JP6948370B2 - 酸化鉄ナノ粒子およびその使用方法 - Google Patents

Description

[関連出願の相互参照]
本出願は、２０１５年２月１３日に出願された米国仮出願第６２/１１５，９６８号の
優先権を主張するものであり、参照によりその全体を本明細書に援用する、

バイオフィルムは、表面に強固に付着し、自己生成した三次元（３Ｄ）細胞外マトリッ
クス中に包まれる微生物の構造化共同体である。バイオフィルムは生体表面や非生体表面
上に形成され、自然環境および工業環境中に存在することができる。例えば、バイオフィ
ルムは、冷却塔、プール、スパなどの人工の水関連システムを汚染し得る。工業環境では
、バイオフィルムは配管の内部表面に発生して目詰まりや腐食の原因となることがある。
バイオフィルムはまた、埋め込まれた医療チューブ内および医療デバイス内や、人体内（
粘膜表面）に形成され、患者の感染症を引き起こす可能性がある。同様に、バイオフィル
ムは口腔内で発生して齲蝕などの口腔疾患を引き起こす可能性がある。このようなバイオ
フィルムの細胞外マトリックスは、エキソポリサッカライド（ＥＰＳ）などのポリマー物
質を含む。微生物が産生するマトリックスはバイオフィルムを構築するための実質的な足
場を提供することができる。さらに、マトリックスは微生物の拡散を妨げつつ微生物の付
着および凝集を促進するため、バイオフィルムの処理や表面からの除去は極めて困難とな
る。

口腔に関して、マトリックスのコアを形成するＥＰＳは齲蝕原性（すなわち齲蝕発生性
）バイオフィルム（歯垢とも呼ばれる）の主要な構成要素である。ＥＰＳ豊富なこの細胞
外マトリックスは、バイオフィルム中に高酸性のミクロ環境を作る一助となる拡散を阻害
するだけでなく、高粘着性・高接着性のバイオフィルムの形成を促進する。このような高
酸性度は、齲蝕原性フローラの生存および成長を促進し、また高分子細胞外マトリックス
の産生をさらに誘導し得るため、隣接する歯エナメル質の酸溶解を促進しつつ、確実に病
原性バイオフィルムを蓄積させる。この細胞外マトリックスはまた、抗体、抗生物質およ
び免疫細胞（これらは、高密度の細胞外マトリックスを通過して細胞外マトリックスに埋
め込まれた微生物を殺すことができない）によって口腔内および人体内の微生物バイオフ
ィルムや、生体材料（インプラント、医療デバイスなど）上の微生物バイオフィルムを排
除することを困難とする一因である。さらに、ＥＰＳ豊富な細胞外マトリックスの酸性ｐ
Ｈは、一部の抗生物質の有効性を低下させる可能性がある。

齲蝕原性バイオフィルムを抑制するためのある種のアプローチは、マトリックスの破壊
を標的とせず、クロルヘキシジン（ＣＨＸ）などの標準的な殺菌剤に限定されている。Ｃ
ＨＸは浮遊性のストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕ
ｔａｎｓ）を殺すことができるものの、バイオフィルムに対しては有効性が低く、また、
歯石の形成や歯の着色などの悪影響があるため毎日の治療用途には適さない。また、化学
剤や生物剤は歯や舌の変色、口腔粘膜の落屑および痛み、不快な味、毒性などのいくつか
の欠点を有する可能性があり、複雑な口腔フローラの不均衡も引き起こす可能性もある。

ある種の抗菌性ナノ粒子が口腔バイオフィルムを破壊し得るアプローチとして検討され
ている。しかし、その多くはＣＨＸと同様の制限がある。銀ナノ粒子および銅ナノ粒子な
どの金属ナノ粒子は広範な抗菌活性を示す。しかしながら、これらの薬剤はマトリックス
を標的とせず、酸性のミクロ環境下では十分機能しない可能性があり、抗バイオフィルム
効果は制限される。口腔バイオフィルムを抑制するための有効な治療法の開発は、口内に
局所的に導入した薬剤が保持性や生物活性が欠如することの影響も受ける。そのため、マ
トリクッスの分解と、埋め込まれた細菌（口腔内に発生し得るものを含むが、これらに限
定されない）の殺菌とを同時に行うことによって一般のバイオフィルムを効果的に処理す
ることができる組成物を提供する必要性があった。

本開示の主題は、（１）バイオフィルムの処理および／または排除、（２）バイオフィ
ルム形成の防止、（３）バイオフィルムの細胞外マトリックスの分解、（４）バイオフィ
ルム内での細菌の生存および増殖の阻害、および／または、（５）歯またはアパタイトの
脱灰の防止、のための酸化鉄ナノ粒子組成物およびその配合物を提供する。

ある実施形態では、本開示は、１つ以上の鉄ナノ粒子および過酸化水素を含む、バイオ
フィルム関連疾患（口腔疾患など）を防止および／または治療するための組成物を提供す
る。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子は、１つ以上の酵素にコンジュゲートされ
る。例えば、限定されず、１つ以上の鉄ナノ粒子は、マトリックス分解酵素および／また
は過酸化物生成酵素にコンジュゲートされる。ある実施形態では、口腔疾患は齲蝕である
。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子は、約１ｎｍ〜約１，０００ｎｍの直径を有
することができる。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子はポリマーコーティングを
有する。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子はポリマーコーティングを有さない。

本開示はさらに、１つ以上の鉄ナノ粒子および過酸化水素を含む、バイオフィルムを防
止および／または処理するための組成物を提供する。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナ
ノ粒子は、１つ以上のマトリックス分解酵素および／または過酸化物生成酵素にコンジュ
ゲートされる。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子は、約１ｎｍ〜約１，０００ｎ
ｍの直径を有することができる。ある実施形態では、組成物はさらにフッ化物を含む。あ
る実施形態では、１つ以上のナノ粒子は、マンガン、コバルト、カルシウム、ニッケル、
マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム
、亜鉛、アルミニウム、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、ルテニウム
、ロジウム、パラジウム、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム
、イリジウム、白金、銅、または、それらの組合せなどの金属でドープされるが、これら
に限定されない。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子は、ポリマーコーティングを
有するか、またはポリマーコーティングを有しない。ある実施形態では、ポリマーコーテ
ィングはデキストランを含む。ある実施形態では、バイオフィルムは、ストレプトコッカ
ス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐ．ａｅｒｕ
ｇｉｎｏｓａｓ）、エシェリヒア・コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロコッカス・フェカ
ーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、バチリス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ス
タフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ
ｃｈｏｌｅｒａｅ）、カンジタ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）
、または、それらの組み合わせによって生成される。バイオフィルムは、歯の表面、粘膜
表面、医療デバイス、工業材料、船舶材料（ｎａｖａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ）、皮膚、歯
の内部（例えば、歯内管）、肺（例えば、嚢胞性線維症）、または、尿路に存在し得る。

本開示は、１つ以上の鉄ナノ粒子を含む組成物の有効量を対象に投与するステップを含
む、口腔疾患を防止、排除および／または治療する方法を提供する。ある実施形態では、
組成物中の鉄ナノ粒子の濃度は、約０．１〜約１．０ｍｇ／ｍｌである。ある実施形態で
は、本方法は、対象に有効量の過酸化水素を投与するステップをさらに含むことができる
。ある実施形態では、過酸化水素は、約０．１％〜約３．０％の濃度の過酸化水素を含む
溶液で投与される。ある実施形態では、本方法は、対象に有効量のフッ化物を投与するス
テップをさらに含むことができる。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子は、マトリ
ックス分解酵素および／または過酸化物生成酵素にコンジュゲートされる。ある実施形態
では、組成物は、フッ化物、過酸化水素、リン酸カルシウム、銅、過炭酸ナトリウム、ま
たは、それらの組み合わせをさらに含むことができる。ある実施形態では、１つ以上の鉄
ナノ粒子は、約１ｎｍ〜約１，０００ｎｍの直径を有することができる。ある実施形態で
は、１つ以上の鉄ナノ粒子は、ポリマーコーティングを有するか、またはポリマーコーテ
ィングを有しない。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子はポリマーコーティングを
有する。

本開示は、バイオフィルムを有する表面を、１つ以上の鉄ナノ粒子を含む有効量の組成
物と接触させるステップを含む、バイオフィルムを防止、排除および／または処理する方
法を提供する。ある実施形態では、バイオフィルムは、歯の表面、粘膜組織表面、軟組織
表面、皮膚、アパタイト表面、インプラント表面、医療デバイス表面、工業材表面、船舶
（ｎａｖａｌ ｖｅｓｓｅｌ）表面、ウォータークラフト表面、船体、またはパイプ表面
に存在する。ある実施形態では、本方法は、表面を過酸化水素含有溶液と接触させるステ
ップをさらに含むことができ、１つ以上の鉄ナノ粒子は、過酸化水素を触媒して．バイオ
フィルムマトリックスを分解かつ／または埋め込まれた細菌を殺菌することができる１つ
以上のフリーラジカルが形成される。ある実施形態では、１つ以上のフリーラジカルは、
同時に、バイオフィルムマトリックスを分解し、埋め込まれた細菌を殺菌する。

