CN107708709B - 铁氧化物纳米粒子及其使用方法 - Google Patents

Abstract

目前公开的主题涉及铁氧化物纳米粒子组合物和其制剂，用于：(1)处理和消除生物膜；(2)预防生物膜形成；(3)生物膜细胞外基质降解；(4)抑制生物膜内的细菌活力和生长；和(5)预防牙齿或磷灰石去矿化。特别地，目前公开的主题提供用于预防和治疗口腔疾病(例如，龋齿)的组合物，其包含一种或多种铁氧化物纳米粒子和过氧化氢。

Description

铁氧化物纳米粒子及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年2月13日提交的美国临时申请序列号62/115,968的优先权，所述临时申请通过引用以其整体结合到本文中。

发明背景

生物膜为有结构的微生物群落，其可牢固地附着到表面并陷入自身产生的三维(3D)细胞外基质中。生物膜可在活或非活表面上形成，并且可存在于天然和工业环境中。例如，生物膜可污染人造水生系统例如冷却塔、池和矿泉。在工业环境中，生物膜可在管内部发展，这可引起阻塞和腐蚀。生物膜也可在植入的医疗管道和医疗装置内以及人体内(粘膜表面)形成，这可在患者中引起感染。相似地，生物膜可在口腔内发展并引起口腔疾病例如龋齿。这种生物膜的细胞外基质包含聚合物质，例如表多糖(EPS)。微生物产生的基质可为生物膜组装提供必要支架。另外，其可促进微生物粘附和粘合，同时阻碍扩散，从而使生物膜非常难于处理或从表面移除。

在口腔环境中，形成基质核心的EPS为生龋的，即产生龋的生物膜(也称为牙菌斑)的主要构件。该富含EPS的细胞外基质促进形成高粘合和粘附的生物膜以及阻碍扩散，这帮助在生物膜内建立高酸性微环境。这种高酸度可增强生龋菌群的存活和生长，并且可进一步诱导产生聚合的细胞外基质，从而确保致病生物膜增长同时促进酸溶解邻近的牙釉质。该细胞外基质还促成通过抗体、抗生素和免疫细胞消除口腔和人体内以及生物材料例如植入物和医疗装置上的微生物膜困难，所述抗体、抗生素和免疫细胞不能穿透致密的细胞外基质以杀灭包埋的微生物。此外，富含EPS的细胞外基质的酸性pH可减少一些抗生素的功效。

用于控制生龋齿生物膜的某些方法限制于标准的杀细菌剂，例如氯己定(CHX)，而不是靶向基质破坏。尽管能够杀灭浮游的变形链球菌(Streptococcus mutans)，CHX可对生物膜不太有效，并且由于副作用例如结石形成和牙齿染色不适于日常治疗使用。另外，化学和生物剂可具有一些缺点，例如牙齿或舌变色、口腔粘膜脱落和疼痛、令人不愉快的味道、毒性以及还可引起复杂的口腔菌群失衡。

某些抗微生物纳米粒子已经作为破坏口腔生物膜的潜在方法开发。然而，许多具有与使用CHX观察到的那些相似的限制。金属纳米粒子，例如银和铜纳米粒子，已经显示广泛的抗细菌活性。然而，这些试剂不靶向基质并且在酸性微环境下可能不太有效，导致有限的抗生物膜功效。开发有效疗法控制口腔生物膜还受口腔中局部引入的试剂的保留和生物活性缺乏影响。因此，本领域需要一般通过同时降解基质和杀灭包埋的细菌而有效处理生物膜的组合物，所述生物膜包括但不限于可出现在口腔中的那些。

发明概述

目前公开的主题提供铁氧化物纳米粒子组合物及其制剂，用于：(1) 处理和/或消除生物膜；(2) 预防生物膜形成；(3) 生物膜细胞外基质降解；(4) 抑制生物膜内细菌的活力和生长；和/或(5) 预防牙齿或磷灰石去矿化。

在某些实施方案中，本公开内容提供用于预防和/或治疗生物膜相关疾病，例如，口腔疾病的组合物，其包含一种或多种铁纳米粒子和过氧化氢。在某些实施方案中，所述一种或多种铁纳米粒子缀合至一种或多种酶。例如，而非限制，所述一种或多种铁纳米粒子缀合至基质降解酶和/或产生过氧化物的酶。在某些实施方案中，口腔疾病为龋齿。在某些实施方案中，一种或多种铁纳米粒子可具有约1 nm-约1000 nm的直径。在某些实施方案中，一种或多种铁纳米粒子具有聚合物涂层。在某些实施方案中，一种或多种铁纳米粒子不具有聚合物涂层。

本公开内容进一步提供用于预防和/或处理生物膜的组合物，其包含一种或多种铁纳米粒子和过氧化氢。在某些实施方案中，所述一种或多种铁纳米粒子缀合至一种或多种基质降解酶和/或产生过氧化物的酶。在某些实施方案中，一种或多种铁纳米粒子可具有约1 nm-约1000 nm的直径。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含氟化物。在某些实施方案中，一种或多种纳米粒子掺杂金属例如，但不限于，锰、钴、钙、镍、镁、锶、钡、钪、钛、钒、铬、锌、铝、钇、锆、铌、钼、钌、铑、钯、铪、钽、钨、铼、锇、铱、铂、铜或其组合。在某些实施方案中，一种或多种铁纳米粒子不具有或具有聚合物涂层。在某些实施方案中，聚合物涂层包括右旋糖酐。在某些实施方案中，生物膜由变形链球菌(S. mutans)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosas)、大肠杆菌(E. coli)、粪肠球菌(E faecalis)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、金黄色葡萄球菌(S. aureus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、白色念珠菌(Candida albicans)或其组合产生。生物膜可存在于牙齿、粘膜表面、医疗装置、工业材料、船舰材料(naval material)、皮肤、牙齿内部(例如，牙髓管)、肺(例如囊性纤维化)或泌尿道的表面上。

本公开内容提供用于预防、消除和/或治疗口腔疾病的方法，其包括给予受试者有效量的包含一种或多种铁纳米粒子的组合物。在某些实施方案中，组合物中铁纳米粒子的浓度为约0.1-约1.0 mg/ml。在某些实施方案中，所述方法可进一步包括给予受试者有效量的过氧化氢。在某些实施方案中，过氧化氢以包含浓度约0.1%-约3.0%的过氧化氢的溶液给予。在某些实施方案中，所述方法可进一步包括给予受试者有效量的氟化物。在某些实施方案中，一种或多种铁纳米粒子缀合至基质降解酶和/或产生过氧化物的酶。在某些实施方案中，组合物可进一步包含氟化物、过氧化氢、磷酸钙、铜、过碳酸钠或其组合。在某些实施方案中，一种或多种铁纳米粒子可具有约1 nm-约1000 nm的直径。在某些实施方案中，一种或多种铁纳米粒子不具有或具有聚合物涂层。在某些实施方案中，一种或多种铁纳米粒子具有聚合物涂层。

本公开内容提供用于预防、消除和/或处理生物膜的方法，其包括使具有生物膜的表面接触有效量的包含一种或多种铁纳米粒子的组合物。在某些实施方案中，生物膜存在于牙齿表面、粘膜组织表面、软组织表面、皮肤、磷灰石表面、植入物表面、医疗装置表面、工业表面、船舶(naval vessel)的表面、水运工具表面、船体或管表面的表面上。在某些实施方案中，所述方法可进一步包括使表面与包含过氧化氢的溶液接触，其中一种或多种铁纳米粒子催化过氧化氢形成一种或多种自由基，所述自由基可降解生物膜基质和/或杀灭包埋的细菌。在某些实施方案中，一种或多种自由基同时降解生物膜基质和杀灭包埋的细菌。

在某些实施方案中，用于预防生物膜中细菌生长的方法包括使具有生物膜的表面接触有效量的包含一种或多种铁纳米粒子的组合物，其中所述一种或多种铁纳米粒子结合到表面并释放铁以抑制生物膜内的细菌生长。本公开内容进一步提供用于预防表面上形成生物膜的方法。在某些实施方案中，用于预防表面上形成生物膜的方法可包括用有效量的包含一种或多种铁纳米粒子的组合物处理有生物膜发展风险的表面。在某些实施方案中，表面可用有效量的包含一种或多种铁纳米粒子的组合物涂覆。在某些实施方案中，组合物可包含一种或多种铁纳米粒子和过氧化氢和/或过碳酸钠。例如，而非限制，这种有风险的表面包括牙齿表面、粘膜表面、植入物表面、装置表面和管表面。

目前公开的主题进一步提供用于预防牙齿或羟基磷灰石(HA)去矿化的方法。在某些实施方案中，用于预防牙齿去矿化的方法可包括使具有生物膜的牙釉质或磷灰石(例如，骨)表面接触有效量的包含一种或多种铁纳米粒子的组合物。在某些实施方案中，一种或多种铁纳米粒子结合到表面以抑制和/或预防釉质或磷灰石溶解。

本公开内容提供用于预防和/或处理生物膜的试剂盒，其包括包含具有一种或多种铁纳米粒子的组合物的第一容器和包含过氧化氢溶液的第二容器。在某些实施方案中，所述试剂盒可包括包含具有一种或多种铁纳米粒子和过氧化氢的组合物的容器，其中过氧化氢为灭活的和/或络合的，并且在口中或与水接触时可变得有活性和/或释放。

附图简述

图1描绘提出的用于通过由催化的纳米粒子(CAT-NP)原位活化H₂O₂而消除/破坏生物膜的模型的示意图。

图2A-2C描绘生物膜内的三维(3D)细胞外基质和酸性pH小环境(niche)的图像。图2A描绘成熟生物膜内的EPS基质(红色)和细菌(绿色)。图2B描绘细胞基质结构组织的近视图，其显示EPS将细菌维持在一起并形成区室化结构。图2C描绘具有高酸性微环境的完整生物膜的原位pH (虚线区)的图像。

图3描绘根据本公开内容的非限制性实施方案制备和表征的IO-NP的TEM图像。比例尺为500 nm。

图4A-4C描绘通过扫描电镜术(SEM)表征的变形链球菌生物膜上IO-NP保留的图像。图4A描绘用IO-NP处理的生物膜的形态学。图4B描绘IO-NP结合到生物膜的近视图。图4C描绘显示生物膜上的IO-NP (粉色)分布的SEM图像的元素分析。

图5A-5B描绘通过IO-NP组合0.5% H₂O₂的细菌杀灭和基质降解的图。图5A描绘有效杀灭生物膜内的变形链球菌的图。图5B描绘EPS基质降解的图。

图6A-6C描绘在低pH下细菌抑制、铁从IO-NP释放和自由基产生的图。图6A描绘显示IO-NP在低pH下在包含葡萄糖的培养基中抑制细菌活力的图。图6B描绘显示在低pH下(5.5以下)在37℃铁从IO-NP释放的图。图6C描绘显示在低pH下(pH在4-5之间) IO-NP催化H₂O₂迅速产生自由基的图。

图7A-7C描绘显示在酸性条件下IO-NP减少羟基磷灰石(HA)去矿化的图像。图7A为未处理的HA珠的图像。图7B为酸性缓冲液(pH 4.5)中的HA珠的图像。图7C为酸性缓冲液中具有IO-NP的HA珠的图像，显示IO-NP抗HA酸溶解的保护作用。

图8A-8E描绘CAT-NP表征和催化活性。图8A-8B描绘通过TEM的CAT-NP的图像。图8C为显示CAT-NP (213.3 ± 26.5 nm)的尺寸分布的图。图8D为CAT-NP活性的图，如通过3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)方法所测定的。图8E为CAT-NP活性的图，如通过AMPLEX®UltraRed (在568/581 nm激发/发射)所测量的。数据描述为平均值±s.d。

图9A-9B描绘示例性的实验设计和体外唾液涂覆的羟基磷灰石(sHA)生物膜模型。图9A描绘示例性的生物膜实验设计和局部处理方案。图9B描绘24孔板中sHA盘的垂直放置和sHA盘的表面上生物膜的形成。

