o indutor de dispersão pode ser usado em colírios.

A presente invenção refere-se ainda a um método de tratamento e/ou prevenção de acne ou outras infecções cutâneas associadas a biofilme sobre a pele de um indivíduo. O método envolve tratar a pele do indivíduo com o indutor de dispersão de acordo com a presente invenção sob condições eficazes para tratar e/ou prevenir a acne ou infecções cutâneas assoei31 adas a biofilme. O indutor de dispersão pode estar presente em uma pomada, creme, unguento, curativo, loção de barbear, ou pós-barba. Esse também pode estar presente em um pó, cosmético, pomada, creme, líquido, sabão, gel, aplicador de cosmético, e/ou sólido, material tecido ou não-tecido para entrar em contato ou ficar próximo à pele.

A presente invenção também refere-se a um método de tratamento e/ou prevenção de uma doença crônica associada a biofilme em um indivíduo. O método envolve administrar ao indivíduo o indutor de dispersão de acordo com a presente invenção sob condições eficazes para tratar e/ou prevenir a doença crônica associada a biofilme. As doenças crônicas associadas a biofilme que serão tratadas e/ou prevenidas incluem, porém sem caráter limitativo, infecções do ouvido médio, osteomielite, prostatite, colite, vaginite, uretrite, placas arteriais, infecções sinoviais, infecções ao longo da fáscia de tecido, infecções do trato respiratório (por exemplo, infecções associadas a infecções pulmonares de pacientes portadores de fibrose cística, pneumonia, pleurisia, infecções pericardiais), infecções genitourinárias, e infecções por úlcera gástrica ou duodenal. Para úlceras gástricas ou duodenais causadas por Helicobacter pylorí, o indutor de dispersão irá precisar funcionar em um pH abaixo de 5,5. O indutor de dispersão pode ser administrado em combinação com um agente antimicrobiano, como biocidas, tensoativos, antibióticos, antissépticos, detergentes, agentes quelantes, ou inibidores do fator de virulência. No caso de terapias gástricas, terapias de redução de ácido, como antiácidos, inibidores de bomba de prótons, anti-histamínicos, e similares também podem ser empregados.

Outro aspecto do presente pedido refere-se a uma solução que compreende:

um indutor de dispersão que compreende:

H₃C-(CH₂)n-CH_m ™ CH_mR, onde — é uma ligação carbono-carbono simples ou dupla, m é 1 ou 2, n é 4 a 7, e R é um ácido carboxílico, onde o dito indutor está presente em uma concentração menor que 0,5 por cento, em peso, e onde a dita solução possui um pH maior que 5.

Um aspecto adicional da presente invenção refere-se a uma composição que compreende: um componente selecionado a partir de um ou mais entre o grupo que consiste em biocidas, tensoativos, antibióticos, antissépticos, detergentes, agentes quelantes, inibidores de fator de virulência, géis, polímeros, pastas, produtos comestíveis, e produtos mastigáveis. Ademais, a composição inclui um indutor de dispersão que compreende:

H₃C-(CH₂)n-CH_m=- CH_mR, onde é uma ligação carbono-carbono simples ou dupla, m é 1 ou 2, n é 4 a 7, e R é um ácido carboxílico. O indutor é formulado em uma forma não-salina.

A presente invenção também refere-se a uma solução que inclui um isômero cis de ácido 2-decenoico, onde a solução é selecionada a partir do grupo que consiste em um creme para a pele, uma pasta de dentes, e um enxaguante bucal e onde a solução é substancialmente isenta do isômero trans de ácido 2-decenoico. Como interpretado aqui, essa solução é substancialmente isenta de um isômero trans se uma redução na concentração de isômero trans (sem alteração em isômero cis) não aumentar a bioatividade. É mais preferido que haja uma razão molar de cis para trans de ao menos 2.

Outra forma do presente pedido refere-se a uma solução que compreende: um isômero cis de ácido 2-decenoico, onde a solução é selecionada a partir do grupo que consiste em um creme para a pele, uma pasta de dentes e um enxaguante bucal onde a dita solução é isenta de isômero trans.

Outra forma do presente pedido é um método que compreende proporcionar lentes de contato e uma solução que compreende um indutor de dispersão em uma concentração menor que 0,5%, em peso, sendo que o dito indutor compreende:

H₃C-(CH₂)_n-CH_m ™ CH_mR, onde é uma ligação carbono-carbono simples ou dupla, m é 1 ou 2, n é 4 a 7, e R é um ácido carboxílico, um sal, um éster, ou uma amida, onde o éster ou amida é um isóstero ou bióstero do ácido carboxílico.

As lentes de contato são então tratadas com a dita solução.

Uma forma adicional da presente invenção é um método que envolve fornecer um indivíduo com uma condição cutânea e uma solução que possui um pH maior que 5, onde a solução compreende um indutor de dispersão em uma concentração menor que 0,5%, em peso, sendo que o dito indutor compreende:

H₃C-(CH₂)n-CH_rn CH_mR, onde é uma ligação carbono-carbono simples ou dupla, m é 1 ou 2, n é 4 a 7, e R é um ácido carboxílico, um sal, um éster, ou uma amida, onde o éster ou amida é um isóstero ou bióstero do ácido carboxílico. A condição cutânea é então tratada com a solução.

A presente invenção também refere-se a uma composição que compreende um ou mais indutores de dispersão e um ou mais componentes aditivos. Esses componentes aditivos são selecionados a partir do grupo que consiste em biocidas, tensoativos, antibióticos, antissépticos, detergentes, agentes quelantes, inibidores do fator de virulência, géis, polímeros, pastas, produtos comestíveis, e produtos mastigáveis. A composição é formulada de modo que quando essa estiver em contato com um biofilme produzido por um micro-organismo, onde o biofilme compreende uma matriz e microorganismo sobre uma superfície, o indutor de dispersão atue seletivamente sobre o micro-organismo e possua uma resposta biológica adequada sem um efeito direto exigido para dissolver a matriz.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método de tratamento ou prevenção de uma condição mediada por um biofilme em um indivíduo. Esse método envolve proporcionar um indivíduo portador, ou suscetível a, uma condição mediada por um biofilme produzido por um microorganismo, de modo que o biofilme compreenda uma matriz e o microorganismo sobre uma superfície. Um indutor de dispersão é administrado ao indivíduo sob condições eficazes para o indutor de dispersão atuar seletivamente sobre o micro-organismo e possuir uma resposta biológica adequada sem um efeito direto exigido sobre a matriz, de modo que a condição mediada por um biofilme no indivíduo seja tratada ou prevenida.