ある実施形態では、バイオフィルム中の細菌増殖を防止する方法は、バイオフィルムを
有する表面を１つ以上の鉄ナノ粒子を含む有効量の組成物と接触させるステップを含み、
１つ以上の鉄ナノ粒子は当該表面に結合し、鉄を放出してバイオフィルム内の細菌の増殖
を阻害する。本開示はさらに、表面上でバイオフィルムの形成を防止する方法を提供する
。ある実施形態では、表面上でバイオフィルムの形成を防止する方法は、１つ以上の鉄ナ
ノ粒子を含む有効量の組成物でバイオフィルム発生のリスクがある表面を処理するステッ
プを含むことができる。ある実施形態では、表面は、１つ以上の鉄ナノ粒子を含む有効量
の組成物でコーティングすることができる。ある実施形態では、組成物は、１つ以上の鉄
ナノ粒子および過酸化水素および／または過炭酸ナトリウムを含むことができる。例えば
、限定されないが、そのようなリスクのある表面には、歯の表面、粘膜表面、インプラン
トの表面、デバイスの表面、および、パイプの表面が含まれる。

本開示の主題は、歯またはヒドロキシアパタイト（ＨＡ）の脱灰を防止する方法をさら
に提供する。ある実施形態では、歯の脱灰を防止する方法は、バイオフィルムを有する歯
エナメル質またはアパタイト（例えば骨）表面を、１つ以上の鉄ナノ粒子を含む有効量の
組成物と接触させるステップを含むことができる。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ
粒子は表面に結合してエナメル質またはアパタイトの溶解を阻害かつ／または防止する。

本開示は、１つ以上の鉄ナノ粒子を有する組成物を含む第１の容器と、過酸化水素溶液
を含む第２の容器とを含む、バイオフィルムを防止および／または処理するためのキット
を提供する。ある実施形態では、キットは、１つ以上の鉄ナノ粒子および過酸化水素を有
する組成物を含む容器を含むことができ、過酸化水素は不活性化および／または複合体化
され、口腔内でまたは水と接触したときに活性化および／または放出することができる。

図１は、触媒性ナノ粒子（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ＣＡＴ−ＮＰ）によるＨ_２Ｏ_２の活性化によるｉｎ ｓｉｔｕでのバイオフィルムの排除／破壊の提案モデルの模式図を示す。 図２は、バイオフィルム内の３次元（３Ｄ）細胞外マトリックスおよび酸性ｐＨニッチの画像を示す。図２Ａは、成熟バイオフィルム内のＥＰＳマトリックス（赤色）および細菌（緑色）を示す。図２Ｂは、バクテリアを保持し、区画化構造体を形成しているＥＰＳを示す細胞マトリックス構造組織の拡大図を示す。図２Ｃは、高酸性のミクロ環境（ドット領域）を有するｉｎｔａｃｔなバイオフィルムのｉｎ ｓｉｔｕでのｐＨ画像を示す。 図３は、本開示の非限定的な実施形態に従って調製および特性解析した酸化鉄ナノ粒子（ＩＯ−ＮＰ）のＴＥＭ画像を示す。スケールバーは５００ｎｍである。 図４Ａ〜４Ｃは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって特性解析したストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）バイオフィルム上のＩＯ―ＮＰ保持の画像を示す。図４ＡはＩＯ−ＮＰで処理したバイオフィルムの形態を示す。図４Ｂは、バイオフィルムに結合したＩＯ−ＮＰの拡大図を示す。図４Ｃはバイオフィルム上のＩＯ−ＮＰ（ピンク）分布を示すＳＥＭ画像の元素分析を示す。 図５Ａ〜５Ｂは、０．５％Ｈ_２Ｏ_２と組み合わせたＩＯ−ＮＰによる殺菌およびマトリックス分解のグラフを示す。図５Ａはバイオフィルム内のストレプトコッカス・ミュータンスの効果的な殺菌のグラフを示す。図５ＢはＥＰＳマトリックス分解のグラフを示す。 図６Ａ〜６Ｃは、低ｐＨ下での細菌阻害、ＩＯ−ＮＰからの鉄放出およびフリーラジカル生成のグラフを示す。図６Ａは、グルコースを含む培地中、低ｐＨ下でＩＯ−ＮＰが細菌生存を阻害することを示すグラフを示す。 図６Ｂは、３７℃で低ｐＨ（５．５未満）下でのＩＯ−ＮＰからの鉄放出を示すグラフである。 図６Ｃは、低ｐＨ（ｐＨ４〜５）でＩＯ−ＮＰがＨ_２Ｏ_２を触媒してフリーラジカルを迅速に生成することを示すグラフである。 図７Ａ〜７Ｃは、ＩＯ−ＮＰが酸性条件下でヒドロキシアパタイト（ＨＡ）の脱灰を減少させることを示す画像を示す。図７Ａは未処理ＨＡビーズの画像である。図７Ｂは酸性緩衝液（ｐＨ４．５）中のＨＡビーズの画像である。図７Ｃは酸性緩衝液中でＩＯ−ＮＰを有するＨＡビーズの画像であって、ＨＡの酸溶解に対するＩＯ−ＮＰの保護効果を示す。 図８Ａ〜８Ｅは、触媒性ナノ粒子（ＣＡＴ−ＮＰ）の特性解析および触媒活性を示す。図８Ａ〜８ＢはＴＥＭによるＣＡＴ−ＮＰの画像を示す。図８ＣはＣＡＴ−ＮＰのサイズ分布（２１３．３±２６．５ｎｍ）を示すグラフである。図８Ｄは３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）法によって測定したＣＡＴ−ＮＰ活性のグラフである。図８ＥはＡＭＰＬＥＸ（登録商標）ＵｌｔｒａＲｅｄ（５６８／５８１ｎｍで励起／発光）によって測定したＣＡＴ−ＮＰ活性のグラフである。データは平均±ｓ．ｄ．で示す。 図９Ａ〜図９Ｂは、例示的な実験デザインおよびインビトロでの唾液被覆ハイドロキシアパタイト（ｓａｌｉｖａ−ｃｏａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ；ｓＨＡ）バイオフィルムモデルを示す。図９Ａは例示的なバイオフィルム実験設計および局所処理レジメンを示す。図９Ｂは２４ウェルプレート内のｓＨＡディスクの垂直配置およびｓＨＡディスク表面上のバイオフィルムの形成を示す。 図１０Ａ〜１０Ｆは、バイオフィルム内のＣＡＴ−ＮＰの保持および触媒活性を示す。図１０Ａは結合したＣＡＴ−ＮＰ（矢印）を有するバイオフィルムの形態を示す。図１０Ａ１は図１０Ａ中の選択された領域内のＣＡＴ−ＮＰの拡大図を示す。図１０Ａ２はバイオフィルム上の鉄（ピンク）の分布を示すＳＥＭ／ＥＤＳ画像を示す。図１０Ｂは、ＩＣＰ−ＭＳで鉄量を測定して測定した、バイオフィルム内の結合ＣＡＴ−ＮＰの量を示すグラフを示す。図１０Ｃは、バイオフィルム（ＥＰＳ（赤色）、細菌（緑色）、ＣＡＴ−ＮＰ（白色）は共焦点顕微鏡で観察したものである）内のＣＡＴ−ＮＰの空間分布を示す。図１０Ｄは、バイオフィルムの厚さ全体のＣＡＴ−ＮＰの直交方向分布を示すグラフを示す。図１０Ｅは、バイオフィルム内のＣＡＴ−ＮＰの触媒活性を示すグラフである（挿入図：ＣＡＴ−ＮＰ処理バイオフィルムのＨ_２Ｏ_２およびＴＭＢへの暴露前後の画像（青色はｉｎ ｓｉｔｕでのＨ_２Ｏ_２触媒作用を介したフリーラジカル生成を示す））。 図１１は、別のペルオキシダーゼ基質（３，３’−ジアミノベンジジン；ＤＡＢ）を用いたバイオフィルム内の結合ＣＡＴ−ＮＰの活性を示す画像を示す。茶色はＨ_２Ｏ_２触媒作用を介したフリーラジカル生成を示す。 図１２は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）反応によって測定した、様々なｐＨ値におけるバイオフィルム内の結合ＣＡＴ−ＮＰの触媒活性を示すグラフである。 図１３Ａ〜１３Ｄは、ＣＡＴ−ＮＰおよびＨ_２Ｏ_２の組み合わせによって達成される殺菌、ＥＰＳ分解およびバイオフィルム破壊を示す。図１３Ａは、Ｈ_２Ｏ_２暴露から５分後のＣＡＴ−ＮＰ処理バイオフィルム内のストレプトコッカス・ミュータンスの生存率を示すグラフである。 図１３Ｂは、Ｈ_２Ｏ_２曝露３０分後のバイオフィルム内のＥＰＳ分解を示すグラフである。 図１３Ｃは、ＧｔｆＢから産生される不溶性グルカンおよびＧｔｆＤから産生される可溶性グルカンの分解を示すグラフである。 図１３Ｄは、ＣＡＴ−ＮＰ＋Ｈ_２Ｏ_２による局所処置後のバイオフィルム破壊の挙動を示す共焦点顕微鏡画像を示す。バイオフィルムをＣＡＴ−ＮＰで局所処置し、その後直ちにＨ_２Ｏ_２に暴露（ＣＡＴ−ＮＰ＋Ｈ_２Ｏ_２）または酢酸ナトリウム緩衝液に暴露（ＣＡＴ−ＮＰ単独）した（１日２回）。ＣＡＴ−ＮＰの非存在下でＨ_２Ｏ_２処理したバイオフィルムについては、バイオフィルムを酢酸ナトリウム緩衝液で処理し、その後直ちにＨ_２Ｏ_２暴露した。対照群は緩衝液のみで処理したバイオフィルムとした。細菌細胞をＳＹＴＯ９（緑色）で染色し、ＥＰＳをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７（赤色）で標識した。データは平均±ｓ．ｄ．で示す。^＊Ｐ≦０．００１（ｖｓ対照）。 図１４Ａ〜１４Ｂは、様々な濃度のＨ_２Ｏ_２を用いたＣＡＴ−ＮＰの抗バイオフィルム活性を示すグラフを示す。図１４Ａは生存細胞の総数（コロニー形成単位、ＣＦＵ）を計数することによって測定した抗菌活性を示すグラフである。図１４Ｂはバイオフィルムのバイオマス（乾燥重量）の減少を示すグラフである。データは平均±ｓ．ｄ．で示す。 図１５Ａ〜図１５Ｃは、処理バイオフィルム内の細菌およびＥＰＳの生体容積（ｂｉｏｖｏｌｕｍｅ）の定量分析を示す。図１５Ａは、ＣＯＭＳＴＡＴによる、４３時間の時点での処理バイオフィルム内の細菌の生体容積のグラフを示す。図１５Ｂは、ＣＯＭＳＴＡＴによる、４３時間の時点での処理バイオフィルム内のＥＰＳの生体容積のグラフを示す。図１５Ｃは、ＣＯＭＳＴＡＴによる、４３時間の時点での処理バイオフィルム内の細菌およびＥＰＳの生体容積の定量分析を示す表である。データは平均±ｓ．ｄ．で示す。 図１６Ａ〜１６Ｂは、齲蝕病変発生に対するＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ_２Ｏ_２処理による保護を示す画像およびグラフを示す。図１６Ａは、述べたとおりに処置したラットの歯の画像を示す。緑色の矢印はエナメル質領域が脱灰されて白くなった初期の病変形成を示し、青色の矢印はエナメル質領域が白色不透明または損傷を受けた中程度の齲蝕病変を示す。一部の領域ではエナメル質が侵食され、最も重篤な齲蝕病変（赤色の矢印）であるキャビテーションが生じた。図１６Ｂは、Ｋｅｙｅｓのスコアリング・システムのＬａｒｓｏｎ改良に従って齲蝕病変重症度のステージおよび程度として記録したスコアを示すグラフを示す：初期の病変（表面エナメル質が白色）；中程度の病変（エナメル質が白色不透明）；広範囲の病変（キャビテーションが起こり、エナメル質が侵食されて下の象牙質が露出している状態）。データは平均±ｓ．ｄ．で示す。^＊Ｐ≦０．００１（ｖｓ対照）；^＊＊Ｐ≦０．０５（ｖｓ対照）；δは未検出を示す。 図１７は、ＣＡＴ−ＮＰおよび／またはＨ_２Ｏ_２で処置した動物の歯肉組織および口蓋組織の組織病理画像を示すものであり、細胞毒性効果は示されず、３週間の局所処置後の細胞異常は全くない。 図１８Ａ〜１８Ｃは、ＣＡＴ−ＮＰ処理によるｓＨＡ酸溶解の減少の画像、グラフおよび図を示す。図１８Ａは、未処理ｓＨＡビーズ（直径８０μｍ）、酸性緩衝液（ｐＨ４．５）中のｓＨＡビーズ、および、酸性緩衝液中のＣＡＴ−ＮＰを有するｓＨＡビーズの画像を示す。図１８Ｂは酸溶解後のｓＨＡの残存量を示す例示的グラフを示す。図１８Ｃは、ｐＨ４またはｐＨ７でのインキュベーション後にＣＡＴ−ＮＰから放出された鉄の量を示す例示的なグラフを示す。データは、平均±ｓ．ｄ．で示す。 図１９Ａ〜図１９Ｂは、修飾ＣＡＴ−ＮＰの触媒活性の比較を示すグラフを示す図である。図１９Ａは、同量の様々なタイプのＣＡＴ−ＮＰ（ＣＡＴ−ＮＰ、デキストラン被覆ＣＡＴ−ＮＰ、および、デキストランで被覆され、かつ、マンガン（Ｍｎ）でドープされたＣＡＴ−ＮＰ）の触媒活性（ＴＭＢ法による）のキネティクスを示すグラフである。図１９Ｂは、修飾ＣＡＴ−ＮＰの触媒活性と比較したＣＡＴ−ＮＰの触媒活性を示すグラフを示す。データ（未修飾ＣＡＴ−ＮＰに対する活性）は平均±ｓ．ｄ．で表し、修飾により触媒活性が増強されることを明確に示している。 図２０はＩＯ−ＮＰの有効性を最適化し得る修飾を示す。 図２１は、ルミノールからの光の発生により示されるデキストラン被覆ＩＯ−ＮＰによるＨ_２Ｏ_２のｉｎ ｖｉｔｒｏ触媒作用を示す画像である。 図２２Ａ〜２２Ｂは、バイオフィルムに結合したＩＯ−ＮＰの触媒活性を示す。図２２ＡはＨ_２Ｏ_２およびＴＭＢへの暴露前後のＩＯ−ＮＰ処理バイオフィルムを示す画像であり、青色は、Ｈ_２Ｏ_２触媒作用を介したｉｎ ｓｉｔｕでのＲＯＳ生成を示す。図２２ＢはＯＤ_６５２で測定した発生フリーラジカルの量を示すグラフである。 図２３Ａ〜２３Ｂは、酸化鉄ナノ粒子と２４時間インキュベートした後の細胞生存率を示す。図２３Ａは酸化鉄ナノ粒子と２４時間インキュベートした後のＢＪ５ｔａ細胞の細胞生存率を示すグラフである。図２３Ｂは酸化鉄ナノ粒子と２４時間インキュベートした後のＨｅｐＧ２細胞の細胞生存率を示すグラフである。データは細胞に対して毒性作用を示さない。