图10A-10F描绘生物膜中CAT-NP的保留和催化活性。图10A描绘具有结合的CAT-NP(箭头)的生物膜的形态学。图10A1描绘图10A中选择的区域内的CAT-NP的放大图。图10A2描绘SEM/EDS图像，显示生物膜上铁(粉色)的分布。图10B描绘显示结合到生物膜内的CAT-NP的量的图，如通过用ICP-MS测量铁量所测定的。图10C描绘生物膜内CAT-NP的空间分布(EPS(红色)、细菌(绿色)、CAT-NP (白色)用共焦显微术观察)。图10D描绘显示CAT-NP跨生物膜的厚度的垂直分布的图。图10E描绘显示生物膜内的CAT-NP的催化活性的图(插图：CAT-NP处理的生物膜暴露于H₂O₂和TMB之前和之后的图像(蓝色指示经由H₂O₂原位催化的自由基产生))。图10F描绘显示CAT-NP在不同pH的生物膜中的催化活性的图。

图11描绘显示使用另一种过氧化物酶底物(3,3’-二氨基联苯胺；DAB)，结合到生物膜中的CAT-NP的活性的图像。褐色指示经由H₂O₂催化的自由基产生。

图12为显示在不同pH值时结合到生物膜中的CAT-NP的催化活性的图，如通过3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)反应所测量的。

图13A-13D描绘通过组合CAT-NP和H₂O₂取得的细菌杀灭、EPS降解和生物膜破坏。图13A为显示H₂O₂暴露5 min后CAT-NP处理的生物膜内变形链球菌的活力的图。图13B为显示H₂O₂暴露30 min后生物膜内的EPS降解的图。图13C为显示由GtfB产生的不可溶葡聚糖和来自GtfD的可溶性葡聚糖的降解的图。图13D描绘共焦显微术图像，显示用CAT-NP + H₂O₂局部处理后生物膜破坏的动力学。生物膜接受通过CAT-NP接着立即H₂O₂暴露(CAT-NP + H₂O₂)或乙酸钠缓冲液(仅CAT-NP)局部处理，每日两次。对于在缺乏CAT-NP下用H₂O₂处理的生物膜，将生物膜用乙酸钠缓冲液接着立即H₂O₂暴露处理。对照组由仅用缓冲液处理的生物膜组成。细菌细胞用SYTO 9 (绿色)染色，EPS用Alexa Fluor 647 (红色)标记。数据显示为平均值± s.d. *P ≤ 0.001 (vs.对照)。

图14A-14B描绘显示CAT-NP与不同浓度的H₂O₂的抗生物膜活性的图。图14A为抗细菌活性的图，如通过计数活细胞的总数(集落形成单位，CFU)所测定的。图14B为生物膜的生物质(干重)减少的图。数据描述为平均值±s.d.。

图15A-15C描绘处理的生物膜内细菌和EPS生物量(biovolume)的定量分析。图15A描绘使用COMSTAT处理的生物膜(43 h)内的细菌生物量的图。图15B描绘使用COMSTAT处理的生物膜(43 h)内的EPS生物量的图。图15C提供显示使用COMSTAT 43 h时处理的生物膜内的细菌和EPS生物量的定量分析的表。数据描述为平均值±s.d。

图16A-16B描绘图像和图表，说明通过CAT-NP/H₂O₂处理保护免于发展龋性损伤。图16A描绘如标明的处理的大鼠牙齿的图像。绿色箭头指示初始损伤形成，其中釉质区域去矿化并变成白色；蓝色箭头显示中等龋性损伤，其中釉质区域为白色不透明或损坏的。在一些区域，釉质受侵蚀，导致空腔化，这是最严重的龋性损伤(红色箭头)。图16B描绘显示根据Larson修改的Keyes评分系统记录为龋性损伤严重性的阶段和程度的分数的图：初始损伤(表面釉质白色)；中度损伤(釉质白色-不透明)；和广泛的(空腔化，伴随釉质侵蚀和下面的牙本质暴露)。数据显示为平均值± s.d. *P ≤ 0.001 (vs.对照)；** P ≤ 0.05 (vs.对照)；δ指示无检测。

图17描绘用CAT-NP和/或H₂O₂处理的动物中牙龈和腭组织的组织病理学图像，显示局部处理3周之后无细胞毒性作用和没有任何细胞异常。

图18A-18C描绘通过CAT-NP处理减少sHA酸溶解的图像、图表和图解。图18A描绘未处理的sHA珠(80 μm直径)、酸性缓冲液(pH 4.5)中的sHA珠和酸性缓冲液中伴随CAT-NP的sHA珠的图像。图18B描绘显示酸溶解后剩余sHA的量的示例性图。图18C描绘显示在pH 4或pH 7孵育后从CAT-NP释放的铁的量的示例性图。数据描述为平均值±s.d.。

图19A-19B描绘显示修饰的CAT-NP的催化活性比较的图。图19A描绘显示不同类型的CAT-NP (相同量)的催化活性(使用TMB方法)动力学的图：CAT-NP、用右旋糖酐涂覆的CAT-NP和由右旋糖酐涂覆并掺杂锰(Mn)的CAT-NP。图19B描绘显示与修饰的CAT-NP的催化活性相比CAT-NP的催化活性的图。数据(相对于未修饰的CAT-NP的活性)描述为平均值±s.d.，并且清楚证明由于修饰增强催化活性。

图20说明可优化IO-NP的有效性的潜在的修饰。

图21为显示H₂O₂通过右旋糖酐涂覆的IO-NP体外催化的图，如由从鲁米诺产生光所证明的。

图22A-22B描绘结合到生物膜的IO-NP的催化活性。图22A为显示暴露于H₂O₂和TMB之前和之后IO-NP处理的生物膜的图像 ；蓝色指示经由H₂O₂原位催化的ROS产生。图22B为显示产生的自由基的量的图，如在OD₆₅₂测量的。

图23A-23B描绘用铁氧化物纳米粒子孵育24小时后的细胞活力。图23A为描绘用铁氧化物纳米粒子孵育24小时后BJ5ta细胞的细胞活力的图。图23B为描绘用铁氧化物纳米粒子孵育24小时后HepG2细胞的细胞活力的图。数据显示对细胞无毒性作用。

发明详述

目前公开的主题提供用于消除生物膜、预防生物膜形成、基质降解和/或抑制生物膜内的微生物活力和生长的铁氧化物纳米粒子(IO-NP)组合物和其制剂。目前公开的主题进一步提供在治疗口腔疾病中以及用于工业和其它医疗应用，使用本公开内容的组合物和制剂的方法。

如本文所使用的，“生物膜”包括细胞外基质和一种或多种微生物，例如，但不限于，细菌、真菌、藻类和原生动物，其附着到表面。例如，而非限制，这样的表面可包括牙齿、粘膜、磷灰石、骨和无生命(例如，植入物、假牙、管等)表面。生物膜可在活或非活表面上形成，并且可存在于自然和工业环境中。

可通过本公开内容的组合物和/或制剂预防、消除和/或处理的生物膜包括，但不限于，口腔中存在的生物膜，例如，在牙齿表面上、粘膜/软组织例如牙龈/牙周表面上和牙管(例如，牙髓管)内部。在某些实施方案中，可通过本公开内容的组合物和/或制剂预防、消除和/或处理的生物膜包括泌尿道上、肺上、胃肠道上、慢性伤口上和/或内部的，以及表面(例如，植入物)上和医疗装置和医疗线例如导管、医疗器械和医疗管道内部存在的生物膜。额外的生物膜的非限制性实例包括工业设备和材料，例如，水、污水、油或其它物质的管中存在的生物膜。在某些实施方案中，本公开内容的组合物和/或制剂可用于处理或清洁船体和其它水运工具。

如本文所使用的，术语“约”或“大约”意指在本领域普通技术人员所测定的具体值的可接受的误差范围内，其将部分取决于该值如何测量或测定，即测量系统的限制。例如，“约”可意指给定值的至多20%、至多10%、至多5%和/或至多1%的范围。

如上文所指出的，本公开内容的组合物可用于减少生物膜中的一种或多种微生物例如，细菌的生长和/或抑制其活力。例如，而非限制，所述细菌可包括变形链球菌(S. mutans)、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)、血链球菌(Streptococcus sanguis)(sanguinis)、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、溶齿放线菌(Actinomyces odontolyticus)、粘性放线菌(Actinomyces viscosus)、伴放线放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、中间普雷沃菌(Prevotella intermedia)、福赛拟杆菌(Bacteroides forsythus)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、直肠弯曲杆菌(Campylobacter rectus)、啮蚀艾肯菌(Eikenella corrodens)、韦荣氏球菌(Veillonella spp.)、微小微单胞菌(Micromonas micros)、犬齿龈液卟啉单胞菌(Porphyromonas cangingivalis)、伴放线嗜血菌(Haemophilus actinomycetemcomitans)、放线菌属(Actinomyces spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、分支杆菌属(Mycobacterium spp.)、梭菌属(Fusobacterium spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococcus agalectiae)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、不动杆菌属(Acinetobacter spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、普雷沃菌属(Prevotella spp.)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas spp)、梭菌属(Clostridium spp)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、犬齿龈液卟啉单胞菌(P. cangingivalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、大肠杆菌(Escherichia coli)和/或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。在某些实施方案中，所述细菌为变形链球菌，其存在于口腔中，例如，牙齿表面上存在的生物膜内。

铁氧化物纳米粒子(IO-NP)和IO-NP组合物

目前公开的主题提供包含一种或多种IO-NP (本文也称作催化纳米粒子、CAT-NP和MNP)的组合物，其用于处理和/或消除生物膜和/或预防生物膜形成。例如，而非限制，本文公开的组合物可用于处理现存的生物膜，例如，已经存在于表面上的生物膜。在某些实施方案中，本公开内容的组合物可用于预防生物膜起始和/或形成，例如，通过用公开的组合物涂覆表面。

如本文所公开的，本公开内容的IO-NP可结合到牙齿表面以及穿透并保留在生物膜内以破坏生物膜的细胞外基质和减少包埋在生物膜内的细菌和/或将其杀灭。例如，而非限制，所公开主题的IO-NP可将铁释放入生物膜中以减少生物膜内的细菌生长。在某些实施方案中，IO-NP在生物膜的酸性微环境中释放铁。例如，而非限制，IO-NP可在pH约5.5或更低、约4.5或更低或约4.0或更低释放铁。在某些实施方案中，IO-NP在pH约7时不显著释放铁。

在某些实施方案中，本公开内容的IO-NP可为从铁氧化物制造的纳米粒子。例如，而非限制，IO-NP可从Fe₃O₄、Fe₂O₃、包含铁氧化物的纳米材料或其组合制造。在某些实施方案中，IO-NP可具有约0.01-约10.0 mg/ml的铁浓度。例如，而非限制，IO-NP可具有约0.01-约9.0 mg/ml、约0.01-约8.0 mg/ml、约0.01-约7.0 mg/ml、约0.01-约6.0 mg/ml、约0.01-约5.0 mg/ml、约0.01-约4.0 mg/ml、约0.01-约3.0 mg/ml、约1.0-约2.0 mg/ml、约2.0-约10.0 mg/ml、约3.0-约10.0 mg/ml、约4.0-约10.0 mg/ml、约5.0-约10.0 mg/ml、约6.0-约10.0 mg/ml、约7.0-约10.0 mg/ml、约8.0-约10.0 mg/ml或约9.0-约10.0 mg/ml的铁浓度。在某些实施方案中，IO-NP可具有约5.0-约6.0 mg/ml的铁浓度。