Uma modalidade adicional do presente pedido refere-se a um método de tratamento ou inibição da formação de um biofilme sobre uma superfície. Essa envolve proporcionar uma superfície que possui ou está suscetível à formação de um biofilme produzido por um micro-organismo, de modo que o biofilme compreenda uma matriz e o micro-organismo sobre a superfície. Um indutor de dispersão é administrado à superfície sob condições eficazes para o indutor de dispersão atuar seletivamente sobre o microorganismo e possuir uma resposta biológica adequada sem um efeito desejado exigido sobre a matriz, de modo que a formação do biofilme sobre a superfície seja tratada ou inibida.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são proporcionados para ilustrar as modalidades da presente invenção, porém não pretendem de modo algum limitar seu escopo.

Exemplo 1 - Cepas e Meios Bacterianos

Os micro-organismos usados nesse estudo incluem Pseudomonas aeruginosa PAO1 de Β. H. Holloway, Escherichia coli (ATCC 10798), Proteus mirabilis (ATCC 25933), Klebsiella pneumoniae (ATCC 10273), Staphylococcus aureus (ATCC 12602), Streptococcus pyogenes (ATCC 19615), Bacillus subtilis (ATCC 6633), e Candida albicans (ATCC 20260) e uma cultura indefinida mista coletada em placas R2A através de contaminação aérea. Exceto onde indicado, todos os experimentos foram realizados em meio EPRI modificado, contendo 0,005% de nitrato de amônio, 0,00019% de KH₂PO₄, 0,00063% de K₂HPO₄ (pH 7,0), e 0,001% de sais de Hutner (Cohen-Bazire e outros., J. Cell. Comp. Physiol. 49:35 (1957), que está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade), suplementado com 0,2% de glicose. C. albicans desenvolveu-se em meio EPRI modificado suplementado com 0,2% de glicose e 0,1% de peptona. K. pneumoniae, P. mirabilis,

S. aureus, e B. subtilis desenvolveram-se em meio EPRI modificado suplementado com 0,1% de peptona. S. pyogenes se desenvolveu em 10% de caldo de Infusão de Cérebro e Coração.

Exemplo 2 - Preparação de Meio usado de P. aeruginosa

Para preparar o meio de cultura gasto isento de célula, 6 mL de uma cultura noturna de P. aeruginosa PAO1 desenvolvida em meio EPRI modificado a 30°C foram inoculados em quatro litros de meio EPRI modificado e incubados durante 10 dias a temperatura ambiente com agitação contínua. As células bacterianas foram sedimentadas por centrifugação (Sorvall RC 5B Plus Centrifuge, GSA Rotor; Thermo Electron Co., Ashville, NC) em 13.000 x g durante 15 minutos a 4°C. O sobrenadante foi removido e filtrado sob vácuo através de um filtro de 0,45 pm Millipore Type HA (Millipore. Co., Billerica, MA) e subsequentemente, através de um filtro de seringa de 0,2 pm, Acrodisc de 32 mm (PALL Co., East Hills, NY). O meio usado foi armazenado a 4°C.

Exemplo 3 - Preparação de CSM

Os componentes orgânicos do meio usado foram extraídos adicionando 80 mL de clorofórmio a 250 mL de meio usado filtrado em um funil separador. A fração de clorofórmio foi removida após um tempo de separação de 1 h. O clorofórmio foi evaporado a 40°C utilizando um evaporador giratório Rotavapor R-3000 (Büchi Laboratories, Flawil, Switzerland) e o material orgânico restante foi ressuspenso em 6 mL de água nanopura filtrada e evaporada até secar utilizando um sistema evaporador Speed-Vac (Savant Instruments, Inc., Hicksville, NY) ou liofilizado. Essas amostras foram então ressuspensas em meio de cultura ou água purificada. O produto final é referido como Meio usado extraído com Clorofórmio (CSM). Exceto onde indicado, o CSM foi usado em experimentos em uma concentração final de carbono orgânico extraído com clorofórmio 125 vezes maior que aquela encontrada no meio usado.

Exemplo 4 - Fracionamento de HPLC de CSM

CSM foi fracionado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) (Varian Prostar model 320, Varian Inc., Paio Alto, CA) utilizando uma coluna de fase reversa C18 Microsorb-mv (Varian Inc.) com dimensões de

250 x 4,6 mm. A coluna foi carregada com 100 pL de CSM e eluída em um gradiente acetonitrila/água (2-75%) com uma taxa de fluxo de 1mL x min'¹ durante 29 minutos. As amostras foram coletadas a cada minuto, começan36 do em 2 minutos. As frações HPLC foram agrupadas e concentradas em um concentrador Speed Vac (Savant Instruments, Inc., Hicksville, NY) e ressuspensas em 0,5 mL de meio EPRI modificado ou água purificada. A fração HPLC ativa foi considerada para se eluir a partir da coluna em 70% de acetonitrila/30% de água. A fração ativa de cada separação HPLC foi determinada por bioensaio de dispersão em placa microtitulação.

Exemplo 5 - Bioensaio de Dispersão em Placa Microtitulação

Os bioensaios de dispersão em placa microtitulação foram usados para testar várias preparações para sua capacidade de induzir de maneira exógena a dispersão de biofilme. Os biofilmes se desenvolveram sobre a superfície interna de poços de placa microtitulação utilizando um método de cultura semicontínuo onde o meio dentro de cada poço foi periodicamente substituído para reduzir o acúmulo de fatores de indução de dispersão nativos. Os biofilmes que se desenvolveram dessa maneira foram tratados com indutor de dispersão ou meio estéril para liberar as células no meio líquido e avaliar o número de células dispersas medindo a densidade óptica. Em suma, placas de 96 poços de poliestireno estéril foram gravadas com acetona durante 10 segundos para criar uma superfície áspera para a fixação de células microbianas. Após a secagem durante 24 horas, as placas foram inoculadas com 150 pL/poço de cultura noturna contendo o organismo de teste, anteriormente diluídas 1:20 em meio de crescimento e incubadas a 30°C com agitação a 200 rpm. O meio nos poços foi substituído a cada 24 horas durante 5 dias e a cada 12 horas no 6^o dia e 7^o dia. O meio foi então substituído após 7 horas. A indução de dispersão foi testada adicionando 150 pL de meio de crescimento contendo o indutor de dispersão durante 1 h a 30°C ou meio estéril como um controle. O meio contendo células dispersas foi então transferido por pipetagem para uma placa microtitulação não-gravada e a densidade óptica (OD₅₇o) foi determinada (ELx808 Absorbance Microplate Reader; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT). Os tratamentos consistidos em meio usado, CSM, ácido cis-2-decenoico, ácido trans-decenoico, ácido decanoico e DSF em várias concentrações. Etanol (10%) foi usado como um veículo para amostras indutoras de ácido graxo e foi determinado para não ter influência sobre a dispersão. Os resultados de uso desse método são significativos para fazer comparações de diferentes tratamentos e determinar se a atividade de dispersão é estatisticamente significativa. Nota: Os bioensaios de dispersão em placa microtitulação não foram adequados para determinar a magnitude absoluta de uma resposta de dispersão induzida, pois em um sistema semicontínuo, as amostras de controle e teste são suscetíveis à dispersão natural contra a qual a atividade de indução exógena é medida. Todos os estudos de eficiência foram realizados utilizando reator de tubo de biofilme ou sistemas de cultura contínuos de célula de fluxo e se basearam tanto nas contagens celulares totais como nas contagens celulares viáveis.