本開示の主題は、バイオフィルムの排除、バイオフィルム形成の阻止、マトリックス分
解および／またはバイオフィルム内の微生物の生存および増殖の阻害のための酸化鉄ナノ
粒子（ＩＯ−ＮＰ）組成物およびその配合物を提供する。本開示の主題は、口腔疾患の治
療ならびに工業用途および他の医療用途のための本開示の組成物および配合物の使用方法
をさらに提供する。

本明細書中において「バイオフィルム」は、細胞外マトリックスと、１つ以上の微生物
、例えば、限定されないが、細菌（バクテリア）、真菌、藻類、原生動物とを含み、表面
に付着する。例えば、限定されないが、このような表面には、歯、粘膜、アパタイト、骨
、非生物（例えば、インプラント、義歯、パイプなど）の表面が含まれ得る。バイオフィ
ルムは、生体表面または非生体表面上上に形成され、自然環境および工業環境中に存在す
ることができる。

本開示の組成物および／または配合物によって防止、排除および／または処理すること
ができるバイオフィルムには、口腔内、例えば、歯の表面、歯肉／歯周組織などの粘膜／
軟組織の表面、および歯の管の内部（例えば、歯内管）に存在するバイオフィルムが含ま
れるが、これらに限定されない。ある実施形態では、本開示の組成物および／または配合
物によって防止、排除および／または処理することができるバイオフィルムには、尿路、
肺、胃腸管、慢性創傷上および／または慢性創傷内のバイオフィルムが含まれ、表面（イ
ンプラントなど）や、医療デバイスおよび医療ライン、例えば、カテーテル、医療機器お
よび医療用チューブの内部に存在する。バイオフィルムの更なる非限定的な例には、工業
装置および工業材料、例えば、水、下水、オイルなどの物質のためのパイプ内に存在する
バイオフィルムが含まれる。ある実施形態では、本開示の組成物および／または配合物は
、船舶および他のウォータークラフトの船体の処理または洗浄に使用され得る。

本明細書において「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特
定の値の許容誤差範囲内を意味し、値がどのように測定ないし決定されるか（すなわち、
測定システムの限界）に部分的に依存する。例えば、「約」は、所定の値の最大２０％、
最大１０％、最大５％、および／または、１％までの範囲を意味し得る。