在某些实施方案中，本公开内容的IO-NP不包含聚合物涂层。在某些实施方案中，本公开内容的IO-NP可包含聚合物涂层，例如，而非限制，聚合物涂层可包括壳聚糖、聚(丙烯酸)、右旋糖酐、聚(寡(乙二醇)甲基丙烯酸酯共甲基丙烯酸)、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、聚(乙烯醇)、二醇、儿茶酚/多巴胺、羟肟酸类、氧化膦、硅烷类和本领域技术人员已知的其它涂层。在某些实施方案中，所述聚合物涂层可为右旋糖酐或修饰的右旋糖酐。例如，而非限制，右旋糖酐可为交联的、胺化的、羧化的或用二乙基氨基乙基部分修饰。可用作本公开内容的IO-NP的市售可得的右旋糖酐-涂覆的铁氧化物纳米粒子的非限制性实例包括Feridex^®、Combidex^®和Feraheme^®。在某些实施方案中，本公开内容的IO-NP的涂层中使用的右旋糖酐可具有约1 kDa-约100 kDa，例如，约1 kDa-约90 kDa、约1 kDa-约80 kDa、约1kDa-约70 kDa、约1 kDa-约60 kDa、约1 kDa-约50 kDa、约1 kDa-约40 kDa、约1 kDa-约30kDa、约1 kDa-约20 kDa、约1 kDa-约10 kDa、约1 kDa-约5 kDa、约5 kDa-约100 kDa、约10kDa-约100 kDa、约20 kDa-约100 kDa、约30 kDa-约100 kDa、约40 kDa-约100 kDa、约50kDa-约100 kDa、约60 kDa-约100 kDa、约70 kDa-约100 kDa、约80 kDa-约100 kDa或约90kDa-约100 kDa的分子量。

在某些实施方案中，本公开内容的IO-NP可具有约1纳米(nm)-约1000 nm的直径，例如，如通过透射电镜术(TEM)所测量的。例如，而非限制，IO-NP可具有约1 nm-约900 nm、约1 nm-约800 nm、约1 nm-约700 nm、约1 nm-约600 nm、约1 nm-约500 nm、约1 nm-约400nm、约1 nm-约300 nm、约1 nm-约200 nm、约1 nm-约100 nm、约1 nm-约75 nm、约1 nm-约50nm、约1 nm-约25 nm、约25 nm-约900 nm、约75 nm-约900 nm、约100 nm-约900 nm、约200nm-约900 nm、约300 nm-约900 nm、约400 nm-约900 nm、约500 nm-约900 nm、约600 nm-约900 nm、约700 nm-约900 nm或约800 nm-约900 nm的直径。在某些实施方案中，IO-NP可具有约200 nm-约300 nm的直径。在某些实施方案中，IO-NP可具有约185 nm-约240 nm，例如约213 nm的直径。

在某些实施方案中，本公开内容的IO-NP可具有约1 nm-约1000 nm的流体动力学直径。例如，而非限制，IO-NP可具有约10 nm-约100 nm、约15 nm-约100 nm、约20 nm-约100nm、约25 nm-约100 nm、约30 nm-约100 nm、约35 nm-约100 nm、约40 nm-约100 nm、约45nm-约100 nm、约50 nm-约100 nm、约55 nm-约100 nm、约60 nm-约100 nm、约65 nm-约100nm、约70 nm-约100 nm、约75 nm-约100 nm、约80 nm-约100 nm、约85 nm-约100 nm、约90nm-约100 nm、约95 nm-约100 nm、约5 nm-约95 nm、约5 nm-约90 nm、约5 nm-约85 nm、约5nm-约80 nm、约5 nm-约75 nm、约5 nm-约70 nm、约5 nm-约65 nm、约5 nm-约60 nm、约5nm-约55 nm、约5 nm-约50 nm、约5 nm-约45 nm、约5 nm-约40 nm、约5 nm-约35 nm、约5nm-约30 nm、约5 nm-约25 nm、约5 nm-约20 nm、约5 nm-约15 nm或约5 nm-约10 nm的流体动力学直径。在某些实施方案中，IO-NP可具有约30 nm-约50 nm的流体动力学直径。

在某些实施方案中，本公开内容的IO-NP，例如，IO-NP的核心，可掺杂金属，例如，作为金属盐。例如，而非限制，金属可为锰(Mn)、钴(Co)、镍(Ni)、镁(Mg)、锶(Sr)、钡(Ba)、钪(Sc)、钛(Ti)、钒(V)、铬(Cr)、铜(Cu)、锌(Zn)、铝(Al)、钇(Y)、锆(Zr)、铌(Nb)、钼(Mo)、钌(Ru)、铑(Rh)、钯(Pd)、铪(Hf)、钽(Ta)、钨(W)、铼(Re)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、铜(Cu)或其组合。在某些实施方案中，金属可作为盐存在，例如，但不限于，MnCl₂、CoCl₂、NiCl₂和MgCl₂。在某些实施方案中，本公开内容的IO-NP可掺杂碱土金属，例如，但不限于，钙(Ca)，例如，作为磷酸钙。在某些实施方案中，掺杂的金属可在IO-NP中(例如，在IO-NP的核心内)以约1%-约50%的重量存在，例如，约1%-约40%、约1%-约30%、约1%-约20%、约1%-约10%、约1%-约5%、约5%-约50%、约10%-约50%、约20%-约50%、约30%-约50%或约40%-约50%的重量。在某些实施方案中，掺杂金属的IO-NP可具有约0.01-约10.0 mg/ml，例如，约0.01-约9.0 mg/ml、约0.01-约8.0 mg/ml、约0.01-约7.0 mg/ml、约0.01-约6.0 mg/ml、约0.01-约5.0 mg/ml、约0.01-约4.0 mg/ml、约0.01-约3.0 mg/ml、约1.0-约2.0 mg/ml、约2.0-约10.0 mg/ml、约3.0-约10.0 mg/ml、约4.0-约10.0 mg/ml、约5.0-约10.0 mg/ml、约6.0-约10.0 mg/ml、约7.0-约10.0 mg/ml、约8.0-约10.0 mg/ml或约9.0-约10.0 mg/ml的掺杂金属浓度。在某些实施方案中，掺杂金属的IO-NP可具有约5.0-约6.0 mg/ml的掺杂金属浓度。

在某些实施方案中，本公开内容的IO-NP可缀合至一种或多种基质降解酶和/或产生过氧化物的酶。例如，而非限制，缀合至IO-NP的酶可降解生物膜基质内的组分，例如，葡聚糖和果聚糖，以产生葡萄糖和果糖，并释放H₂O₂到生物膜中。IO-NP然后可催化H₂O₂产生自由基用于基质降解和/或细菌杀灭。此外，基质降解酶可帮助降解生物膜基质。合适的酶的非限制性实例包括右旋糖酐酶、mutanase、葡萄糖/果糖/半乳糖-氧化酶及其组合。额外的基质降解酶的非限制性实例包括DNA酶、核酸酶、dispersin、糖苷水解酶、蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和葡聚糖水解酶。酶可使用本领域已知的任何技术缀合至IO-NP。在某些实施方案中，酶可使用IO-NP静电附着至酶的带电基团而缀合至IO-NP。或者或另外地，酶可使用戊二醛或碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺活化IO-NP接着交联活化的IO-NP与酶的胺基而缀合至聚合物涂覆的IO-NP。

本公开内容进一步提供包含本文所述的一种或多种IO-NP，例如，IO-NP和/或缀合至酶的IO-NP和H₂O₂的组合物。在某些实施方案中，组合物中存在的IO-NP具有聚合物涂层，例如，右旋糖酐。在某些实施方案中，组合物中存在的IO-NP不具有聚合物涂层。在某些实施方案中，组合物中存在的H₂O₂可从其它化学品如过碳酸钠产生。例如，而非限制，本公开内容的组合物可包含过碳酸钠，其继而产生H₂O₂。

在某些实施方案中，组合物可包含浓度约0.01%-约3.0% v/v的H₂O₂。在某些实施方案中，组合物可包含浓度约0.05%-约3.0%、5%、0.1%-约0.25%、约0.1%-约0.5%、约0.1%-约0.75%、约0.1%-约1.0%、约0.1%-约1.5%、约0.1%-约1.75%、约0.1%-约2.0%、约0.1%-约2.25%、约0.1%-约2.5%或约0.1%-约2.75%的H₂O₂。在某些实施方案中，一种或多种IO-NP催化H₂O₂形成一种或多种自由基，其可降解和/或消化生物膜的细胞外基质和/或杀灭细菌。例如，而非限制，一种或多种自由基可同时降解生物膜的细胞外基质和杀灭细菌。在某些实施方案中，IO-NP可催化H₂O₂产生自由基，例如，而非限制，羟基自由基(·OH)。

在某些实施方案中，本公开内容的组合物可包含尺寸(例如，直径)和组成不同的IO-NP。例如，而非限制，本公开内容的组合物可包含具有聚合物涂层的IO-NP和不具有聚合物涂层的IO-NP的混合物。在某些实施方案中，本公开内容的组合物可包含具有不同的聚合物涂层的IO-NP的混合物，例如，组合物中的一种或多种IO-NP可具有右旋糖酐涂层，并且组合物中的一种或多种IO-NP可具有修饰的右旋糖酐涂层。或者或另外地，在某些实施方案中，本公开内容的组合物可包含组成不同的IO-NP，例如，本公开内容的组合物可包含掺杂不同金属，例如Mg和/或Mn的IO-NP的混合物。

制剂和产品

目前公开的主题进一步提供掺入所公开的IO-NP组合物的制剂，例如，包含一种或多种IO-NP的组合物和/或包含一种或多种IO-NP和H₂O₂的组合物。例如，而非限制，所述制剂可包括口腔护理产品和用于将组合物递送到口腔的产品和用于将组合物递送到医疗装置、船舰材料和/或船舶或工业材料内的市售产品。在某些实施方案中，组合物可掺入用于制造医疗装置，例如，医疗管道和导管，用于制造口腔假肢，例如，义齿和植入物，和用于制造工业材料，例如，管和船体的材料中。在某些实施方案中，本公开内容的制剂可局部施用，例如，施用到慢性伤口或皮肤疾病作为治疗。在某些实施方案中，本公开内容的制剂可用作喷雾剂和/或涂料以涂覆工业材料或船体的一个或多个表面。

在某些实施方案中，本公开内容的组合物和/或制剂可包含浓度约0.01 mg/ml-约5 mg/ml，例如，约0.01 mg/ml-约4 mg/ml、约0.01 mg/ml-约3 mg/ml、约0.01 mg/ml-约2mg/ml、约0.01 mg/ml-约1 mg/ml、约0.01 mg/ml-约0.75 mg/ml、约0.01 mg/ml-约0.5 mg/ml、约0.01 mg/ml-约0.1 mg/ml、约0.01 mg/ml-约0.05 mg/ml、约0.05 mg/ml-约5 mg/ml、约0.1 mg/ml-约5 mg/ml、约0.5 mg/ml-约5 mg/ml、约1 mg/ml-约5 mg/ml、约2 mg/ml-约5mg/ml、约3 mg/ml-约5 mg/ml或约4 mg/ml-约5 mg/ml的如上文所公开的IO-NP。在某些实施方案中，本公开内容的制剂和/或组合物可包含浓度约0.5 mg/ml的IO-NP。

在某些实施方案中，本公开内容的制剂可包含如上所公开的组合物和氟化物，例如，氟化钠。在某些实施方案中，氟化物可以以浓度约百万分之10 (10 ppm)-约5,000 ppm，例如，约100 ppm-约4,500 ppm、约100 ppm-约4,000 ppm、约100 ppm-约3,500 ppm、约100ppm-约3,000 ppm、约100 ppm-约2,500 ppm、约100 ppm-约2,000 ppm、约100 ppm-约1,500ppm、约100 ppm-约1,000 ppm、约100 ppm-约500 ppm或约200 ppm-约400 ppm存在于本公开内容的制剂中。在某些实施方案中，氟化物以浓度约200 ppm-约300 ppm，例如，约250ppm存在。在某些实施方案中，氟化物以浓度约5,000 ppm存在。