Exemplo 6 - Bioensaios de Dispersão em Reatores de Tubo de Biofilme

As culturas de biofilme P. aeruginosa PAO1 se desenvolveram em reatores de tubo como anteriormente discutido por Sauer e outros. (K. Sauer, e outros., J. Bacteriol. 184: 1140 (2002), que está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade). Um sistema de reator de tubo direto contínuo foi configurado utilizando 8 tubos de reator de silicone (81,5 cm de comprimento x 14 mm ID), conectados a uma bomba peristáltica de 8 cilindros e reservatório de meio, através de tubo de silicone adicional. O meio foi bombeado através do tubo até um reservatório de meio de efluente fechado. O sistema montado foi esterilizado por autoclavagem antes da inoculação. Os tubos de silicone foram inoculados por injeção com seringa através de um septo de 1 cm a montante de cada tubo de reator, com 2 mL de culturas noturnas de P. aeruginosa (contendo aproximadamente 1x10⁸ CFU mL'¹). As células bacterianas foram permitidas para se ligarem (incubação estática) ao tubo durante 1 hora, após isso o fluxo foi iniciado em uma taxa de eluição de 10,8 mL hr'¹. Os tratamentos foram realizados após 96 horas de culturas de biofilme P. aeruginosa. Os tratamentos foram realizados sob condições contínuas e estáticas.

Sob tratamento contínuo (figura 17A), o meio afluente foi alterado do meio fresco nas linhas de teste para o meio usado transformado com 2% de glicose, ajustado para neutralidade e arejado durante a noite antes da adição. As linhas de controle foram trocadas por novas linhas contendo meio EPRI modificado fresco. As amostras foram coletadas durante intervalos de um minuto começando no tempo = 0 min, e avaliadas para densidade óptica. O meio usado* foi adicionado no tempo = 30 min. As amostras foram coletadas em tubos de teste em gelo e foram subsequentemente homogeneizadas durante 30 segundos em 5000 rpm com um Tissue Tearor Model 985370 (Biospec Products, Inc.) para garantir a separação de células. A densidade celular foi determinada por densidade óptica em 600 nm com um espectrofotômetro Ultrospec 3000 (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.).

Sob condições de tratamento estático, o indutor de dispersão foi adicionado por injeção com seringa através da porta de inoculação, 2 cm a montante do início do reator de tubo, deslocando o volume de reator com meio contendo indutor. O meio usado foi diretamente adicionado. CSM ou indutor de dispersão sintético (por exemplo: ácido cis-2-decenoico) foi preparado em EPRI modificado e adicionado. Após uma hora de exposição sob condições de não-fluxo, um comprimento de 81,5 cm de cada reator de tubo de silicone foi cortado, a fração líquida (contendo células de biofilme liberadas) foi coletada em tubos de teste em gelo e a fração de biofilme foi coletada girando o tubo sobre a bancada do laboratório com uma haste de metal para extrudar as células restantes no lúmen do tubo (K. Sauer, e outros., J. Bacteriol. 184:1140 (2002), que está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade). As amostras foram coletadas em gelo, e homogeneizadas como exposto acima. Os números de células foram determinados por um método de espalhamento em placa no meio ágar Standard Plate Count (Difco, Detroit, Ml) ou por densidade óptica em OD₆oo ajustados para o número de células por calibração em uma curva padrão para o número de células como determinado de maneira microscópica pela contagem celular total. A eficácia de dispersão foi calculada utilizando tanto densidade óptica como medidas de viabilidade:

Eficácia de Dispersão =

Células do Meio Líquido x 100

Células do Meio Líquido + Células do Biofilme

Exemplo 7 - Análise Microscópica

Uma célula de fluxo direto em cultura contínua foi configurada para observar o crescimento e desenvolvimento de biofilmes ligados a um substrato vítreo. A célula de fluxo foi construída de alumínio contendo uma câmara de 1,0 mm por 1,4 cm por 4,0 cm terminada com um deslizamento de tampa de vidro. O meio EPRI modificado estéril foi bombeado a partir de um recipiente de 10 litros através de um tubo de silicone até a célula de fluxo utilizando uma bomba peristáltica de 8 cilindros Masterflex em uma taxa de fluxo de 0,13 mL min’¹. O fluxo através da câmara era laminar, com um número de Reynolds de 0,17, contendo um tempo de residência de fluido de 4,3 min. O meio de saída da célula de fluxo foi descarregado em um reservatório de efluente através do tubo de silicone. Todo o sistema foi fechado para o ambiente externo, porém mantido em equilíbrio com pressão atmosférica por um filtro permeável a gás com tamanho de poro de 0,2 pm ajustado em cada recipiente. P. aeruginosa em fase log (aproximadamente 10⁸ CFU mL'¹>) foi inoculada como uma dose de pélete de 3,0 mL através de um septo de 4 cm a montante da célula de fluxo sob condições de fluxo. As células ligadas à superfície interna do deslizamento de tampa de vidro foram visualizadas por luz transmitida ou iluminação epi-UV utilizando um microscópio Olympus BX60 e uma lente objetiva A100PL com ampliação de 100X ou uma lente objetiva Olympus de longa distância de trabalho com ampliação de 50X ULWD MSPIan. Todas as imagens foram capturadas utilizando uma câmara com dispositivo acoplado à carga de três chips resfriada Magnafire (CCD) (Optronics Inc., Galena, CA) e armazenadas como arquivos digitais separados para recuperação subsequente e análise. P. aeruginosa foram desenvolvidas na célula de fluxo durante até 12 dias. Um trabalho anterior realizado pelo requerente mostrou que a P. aeruginosa desenvolveu biofilmes em estado estacionário após um período de cultura contínua de 7 a 9 dias. O estado estacionário é definido por nenhuma alteração nas contagens de células efluentes (CFU) resultantes das células de biofilme descoladas; no estado estacionário, o crescimento do biofilme é equilibrado pela perda de células através da dispersão ou descolamento. Os agrupamentos celulares individuais foram examinados durante o curso de cada experimento e coor denadas de grade atribuídas, que são reexaminadas periodicamente durante o curso dos experimentos. As medidas de tamanho foram tiradas de agrupamentos de células aleatórios localizando o agrupamento mais próximo a uma coordenada de estágio microscópico aleatoriamente selecionada. Cada agrupamento de célula foi medido para determinar sua altura e concentrando-se a partir do substrato através do ápice do agrupamento, e sua largura por meio da medida na base do agrupamento celular utilizando um micrômetro de estágio. Os agrupamentos celulares foram definidos como células incrustadas em uma matriz de exopolissacarídeo ligada ao substrato e desprovida de motilidade; as áreas vazias dentro dos agrupamentos celulares foram determinadas pela observação de bactérias flutuando livremente dentro de um espaço dentro de um agrupamento celular.