上述したように、本開示の組成物は、バイオフィルム中の細菌などの１つ以上の微生物
の成長を低減させ、かつ／または当該微生物の生存を阻害するために使用することができ
る。例えば、限定されないが、細菌には、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕ
ｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒ
ｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎ
ｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒ
ｄｏｎｉｉ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌ
ｉｓ）、ストレプトコッカス・ミチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）、ア
クチノマイセス・オドントリティカス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉ
ｃｕｓ）、アクチノマイセス・ビスコーカス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕ
ｓ）、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａ
ｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、ラクトバチルスｓｐｐ．（
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ.）、ポルフィロモナスジンジバリス（Ｐｏｒｐｈ
ｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・インテルメディア（Ｐｒｅｖ
ｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、バクテロイデス・フォーサイス（Ｂａｃｔｅｒ
ｏｉｄｅｓ ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍ
ａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、カンピロバクター・レクタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅ
ｒ ｒｅｃｔｕｓ）、オイコネラ・コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎ
ｓ）、ベイロネラｓｐｐ．（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ.）、ミクロモナス・ミク
ロス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ ｍｉｃｒｏｓ）、ポルフィロモナス・カンジンジバリス（
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃａｎｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、フェモリラス・アクチノ
ミセテムコミタンス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔ
ａｎｓ)、アクチノマイセスｓｐｐ．（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ.）、バチリスｓ
ｐｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ.）、マイクロバクテリウムｓｐｐ．（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ.）、フソバクテリウムｓｐｐ．（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｐｐ.）、ストレプトコッカスｓｐｐ．（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ.）、
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ス
トレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ス
トレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌｅｃｔｉａ
ｅ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、クレブシエラ
・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクターｓ
ｐｐ．（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ.）、エンテロコッカスｓｐｐ．（Ｅｎｔ
ｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ.）、プレボテーラｓｐｐ．（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ
ｐ．）、ポルフィロモナスｓｐｐ．（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ.）、クロス
トリジウムｓｐｐ.（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ.）、ステノトロフォモナス・マル
トフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、ポルフィ
ロモナス・カンジンジバリス（Ｐ．ｃａｎｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、カンジタ・アルビカ
ンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、エシェリヒア・コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）、
および／または、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｓ）が含ま
れ得る。ある実施形態では、細菌はＳ．ｍｕｔａｎｓであり、これは，口腔内、例えば歯
の表面上に見出されるバイオフィルム内に存在する。

酸化鉄ナノ粒子（Ｉｒｏｎ Ｏｘｉｄｅ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ＩＯ−ＮＰ）
およびＩＯ−ＮＰ組成物
本開示の主題は、バイオフィルムを処理および／または排除および／またはバイオフィ
ルム形成を防止するための、１つ以上のＩＯ−ＮＰ（本明細書では触媒ナノ粒子、ＣＡＴ
−ＮＰおよびＭＮＰともいう）を含む組成物を提供する。例えば、限定されないが、本明
細書に開示される組成物は、存在するバイオフィルム、例えば既に表面上に存在するバイ
オフィルムを処理するために使用することができる。ある実施形態では、本開示の組成物
は、例えば、開示された組成物で表面をコーティングすることによって、バイオフィルム
の発生および／または形成を防止するために使用することができる。

本明細書に開示されるように、本開示のＩＯ−ＮＰは、歯表面に結合し、また、バイオ
フィルム内に浸透・保持されてバイオフィルムの細胞外マトリックスを破壊して、バイオ
フィルム内に埋め込まれた細菌の増殖の減少および／または殺菌をすることができる、例
えば、限定されないが、開示される主題のＩＯ−ＮＰは、バイオフィルム内に鉄を放出し
てバイオフィルム内の細菌の増殖を減少することができる。ある実施形態では、ＩＯ−Ｎ
Ｐは、バイオフィルムの酸性ミクロ環境中で鉄を放出する。例えば、限定されないが、Ｉ
Ｏ−ＮＰは、ｐＨ約５．５以下、ｐＨ約４．５以下またはｐＨ約４．０以下で鉄を放出す
ることができる。ある実施形態では、ＩＯ−ＮＰはｐＨ約７で鉄を顕著に放出しない。

ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰは、酸化鉄から製造されたナノ粒子とすること
ができる。例えば、限定されないが、ＩＯ−ＮＰは、Ｆｅ_３Ｏ_４、Ｆｅ_２Ｏ_３、酸化鉄を
含むナノ材料、または、その組み合わせから製造することができる。ある実施形態では、
ＩＯ−ＮＰは、約０．０１〜約１０．０ｍｇ／ｍｌの鉄濃度を有することができる。例え
ば、限定するものではないが、ＩＯ−ＮＰは、約０．０１〜約９．０ｍｇ／ｍｌ、約０．
０１〜約８．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１〜約７．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１〜約６．０ｍ
ｇ／ｍｌ、約０．０１〜約５．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１〜約４．０ｍｇ／ｍｌ、約０．
０１〜約３．０ｍｇ／ｍｌ、約１．０〜約２．０ｍｇ／ｍｌ、約２．０〜約１０．０ｍｇ
／ｍｌ、約３．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約４．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約５．０
〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約６．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約７．０〜約１０．０ｍｇ
／ｍｌ、約８．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌまたは約９．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌの鉄濃
度を有することができる。ある実施形態では、ＩＯ−ＮＰは、約５．０〜約６．０ｍｇ／
ｍｌの鉄濃度を有することができる。

ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰはポリマーコーティングを含まない。ある実施
形態では、本開示のＩＯ−ＮＰはポリマーコーティングを含むことができ、例えば、限定
されないが、ポリマーコーティングは、キトサン、ポリ（アクリル酸）、デキストラン、
ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メタクリレート−ｃｏ−メタクリル酸）、ポリグリ
シジルメタクリレート、ポリ（ビニルアルコール）、ジオール、カテコール／ドーパミン
、ヒドロキサム酸、ホスフィンオキシド、シラン、および、当業者に知られている他のコ
ーティングを含むことができる。ある実施形態では、ポリマーコーティングは、デキスト
ランまたは修飾デキストランとすることができる。例えば、限定されないが、デキストラ
ンは架橋、アミノ化、カルボキシル化、またはジエチルアミノエチル部分で修飾すること
ができる。本開示のＩＯ−ＮＰとして使用することができる市販のデキストラン被覆酸化
鉄ナノ粒子の非限定的な例には、Ｆｅｒｉｄｅｘ（登録商標）、Ｃｏｍｂｉｄｅｘ（登録
商標）およびＦｅｒａｈｅｍｅ（登録商標）が挙げられる。ある実施形態では、本開示の
ＩＯ−ＮＰのコーティングに使用されるデキストランは、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、
例えば、約１ｋＤａ〜約９０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約８０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約７０ｋ
Ｄａ、約１ｋＤａ〜約６０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約４０ｋＤ
ａ、約１ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約１０ｋＤａ
、約１ｋＤａ〜約５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１００ｋＤ
ａ、約２０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約
１００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約６０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約７０
ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約８０ｋＤａ〜約１００ｋＤａまたは約９０ｋＤａ〜約１００
ｋＤａの分子量を有することができる。

ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰは、例えば、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によ
る測定で、約１ナノメートル（ｎｍ）〜約１，０００ｎｍの直径を有することができる。
例えば、限定されないが、ＩＯ−ＮＰは、約１ｎｍ〜約９００ｎｍ、約１ｎｍ〜約８００
ｎｍ、約１ｎｍ〜約７００ｎｍ、約１ｎｍ〜約６００ｎｍ、約１ｎｍ〜約５００ｎｍ、約
１ｎｍ〜約４００ｎｍ、約１ｎｍ〜約３００ｎｍ、約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、約１ｎｍ〜
約１００ｎｍ、約１ｎｍ〜約７５ｎｍ、約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約２５ｎｍ、
約２５ｎｍ〜約９００ｎｍ、約７５ｎｍ〜約９００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約９００ｎｍ、
約２００ｎｍ〜約９００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約９００ｎｍ、約４００ｎｍ〜約９００ｎ
ｍ、約５００ｎｍ〜約９００ｎｍ、約６００ｎｍ〜約９００ｎｍ、約７００ｎｍ〜約９０
０ｎｍまたは約８００ｎｍ〜約９００ｎｍである。ある実施形態では、ＩＯ−ＮＰは約２
００ｎｍ〜約３００ｎｍの直径を有することができる。ある実施形態では、ＩＯ−ＮＰは
約１８５ｎｍ〜約２４０ｎｍ、例えば、約２１３ｎｍの直径を有することができる。

ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰは約１ｎｍ〜約１，０００ｎｍの流体力学直径
を有することができる。例えば、限定されないが、ＩＯ−ＮＰは、約１０ｎｍ〜約１００
ｎｍ、約１５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約２５ｎｍ〜約１００ｎ
ｍ、約３０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約３５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１００ｎｍ
、約４５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５５ｎｍ〜約１００ｎｍ、
約６０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約６５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約
７５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９
０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５ｎｍ〜約９５ｎｍ、約５ｎｍ〜
約９０ｎｍ、約５ｎｍ〜約８５ｎｍ、約５ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５ｎｍ〜約７５ｎｍ、約
５ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５ｎｍ〜約６５ｎｍ、約５ｎｍ〜約６０ｎｍ、約５ｎｍ〜約５５
ｎｍ、約５ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５ｎｍ〜約４５ｎｍ、約５ｎｍ〜約４０ｎｍ、約５ｎｍ
〜約３５ｎｍ、約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２５ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、
約５ｎｍ〜約１５ｎｍ、または約５ｎｍ〜約１０ｎｍの範囲内である。ある実施形態では
、ＩＯ−ＮＰは約３０ｎｍ〜約５０ｎｍの流体力学直径を有することができる。

ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰ、例えばＩＯ−ＮＰのコアは、金属（例えば金
属塩として）でドープすることができる。例えば、限定するものではないが、金属は、マ
ンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、マグネシウム（Ｍｇ）、ストロ
ンチウム（Ｓｒ）、バリウム（Ｂａ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジ
ウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、アルミニウム（Ａｌ）、イッ
トリウム（Ｙ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ニオブ（Ｎｂ）、モリブデン（Ｍｏ）、ルテニ
ウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）、ハフニウム（Ｈｆ）、タンタル
（Ｔａ）、タングステン（Ｗ）、レニウム（Ｒｅ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（
Ｉｒ）、白金（Ｐｔ）、銅（Ｃｕ）またはそれらの組み合わせである。ある実施形態では
、金属はＭｎＣｌ_２、ＣｏＣｌ_２、ＮｉＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２などの塩として存在すること
ができるが、これらに限定されない。ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰは、リン酸
カルシウムなどのカルシウム（Ｃａ）などのアルカリ土類金属でドープすることができる
が、これに限定されない。ある実施形態では、ドーピング金属は、約１重量％〜約５０重
量％、例えば、約１重量％〜約４０重量％、約１重量％〜約３０重量％、約１重量％〜約
２０重量％、約１重量％〜約１０重量％、約１重量％〜約５重量％、約５重量％〜約５０
重量％、約１０重量％〜約５０重量％、約２０重量％〜約５０重量％、約３０重量％〜約
５０重量％、または約４０重量％〜約５０重量％の量でＩＯ−ＮＰ中に（例えば、ＩＯ−
ＮＰのコア内に）存在することができる。ある実施形態では、金属でドープされたＩＯ−
ＮＰは、約０．０１〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、例えば、約０．０１〜約９．０ｍｇ／ｍｌ
、約０．０１〜約８．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１〜約７．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１〜約
６．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１〜約５．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１〜約４．０ｍｇ／ｍｌ
、約０．０１〜約３．０ｍｇ／ｍｌ、約１．０〜約２．０ｍｇ／ｍｌ、約２．０〜約１０
．０ｍｇ／ｍｌ、約３．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約４．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、
約５．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約６．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約７．０〜約１０
．０ｍｇ／ｍｌ、約８．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、または約９．０〜約１０．０ｍｇ／
ｍｌのドーピング金属濃度を有することができる。ある実施形態では、金属でドープされ
たＩＯ−ＮＰは、約５．０〜約６．０ｍｇ／ｍｌのドーピング金属濃度を有することがで
きる。

ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰは１つ以上のマトリックス分解酵素および／ま
たは過酸化物生成酵素にコンジュゲートすることができる。例えば、限定されないが、Ｉ
Ｏ−ＮＰとコンジュゲートした酵素は、バイオフィルムマトリックス内の成分、例えばグ
ルカンおよびフルクタンを分解してグルコースおよびフルクトースを生成し、Ｈ_２Ｏ_２を
バイオフィルム内に放出することができる。そして、ＩＯ−ＮＰは、Ｈ_２Ｏ_２を触媒して
マトリックス分解および／または殺菌のためのフリーラジカルを生成することができる。
さらに、マトリックス分解酵素はバイオフィルムマトリックス分解に役立ち得る。適切な
酵素の非限定的な例としては、デキストラナーゼ、ムタナーゼ、グルコース／フルクトー
ス／ガラクトース−オキシダーゼおよびそれらの組み合わせが挙げられる。マトリックス
分解酵素の更なる非限定的な例には、ＤＮＡｓｅ、ヌクレアーゼ、ディスパーシン、グリ
コシドヒドロラーゼ、プロテアーゼ、ズブチリシン、および、グルカノヒドロラーゼが含
まれる。当技術分野で公知の任意の技術を用いて酵素をＩＯ−ＮＰにコンジュゲートする
ことができる。ある実施形態では、酵素は、酵素の帯電基へのＩＯ−ＮＰの静電的付着に
よりＩＯ−ＮＰにコンジュゲートすることができる。代替的にまたは追加的に、グルタル
アルデヒドまたはカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて酵素をポリマ
ー被覆ＩＯ−ＮＰにコンジュゲートしてＩＯ−ＮＰを活性化した後、活性化されたＩＯ−
ＮＰを酵素のアミン基に架橋することができる。

本開示は、本明細書に記載の１つ以上のＩＯ−ＮＰ、例えば、ＩＯ−ＮＰおよび／また
は酵素にコンジュゲートされたＩＯ−ＮＰとＨ_２Ｏ_２とを含む組成物をさらに提供する。
ある実施形態では、組成物中に存在するＩＯ−ＮＰはポリマーコーティング、例えばデキ
ストランを有する。ある実施形態では、組成物中に存在するＩＯ−ＮＰはポリマーコーテ
ィングを有さない。ある実施形態では、組成物中に存在するＨ_２Ｏ_２は、過炭酸ナトリウ
ムのような他の化学物質から生成され得る。例えば、限定するものではないが、本開示の
組成物は過炭酸ナトリウムを含むことができ、過炭酸ナトリウムがＨ_２Ｏ_２を生成する。

ある実施形態では、組成物は、約０．０１％〜約３．０％（ｖ／ｖ）の濃度でＨ_２Ｏ_２
を含むことができる。ある実施形態では、組成物は、約０．０５％〜約３．０％、５％、
０．１％〜約０．２５％、約０．１％〜約０．５％、約０．１％〜約０．７５％、約０．
１％〜約１．０％、約０．１％〜約１．５％、約０．１％〜約１．７５％、約０．１％〜
約２．０％、約０．１％〜約２．２５％、約０．１％〜約２．５％、または約０．１％〜
約２．７５％の濃度でＨ_２Ｏ_２を含むことができる。ある実施形態では、１つ以上のＩＯ
−ＮＰはＨ_２Ｏ_２を触媒して、バイオフィルムの細胞外マトリックスの分解および／また
は消化し、かつ／または細菌を殺菌することができる１つ以上のフリーラジカルを形成す
る。例えば、限定されないが、１つ以上のフリーラジカルは、バイオフィルムの細胞外マ
トリックスを分解すると同時に細菌を殺菌することができる。ある実施形態では、ＩＯ−
ＮＰはＨ_２Ｏ_２を触媒してフリーラジカル、例えば、限定するものではないが、ヒドロキ
シルラジカル（・ＯＨ）を生成することができる。

ある実施形態では、本開示の組成物は、サイズ（例えば、直径）および組成が異なるＩ
Ｏ−ＮＰを含むことができる。例えば、限定するものではないが、本開示の組成物は、ポ
リマーコーティングを有するＩＯ−ＮＰと、ポリマーコーティングを有さないＩＯ−ＮＰ
との混合物を含むことができる。ある実施形態では、本開示の組成物は、異なるポリマー
コーティングを有するＩＯ−ＮＰの混合物を含むことができ、例えば、組成物内の１つ以
上のＩＯ−ＮＰはデキストランコーティングを有することができ、組成物内の１つ以上の
ＩＯ−ＮＰは変性デキストランコーティングを有することができる。代替的または追加的
に、ある実施形態では、本開示の組成物は、組成が異なるＩＯ−ＮＰを含み得る。例えば
、本開示の組成物は、様々な金属、例えばＭｇおよび／またはＭｎでドープされたＩＯ−
ＮＰの混合物を含むことができる。

配合物および製品
本開示の主題は、開示されたＩＯ−ＮＰ組成物、例えば、１つ以上のＩＯ−ＮＰを含む
組成物および／または１つ以上のＩＯ−ＮＰおよびＨ_２Ｏ_２を含む組成物を組み込んだ配
合物をさらに提供する。例えば、限定するものではないが、配合物には、組成物を口腔内
に送達するための口腔ケア製品および製品、および、組成物を医療デバイス、船舶材料お
よび／または船舶または工業材料に送達するための市販の製品が含まれる。ある実施形態
では、組成物は、医療デバイス（例えば、医療用チューブ、カテーテル）製造用材料、口
腔用補綴物（例えば、義歯、インプラント）製造用材料、および、工業材料（例えば、パ
イプ、船体）製造用材料に組み込むことができる。ある実施形態では、本開示の配合物は
局所的に適用することができ、例えば、治療として慢性創傷または皮膚疾患に適用するこ
とができる。ある実施形態では、本開示の配合物は、工業材料または船体の１つ以上の表
面をコーティングするためのスプレーおよび／または塗料として使用することができる。