在某些实施方案中，本公开内容的IO-NP组合物，例如，包含一种或多种缀合至酶的IO-NP的组合物，可掺入用于将组合物递送到口腔的制剂中。例如，而非限制，组合物可掺入液体或凝胶制剂、喷雾剂中。在某些实施方案中，液体制剂可包含载体例如，但不限于，盐水、右旋糖、水、等渗盐水、油例如植物油或矿物油、油酯和醇例如乙醇。在某些实施方案中，液体制剂可进一步包含一种或多种额外的组分，包括悬浮剂、分散剂或润湿剂、乳化剂、缓和剂、防腐剂、缓冲剂、盐、调料、着色剂、甜味剂和增稠剂。在某些实施方案中，本公开内容的IO-NP组合物可掺入口腔护理产品中。口腔护理产品的非限制性实例包括牙膏、口腔清洗剂、牙齿增白产品、研磨洁齿剂凝胶、义齿洗涤剂、非研磨洁齿剂凝胶、义齿洗涤剂或浸泡剂、义齿粘附剂或粘合剂、凝胶、乳剂、涂剂、修复材料(例如，陶瓷、树脂等)、补牙材料、口腔凝胶-条产品、口香糖、糖果和饮料。意在用于口腔用途的制剂可按照本领域已知的任何方法制备。

在某些实施方案中，本公开内容的IO-NP组合物可掺入用于将组合物递送到医疗装置或工业材料的制剂中。例如，组合物可掺入如上所公开的液体制剂中。在某些实施方案中，组合物可掺入润滑剂、软膏剂、乳膏或凝胶中，其包含具有不同pH值和离子强度的稀释剂(例如，Tris、柠檬酸盐、乙酸盐或磷酸盐缓冲液)、增溶剂例如Tween™或聚山梨醇酯、防腐剂例如硫柳汞、对羟基苯甲酸酯、苯扎氯铵或苯甲醇、抗氧化剂例如抗坏血酸或偏亚硫酸钠和其它组分例如赖氨酸或甘氨酸。或者或另外地，导管或医疗管道材料可浸渍本公开内容的IO-NP组合物用于预防导管或管道的表面上和/或导管或管道内形成生物膜。

使用方法

目前公开的主题进一步提供用于使用所公开的组合物和/或制剂的方法。本公开内容的方法可用于治疗和/或预防生物膜和/或生物膜相关感染。例如，而非限制，给予本公开内容的组合物或制剂可用于抑制形成生物膜、抑制进一步累积生物膜、促进破坏或分解现有生物膜和/或减弱现有生物膜。例如，而非限制，本公开内容的组合物和/或制剂可用于治疗促进口腔疾病的生物膜。口腔疾病可包括，但不限于，影响口腔的疾病和病症或相关医疗病况。例如，口腔疾病包括，但不限于，龋齿，以及牙周疾病，例如牙龈炎、成人牙周炎、早发牙周炎、种植体周围炎和牙髓感染。

在某些实施方案中，本公开内容的组合物或制剂可用于治疗和/或预防生物膜相关粘膜感染，包括，例如，义齿性口炎和口腔念珠菌病。在某些实施方案中，所公开主题的方法可用于治疗和/或预防疾病或病症，例如，生物膜相关疾病，包括，但不限于，龋齿、粘膜感染、口腔疾病、泌尿道感染、导管感染、中耳感染、伤口、植入的医疗装置例如人工关节和人工瓣膜感染和人类感染。

如本文所使用的，“治疗(treatment)”(和其语法变体例如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指临床干预，试图改变治疗个体的自然进程，并且可用于预防或在疾病进程期间实施。治疗的期需效果包括，但不限于，预防疾病出现或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、降低疾病进展速率或改善疾病状态。在某些实施方案中，本公开内容的组合物和制剂可用于延迟疾病发展或减缓疾病进展。在某些实施方案中，治疗可指消除、移除和/或减少现有生物膜。在某些实施方案中，预防可指阻碍生物膜在表面上起始或形成。

“个体”、“患者”或“受试者”在本文中可互换使用，指哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，驯养动物(例如，奶牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类例如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者为人。

在某些实施方案中，用于在受试者中预防和治疗口腔疾病和/或预防和处理生物膜的方法可包括给予受试者有效量的本公开内容的组合物和/或制剂。在某些实施方案中，所述方法包括给予受试者包含IO-NP和/或缀合至酶的IO-NP的组合物或制剂。在某些实施方案中，本公开内容的组合物和/或制剂可以短时间间隔给予受试者，例如，但不限于，小于约10分钟、小于约9分钟、小于约8分钟、小于约7分钟、小于约6分钟、小于约5分钟、小于约4分钟、小于约3分钟、小于约2分钟或小于约1分钟的时间段。

“有效量”，如本文所使用的，指以必需的剂量并且持续必需的时间段，有效达到期需治疗或预防结果的量。对于预防或治疗疾病，适当量，例如，有效量的本公开内容的组合物或制剂将会取决于待治疗或预防的疾病类型以及疾病的严重性和进程。剂量方案可进行调整以提供最佳治疗响应

在某些实施方案中，所述方法可进一步包括给予受试者过氧化氢，例如，通过给予包含过氧化氢的溶液。或者或另外地，过氧化氢可存在于包含IO-NP的组合物和/或制剂中。例如，而非限制，过氧化氢可使用过碳酸钠配制在凝胶样产品，例如，牙膏中，其中凝胶样产品进一步包含一种或多种IO-NP。在某些实施方案中，过碳酸钠可存在于组合物和/或制剂中以在水存在下或当放置在口中时释放过氧化氢。这样的组合物和/或制剂可允许当接触水溶液或放置在口中时从组合物和/或制剂释放过氧化氢，从而允许过氧化氢和IO-NP之间的反应原位发生。

在某些实施方案中，溶液、组合物和/或制剂可包含浓度约0.1%-约0.25%、约0.1%-约0.5%、约0.1%-约0.75%、约0.1%-约1.0%、约0.1%-约1.5%、约0.1%-约1.75%、约0.1%-约2.0%、约0.1%-约2.25%、约0.1%-约2.5%、约0.1%-约2.75%或约0.1%-约3.0%的过氧化氢。在某些实施方案中，溶液、组合物和/或制剂可包含浓度约0.1%-约1.0%的过氧化氢。在某些实施方案中，溶液、组合物和/或制剂可包含浓度约0.1%-约0.5%的过氧化氢。

在某些实施方案中，所述方法可进一步包括给予有效量的氟化物。在某些实施方案中，氟化物可存在于包含IO-NP和/或过氧化氢的组合物和/或制剂中。例如，而非限制，氟化物可配制在凝胶样产品中，如上文所公开的，其中凝胶样产品进一步包含一种或多种IO-NP和/或过氧化氢。在某些实施方案中，氟化物可以以浓度约百万分之10 (10 ppm)-约10,000 ppm，例如约5,000 ppm存在于本公开内容的组合物和/或制剂中。

在某些实施方案中，本公开内容的组合物或制剂可一次或通过一系列治疗给予受试者。在某些实施方案中，若干分开的剂量可每日给予或剂量可按比例减少，如治疗情况的紧急状态所需要的。例如，而非限制，本文所公开的组合物和制剂可每日两次、每日一次、每两日一次、每三日一次、每四日一次、每五日一次、每六日一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两月一次、每三月一次、每六月一次或每年一次给予受试者。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或制剂，例如，包含一种或多种IO-NP和/或一种或多种缀合至基质降解酶和/或产生过氧化物的酶的IO-NP的组合物，可每日两次给予受试者。在某些实施方案中，包含一种或多种IO-NP的组合物，例如，在口腔清洗制剂中，可每日一次或两次给予受试者，接着每日一次或两次、每两日一次、每三日一次、每四日一次、每五日一次、每六日一次或每周一次给予H₂O₂。在某些实施方案中，包含一种或多种IO-NP和过碳酸钠(继而产生H₂O₂)的组合物可以，例如，以基于凝胶的制剂，每日一次或两次、每两日一次、每三日一次、每四日一次、每五日一次、每六日一次或每周一次给予受试者。

本公开内容进一步提供用于预防生物膜中的细菌生长的方法。在某些实施方案中，这样的方法可包括使具有生物膜的表面接触有效量的本文所公开的包含一种或多种铁纳米粒子的组合物和/或制剂。在某些实施方案中，所述一种或多种铁纳米粒子结合到表面并释放铁以抑制生物膜内的细菌生长。

本公开内容进一步提供用于预防表面上形成生物膜的方法。在某些实施方案中，用于预防表面上形成生物膜的方法可包括用有效量的本文所公开的包含一种或多种铁纳米粒子的组合物和/或制剂处理“有风险”发展生物膜的表面。在某些实施方案中，所述方法可进一步包括使“有风险”的表面接触H₂O₂。例如，而非限制，有效量的本文所公开的包含一种或多种铁纳米粒子的组合物和/或制剂可，例如，通过喷雾或涂敷，涂覆在表面上。“有风险”发展生物膜的表面包括，但不限于，磷灰石表面(例如，骨和牙齿表面)、牙髓管、植入物表面、医疗装置表面(例如，导管和器械)以及工业和船舰表面，例如，管和船体表面。在某些实施方案中，所述表面可为医疗装置和工业和/或船舰材料的内部和/或外部表面。

目前公开的主题进一步提供用于预防牙齿去矿化的方法。在某些实施方案中，用于预防去矿化的方法可包括使具有生物膜的牙釉质或磷灰石(例如，骨)表面接触有效量的包含一种或多种铁纳米粒子的组合物。在某些实施方案中，一种或多种铁纳米粒子结合到表面以抑制和/或预防釉质或磷灰石溶解。

目前公开的主题进一步提供用于处理和消除医疗装置或工业和/或船舰材料表面上的生物膜和/或预防医疗装置或工业和/或船舰材料表面上形成生物膜的方法。在某些实施方案中，所述方法可包括使医疗装置，例如，导管、植入物、人工关节、管道、任何植入的装置，或工业和/或船舰材料，例如，管、容器、反应器、涡轮机或船体接触本文所公开的组合物或制剂。在某些实施方案中，所述方法可包括使医疗装置或工业材料的表面接触包含IO-NP或缀合至酶的IO-NP的组合物或制剂。在某些实施方案中，所述方法可进一步包括使医疗装置或工业材料的表面接触H₂O₂。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或制剂可掺入用于制造医疗装置或工业和/或船舰材料的材料中以预防、最小化和/或减少医疗装置或工业和/或船舰材料的表面上形成生物膜。

试剂盒

目前公开的主题进一步提供用于如上所述的处理和/或预防生物膜的试剂盒。例如，而非限制，本公开内容的试剂盒可包含一种或多种本文公开的组合物或制剂，例如，在一个或多个容器中。

在某些实施方案中，所述试剂盒可包括包含一种或多种本文所描述的组合物或制剂的容器和容器上或与容器关联的标签或包装说明书(package insert)。在某些实施方案中，目前公开主题的试剂盒可包括包含目前公开主题的IO-NP组合物或制剂的容器。在某些实施方案中，目前公开的主题的试剂盒可包括包含目前公开主题的IO-NP组合物或制剂的第一容器和包含过氧化氢的第二容器。在某些实施方案中，所述试剂盒可进一步包括使用说明书，例如给药方案。合适的容器的非限制性实例包括瓶、小瓶、溶液袋等。容器可从多种材料形成，例如玻璃或塑料。

提供下列实施例以更全面说明本发明，但不解释为对其范围的限制。

实施例1

生物膜随着微生物在表面上积聚而发展，形成包裹在细胞外基质中的有结构的群落，细胞外基质包括聚合物例如表多糖(EPS)。细胞外基质在生物膜中建立空间和微环境异质性并提供扩散限制障碍，从而调节病原体生长和保护病原体免于局部抗微生物剂。因此，基质本质上妨碍药物治疗生物膜和生物膜相关疾病的功效。