Exemplo 8 - Inibição de Desenvolvimento de Biofilme

Uma célula de fluxo foi usada para cultivar bactérias sobre a superfície de um substrato vítreo (descrito acima). Os biofilmes de P. aeruginosa se desenvolveram em temperatura ambiente durante um periodo de 99 horas na presença e ausência de CSM (diluído 1:125 para se adaptar à concentração do material orgânico extraído com clorofórmio encontrada no meio usado) em meio EPRI modificado. Durante o curso do experimento, a cobertura de célula total das bactérias sobre a superfície e a espessura média de biofilme foram determinadas pela contagem de 20 campos microscópicos utilizando uma lente objetiva 50 x ULWD MSPlan para cada ponto de tempo. Utilizando-se o software de análise de imagens, ImagePro Plus, a área total de células por cm² foi determinada em 72 horas e 99 horas. A espessura foi determinada medindo a altura média máxima de 20 agrupamentos celulares aleatórios em 72 horas e 99 horas de crescimento. As amostras de controle se desenvolveram e foram testadas na presença de meio EPRI modificado sem CSM adicionado. Os resultados desses experimentos mostraram que a cobertura de área de superfície do biofilme em desenvolvimento foi significativamente reduzida quando os biofilmes se desenvolveram na presença de CSM comparados aos biofilmes desenvolvidos apenas no meio EPRI. A adição de CSM também causou uma redução significativa na espessura média de agrupamento celular de biofilme após 99 horas de crescimento, comparado com as amostras não-tratadas com CSM (figura 18).

Exemplo 9 - Análise Espectral de CSM de P. aeruginosa e Ácido cis-2-decenoico

Todas as amostras de CSM preparadas em água purificada foram liofilizadas e ressuspensas em veículos apropriados para cada análise espectroscópica. Os controles de CSM em todos os experimentos consistiam em produtos HPLC de CSM que não induzem a dispersão como determinado pelo bioensaio de dispersão em placa microtitulação, e a solução transportadora não contendo CSM.

Exemplo 10 - Espectroscopia de Massas

As amostras foram ressuspensas em solução transportadora (50% de água, 50% de metanol e 0,01% de ácido fórmico). A Espectroscopia de massas foi realizada utilizando um espectrômetro de massas hibrido quadrupolo tempo de voo de alta eficiência - QSTAR® XL Hybrid LC/MS/MS System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) - em modo iônico positivo, em temperatura ambiente, com uma fonte lonSpray de API 150EX®, API 3000® e QSTAR® Systems (Applied Biosystems). Os dados foram analisados utilizando Analyst QS versão 1.1.

Exemplo 11 - Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

As amostras de CSM e ácido c/s-2-decenoico foram ressuspensas em 1 mL de acetonitrila deuterada e inseridas em um tubo de amostra de RMN de paredes finas (VWR). A análise foi realizada em um 300 MHz Proton RMN-Bruker AC 300 (Bruker Daltonics Inc., Vilarica, MA, USA). Os espectros foram acumulados durante 24 horas.

Exemplo 12 - Cromatografia Gasosa - Espectroscopia de Massas (GC-MS)

As amostras de CSM e concentrações de ácido c/s-2-decenoico de 0,01 mg x mL'¹ -10 mg x mL*¹ foram ressuspensas em 2 mL de acetonitrila. Uma extração com hexano de 3 etapas foi realizada para remover o material de amostra orgânico solúvel. O hexano foi evaporado até secar em um banho de água (55 a 70°C). A puridina (250 μί) foi subsequentemente adicionada para solubilizar as amostras para injeção em GC. Os espectros fo42 ram obtidos com um sistema Shimadzu QP5050A GC-MS, utilizando hélio como um veículo e uma coluna Restek (Columbia, MD) XTI-5 GC (30 m, 0,25 mm i.d., 0,25 pm de espessura de filme) com uma taxa de fluxo de 1 mL x miri¹>. Todas as análises incorporaram injeção de divisão de fluxo e ionização por impacto de elétrons. A temperatura de interface entre a GC e a MS foi mantida a 310°C. Os dados foram analisados utilizando o programa Lab Solutions, GCMS solution versão 1.2.

Exemplo 13 - Espectroscopia de Infravermelho (IR)

As amostras de CSM e ácido c/s-2-decenoico foram pesadas antes e após a liofilização para determinar a quantidade de KBr que se deve adicionar a cada amostra. KBr foi adicionado em 10 vezes a massa de amostra e misturado utilizando um almofariz e pilão. O pó resultante foi formado em um pélete utilizando um Carver 4350 Manual Pellet Press (Carver Inc., Wabash, IN, USA). A pressão foi aplicada em 10 toneladas durante 10 minutos. Os espectros IR foram obtidos utilizando um espectrômetro Bruker Equinox 55 FT-IR a temperatura ambiente na faixa de 3500 cm’¹ a 400 cm'¹em uma resolução de 1cm'¹. Os espectros finais representam a média de 128 varreduras. Cada amostra foi medida em triplicata.

Exemplo 14 - Bactérias de Biofilmes são Resistentes a Antibióticos

A figura 1A ilustra esquematicamente como as bactérias de biofilme são resistentes à adição de antibióticos, com resistência similar mostrada para biocidas e outros tratamentos antimicrobianos. A figura 1B ilustra que se um indutor de dispersão for adicionado além do antibiótico, as bactérias dispersas perdem sua resistência e se tornam suscetíveis ao antibiótico. Exemplo 15 - Efeito de Compostos Indutores de Dispersão

A figura 2 ilustra uma amostra de biofilme real tratada com o composto indutor de dispersão de acordo com a presente invenção, derivada de culturas de Pseudomonas aeruginosa. Nesse experimento, uma célula de fluxo direto foi usada para cultivar P. aeruginosa durante um período de seis dias antes do teste com CSM adicionado.