ある実施形態では、本開示の組成物および／または配合物は、上述のＩＯ−ＮＰを、約
０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、例えば、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ
、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約
０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約０．７５ｍｇ／ｍｌ、
約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約０．１ｍｇ／ｍ
ｌ、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約０．０５ｍｇ／ｍｌ、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／
ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約
１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約
５ｍｇ／ｍｌ、または約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度で含むことができる。ある
実施形態では、本開示の配合物および／または組成物はＩＯ−ＮＰを約０．５ｍｇ／ｍｌ
の濃度で含むことができる。

ある実施形態では、本開示の配合物は、上述の組成物と、フッ化物、例えばフッ化ナト
リウムとを含むことができる。ある実施形態では、フッ化物は、約１０ｐｐｍ（ｐａｒｔ
ｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）〜約５，０００ｐｐｍ、例えば、約１００ｐｐｍ〜約４，
５００ｐｐｍ、約１００ｐｐｍ〜約４，０００ｐｐｍ、約１００ｐｐｍ〜約３，５００ｐ
ｐｍ、約１００ｐｐｍ〜約３，０００ｐｐｍ、約１００ｐｐｍ〜約２，５００ｐｐｍ、約
１００ｐｐｍ〜約２，０００ｐｐｍ、約１００ｐｐｍ〜約１，５００ｐｐｍ、約１００ｐ
ｐｍ〜約１，０００ｐｐｍ、約１００ｐｐｍ〜約５００ｐｐｍ、または約２００ｐｐｍ〜
約４００ｐｐｍの濃度で、本開示の配合物中に存在することができる。ある実施形態では
、フッ化物は約２００ｐｐｍ〜約３００ｐｐｍ、例えば、約２５０ｐｐｍの濃度で存在す
る。ある実施形態では、フッ化物は約５，０００ｐｐｍの濃度で存在する。

ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰ組成物、例えば酵素にコンジュゲートした１つ
以上のＩＯ−ＮＰを含む組成物は、当該組成物を口腔に送達するための配合物に組み込む
ことができる。例えば、限定されるものではないが、組成物を液体配合物またはゲル配合
物、スプレーに組み込むことができる。ある実施形態では、液体配合物は担体を含むこと
ができ、例えば、限定されないが、生理食塩水、デキストロース、水、等張食塩水、植物
油または鉱油などの油、油性エステル、エチルアルコールなどのアルコールである。ある
実施形態では、液体配合物は、懸濁剤、分散または湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、保存剤、緩
衝剤、塩、着香剤、着色剤、甘味剤、増粘剤を含む、１つ以上の他の成分をさらに含むこ
とができる。ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰ組成物は口腔ケア製品に組み込むこ
とができる。口腔ケア製品の非限定的な例には、練り歯磨き、口内洗浄剤、歯美白製品、
研磨性歯磨ジェル、義歯洗浄剤、非研磨性歯磨ジェル、義歯洗浄剤または浸漬液、義歯接
着剤またはセメント、ゲル、エマルジョン、ワニス、修復材料（例えば、セラミック、樹
脂など）、歯科充填材、口腔ゲルストリップ製品、チューインガム、キャンデー、および
、飲料が含まれる。口腔用途が意図される配合物は当技術分野で公知の任意の方法に従っ
て調製することができる。

ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰ組成物は、当該組成物を医療デバイスまたは工
業材料に送達するための配合物に組み込むことができる。例えば、組成物は上述したよう
に液体配合物に組み込むことができる。ある実施形態では、組成物は、様々なｐＨ値およ
びイオン強度を有する希釈剤（例えば、トリス、クエン酸塩、酢酸塩またはリン酸塩緩衝
液）；ＴＷＥＥＮ（商標）またはポリソルベートなどの可溶化剤；チメロサール、パラベ
ン、ベンジルアルコニウムクロライドまたはベンジルアルコールなどの保存剤；アスコル
ビン酸またはメタ重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；および、リジンまたはグリシンな
どの他の成分を含む、潤滑剤、軟膏、クリームまたはゲルに組み込むことができる。代替
的にまたは追加的に、カテーテルまたはチューブの表面および／またはその内部のバイオ
フィルムの形成を防止するために、カテーテルまたは医療用チューブ材料に本開示のＩＯ
−ＮＰ組成物を含浸させることができる。

使用方法
本開示の主題は、開示された組成物および／または配合物を使用する方法をさらに提供
する。本開示の方法は、バイオフィルムおよび／またはバイオフィルム関連感染症を治療
および／または防止するために使用することができる。例えば、限定するものではないが
、本開示の組成物または配合物の投与は、バイオフィルムの形成を阻害し、バイオフィル
ムの更なる蓄積を阻害し、存在するバイオフィルムの破壊または分解を促進し、および／
または存在するバイオフィルムを弱体化する。例えば、限定するものではないが、本開示
の組成物および／または配合物は、口腔疾患を促進するバイオフィルムを処理するために
使用することができる。口腔疾患には、口腔または関連する医学的状態に影響を及ぼす疾
患および障害が含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、口腔疾患には、齲蝕や、
歯肉炎、成人歯周炎、早期発症性歯周炎、インプラント周囲炎および歯内感染症などの歯
周病が含まれるが、これらに限定されない。

ある実施形態では、本開示の組成物または配合物は、例えば、義歯の口内炎および口腔
カンジダ症を含む、バイオフィルム関連粘膜感染症を治療および／または防止するために
使用することができる。ある実施形態では、開示される主題の方法は、限定するものでは
ないが、齲蝕、粘膜感染症、口腔疾患、尿路感染症、カテーテル感染症、中耳炎、創傷、
人工関節および人工弁などの移植医療デバイスの感染症、および、ヒト感染症などを含む
、バイオフィルム関連疾患などの疾患または障害を治療および／または防止するために使
用することができる。

本明細書において「治療」（および「治療する」などのその文法的変形）は、治療対象
の個体の自然経過を変えようとする臨床的介入を意味し、予防のためにまたは疾患の治療
過程中に行うことができる。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の防止、症
状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的影響の減少、疾患の進行速度の低下また
は疾患状態の改善が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、本開示の組
成物および配合物は、疾患の発症を遅延させるために、または疾患の進行を遅らせるため
に使用することができる。ある実施形態では、治療は、存在するバイオフィルムの排除、
除去および／または低減を指し得る。ある実施形態では、防止とは、表面上のバイオフィ
ルムの発生または形成を妨げることを指し得る。

本明細書において交換可能に使用される「個体」、「患者」または「対象」は哺乳動物
を指す。哺乳動物には、限定されないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウ
マ）、霊長類（例えば、ヒトや、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば
、マウス、ラット）が含まれる。ある実施形態では、個体または対象はヒトである。

ある実施形態では、対象における口腔疾患の防止および治療、および／または、バイオ
フィルムの防止および治療をする方法は、有効量の本開示の組成物および／または配合物
を対象に投与するステップを含み得る。ある実施形態では、この方法は、ＩＯ−ＮＰおよ
び／または酵素にコンジュゲートしたＩＯ−ＮＰを含む組成物または配合物を対象に投与
するステップを含む。ある実施形態では、本開示の組成物および／または配合物は、限定
されないが、約１０分未満、約９分未満、約８分未満、約７分未満、約６分未満、約５分
未満、約４分未満、約３分未満、約２分未満または約１分未満などの期間の短い時間間隔
で対象に投与することができる。

本明細書で使用される「有効量」は、必要な用量および期間において、所望の治療また
は予防結果を達成するのに有効な量を指す。疾患の防止または治療のために、本開示の組
成物または製剤の適切な量（例えば有効量）は、治療または防止対象の疾患のタイプ、疾
患の重篤度および経過に依存する。投薬レジメンは最適な治療レスポンスが得られるよう
に調節され得る。

ある実施形態では、上記方法は、過酸化水素を含む溶液の投与などにより、対象に過酸
化水素の投与するステップをさらに含むことができる。代替的または追加的に、過酸化水
素はＩＯ−ＮＰを含む組成物および／または配合物中に存在することができる。例えば、
限定するものではないが、過酸化水素は、過炭酸ナトリウムを使用して、ゲル様製品、例
えば練り歯磨きに配合することができ、ゲル様製品はさらに１つ以上のＩＯ−ＮＰを含む
。ある実施形態では、過炭酸ナトリウムは、組成物および／または配合物内に存在して、
水の存在下でまたは口内に入れたときに過酸化水素を放出することができる。このような
組成物および／または配合物は、水溶液と接触したときに、または口内に入れたときに組
成物および／または配合物から過酸化水素を放出させることができ、それにより、過酸化
水素とＩＯ−ＮＰとの反応をｉｎ ｓｉｔｕで発生させることができる。

ある実施形態では、溶液、組成物および／または配合物は、約０．１％〜約０．２５％
、約０．１％〜約０．５％、約０．１％〜約０．７５％、約０．１％〜約１．０％、約０
．１％〜約１．５％、約０．１％〜約１．７５％、約０．１％〜約２．０％、約０．１％
〜約２．２５％、約０．１％〜約２．５％、約０．１％〜約２．７５％または約０．１％
〜約３．０％の濃度で過酸化水素を含むことができる。ある実施形態では、溶液、組成物
および／または配合物は、約０．１％〜約１．０％の濃度で過酸化水素を含むことができ
る。ある実施形態では、溶液、組成物および／または配合物は、約０．１％〜約０．５％
の濃度で過酸化水素を含むことができる。