在复杂的口腔微生物组(microbiome)内，变形链球菌(S. mutans)不一定是最丰富的生物。然而，当频繁暴露于蔗糖时，变形链球菌可经由表膜上和细菌表面上EPS合成在表膜涂覆的牙齿上迅速配合形成生龋生物膜。原位形成的EPS促进牙齿上局部聚集微生物，同时形成空间异质的和限制扩散的基质。并行地，糖由埋在基质中的细菌发酵，这建立强酸性微环境(图1)。低pH小环境诱导EPS合成，同时生龋的(耐酸和生酸的)菌群繁盛。结果是，局部酸性确保连续的生物膜增长和酸溶解邻近的牙釉质，导致开始龋齿。另外，局部细菌簇(由细胞外基质描绘)变得对抗微生物剂顽抗，使生物膜消除极其困难。这些过程代表其它生物膜和相关感染，因为基质建立保护性和引起疾病的环境，同时妨碍药物功效。

为了有效消除生物膜和微生物，例如，陷入EPS细胞外基质中的微生物，抗生物膜剂将需要在酸性环境中局部保留并破坏基质组装、降解现有基质和/或靶向包埋的细菌。同时，酸溶解釉质应局部阻断。本实施例公开了包含铁氧化物纳米粒子(IO-NP；本文也称为MNP和CAT-NP)的抗生物膜剂，其具有仿生性质例如过氧化物酶样活性(Gao等人, Nature Nanotech, 2007)，以消除致病性口腔生物膜。IO-NP在许多生物医学和绿色化学领域已经受到更多的关注，这是因为其纳米催化性质、生物活性和安全性。此外，IO-NP为经济的(低成本并且容易生产)和环境安全的(Hudson等人, Green Chemistry, 2014)，并且也是最早受FDA批准用于临床应用的纳米材料之一。

本实施例的抗生物膜组合物使用生物相容的具有仿生(催化)和pH响应性质的IO-NP，其协同H₂O₂有效破坏生龋生物膜，并提供令人兴奋的和创新的用于使用IO-NP组合H₂O₂消除生物膜的方法，其能够在低pH分解EPS细胞外基质和有效杀灭生物膜内的细菌(图1和图2)。

IO-NP可使用容易可得的材料通过简单和适合的方法合成，其可以以非常低的成本按比例放大。IO-NP通过水热法如先前所描述的(Gao等人, Nanoscale, 2014)产生。简言之，可将氯化铁(FeCl₃)和乙酸钠在高压釜反应器中混合入乙二醇中并在200℃孵育一定时间。然后收集产生的IO-NP用于进一步的应用。图3显示通过上文公开的方法产生的IO-NP，如在透射电镜(TEM)下可视化的。

为了检验IO-NP组合H₂O₂的功效，成熟生物膜使用变形链球菌(已确立的生物膜形成、生酸和基质产生的口腔病原体)在唾液涂覆的羟基磷灰石(sHA)表面(牙釉质-样材料)上形成。以每天两次短暂暴露(1或5 min)进行局部施用低pH (4.5-6.5)的IO-NP组合低剂量的H₂O₂ (≤0.5%)，以模拟潜在的临床治疗方案。IO-NP能够有效结合sHA并保留在生物膜内，尽管短暂局部暴露(图4)。

如图5A中所示，局部施用IO-NP组合H₂O₂显示相对于对照异常优越地杀灭包埋在生物膜中的变形链球菌(>6-log减少)，相对于单独的H₂O₂ >4‐log减少，几乎完全消除有活力的细菌群体。另外，IO-NP组合H₂O₂还可显著增加细胞外葡聚糖(生龋生物膜基质中主要的EPS组分)的降解(图5B)，这可有效破坏生物膜的结构完整性(Xiao等人, PLoS Pathog,2012)。这些数据证明IO-NP显著增强H₂O₂ (便宜和容易可得的“绿色化学品”，广泛用于许多临床应用中)的抗微生物功效和抗生物膜活性的潜能。

除了在低pH时有效，IO-NP还具有在低pH时抑制培养基中的细菌活力的能力。如图6A中所示，与中性pH时的细菌生长相比，在酸性pH (pH 5)使用IO-NP，变形链球菌生长明显受到抑制。此外，在低pH (pH 4.5)时在生理温度(37℃)铁从IO-NP释放(图6B)，这可解释酸性pH时IO-NP抑制细菌生长的机制。此外，并且如图6C中所示，IO-NP催化H₂O₂以显著增加自由基产生(图6C)。这些数据提供证据，表明在致病性口腔生物膜中存在的酸性微环境下IO-NP组合H₂O₂可产生自由基。

如图7中所示，IO-NP还可同时阻断羟基磷灰石(HA)珠的酸溶解。与未处理的HA珠相比，在酸性缓冲液中孵育之后HA珠几乎完全溶解(图7A-B)。与其形成鲜明对比，在IO-NP存在下HA珠的酸溶解大大受损，这显示使用公开的抗生物膜组合物预防牙釉质去矿化的潜能(图7C)。这些数据显示公开的抗生物膜组合物可为理想的抗生物膜/抗龋治疗方法。其整合综合的多功能策略，这促进基质破坏和在生物膜内具有抗细菌作用，同时防止在酸性微环境下去矿化。不受具体理论限制，所述抗生物膜剂包括五个生物学特征：(1) IO‐NP (即，MNP)有效结合到牙齿表膜(有风险形成生物膜的表面)，并保留在生物膜内，即使在短暂的局部暴露后；(2) IO‐NP为pH响应的，在酸性pH时释放抑制细菌生长的铁；(3) IO-NP催化H₂O₂产生有效降解基质组分的自由基；(4) IO-NP可迅速杀灭包埋在生物膜内的细菌；和(5)预防磷灰石去矿化(图1)。

公开的IO-NP-H₂O₂方法可提供格外有效的用于生物膜消除的策略。IO-NP可比目前的化学方式更有利和有效控制致病性口腔生物膜。首先，IO-NP可结合并保留在生物膜内，即使在短暂局部暴露之后。第二，IO-NP可迅速催化低剂量H₂O₂ (0.1‐0.5%)产生自由基，这增强生物膜基质破坏和包埋细菌的杀灭功效，并且可有效减少临床治疗中通常使用的H₂O₂的量(多达10%)。第三，其为pH响应过程，其中IO-NP启动的生物活性在酸性条件下特别有效，这正是最需要的。第四，其可减少羟基磷灰石的酸溶解，这对于预防牙釉质和骨去矿化至关重要。此外，IO-NP可增强从牙齿表面去污，这是因为H₂O₂原位催化。由于IO-NP和H₂O₂为FDA批准的和可持续的材料，可以容易地以非常低的成本大规模合成，IO-NP可掺入各种口腔护理产品中，包括牙膏或漱口水。IO-NP-H₂O₂的使用还具有广泛的适用性，因为细胞外基质和微生物杀灭的抗性是大部分，如果并非所有，与其它人类疾病以及工业相关问题有关的生物膜所固有的。

实施例2

由于容易进入口中，口腔生物膜用作优异的模型探索用于生物膜控制的新概念。牙齿上形成的致病性生物膜为有毒物种，例如变形链球菌，如何在富含EPS的基质的整个发展过程中积聚和存留在表面上的实例(Koo等人, J Dent Res, 2013)。包埋在基质中的病原体产生强酸性微环境，pH值接近4.5，这引起酸溶解釉质-磷灰石并且可导致牙齿-腐烂过程(称为龋齿的疾病)开始和进展(Koo等人, J Dent Res, 2013; Fejerskov等人, J Dent Res, 1992)。通过使用模拟这些病理学状况的实验模型，本实施例证明催化纳米粒子(CAT-NP)的抗生物膜机制和CAT-NP活化H₂O₂的有效性。本实施例进一步显示CAT-NP组合H₂O₂预防生物膜相关口腔疾病发展的有效性。

铁纳米粒子在生物膜内有效保留和铁纳米粒子的原位活性可在铁纳米粒子的体内生物学功效中发挥作用(Hannig和Hannig, Nature Nanotechnol, 2010; Allaker和Memarzadeh, Int J. Antimicrob Agents, 2014)。为了检查CAT-NP在用短期暴露(5或10min)局部处理之后是否保留在生物膜内，进行下列实验。CAT-NP通过如下所述的溶剂热法合成(也参见，Gao等人, Nat Nanotechnol, 2007; Deng等人, Angew Chem Int Edit,2005)。该方法产生具有直径213 ± 26 nm和固有过氧化物酶样活性的纳米粒子(图8)。简言之，将0.82 g FeCl₃溶解在40 mL乙二醇中以形成澄清溶液。然后，将3.6 g NaAc加入溶液中，剧烈搅拌30 min。然后将混合物转移至50 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中并在200℃孵育12 h。冷却至室温后，收集沉淀，用乙醇漂洗几次，然后在60℃干燥3 h。将合成的纳米粒子使用扫描电镜术(SEM; Philips XL-30 field, 15 kV)和透射电镜术(TEM,HITACHI H7650, 120 kV)表征。铁纳米粒子的过氧化物酶样活性在包含20 μg CAT-NP的500 μl NaOAc缓冲液(0.1 M, pH 4.5)、1% H₂O₂和100 μg TMB的混合物中检验。产生的蓝色用分光光度计在652 nm吸光度处记录。这些条件也用于测定生物膜上的CAT-NP活性。两个额外的底物，3,3’-二氨基联苯胺(DAB)和AMPLEX® UltraRed (Thermo-FisherScientific; 568/581 nm)也在相同的反应条件下使用以确认CAT-NP的活性。化学品和材料由Sigma-Aldrich提供，除非另有说明。

生物膜使用变形链球菌(已确立的生物膜形成、生酸和基质产生的口腔病原体)在唾液涂覆的羟基磷灰石(sHA)表面(牙釉质样材料)上形成(图9)。羟基磷灰石盘(表面区域，2.7±0.2 cm²)购自Clarkson Chromatography，细菌菌株，变形链球菌UA159，购自ATCC。生物膜方法基于唾液涂覆的羟基磷灰石(sHA)盘模型(参见Xiao等人, PLoS Pathog. 2012;Klein等人,J Vis Exp. 2011; Falsetta等人, Infect Immun., 2014; Koo等人, J Bacteriol, 2010; Koo等人, J Antimicrob Chemother, 2003)。羟基磷灰石盘用过滤除菌的澄清的全唾液涂覆并使用定制的线盘架(wire disc holder)垂直悬浮在24孔板中(图9)，这设计为模拟牙齿的自由光滑表面(Klein等人,J Vis Exp. 2011)。变形链球菌UA159细胞在超滤的(10-kDa截留; Millipore, Billerica, MA)包含1%蔗糖的胰蛋白胨-酵母提取物(UFYTE)肉汤中在37℃和5% CO₂下生长至指数中期。将每一sHA盘放置在2.8 ml包含定义的变形链球菌微生物群体(10⁵ CFU/ml)的接种物且含1% (w/v)蔗糖的UFYTE培养基中，在37℃和5% CO₂下孵育19 h。培养基用新鲜培养基每日更换两次(在19 h和29 h时)，直至实验期结束(43 h)。在特定时间点(19 h、29 h和43 h)收集生物膜并通过共焦荧光成像、微生物和生化分析手段分析(Xiao等人, PLoS Pathog. 2012; Klein等人,J Vis Exp.2011; Falsetta等人, Infect Immun., 2014; Koo等人, J Bacteriol, 2010; Koo等人,JAntimicrob Chemother, 2003)。

为了模拟致病情况，生物膜在蔗糖存在下形成，这为表多糖(EPS)合成和酸产生(在该生物膜模型中pH值达到4.5-5.0，与人类患病部位的斑块pH一致)提供底物(Koo等人,J Dent Res. 2013)。扫描电镜术(图10A1)、能量色散谱(EDS) (图10A2)和电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES) (图10B)均证明CAT-NP结合到生物膜。CAT-NP与生物膜的最大结合在浓度0.5 mg/mL时达到(图10B)。