A célula de fluxo foi construída de alumínio anodizado, contendo uma câmara de 1,0 mm por 1,4 cm por 4,0 cm terminada com um desliza43 mento de tampa de vidro. O meio EPRI estéril foi bombeado a partir de um recipiente de 2 litros através do tubo de silicone até a célula de fluxo utilizando uma bomba peristáltica de 8 cilindros Masterflex em uma taxa de fluxo de 0,13 ml min’¹. O fluxo através da câmara era laminar, com um número de Reynolds de 0,17, contendo um tempo de residência de fluido de 4,3 min. O meio de saída da célula de fluxo foi descarregado em um reservatório de efluente através do tubo de silicone. Todo o sistema foi fechado para o ambiente externo, porém mantido em equilíbrio com pressão atmosférica por um filtro permeável a gás com tamanho de poro de 0,2 pm ajustado em cada recipiente. P. aeruginosa em fase log (aproximadamente 10⁸ CFU mL‘¹>) foi inoculada como uma dose de pélete de 3,0 mL através de um septo de 4 cm a montante da célula de fluxo sob condições de fluxo. As células ligadas à superfície interna do deslizamento de tampa de vidro foram visualizadas por luz transmitida ou iluminação epi-UV utilizando um microscópio Olympus BX60 e uma lente objetiva Olympus de longa distância de trabalho com ampliação de 50x ULWD MSPIan. Todas as imagens foram capturadas utilizando uma câmara com dispositivo acoplado à carga de três chips resfriada Magnafire (CCD) (Optronics Inc., Galena, Calif.) e armazenadas como arquivos digitais separados para recuperação subsequente e análise. Após o desenvolvimento de um biofilme maduro dentro da célula de fluxo, fluxo de meio foi interrompido e 3 mL de CSM filtrado em meio EPRI estéril foram adicionados à célula de fluxo. As imagens transmitidas por luz de um único dentro da célula de fluxo foram obtidas antes e durante o tratamento com CSM. A figura 2 mostra as imagens obtidas de tal experimento 1 minuto antes da adição de CSM, 5 minutos após a adição de CSM, e 30 minutos após a adição de CSM. As amostras de controle também operaram da mesma maneira que as amostras de teste com a exceção que o CSM não foi incluído com os 6 mL de meio EPRI adicionado. Os resultados das amostras de controle não mostraram alteração no números de células de biofilme ou arquitetura de biofilme, sem dispersão evidente.

Exemplo 16 - Bactérias de Biofilme se Submetem a uma Mudança Fenotípica

Durante o curso de desenvolvimento normal de biofilme, as bactérias de biofilme se submetem a uma mudança fenotípica no fim do estágio de maturação II (figura 3) em que suas alterações fisiológicas de uma forma de predominantemente de biofilme para uma forma predominantemente planctônica. As observações microscópicas de biofilmes durante a fase de dispersão demonstrou que as bactérias dentro dos agrupamentos celulares se tornam capazes de se movimentar (estágio de maturação de P. aeruginosa são não-móveis), enquanto as bactérias em torno das bordas dos agrupamentos permanecem fixas. A região do agrupamento celular dentro da qual as bactérias podem flutuar/se movimentar se desenvolve em volume a partir de um local (geralmente) central e eventualmente uma ruptura é feita na parede do agrupamento. As bactérias são capazes de flutuar através dessa ruptura e entrar na fase de meio líquido abandonando um espaço vazio dentro do agrupamento celular.

O estudo continuado da resposta de dispersão revelou que os agrupamentos celulares transitam ao longo de episódios de crescimento e dispersão; o mesmo agrupamento celular geralmente resiste a muitos tais ciclos. Múltiplos eventos de dispersão e recrescimento geralmente resultam no desenvolvimento de agrupamentos celulares com padrões análogos aos anéis de crescimento que podem indicar o número de vezes que a dispersão ocorreu. Geralmente, os agrupamentos celulares irão se descolar do substrato completamente durante um evento de dispersão (Stoodley e outros., Growth and Detachment of Cell Clusters from Mature Mixed-species Biofilms, Appl. Environ. Microbiol. 67:5608-5613 (2001), que está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade). Acredita-se que esse efeito se deva ao enfraquecimento de estruturas de ligação na base do agrupamento celular permitindo que o desvio de fluido descole o agrupamento.

Exemplo 17 - Descolamento Celular após Estagnação de Meio

A figura 4 mostra uma série de tempo de fotomicrografias de contraste de fase que mostra o descolamento de células após a estagnação de meio de 72 horas. A célula de fluxo foi inoculada com P. aeruginosa PAO1 e cultivada durante um período de três dias, de acordo com o método descrito no Exemplo 3, acima. A seleção de três dias de cultura desses biofilmes se baseou na observação que sob fluxo contínuo, os agrupamentos celulares dentro de um biofilme de P. aeruginosa foram observados para se submeterem a eventos de dispersão espontânea após 9 dias de incubação. Após 72 dias de crescimento sob fluxo contínuo, o fluxo de meio foi interrompido e as imagens dos agrupamentos celulares foram registradas a cada duas horas durante um período de 96 horas. Após 72 horas de estagnação de meio, os agrupamentos celulares dentro da célula de fluxo foram observados se desagregando, com células entrando no meio líquido como bactérias planctônicas (figura 4). Esses experimentos demonstraram que a cessação de fluxo induziu a dispersão de biofilmes. Nesses experimentos, a dispersão não ocorreu simplesmente dentro dos agrupamentos celulares, como ao longo de todos os agrupamentos no biofilme. Apenas aquelas células que foram diretamente ligadas ao substrato não foram observadas flutuando dentro do meio líquido, como ilustrado na figura 4.