ある実施形態では、上記方法は、有効量のフッ化物を投与するステップをさらに含むこ
とができる。ある実施形態では、フッ化物は、ＩＯ−ＮＰおよび／または過酸化水素を含
む組成物および／または配合物中に存在し得る。例えば、限定されるものではないが、フ
ッ化物は、上述したように、ゲル様製品中に配合することができ、ゲル様製品中はさらに
１つ以上のＩＯ−ＮＰおよび／または過酸化水素を含む。ある実施形態では、フッ化物は
、約１０ｐｐｍ（ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）〜約１０，０００ｐｐｍ（例え
ば、約５，０００ｐｐｍ）の濃度で、本開示の組成物および／または配合物中に存在し得
る。

ある実施形態では、本開示の組成物または配合物は、１回のまたは一連の治療にわたっ
て対象に投与することができる。ある実施形態では、複数に分割して毎日投与してもよく
、または治療状況の緊急性によって用量を比例的に減少させてもよい。例えば、限定する
ものではないが、本明細書に開示される組成物および配合物は、毎日２回、毎日１回、２
日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、１週間に１回、２週間に
１回、３週間に１回、毎月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、６ヶ月に１回または１
年に１回、対象に投与することができる。ある実施形態では、本開示の組成物または配合
物、例えば、マトリックス分解酵素および／または過酸化物生成酵素にコンジュゲートさ
れた１つ以上のＩＯ−ＮＰおよび／または１つ以上のＩＯ−ＮＰを含む組成物を毎日２回
対象に投与することができる。ある実施形態では、１つ以上のＩＯ−ＮＰを、例えば口内
洗浄配合物に含む組成物を、毎日１回または２回対象に投与し、続いて、Ｈ_２Ｏ_２を、毎
日１回または２回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、ま
たは週に１回投与することができる。ある実施形態では、１つ以上のＩＯ−ＮＰ、および
、Ｈ_２Ｏ_２を生成する過炭酸ナトリウムを含む組成物を、例えばゲル系配合物で、対象に
、毎日１回または２回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回
、または週に１回投与することができる。

本開示はさらに、バイオフィルム内の細菌増殖の防止方法を提供する。ある実施形態で
は、本方法は、バイオフィルムを有する表面を、１つ以上の鉄ナノ粒子を含む有効量の本
明細書に開示する組成物および／または配合物と接触させるステップを含むことができる
。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子は表面に結合して鉄を放出し、バイオフィル
ム内の細菌の増殖を阻害する。

本開示はさらに、表面上でバイオフィルムの形成を防止する方法を提供する。ある実施
形態では、表面上でバイオフィルムの形成を防止する方法は、バイオフィルムが発達する
「リスクのある」表面を、１つ以上の鉄ナノ粒子を含む、有効量の本明細書に開示される
組成物および／または配合物で処理するステップを含む。ある実施形態では、本方法は「
リスクのある」表面をＨ_２Ｏ_２と接触させるステップをさらに含むことができる。例えば
、限定されるものではないが、１つ以上の鉄ナノ粒子を含む有効量の本明細書に開示され
る組成物および／または配合物を、スプレーまたは塗装などによって表面にコーティング
することができる。バイオフィルムが発達する「リスクのある」表面には、限定されない
が、アパタイト表面、例えば、骨および歯の表面、歯内管、インプラント表面、医療デバ
イス表面、例えば、カテーテルおよび機器、ならびに、工業材表面および船舶表面（ｎａ
ｖａｌ ｓｕｒｆａｃｅ）、例えば、パイプ表面および船体表面が含まれる。ある実施形
態では、表面は、医療デバイスや工業材料および／または船舶材料の内面および／または
外面であり得る。

本開示の主題は、歯の脱灰を防止する方法をさらに提供する。ある実施形態では、脱灰
を防止する方法は、バイオフィルムを有する歯エナメル質またはアパタイト（例えば、骨
）表面を、１つ以上の鉄ナノ粒子を含む有効量の組成物と接触させるステップを含むこと
ができる。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子は、表面に結合してエナメル質また
はアパタイトの溶解を阻害および／または防止する。

本明細書に開示される主題はさらに、医療デバイスまたは料および／または船舶材料の
表面上において、バイオフィルムを処理および排除し、かつ／またはバイオフィルムの形
成を防止する方法を提供する。ある実施形態では、本方法は、医療デバイス、例えば、カ
テーテル、インプラント、人工関節、チューブ、移植デバイス、または、工業材料および
／または船舶材料、例えばパイプ、容器、リアクタ、タービンまたは船体を、本明細書中
に開示される組成物または配合物と接触させるステップを含むことができる。ある実施形
態では、上記方法は、医療デバイスまたは工業材料の表面を、酵素にコンジュゲートされ
たＩＯ−ＮＰまたはＩＯ−ＮＰを含む組成物または配合物と接触させるステップを含むこ
とができる。ある実施形態では、上記方法は、医療デバイスまたは工業材料の表面をＨ_２
Ｏ_２と接触させるステップをさらに含むことができる。ある実施形態では、本開示の組成
物または配合物を医療デバイスまたは工業材料および／または船舶材料を製造するための
材料に組み込み、医療デバイスまたは工業材料および／または船舶材料の表面上のバイオ
フィルムの形成を防止、最小化および／または低減することができる。

キット
本明細書に開示される主題は、上記のバイオフィルムの処理および／または防止のため
のキットをさらに提供する。例えば、限定するものではないが、本開示のキットは、本明
細書に開示される１つ以上の組成物または配合物を、例えば、１つ以上の容器内に含むこ
とができる。

ある実施形態では、キットは、本明細書に記載された１つ以上の組成物または配合物を
含む容器と、当該容器上のまたは当該容器と関連付けられたラベルまたは添付文書とを含
むことができる。ある実施形態では、本明細書に開示される主題のキットは、本開示の主
題のＩＯ−ＮＰ組成物または配合物を含む容器を含むことができる。ある実施形態では、
本発明の主題のキットは、本明細書に開示された主題のＩＯ−ＮＰ組成物または配合物を
含む第１の容器と、過酸化水素を含む第２の容器とを含むことができる。ある実施形態で
は、キットは、投薬レジメンなどの使用説明書をさらに含むことができる。適切な容器の
非限定的な例には、ボトル、バイアル、溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラスやプ
ラスチックなどの様々な材料で形成することができる。

以下の実施例は、本発明をより完全に説明するために提供されるが、本発明の範囲を限
定するものと解釈されるべきではない。

実施例１
バイオフィルムは微生物が表面上に蓄積するにつれて発達し、エキソポリサッカリド（
ＥＰＳ）などのポリマー物質を含む細胞外マトリックス内に封入された構造化集団を形成
する。細胞外マトリックスは空間的・微環境的な不均一性を作り、またバイオフィルム内
に拡散制限バリアを提供することにより、病原体の増殖および抗菌剤に対する防御を局所
的にモジュレートする。そのため、マトリックスはバイオフィルムおよびバイオフィルム
関連疾患の処理／治療に対する薬剤有効性を実質的に阻害する。

複雑な口腔マイクロバイオーム内では、ストレプトコッカス・ミュータンス（ｓ．ｍｕ
ｔａｎｓ）が常に最も多く存在する生物であるとは限らないが、ストレプトコッカス・ミ
ュータンスは、スクロースに頻繁に曝されると、薄膜で被覆された歯の上において、薄膜
および細菌表面上のＥＰＳ合成を介する齲蝕原性バイオフィルムの形成を迅速に指揮する
ことができる。ｉｎ ｓｉｔｕで形成されたＥＰＳは、空間的に不均一な拡散を制限する
マトリックスを形成しながら、歯上への微生物の局所的な蓄積を促進する。並行して、糖
がマトリックスに埋め込まれた細菌によって発酵し、高酸性のミクロ環境が作り出される
（図１）。齲蝕原性（酸耐性および酸産生）フローラが繁殖しつつ、低ｐＨのニッチがＥ
ＰＳ合成を誘導する。その結果、局所的な酸性によって連続的なバイオフィルムの付着と
、隣接歯のエナメル質の酸溶解が起こり、齲蝕が発症する。さらに、細胞外マトリックス
により形取られた局所的な細菌クラスターは抗菌剤に対して抵抗性となり、バイオフィル
ムの排除が極めて困難となる。マトリックスは薬物の有効性を阻害しつつ保護的な疾患発
症環境を作り出すため、これらのプロセスは他のバイオフィルムおよび関連する感染症を
代表するものである。