结合在生物膜内的CAT-NP的定量评估用电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)进行。简言之，将生物膜用在0.1 M NaOAc (pH 4.5)中的CAT-NP (0、0.125、0.25、0.5、1或2mg/ml)在室温在特定时间点处理5或10 min (图9)。将生物膜从sHA盘移除并经由标准水浴超声接着探针超声 (Xiao等人, PLoS Pathog, 2012) 均质化。将悬浮液离心并将生物膜沉淀用水洗涤两次以去除未结合的材料。然后将沉淀用250 µl王水(HC1/HNO₃=3:1)在60^oC过夜溶解(Naha等人, J Mater. Chem. Biol. Med., 2014)。然后，将4.75 ml Milli-Q水加入，样品通过ICP-OES分析铁含量。在分开的实验中，将完整生物膜用环境SEM检查，铁的量经由能量色散谱(EDS)在同一SEM上分析。

为了测定CAT-NP在完整生物膜3D结构内的保留和空间分布，使用多光子共焦显微术和计算分析(Xiao等人, PLoS Pathog. 2012; Klein等人, J Vis Exp, 2011; Koo等人, J Bacteriol, 2010)。表多糖(EPS) (红色)使用1 µM Alexa Fluor 647-标记的右旋糖酐缀合物(10 kDa; 647/668 nm; Molecular Probes Inc., Invitrogen Corp.,Carlsbad, CA, USA)标记，细菌细胞(绿色)用2.5 µM SYTO 9 (485/498 nm; MolecularProbes Inc.)染色。CAT-NP (白色)经由其固有的非线性光学性质使用多光子共焦显微术检测(Xiao等人, PLoS Pathog, 2012; Klein等人, J Vis Exp, 2011; Liao等人, Adv Funct Mater,2013; Koo等人, J Bacteriol, 2010; Liao等人, Adv Funct Mater,2013)。成像使用带有20× LPlan N (1.05数值孔径)水浸物镜的Leica SP5多光子共焦显微镜进行。激发波长为780 nm，用于检测SYTO 9的发射波长滤波器为495/540 OlyMPFC1滤波器，而用于检测Alexa Fluor 647的滤波器为HQ655/40M-2P滤波器。用于CAT-NP的激发波长为910 nm，其不激发SYTO 9或Alexa Fluor 647。共焦图像使用软件分析用于同时可视化和定量完整生物膜内的EPS、细菌细胞和CAT-NP。Amira 5.0.2软件平台(Mercury ComputerSystems Inc., Chelmsford, MS)用于建立生物膜内每一组分(EPS、细菌和CAT-NP)的3D重现用于可视化3D结构。COMSTAT和ImageJ用于定量分析，如以前所描述的(Xiao等人, PLoS Pathog. 2012; Klein等人,J Vis Exp. 2011; Koo等人, J Bacteriol, 2010)。

如图10C中所示，原位成像显示局部处理后CAT-NP有效保留在生物膜结构各处。跨生物膜厚度(从顶部至底部)的定量分析显示大多数纳米粒子存在于深度25-150 µm,，在该处EPS和细菌生物质二者均最丰富(图10D)。

为了研究粘附到生物膜的CAT-NP是否能够在酸性pH (pH 4.5)迅速催化H₂O₂原位产生自由基，使用用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)的比色法(Gao等人, Nat Nanotechnol. 2007)。结合到生物膜的纳米粒子在H₂O₂存在下催化TMB (用作过氧化物酶底物)反应产生蓝色(图10E)，这是自由基产生的结果。蓝色在652 nm具有最大吸光度。实验使用额外的过氧化物酶底物(重氮氨基苯)重复，以进一步确认CAT-NP处理的生物膜中过氧化物酶样活性的存在(图11)。

与生物膜内吸附的CAT-NP的量一致，在检验条件下最高的催化活性在浓度0.5-2.0 mg/ml达到(图10E)。通过CAT-NP的H₂O₂催化依赖pH (Gao等人, Nat Nanotechnol,2007)；因此，生物膜-结合的CAT-NP的过氧化物酶样活性在具有pH值4.5-6.5的缓冲液中测量。如图10F中所示，粘附到生物膜的CAT-NP在酸性pH (4.5-5.5)发挥更大的催化效率，与病理学状况下存在的pH值一致(Mercier等人, J Antimicrob Chemother, 2002; Poschet等人 Trends Mol Med, 2002; Fejerskov等人, J Dent Res, 1992)。这些数据显示短暂局部施用之后CAT-NP保留在生物膜内并且显示pH响应的原位H₂O₂催化。

为了研究CAT-NP介导的原位H₂O₂催化和自由基产生是否可杀灭包埋的细菌和降解生物膜内的EPS基质，进行下列实验。为了评估CAT-NP/ H₂O₂组合的抗生物膜功效，准备了四种处理：对照(0.1 M NaOAc, pH 4.5)，单独的CAT-NP (在0.1 M NaOAc, pH 4.5中，0.5mg/ml)，1% H₂O₂ (0.1 M NaOAc, pH 4.5)，CAT-NP + H₂O₂ (在0.1 M NaOAc, pH 4.5中，0.5 mg/ml CAT-NP，1% H₂O₂)。将用CAT-NP (0.5 mg/ml)处理的生物膜立即暴露于H₂O₂(0.1-1%, v/v)并测定活细胞数目和EPS含量(图13A和图14)。

将sHA盘和生物膜用每一溶液局部处理5或10 min，用无菌盐水(0.89% NaCl)洗涤3次以去除未结合的材料，然后转移至培养基中(图9)。第一次处理在唾液表膜形成(sHA)后直接施用，然后将处理的sHA盘转移至包含变形链球菌(10⁵ CFU/ml)的培养基中。让生物膜在sHA盘上形成6 h，在该点施用第二次处理。次日，将生物膜每日处理两次(在19 h和29h)。实验期结束时(43 h)，每一生物膜中活细胞的总数通过计数形成的集落数目评估(Koo等人, J Bacteriol, 2010; Klein等人, J Vis Exp, 2011; Koo等人, J Antimicrob Chemother, 2003)。对于CFU和干重评估，将生物膜从sHA盘移除并经由不杀灭细菌细胞的标准超声均质化，同时提供最大可恢复的活菌计数。将均质化生物膜悬浮液的等分试样连续稀释并铺在血液琼脂平板上，48 h孵育后，将集落目测计数。将剩余的生物膜悬浮液用Milli-Q H₂O洗涤两次，烘干(至预先称重的箔舟皿中) 2 h并称重。

如图13A和图14中所示，存在格外强的对生物膜内变形链球菌的杀生物作用，在5分钟内杀灭>99.9%的细菌。CAT-NP组合1% H₂O₂暴露导致与对照生物膜或无H₂O₂ CAT-NP-处理的生物膜相比活细胞数目>5-log减少(图13A)。如图13A中所示，CAT-NP和H₂O₂组合在杀灭变形链球菌中比单独H₂O₂>5,000-倍更有效，表明CAT-NP和H₂O₂之间明显的协同作用以加强试剂的杀灭功效。

考虑到从H₂O₂催化产生的自由基也可体外降解多糖(Gao等人, Nanoscale,2014)，在暴露于H₂O₂之后分析CAT-NP-处理的生物膜中的EPS的量。对于评估EPS降解，将100µg由纯化的葡糖基转移酶(GtfB或GtfD) (Koo等人, Antimicrob Agents Chemother,2002)产生的(不可溶或可溶的)葡聚糖与每一处理溶液(在0.1 M NaOAc, pH 4.5中)混合，并在37℃孵育30 min。葡聚糖如下制造。将每一Gtf酶(10 U)与蔗糖底物缓冲液(100 m蔗糖、20 µM右旋糖酐9,000、50 mM KCl、1.0 mM KPO₄、1.0 mM CaCl₂和0.1 mM MgCl₂, pH6.5)混合，并在37℃孵育4 h。孵育后，将产生的葡聚糖通过离心收集，洗涤，总量通过标准苯酚-硫酸比色测定法(Koo等人, J Antimicrob Chemother, 2003; Koo等人,Antimicrob Agents Chemother, 2002)测定。将100 μg葡聚糖与每一处理溶液混合(总反应体积300 µl，在0.1 M NaOAc, pH 4.5中)，并在37℃振动孵育30 min。孵育后，还原糖的量通过Somogyi-Nelson比色测定法测定。

如图13B中所示，与对照相比或与用单独H₂O₂或CAT-NP处理相比，不可溶的和，较小程度，可溶的EPS的量在CAT-NP和H₂O₂的存在下显著减少。不可溶的EPS主要由α1,3-连接的葡聚糖构成，而可溶的EPS大部分为α1,6-连接的葡聚糖，二者均产生(Bowen和Koo, Caries Res, 2011)。因此，进行进一步分析以测定由GtfB (其合成α1,3-连接的葡聚糖)和GtfD (α1,6-连接的葡聚糖)产生的纯化的细胞外葡聚糖在用CAT-NP在H₂O₂存在或不存在下孵育之后是否降解。图13C显示两种葡聚糖(特别是来自GtfB的)均被分解，如通过测量CAT-NP/H₂O₂处理之后从多糖释放的葡萄糖的量所测定的。相反，单独的H₂O₂或单独的CAT-NP未能切割任一葡聚糖，该观察结果与其未能减少生物膜内的EPS一致。不可溶EPS的降解高度有关，因为葡聚糖或可比的多糖在其它生物膜中形成许多基质的核心(Flemming和Wingender, Nat Rev Microbiol, 2010; Koo等人, J Dent Res. 2013)，并且与龋齿和其它生物膜相关疾病有关(Hall-Stoodley等人, Nat Rev Microbiol, 2004; Flemming和Wingender, Nat Rev Microbiol, 2010; Lebeaux等人, Microbiol Mol Biol Rev, 2014; Koo等人, J Dent Res, 2013; Bowen和Koo, Caries Res, 2011)。总而言之，体外数据提示CAT-NP与H₂O₂组合可显著抑制有毒的生物膜。

由于显示CAT-NP保留在生物膜内并且原位催化H₂O₂用于增强生物膜破坏，开发了临床可行的组合疗法，其包括用CAT-NP (0.5 mg/ml)局部处理立即接着H₂O₂ (1%, w/v)暴露(CAT-NP/H₂O₂)，每天两次。该治疗方案最初在体外检验以评估生物膜是否可被CAT-NP组合H₂O₂破坏。共焦显微术成像显示用CAT-NP/H₂O₂处理损伤细菌细胞(绿色)聚集和EPS基质(红色)发展二者(图13D和图15)。相反，用单独的CAT-NP或H₂O₂局部处理在体外具有有限的抗生物膜作用，与当这些试剂组合使用时的协同增强一致。

实施例3

为了检验CAT-NP/H₂O₂的体内功效和测定CAT-NP/H₂O₂是否可在体内抑制龋齿的起始和严重性，使用啮齿动物疾病模型(Bowen, Odontology, 2013; Falsetta等人, Infect Immun, 2014; Horev等人, ACS Nano, 2015)。

简言之，动物实验在建立好的啮齿动物龋齿模型上进行(Bowen, Odontology,2013; Falsetta等人, Infect Immun, 2014; Horev, ACS Nano, 2015; Koo等人, J Dent Res, 2005)。简言之，15天大的Sprague-Dawley大鼠连同其母鼠购自HarlanLaboratories (Madison, WI, USA)并筛查变形链球菌感染。将接种前感染变形链球菌的任何动物从研究中去除。然后将动物使用活跃生长(对数中期)的变形链球菌UA159培养物口腔感染，其感染经由口腔擦拭检查。将感染的动物随机放置到四个处理组(12动物/组)，并将其牙齿使用定制的涂药器每天两次局部处理。处理组包括：(1) 对照(0.1 M NaOAc,pH 4.5)，(2) 单独的CAT-NP (在0.1 M NaOAc, pH 4.5中，0.5 mg/ml)，(3) 1% H₂O₂ (0.1M NaOAc, pH 4.5)，(4) CAT-NP + H₂O₂ (在0.1 M NaOAc, pH 4.5中，0.5 mg/ml CAT-NP连同1% H₂O₂)。将试剂每天两次局部施用(口腔递送；每只大鼠100 µL)持续3周，短暂暴露(30s)以模拟临床使用。