Exemplo 18 - Desenvolvimento de Método de Extração com Clorofórmio

Vários procedimentos de crescimento e extração foram testados para desenvolver um método confiável de extração da fração ativa de meio de cultura gasto que possui atividade de indução de dispersão. O clorofórmio foi selecionado como o solvente de extração de seleção devido à sua compatibilidade com procedimentos de fracionamento HPLC, pois isso resultou em uma faixa estreita de compostos orgânicos extraíveis (como determinado por espectrometria de massas) e devido à possibilidade de recuperação de quantidades bioativos do agente de indução de dispersão. O método atualmente usado para extração com clorofórmio de meio usado é o seguinte: As culturas bacterianas de P. aeruginosa PAO1 se desenvolvem em 4 litros de meio EPRI (contendo: lactato de sódio 0,05 g/l, succinato de sódio 0,05 g/l, nitrato de amônio 50,381 g/l, KH₂PO₄ 0,19g/l, K₂HPO₄ 0,63 g/l, solução de metais de sais de Hutner 1ml, e glicose, 2,0 g/l) em um recipiente de cultura em batelada durante seis dias em temperatura ambiente com agitação contínua. Após o crescimento, as bactérias foram removidas do meio de cultura por centrifugação em 10.000 x g durante 20 minutos, seguidas por filtração de meio usado através de um filtro com tamanho de poro de 0,22 pm. Em bateladas, 250 ml de meio usado filtrado foram misturados com 80 ml de clorofórmio em um funil separador. A fração de clorofórmio foi removida após um tempo de separação de 10 minutos. As amostras de clorofórmio foram então evaporadas até secar a 70°C utilizando um rotavapor R-3000 (BiichiLaboratories, Flawil, Switzerland) e ressuspensas em 6 mL de água nanopura filtrada ou meio EPRI. O produto final, resultante do procedimento de extração de clorofórmio é referido aqui como meio usado concentrado ou CSM. A figura 15 mostra os resultados da comparação do efeito de CSM e Meio usado sobre o crescimento de biofilmes de cultura contínua em reatores de tubo de biofilme. O meio CSM e gasto foram preparados como anteriormente descrito a partir de culturas de P. aeruginosa PAO1 desenvolvidas a 22°C durante 9 dias em meio EPRI suplementado com 2,0 gramas por Litro de glicose. Os biofilmes de P. aeruginosa PAO1 foram cultivadas durante seis dias a 22°C em reatores de tubo de biofilme consistindo em um tubo de tamanho 14 Masterflex de dióxido de silicone de 32 cm. Ao final de seis dias, 6 mL de CSM, o Meio usado ou meio EPRI estéril, cada um suplementado com 2,0 gramas por Litro de glicose, foi adicionado aos tubos. O efluente dos tubos foi coletado e agrupado para cada tratamento durante um período de 20 minutos. As amostras agrupadas foram avaliadas para densidade óptica em 570 nm para determinar números celulares relativos dispersos de cada tratamento. Cada experimento foi realizado com cinco duplicatas. Os resultados desses experimentos demonstrou que o meio de cultura gasto extraído com clorofórmio, CSM mostrou uma atividade maior na dispersão de biofilmes de P. aeruginosa comparado com o meio usado.

Os requerentes observaram que P. aeruginosa PAO1 irão se dispersar de um biofilme de cultura contínua desenvolvido em um substrato vítreo em um reator de célula de fluxo após o fluxo de meio ser interrompido durante algumas horas. Essa observação resultou na hipótese de que a dispersão de biofilme pode resultar do acúmulo de um mensageiro extracelular que atua como um indutor de desagregação de biofilme Essa hipótese é sustentada por observações que os biofilmes de P. aeruginosa não irão se formar em frascos de cultura em batelada, porém irão se formar nas paredes de um quimiostato, indicando que o acúmulo de um sinal para dispersão pode prevenir o desenvolvimento de biofilme. Ademais, quando se desenvolvem em cultura contínua, as microcolônias de P. aeruginosa irão formar espaços vazios ocos em seu centro quando essas atingem um diâmetro mínimo de 40 mícrons e espessura de 10 mícrons (figura 6). O tamanho da microcolônia dentro da qual esses espaços se formam, entretanto, depende da taxa de fluxo de fluido. Quando o fluxo em um reator de biofilme for aumentado, o diâmetro e espessura na qual ocorreu a formação de vazios de microcolônia também aumenta, indicando uma relação entre a indução de dispersão e transporte. Essas observações sugeriram que uma substância extracelular produzida por P. aeruginosa foi responsável pela indução de dispersão de biofilme.

Se a P. aeruginosa produzir um compostos de indução de dispersão extracelular, o requerente avaliou que a adição de meio de cultura gasto isento de células aos biofilms maduros de P. aeruginosa causa a liberação de células no meio líquido. Essas bactérias devem ser detectáveis como um aumento no número de células recuperadas no efluente de reator. A figura 7A ilustra resultados de um experimento representativo onde os biofilmes foram tratados durante 70 minutos sob fluxo contínuo com meio usado isento de células onde a P. aeruginosa se desenvolveu em suspensão durante 24 horas; o meio fresco foi adicionado aos biofilmes de controle. Antes da adição, o meio usado foi ventilado, suplementado com glicose e seu pH ajustado até a neutralidade, para garantir que a inanição, depleção de oxigênio ou uma alteração em pH não seja responsável pela liberação de bactérias. Um grande pico no número de células efluentes foi detectável comparado com as linhas de controle dentro de 20 minutos da adição do meio usado, indicando a liberação de bactérias de biofilme no efluente de culturas tratadas com meio usado. Um pequeno pico de células liberadas também foi detectável em amostras de controle, provavelmente representando uma resposta aos efeitos físicos ou mecânicos associados às linhas de troca para um reservatório de meio fresco.

Para purificar a fração de indução de dispersão ativa do meio usado, as culturas em batelada em fase estacionária isenta de células de P. aeruginosa foram extraídas utilizando clorofórmio, seguido pela evaporação rotativa do clorofórmio e ressuspensão da fração orgânica em meio fresco ou solução tampão (resultando em um aumento de 125 vezes na fração orgânica solúvel em clorofórmio). Essa preparação é referida como CSM. Para testar a atividade de indução de dispersão de CSM, os biofilmes de P. aeruginosa se desenvolveram em cultura contínua em tubo de silicone e os biofilmes foram expostos durante um hora ao meio alterado com CSM. Os conteúdos extrudados dos reatores de tubo mostraram um biofilme amplamente intacto na linha de controle tratada com o meio fresco (figura 7B), enquanto os conteúdos dos tubos tratados com CSM mostraram que o biofilme se desintegrou completamente (figura 7C). Estudos de biofilmes de 4 dias de idade desenvolvidos em cultura contínua em tubo de silicone revelaram que o tratamento com meio contendo CSM durante uma hora foi eficaz na liberação de um média de 87,4% (±1,4%) de células de biofilme como determinado por unidades formadoras de colônia liberadas no meio usado de efluente foi mostrado para possuir uma eficácia de dispersão média de 32,4% (±5,5%).

A microscopia foi usada para avaliar o efeito de CSM sobre colônias de biofilme desenvolvidas durante seis dias em cultura contínua sobre o substrato vítreo de uma célula de fluxo montada em um microscópio (K. Sauer e outros., J. Bacteriol. 184:1140 (2002), que está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade). Antes da adição de CSM, uma microcolônia bem desenvolvida foi observada para conter células que eram estacionárias e não mostrou sinal de motilidade (figura 7D). Após 7 minutos de contato com meio contendo CSM, as células dentro da microcolônia começaram a se movimentar e exibir motilidade ativa (figura 7E). Após 30 minutos, a microcolônia se ficou completamente desagregada e as células foram observadas para flutuar livremente pelo meio (figura 7F). Quando comparada à dispersão natural, a dispersão exogeneamente induzida foi observada para progredir de fora da microcolônia em direção à parte interna e, em vez de criar um vazio central, resultou em desagregação completa da microcolônia.

Quando continuamente adicionado às células de fluxo, o CSM ajustado à concentração de meio usado, mostrou uma inibição significativa de desenvolvimento de biofilme durante um período de 99 h, demonstrando uma redução tanto na espessura média de biofilme como na cobertura de área de superfície (figura 8). A indução de dispersão exógena de biofilmes pré-formados por CSM foi mensurável em todos os pontos de tempo a partir do 1^o dia (começando da formação de microcolônia de biofilme) até o 6^o dia, após isso a dispersão natural começa a ocorrer. A atividade de CSM foi mostrada para persistir até 6 meses sem redução significativa quando armazenada sob refrigeração. A extração de meio usado por acetato de etila (para recuperar acil-homosserina lactonas) não resultou em uma preparação com atividade de dispersão.

Demonstrando a indução de dispersão contra biofilmes maduros e desenvolvidos formados por P. aeruginosa, a capacidade de CSM induzir dispersão em culturas de biofilme de E. coli, E. coli misturado com P. aeruginosa, um biofilme bacteriano misturado indefinido derivado de contaminantes aéreos, e contra biofilmes formados por Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Streptococcus pyogenes, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, e Candida albicans foi testada posteriormente. CSM foi mostrado para estimular a dispersão significativa comparado a controles em todas as amostras testadas. Os resultados desses experimentos estão resumidos na figura 9. A capacidade de o indutor de dispersão de P. aeruginosa ativar a dispersão em espécies diferentes de bactérias e em levedura indica que esse possui atividade cross-phylum e cross-kingdom.

Ao estabelecer a função de CSM como um indutor de dispersão de biofilme, a molécula ativa ou moléculas presentes em CSM foram identificadas. Essa começa avaliando a atividade de dispersão de múltiplas frações de CSM separadas por gradiente Isocrático em acetonitrila e água utilizando cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa C-18 (HPLC). As frações HPLC eluídas (coletadas em intervalos de um minuto) foram desse50 cadas em um Speedvac para remover a acetonitrila residual e ressuspensas em água purificada e testadas por bioensaio de dispersão em placa microtitulação para determinar a atividade de dispersão. A figura 10A mostra os resultados de ensaios de dispersão de biofilme de fracionamento CSM. Os resultados indicaram que a fração HPLC de CSM que mostra a atividade mais alta eluida em 22 minutos, uma razão acetonitrila/água de 70%/30%.

A espectrometria de massas da fração de CSM HPLC ativa mostrou um pico molecular compatível com a baixa atividade de ionização em 171 M/Z (mw=170). Esse pico estava presente em todas as amostras que apresentam atividade de dispersão e ausente de todas as amostras desprovidas de atividade de dispersão. Esse pico também se mostrou ausente de todos os líquidos transportadores e solventes usados na preparação de CSM (inclusive meio de cultura fresco). A análise iônica de produto-espectroscopia de massas do pico de 170 mw, análise de solubilidade, espectroscopia de ressonância magnética nuclear H¹- e C¹³ (RMN) e infravermelho (IR) demonstrou que a molécula de 170 mw era um ácido graxo-Cw monoinsaturado, com uma ligação dupla localizada no carbono número 2; ácido 2decenoico.

Para confirmar que a molécula de 170-mw (M/Z=171) da fração HPLC de CSM de 22 minutos era idêntica ao ácido 2-decenoico, a molécula original foi fragmentada na espectrometria de massas para gerar picos iônicos de produto. Os íons de produto da fração de CSM ativo e ácido 2decenoico forma analisados por quadrupolo ms/ms para avaliar diferenças de divagem entre duas moléculas. A figura 12 A, mostra que a amostra de CSM 171 M/Z possui identidade com o ácido 2-decenoico. Quando analisado por GC-MS, o CSM não-fracionado exibiu um único pico principal com um tempo de retenção de 7,6 min idêntico àquele de ácido 2-decenoico da figura 12B. A espectroscopia de infravermelho confirmou que o isômero cis de ácido 2-decenoico era o composto orgânico isolado de CSM, figura 12C.

Após essa identificação, as moléculas de ácido graxo monoinsaturadas de vários pesos moleculares foram sintetizadas e testadas para atividade de dispersão. DSF, que foi mostrada para dissolver os flocos de célu

Ias de X. campestris não foi mostrada para promover a dispersão de P. aeruginosa. Os compostos que possuem a atividade mais alta foram dois isômeros de ácido 2-decenoico. O isômero trans (ácido trans-2-decenoico) foi mostrado por bioensaio de dispersão em placa microtitulação para possuir atividade apenas em concentrações milimolares, tipicamente não baixas o suficiente para se qualificar como uma molécula de sinalização de célulacélula. A figura 10B mostra a atividade de dispersão de concentrações crescentes de ácido c/s-2-decenoico contra culturas de biofilm de P. aeruginosa desenvolvidas em placas microtitulação. Esses resultados demonstraram que o isômero cis (ácido c/s-2-decenoico) era ativo sobre uma faixa de concentração de 1,0 nanomolar a 10 milimolares, mostrando uma atividade dispersão maior em 1,0 nanomolar do que o meio de cultura gasto nãoconcentrado (isto é: maior do que o indutor de ocorrência natural). A microscopia revelou que a atividade de ácido c/s-2-decenoico como um indutor de dispersão era similar à atividade de CSM, dissolvendo completamente uma microcolônia de biofilme como mostrado na figura 13. A atividade de ácido c/s-2-decenoico também foi testada contra cultura de biofilme de E. coli, S. pneumonia, P. mirabilis, S. pyogenes, B. subtilis, S. aureus, e C. albicans, resultando em resultados similares àqueles obtidos por CSM (figura 11).