向每一组提供国立卫生研究院致龋膳食2000和随意提供5%蔗糖水。实验进行3周。所有动物每周称重，并每天记录其身体外观。在实验期间实验组之间所有动物获得相等重量并保持身体健康。实验期结束时，将动物处死并将颚手术移除和解剖。将所有颚去皮肉，并制备牙齿用于根据Larson修改的Keyes系统疾病龋评分(参见Larson, Animal models in cariology: symposium and workshop proceedings special supplement of microbiology abstracts, 1981; Bowen, Odontology, 2013; Falsetta等人, Infect Immun, 2014; Horev, ACS Nano, 2015)。确定整理的颚的龋分数由一个标准化的检查员进行。此外，将牙龈和腭组织二者收集并处理用于苏木精和伊红(HE)染色用于组织病理学分析。

在该动物模型中，牙齿渐进地发展龋损伤(类似于在人类中观察到的那些)，从初始的釉质去矿化区域(图16A，绿色箭头)进行至进一步的毁坏(蓝色箭头)，导致最严重的以空腔化为特征的损伤(红色箭头)。CAT-NP/H₂O₂处理对龋发展的作用引人注目。定量龋评分分析显示CAT-NP/H₂O₂显著减弱损伤的起始和严重性二者(vs. 溶媒对照；图16B)并完全阻断广泛的釉质损伤，从而预防空腔化起始。与之形成鲜明对比，用单独的H₂O₂处理没有显著作用，而用单独的CAT-NP处理显示龋损伤严重性的一些减少(vs. 溶媒对照；图16A和16B)。CAT-NP/H₂O₂的优异的止龋作用提供强有力的在临床相关模型中体内功效证据。另外，在接受CAT-NP/H₂O₂局部施用的大鼠上未观察到有害作用。具体地，来自CAT-NP/H₂O₂-处理动物的牙龈和腭组织的组织病理学分析显示，当与未处理(或溶媒-处理的)动物相比时，无细胞毒性作用，例如增生性变化、炎性反应和/或坏死的迹象(图17)。

用单独的CAT-NP处理在一定程度上减少龋损伤，如上文所指出的。不受特定理论束缚，除了铁离子的抗细菌作用(Rosalen等人, Arch Oral Biol, 1996; Pecharki等人,Caries Res, 2005; Delbem等人, Caries Res, 2012; Ribeiro等人, Braz Oral Res,2012)之外，铁离子似乎通过干扰釉质去矿化过程而抑制龋齿。当在酸性pH (4.5)孵育几分钟时，铁离子从CAT-NP迅速释放，但在pH 7.0不释放(图18A)。

为了研究CAT-NP是否可通过在酸性pH释放铁减少磷灰石酸溶解，使用下列唾液涂覆的HA珠酸溶解和铁释放测定法。羟基磷灰石(Bio-Rad Laboratories)珠用过滤除菌的澄清全唾液涂覆以获得唾液涂覆的羟基磷灰石(sHA) (Koo等人, Antimicrob Agents Chemother, 2002; Gregoire等人, Appl Environ Microbiol, 2011; Ambatipudi等人,J Proteome Res, 2010)。对于sHA酸溶解测定，将10 mg sHA珠在1 mL包含0.5 mg/ml CAT-NP的0.1 M NaOAc缓冲液(pH 4.5)中在室温振动孵育2 h。然后，将上清液去除并将sHA珠再次重悬在1 mL新鲜的酸性NaOAc缓冲液并如上所述孵育；该过程重复6次。相同程序用sHA珠且不含CAT-NP进行(对照)。紧接酸溶解之前和之后获取sHA等分试样并经由光学显微术(OM)和SEM分析。平行地，将剩余sHA珠通过离心收集、烘干和称重，用于测定其干重。将用CAT-NP处理的sHA的剩余干重与对照组比较，以评估CAT-NP减少去矿化的效率。对于铁释放测定法，将 0.5 mg/ml CAT-NP在0.1 M NaOAc (pH 4.5)中在室温孵育0、3、5、10、30、60、120 min。将混合物在10,000 g离心5 min，收集上清液用于使用铁测定试剂盒(Sigma-Aldrich)按照制造商的方案测量铁浓度。作为对照，在0.1 M NaOAc (pH 7)中释放的铁的量使用如上所述的同一程序测定。

图18B和18C显示唾液涂覆的羟基磷灰石(sHA)珠的图，其在含或不含CAT-NP的酸性乙酸钠缓冲液(pH 4.5)中孵育，然后经由SEM检查和分析以测定酸孵育之后剩余的sHA的量。如图18B中所示，未用CAT-NP处理的sHA珠几乎完全溶解。相反，sHA的酸溶解在CAT-NP存在下减少(图18B)。这些发现提示CAT-NP可通过减少磷灰石酸溶解提供额外的龋预防机制。上述实验数据的统计学分析使用SAS 9.5 (SAS Institute) (Falsetta等人, Infect Immun, 2014)进行。

目前的治疗方法，包括抗细菌纳米粒子，主要关注于抑制活性或杀灭细菌而不处理存在的保护性生物膜基质和酸性微环境，这些可限制其抗生物膜引起的感染的功效(Lebeaux等人, Microbiol Mol Biol Rev, 2014; Allaker和Memarzadeh, Int J Antimicrob Agents, 2014)。

本公开内容呈现可如何利用纳米粒子以在临床相关的体内模型中对抗生物膜相关疾病的证据。图1概述生物相容的和pH响应的策略，其包含4个主要性质：(1) CAT-NP在短暂局部暴露后保留在3D生物膜结构中；(2) CAT-NP在酸性pH迅速原位催化H₂O₂产生自由基，其同时(3) 降解EPS；和(4) 杀灭包埋在生物膜中的细菌。另外CAT-NP在酸性pH释放铁离子，其减少磷灰石去矿化，这可对生物膜相关骨疾病具有潜在价值(Katsarelis等人, J Dent Res, 2015; Arciola等人, Adv Exp Med Biol, 2015)。CAT-NP可在体内抑制常见的生物膜相关疾病发展，同时不伤害正常组织。CAT-NP可以以低成本大规模合成，同时CAT-NP化学的灵活性可使得开发额外的纳米晶体核心，其可进一步改善催化性能(图19)。因此，该方法可产生可行的用于基于纳米催化剂开发抗生物膜疗法的新平台，用于局部使用抗口腔疾病和其它人类感染以及工业和船舰生物污垢。

实施例4

本实施例使用IO-NP合成化学的灵活性进一步增强IO-NP的保留、催化活性和去矿化-阻断作用，以致IO-NP/H₂O₂系统用于体外生物膜控制的有效性可得到优化。

不同的金属盐(例如MnCl₂)可掺入IO-NP结构中以增强纳米粒子催化H₂O₂的速率和水平。此外，IO-NP可用不同的生物相容的右旋糖酐涂覆，目的在于增强IO-NP在牙齿/生物膜界面和生物膜内的保留。无定形磷酸钙可加入IO-NP中以改善在酸性pH抗釉质去矿化的作用。优化的IO-NP的功效可在体外评估，并且最有效的纳米粒子(vs. 目前的IO-NP)可选择用于进一步评估。

在该实施例中，产生具有右旋糖酐表面涂层(用于增强保留)和不同掺杂材料(用于增强催化)的新纳米晶体核心的小文库。下文讨论的数据证明这些修饰是可行的并且可增强公开的治疗方法的功效。不同的IO-NP和掺杂的IO-NP制剂在下表1中示出。表1中显示的右旋糖酐-涂覆的铁氧化物纳米粒子如先前所公开的(Naha等人, J Mater Chem Biol Med, 2014)合成。简言之，将12.5 g右旋糖酐(MW 10,000)溶解在25 mL去离子(DI)水中。将所得溶液放置在冰浴中并用氮气净化30分钟，同时搅拌以完全从烧瓶去除氧。对于每一制剂，将980 mg氯化铁和360 mg氯化亚铁加入右旋糖酐溶液中。使用注射泵在6 hr内将15 mL浓缩的氢氧化氨加入右旋糖酐-铁溶液中。然后将纳米粒子悬浮液加热至90℃持续1 h，然后在室温搅拌过夜。将所得纳米粒子悬浮液在20k rcf离心30 min以去除聚集体。收集包含IO-NP的上清液，浓缩至15 mL并用柠檬酸缓冲盐水使用100 kDa MW渗滤柱洗涤。合成了具有不同的未修饰的右旋糖酐分子量(1、5、10、20和40 kDa)涂覆的IO-NP。

表1. 右旋糖酐涂覆的IO-NP和掺杂的IO-NP制剂的合成和表征

尽管新近开发的纳米粒子为新型的，但其基于高度生物相容的和已经临床批准作为MRI造影剂的材料(Fan等人, Wires Nanomed Nanobi, 2013)。掺杂材料已经显示增强IO-NP的催化活性(例如，MnCl₂)并且在体内存在。另外，纳米粒子可以大规模合成，并且终产品将会高度实惠。因此，公开的系统用于临床用途的潜能是显著的。

铁氧化物纳米粒子基于批准用于患者的右旋糖酐-涂覆的铁氧化物纳米粒子，例如Feridex、Combidex和Feraheme (Wang, Quantitative imaging in medicine and surgery, 2011)。这些铁氧化物纳米粒子被视为高度生物相容的，因为其分解成无害的、天然存在的物质(例如，铁和糖分子) (Tassa等人, Accounts of chemical research,2011; Koo等人, Journal of bacteriology, 2010)。为了改善和优化平台，可研究进行下列3个修饰的作用：涂层、核心掺杂和包含磷酸钙的作用(图20)。

为了研究涂层对IO-NP活性的作用，右旋糖酐涂覆的铁氧化物纳米粒子可如上所公开的(Naha等人, J Mater Chem Biol Med, 2014)合成。合成用不同的未修饰的右旋糖酐分子量(1、5、10、20和40 kDa)和修饰的右旋糖酐(例如，胺化的、交联的、羧基和二乙氨乙基)涂覆的IO-NP。同样，对临床可得的制剂Feraheme进行研究。改变右旋糖酐涂层类型可改变H₂O₂对纳米粒子表面的接近，这可然后改变催化性能。IO-NP涂层对催化H₂O₂的作用使用先前提及的TMB测定法测定。图19B (浅灰条)显示右旋糖酐涂覆的铁氧化物催化过氧化氢活化并且右旋糖酐为生物相容的涂层，提供最接近不具有涂层的IO-NP的催化活性。此外，不同类型的右旋糖酐涂层可潜在地增强IO-NP在牙齿/生物膜界面和富含EPS的生龋生物膜内的保留。先前的研究已经显示外源的右旋糖酐可用作引物(primer)用于由牙齿表膜上存在的变形链球菌-衍生的葡糖基转移酶(Gtfs)合成EPS，其继而可在生物膜开始时掺入基质中(Xiao等人, PLoS pathogens, 2012; Bowen和Koo, Caries research, 2006; Koo等人, Journal of dental research, 2013)而不影响催化活性(Gao等人, Nat Nanotechnol, 2007)。此外，保留可通过葡聚糖-葡聚糖粘附相互作用增强(图21) (Xiao等人, PLoS pathogens, 2012; Bowen和Koo, Caries research, 2011; Koo等人, Journal of dental research, 2013; Banas和Vickerman, Critical reviews in oral biology and medicine: an official publication of the American Association of Oral Biologists, 2003)。

为了研究掺杂金属的IO-NP核心的作用，可使用下列方法。实施合成，其中不同百分比的掺杂金属盐例如MnCl₂、CoCl₂和NiCl₂ (1、5、10和20%或更多)包含在核心中。掺杂金属的加入是改善催化剂性能的策略(Mohamed等人, Mat Sci Eng R, 2012; Bin Asif等人, Nanoscale research letters, 2014; Wang等人, Journal of Molecular Catalysis a-Chemical, 2013)。合成20% Mn-掺杂的右旋糖酐涂覆的IO-NP，Mn的包含通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)确认。图19B显示过氧化氢活化的速率相比未掺杂的IO-NP提高4.7倍。通过该方法，可开发具有与原始IO-NP，例如，不具有掺杂核心的IO-NP相比，根本上改善的催化性能的核心。