Esse estudo mostrou que uma pequena molécula de ácido graxo mensageiro, ácido c/s-2-decenoico, é produzida por P. aeruginosa em cultura em batelada e de biofilme. Essa molécula demonstrou a indução de uma resposta de dispersão em biofilmes formados por P. aeruginosa e uma faixa de bactérias gram-negativas e gram-positivas e em levedura. A resposta de dispersão é um mecanismo para escapar de condições de inanição dentro de uma população, permitindo que as células fixas tenham a oportunidade de migrar para um ambiente mais favorável e diluam a população que resta, permitindo que as células obtenham mais nutrientes. Quando as microcolônias de biofilme forem pequenas, o indutor, que se acumula na matriz extracelular é removido por transporte difusivo e advectivo. Essa remoção não é possível em sistemas de batelada. Quando os agrupamentos celulares atingirem uma dimensão onde o indutor não é adequadamente eliminado da parte interna (a taxa de difusão é excedida pela taxa de produção), o indutor é capaz de atingir uma concentração necessária para a ativação da resposta de dispersão, liberando as células do biofilme. A descoberta de uma molécula de sinalização célula-para-célula responsável pela dispersão de biofilme 5 permite a indução exógena da transição de bactérias de biofilme para um estado planctônico. O uso desse indutor de dispersão provavelmente irá resultar em opções de tratamento aumentadas no combate de infecções relacionadas a biofilme e no controle de sujamento biológico microbiano.

Embora as modalidades preferidas sejam mostradas e descritas 10 em detalhes aqui, tornar-se-á óbvio para os versados na técnica relativa que várias modificações, adições, substituições, e similares podem ser feitas sem que se abandone o espírito da invenção e essas são, portanto, consideradas dentro do escopo da invenção como definido nas reivindicações a seguir.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende:

um indutor(es) de resposta fisiológica à dispersão ácido decanóico um ou mais componentes aditivos selecionados a partir do grupo que consiste em biocidas, tensoativos, antibióticos, antissépticos, detergentes, agentes quelantes, inibidores do fator de virulência, géis, polímeros, pastas, produtos comestíveis, e produtos mastigáveis.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição é um dentifrício, enxaguante bucal ou cola cirúrgica.
3. Superfície, caracterizada pelo fato de que é revestida com a composição, como definida na reivindicação 1.
4. Superfície, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a superfície é um fio dental, uma lente de contato, ou um implante ósseo.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 1 5, caracterizado pelo fato de que o dito indutor de resposta fisiológica à dispersão ácido decanóico é administrado como uma composição formulada de modo que o dito indutor de resposta fisiológica à dispersão ácido decanóico seja nãobactericida.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito indutor de resposta fisiológica à dispersão ácido decanóico é administrado em uma concentração de menos de 0,5 por cento, em peso.
7. Método ex vivo de tratamento ou inibição da formação de um biofilme sobre uma superfície, sendo que o dito método compreende:

proporcionar uma superfície que possui ou está suscetível à formação de um biofilme produzido por um micro-organismo, de modo que o biofilme compreenda uma matriz e o micro-organismo sobre a superfície e administrar à superfície um indutor de resposta fisiológica à dispersão ácido decanóico, de modo que a formação do biofilme sobre a superPetição 870170095767, de 08/12/2017, pág. 6/10 fície seja tratada ou inibida.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a superfície é uma lente de contato, um dispositivo médico invasivo, um dispositivo médico implantado, drenos, tubos, eletrodomésticos, bancadas, cortinas de chuveiro, graute, banheiros, instalações industriais de produção de alimentos e bebidas, pisos, equipamento de processamento de alimentos, uma superfície trocadora de calor, uma superfície de filtro, uma estrutura marinha, um sistema de tratamento e/ou distribuição de água, ou uma superfície associada a um sistema de perfuração ou armazenamento ou separação ou refinamento ou distribuição de petróleo ou meio poroso do qual o petróleo é extraído.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente:

administrar à superfície, em conjunto com a dita administração do indutor de resposta fisiológica à dispersão ácido decanóico, ao menos um tratamento antimicrobiano selecionado a partir do grupo que consiste em biocidas, tensoativos, antibióticos, antissépticos, detergentes, agentes quelantes, inibidores de fator de virulência, tratamento ultrassônico, tratamento com radiação, tratamento térmico, e tratamento mecânico.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o indutor de resposta fisiológica à dispersão ácido decanóico é impregnado na superfície ou administrado em um copolímero ou um gel que cobre a superfície.
11. Solução, caracterizada pelo fato de que compreende:

um indutor de resposta fisiológica à dispersão ácido decanóico, em que o dito indutor de resposta fisiológica à dispersão ácido decanóico está presente em uma concentração menor que 0,5 por cento, em peso, e onde a dita solução possui um pH maior que 5.
12. Solução, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um componente selecionado a partir de um ou mais entre o grupo que consiste em biocidas, tensoativos, antibióticos, antissépticos, detergentes, agentes quelantes, inibidores do faPetição 870170095767, de 08/12/2017, pág. 7/10 tor de virulência, géis, polímeros, pastas, produtos comestíveis e produtos mastigáveis.
13. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende:

um componente selecionado a partir do grupo que consiste em biocidas, tensoativos, antibióticos, antissépticos, detergentes, agentes quelantes, inibidores do fator de virulência, géis, polímeros, pastas, produtos comestíveis e produtos mastigáveis, e um indutor de resposta fisiológica à dispersão ácido decanóico, onde o dito indutor é formulado em uma forma não-salina.
14. Solução, de acordo com a reivindicação 11 ou composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a dita solução e a dita composição está em uma formulação selecionada a partir do grupo que consiste em um creme para a pele, uma pasta de dentes, e um enxaguante bucal.
15. Método, caracterizado pelo fato de que compreende:

a) fornecer lentes de contato e uma solução que compreende um indutor de resposta fisiológica à dispersão ácido decanóico em uma concentração menor que 0,5%, em peso; e

b) tratar as ditas lentes de contato com a dita solução.
16. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende:

um ou mais indutor(es) de resposta fisiológica à dispersão ácido decanóico e um ou mais componentes aditivos selecionados a partir do grupo que consiste em biocidas, tensoativos, antibióticos, antissépticos, detergentes, agentes quelantes, inibidores do fator de virulência, géis, polímeros, pastas, produtos comestíveis, e produtos mastigáveis.
17. Método ex vivo de tratamento ou inibição da formação de um biofilme sobre uma superfície, caracterizado pelo fato de que compreende:

fornecer uma superfície que possui ou está suscetível à formação de um biofilme produzido por um micro-organismo, de modo que o biofilme compreenda uma matriz e o micro-organismo sobre a superfície e administrar à superfície um indutor de resposta fisiológica à dis

Petição 870170095767, de 08/12/2017, pág. 8/10 persão ácido decanóico, de modo que a formação do biofilme sobre a superfície seja tratada ou inibida.