IO-NP可通过包含磷酸钙作为添加剂修饰，以改善纳米粒子的去矿化-阻断作用(和可能增强再矿化)。磷酸钙可通过混合IO-NP溶液与硝酸钙然后以1.67:1 Ca:P比逐滴加入磷酸钾而包含在IO-NP中(Sun等人, J Res Natl Inst Stan, 2010; Liou等人,Biomaterials, 2004)。变型可通过改变IO-NP与磷酸钙的比率合成。可对磷酸钙对阻断去矿化、IO-NP保留和H₂O₂催化的作用进行检查。或者，钙可通过如上所述掺杂或通过使用反相微乳液合成方法(Kong等人, Curr Appl Phys, 2005)包含。另外，如果磷酸钙的包含显著不利影响纳米粒子的催化活性，则可单独制造磷酸钙纳米粒子(CP-NPs)并且可施用IO-NP和CP-NP的混合物。这些IO-NP可通过透射电镜术(TEM, FEI Tecnai T12)、动态光散射(DLS)手段表征尺寸和表征ζ电势(Zetasizer ZS90, Malvern Instruments)，同时浓度可使用ICP-MS (Naha等人, J Mater Chem, 2014)测定。这些分析确保标准化的纳米粒子尺寸和浓度。优化这些不同的参数可使用下文所述的测定法进行，然后可合成组合鉴定的最佳特征的IO-NP，例如，具有改变的涂层的包含磷酸钙的掺杂的核心。

对于评估修饰的IO-NP的催化活性和生物活性，可使用下列方法。纳米粒子充当催化剂用于H₂O₂活化的能力经由使用鲁米诺测定法测量随时间的发光强度评估。简言之，将纳米粒子与过氧化氢和鲁米诺混合至多10 min，其中过氧化氢在铁氧化物纳米粒子表面反应以产生自由基，自由基使鲁米诺活化而产生光(Triantis等人, Chem Eng J, 2008)。图21显示来自鲁米诺测定法的数据。最好的催化剂产生最强的光发射。鲁米诺测定法还与已建立的使用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)作为底物的比色方法相补充。与由IO-NP随时间催化的自由基反应后，TMB产生蓝色，在652 nm具有特异吸收(Gao等人, Nat Nanotechnol,2007)。所有纳米粒子在相同条件(即，0.5 mg/ml和0.5% H₂O₂，如先前所使用的)下检验以在催化速率和水平方面比较其活性。筛选在吸附缓冲液(模拟唾液的离子强度)和澄清人全唾液(模拟生物学环境)中进行(Horev等人, ACS nano, 2015)。对于随后选择的首位纳米粒子候选，可检验不同的IO-NP和H₂O₂浓度组合以在最小剂量达到最大有效性。

对于IO-NP保留测定法，可使用下列方法。纳米粒子在生物膜内的保留使用唾液涂覆的羟基磷灰石生物膜模型评估。局部施用以每一IO-NP (0.5 mg/mL)每天两次短暂暴露(1或5 min)使用，以模拟临床治疗方案。将局部处理的生物膜洗涤以去除未结合或松弛结合的IO-NP。然后，将生物膜移除并均质化(Bowen和Koo, Caries research, 2011; Koo等人, J Antimicrob Chemoth, 2003)。保留在生物膜内的IO-NP的量通过用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS) (Naha等人, J Mater Chem B, 2014)分析生物膜的铁含量测定。H₂O₂(0.5%)的催化活性通过比色(TMB)测定法(Gao等人, Nat Nanotechnol, 2007)测量，以确保结合在生物膜内的IO-NP为有活性的(图22)。

IO-NP在H₂O₂存在下的细菌杀灭作用可使用上文公开的相同生物膜模型和局部处理评估。将IO-NP-处理的生物膜暴露于H₂O₂，变形链球菌的干重和总活细胞使用标准培养和基于qPCR的方法(Cury和Koo, Analytical biochemistry, 2007; Klein等人, Mol Oral Microbiol, 2012)测定。在该模型中，多达72个生物膜可在单个实验中同时形成；因此，方便筛选新开发的IO-NP。

另外，在H₂O₂存在下IO-NP通过氧化裂解降解葡聚糖的能力可按照下列方法测定。简言之，使用不可溶和可溶的葡聚糖(通过变形链球菌Gtfs产生)。将100 μg不可溶或可溶的葡聚糖在相同条件下用IO-NP和H₂O₂孵育以比较其活性，分解产物(即，葡萄糖)的量可使用标准比色方法(Koo等人, J Antimicrob Chemoth, 2003; Kopec等人, Glycobiology,1997)测量。

纳米粒子的去矿化-阻断作用可通过测定在IO-NP存在或不存在下酸溶解唾液涂覆的HA珠和唾液涂覆的牙釉质(sTE)板的量而分析。简言之，将sHA珠或sTE板在乙酸钠缓冲液(pH 4.5)中在37℃孵育4 h。将sHA珠离心并洗涤三次以去除溶解的磷灰石，钙和磷酸盐的量使用ICP-MS和比色测定法(Naha等人, J Mater Chem B, 2014)测量。将剩余的sHA珠(未溶解的)收集用于测定干重。将sTE板(处理后)使用高度标准化的表面显微硬度(SMH)方法(Arthur等人, Journal of oral diseases, 2014; Hara等人, Caries research,2005; Zero等人, Journal of dental research, 1992; Hara等人, European journal of oral sciences, 2014; Cury等人, Caries research, 1997)分析去矿化的量。简言之，釉质SMH使用与电动测微计镜台连接的硬度检验器测量。使用50 g负载和11 s停留时间的努普金刚石。釉质SMH通过使用专用图像分析系统在基线(处理前)和处理后测量压痕(indentation)长度(µm)而测定，然后计算为% SMH变化，其与去矿化水平直接相关。

对于体外评估生物相容性，可使用下列方法。系统可包括生物相容的和批准用于临床用途的IO-NP和H₂O₂。此外，使用的浓度低于目前在临床环境中使用的，并且由于短期、局部施用治疗，IO-NP与旁观者组织的接触将会最小。体内数据显示每天两次暴露IO-NP/H₂O₂组合不导致细胞毒性作用。然而，评估优化的纳米粒子(具有或不具H₂O₂)的潜在细胞毒性可使用口腔(牙龈和粘膜)上皮和纤维母细胞进行，以确保对哺乳动物细胞的活力无影响。简言之，生物相容性可通过将细胞暴露于单独的或与H₂O₂组合的纳米粒子至多10 min(模拟局部暴露)评估。对一系列IO-NP浓度(10-1000 μg/ml)和H₂O₂ (0.5-1% v/v)进行评估，进行MTS或MTT测定法以使用标准方案测定细胞活力(Naha等人, J Mater Chem B,2014)。该测定法可与在显微镜下定性观察细胞相补充。可进行一系列时间范围(1-10 min)的孵育和脉冲追踪实验，其中将细胞用IO-NP孵育10 min，然后随时间追踪，其活力在24、72和168 hr测量。图23显示右旋糖酐-涂覆的IO-NP的生物相容性。综合筛选可确保选择最有效和生物相容的IO-NP用于生龋生物膜控制和预防龋齿。

IO-NP特征的进一步优化可通过利用IO-NP化学灵活性进行以改善催化活性和生物活性。可合成多种可催化活化H₂O₂的新型纳米粒子。可鉴定以比未催化的速率高1000倍以上的速率活化过氧化氢的催化剂。同样，可产生不同掺杂的铁氧化物纳米粒子以研究其催化性质(Cormode等人, Contrast Media Mol Imaging, 2014; Naha等人, J Mater Chem B, 2014)。如果出现困难，合成IO-NP可通过使用不同比率的掺杂金属盐、不同的掺杂金属(例如，Mg、Ca)和不同涂层例如多巴胺或基于磷酸盐的配体而改变。

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本文引用多个出版物、专利和专利申请，其内容通过引用以其整体结合到本文中。

Claims (22)

1.用于预防、消除和/或治疗口腔疾病，或者用于预防、消除和/或处理生物膜的组合物，所述组合物包含：

a. 一种或多种铁纳米粒子；

b. 过氧化氢和/或过碳酸钠；和

c. 任选的选自氟化物、铜、磷酸钙和其组合的化合物。

2.权利要求1的组合物，其中所述一种或多种铁纳米粒子包括缀合至选自基质降解酶、产生过氧化物的酶和其组合的酶的纳米粒子。

3.权利要求1或2的组合物，其中所述口腔疾病包括龋齿。

4.权利要求1或2的组合物，其中所述一种或多种铁纳米粒子包括具有1 nm-1000 nm的直径的纳米粒子。

5.权利要求1或2的组合物，其中所述一种或多种铁纳米粒子掺杂金属。

6.权利要求5的组合物，其中掺杂的金属选自锰、钴、钙、镍、铜、镁、锶、钡、钪、钛、钒、铬、锌、铝、钇、锆、铌、钼、钌、铑、钯、铪、钽、钨、铼、锇、铱、铂、铜和其组合。

7.权利要求1或2的组合物，其中所述一种或多种铁纳米粒子包括具有聚合物涂层的纳米粒子。

8.权利要求7的组合物，其中所述聚合物涂层包括生物聚合物、右旋糖酐、壳聚糖或其组合。

9.权利要求1或2的组合物，其中所述一种或多种铁纳米粒子包括不具有聚合物涂层的纳米粒子。

10.权利要求1或2的组合物，其中所述生物膜由形成生物膜的微生物产生。

11.权利要求10的组合物，其中所述形成生物膜的微生物选自变形链球菌(S. mutans)、铜绿假单胞菌(P. aeruginosas)、大肠杆菌(E. coli)、粪肠球菌(E faecalis)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、金黄色葡萄球菌(S. aureus)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、白色念珠菌(Candida albicans)和其组合。

12.权利要求1或2的组合物，其中生物膜存在于牙齿、工业材料、船舰材料、皮肤、粘膜组织、软组织、牙齿内部、肺、泌尿道或医疗装置的表面上。

13.权利要求1-12中任一项的组合物在制备用于预防和/或治疗生物膜相关疾病的产品中的用途。

14.权利要求13的用途，其中所述生物膜相关疾病选自龋齿、粘膜感染、口腔疾病、泌尿道感染、导管感染、中耳感染、伤口、植入的医疗装置感染、骨疾病、人感染和其组合。

15.权利要求1-12中任一项的组合物在制备用于预防、消除和/或处理生物膜，或者用于预防生物膜中的细菌生长的产品中的用途。

16.权利要求15的用途，其中所述生物膜存在于牙齿表面、粘膜表面、软组织表面、皮肤表面、磷灰石表面、植入物表面、医疗装置表面、牙齿的内部表面、肺表面、泌尿道表面、工业表面、船舶表面、水运工具表面、船体或管表面上。

17.权利要求15或16的用途，其中所述化合物包含过氧化氢，并且其中(1)一种或多种铁纳米粒子与过氧化氢反应以形成预防生物膜形成的一种或多种自由基；和/或(2)一种或多种铁纳米粒子与过氧化氢反应以形成消化生物膜基质并同时杀灭包埋的细菌的一种或多种自由基。

18.权利要求1-12中任一项的组合物在制备用于预防牙齿或磷灰石去矿化的产品中的用途，其中所述一种或多种铁纳米粒子结合到牙釉质表面或磷灰石表面和/或释放铁以抑制釉质或磷灰石溶解。

19.权利要求18的用途，其中所述磷灰石表面为骨表面。

20.用于预防、消除和/或处理生物膜的试剂盒，包括：

a. 第一容器，包含含有一种或多种铁纳米粒子的组合物；和

b. 第二容器，包含过氧化氢和/或过碳酸钠。

21.权利要求20的试剂盒，其中所述组合物进一步包含氟化物。

22.包含权利要求1-12中任一项的组合物的口腔护理产品。

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