バイオフィルムおよび微生物（例えば、ＥＰＳ細胞外マトリックス内に取り込まれた微
生物）を効果的に排除するためには、酸性環境内で、抗バイオフィルム剤を局所的に保持
し、マトリックス構築物を破壊し、存在するマトリックスおよび／または標的の埋め込ま
れた細菌を分解する必要があろう。同時に、エナメル質の酸溶解は局所的に阻止されるべ
きである。本実施例は、病原性口腔バイオフィルムを排除するための、ペルオキシダーゼ
様活性などの生体模倣特性（Gao et al, Nature Nanotech, 2007）を有する酸化鉄ナノ粒
子（ＩＯ−ＮＰ；本明細書ではＭＮＰおよびＣＡＴ−ＮＰともいう）を含む抗バイオフィ
ルム剤を開示する。ＩＯ−ＮＰは、そのナノ触媒特性、生物活性および安全性のために、
生物医学およびグリーンケミストリーの多くの分野において注目を集めている。さらに、
ＩＯ−ＮＰは経済的であり（低コスト、製造容易）、環境に安全である（Hudson et al.,
Green Chemistry, 2014）。また、臨床用途のＦＤＡ承認を受けた最初のナノ物質の１つ
でもある。

この実施例の抗バイオフィルム組成物は、Ｈ_２Ｏ_２と相乗作用して齲蝕原性バイオフィ
ルムを効果的に破壊する生体模倣性（触媒性）およびｐＨ応答性を有する生体適合性ＩＯ
−ＮＰを使用するものであり、ＩＯ−ＮＰを、低ｐＨでＥＰＳ細胞外マトリックスを分解
できると共にバイオフィルム内の細菌を効果的に殺すことができるＨ_２Ｏ_２と併用したバ
イオフィルム排除のための刺激的で革新的なアプローチを提供する（図１および図２）。

ＩＯ−ＮＰは、非常に低コストでスケールアップすることができる簡単かつ適切な手法
によって、容易に入手可能な材料を用いて合成することができる。ＩＯ−ＮＰは従来の水
熱法（Gao et al., Nanoscale, 2014）によって生成した。簡潔に説明すると、塩化第二
鉄（ＦｅＣｌ_３）および酢酸ナトリウムをオートクレーブ反応器中でエチレングリコール
と混合し、一定時間２００℃でインキュベートする。その後、さらに適用するために、生
成したＩＯ−ＮＰを収集する。図３は、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）下で視覚化した上記の
方法によって生成されたＩＯ−ＮＰを示す。

Ｈ_２Ｏ_２と組み合わせたＩＯ−ＮＰの有効性を試験するために、十分に確立されたバイ
オフィルム形成性・酸生成性・マトリックス生成性の口腔内病原体であるストレプトコッ
カス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）を用いて、唾液被覆ヒドロキシアパタイト（ｓ
ａｌｉｖａ ｃｏａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ；ｓＨＡ）表面（歯のエナメ
ル様物質）上に成熟バイオフィルムを形成した。潜在的な臨床的治療レジメンをシミュレ
ートするために、短時間（１分または５分）、低ｐＨ（４．５〜６．５）の低用量のＨ_２
Ｏ_２（≦０．５％）と組み合わせたＩＯ−ＮＰの局所適用を１日２回行った。ＩＯ−ＮＰ
はｓＨＡに効果的に結合することができ、短時間の局所曝露にもかかわらず、バイオフィ
ルム内に保持された（図４）。

図５Ａに示されるように、Ｈ_２Ｏ_２と組み合わせたＩＯ−ＮＰの局所適用は、対照と比
較してバイオフィルム内に埋め込まれたＳ．ｍｕｔａｎｓを有意に殺菌(＞６−ｌｏｇの
減少)し、Ｈ_２Ｏ_２単独に対しては＞４−ｌｏｇの減少を示し、生存細菌集団のほぼ全体
を排除した。さらに、Ｈ_２Ｏ_２と組み合わせたＩＯ−ＮＰは、齲蝕原性バイオフィルムマ
トリックスの主要なＥＰＳ成分である細胞外グルカンの分解を劇的に増加させることがで
き（図５Ｂ）、これは、バイオフィルムの構造的完全性を効果的に破壊し得る（Xiao et
al., PLoS Pathog, 2012）。これらのデータは、多くの臨床用途で広く使用されている安
価で容易に入手可能な「グリーンケミカル物質」であるＨ_２Ｏ_２の抗菌効力および抗バイ
オフィルム活性を劇的に高めるＩＯ−ＮＰの可能性を実証している。

低ｐＨで効果的であることに加えて、ＩＯ−ＮＰはまた、低ｐＨで培地中の細菌の生存
を阻害する能力を有する。図６Ａに示すように、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの増殖は、中性ｐＨで
の細菌増殖と比較して、ＩＯ−ＮＰを用いた酸性ｐＨ（ｐＨ５）で明らかに阻害された。
さらに、生理的温度（３７℃）、低ｐＨ（ｐＨ４．５）でＩＯ−ＮＰから鉄が放出され（
図６Ｂ）、これは、酸性ｐＨでの細菌増殖に対するＩＯ−ＮＰの阻害メカニズムを説明し
得る。さらに、図６Ｃに示すように、ＩＯ−ＮＰはＨ_２Ｏ_２を触媒してフリーラジカルの
生成を劇的に増加させる（図６Ｃ）。これらのデータは、Ｈ_２Ｏ_２と組み合わせたＩＯ−
ＮＰが、病原性口腔バイオフィルム内に見出される酸性ミクロ環境下でフリーラジカルを
生成し得るという証拠となる。

図７に示すように、ＩＯ−ＮＰはまた、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）ビーズの酸溶解
を同時にブロックすることができる。ＨＡビーズは、未処理ＨＡビーズと比較して、酸性
緩衝液中でのインキュベーション後にほぼ完全に溶解した（図７Ａ〜Ｂ）。これとは全く
対照的に、ＨＡビーズの酸溶解はＩＯ−ＮＰの存在下で大きく阻害され、これは、歯エナ
メル質の脱灰を防止するために、本開示の抗バイオフィルム組成物が使用できる可能性を
示している（図７Ｃ）。これらのデータは、本開示の抗バイオフィルム組成物が理想的な
抗バイオフィルム／齲蝕治療アプローチであり得ることを示す。これは、酸性ミクロ環境
下での脱灰を防ぎつつ、マトリックスの破壊を促進し、かつバイオフィルム内で抗菌作用
を有する包括的な多機能戦略を統合する。特定の理論に拘束されることなく、上記抗バイ
オフィルム剤には以下の５つの生物学的特徴がある。すなわち、（１）ＩＯ−ＮＰ（すな
わち、ＭＮＰ）はバイオフィルム形成のリスクのある表面である歯薄膜に効果的に結合し
、短時間の局所曝露後でもバイオフィルム内に保持されること；（２）ＩＯ−ＮＰはｐＨ
応答性であり、細菌増殖を抑制する鉄を酸性ｐＨで放出すること；（３）ＩＯ−ＮＰはＨ
_２Ｏ_２を触媒してマトリックス成分を効率的に分解するフリーラジカルを生成すること；
（４）ＩＯ−ＮＰはバイオフィルム内に埋め込まれた細菌を迅速に殺菌することができる
こと；および、（５）アパタイトの脱灰を防止すること、である（図１）。

本開示のＩＯ−ＮＰ−Ｈ_２Ｏ_２アプローチは、バイオフィルム除去のための非常に有効
な戦略を提供することができる。ＩＯ−ＮＰは、病原性口腔バイオフィルムを抑制するた
めの現在の化学的治療法よりも有利かつ効果的であり得る。第１に、ＩＯ−ＮＰは、短時
間の局所曝露後であってもバイオフィルム内に結合・保持できる。第２に、ＩＯ−ＮＰは
、低濃度（０．１〜０．５％）のＨ_２Ｏ_２を迅速に触媒して、バイオフィルム・マトリッ
クスの破壊および埋め込まれた細菌の殺菌効力を高めるフリーラジカルを生成し、臨床治
療で典型的に使用されるＨ_２Ｏ_２の量を効果的に減少させることができる（最大１０％）
。第３に、ＩＯ−ＮＰにより開始される生物活性が酸性条件下で（正確に最も必要とされ
るときに）最も効果的となる、ｐＨ応答性プロセスであることである。第４に、歯エナメ
ル質および骨の脱灰の防止に重要である、ハイドロキシアパタイトの酸溶解を減少させる
ことができることである。さらに、ＩＯ−ＮＰは、ｉｎ ｓｉｔｕでのＨ_２Ｏ_２触媒作用
により歯の表面からのステイン除去を促進し得る。ＩＯ−ＮＰおよびＨ_２Ｏ_２は、非常に
低コストで大規模に容易に合成することができる、ＦＤＡにより承認された持続可能な材
料であるため、練り歯磨きやマウスウォッシュを含む、様々な口腔ケア製品に組み込むこ
とができる。細胞外マトリックスや微生物殺菌の抵抗性は他のヒト疾患および産業関連問
題に関連するバイオフィルムの全てではないにしても大部分に内在するものであるため、
ＩＯ−ＮＰ−Ｈ_２Ｏ_２の使用は広範な適用性を有する。

実施例２
口内へはアクセスが容易であるため、口腔バイオフィルムはバイオフィルム抑制の新し
い概念を探索するための優れたモデルとなる。歯に形成された病原性バイオフィルムは、
ＥＰＳ豊富なマトリックスの発達過程全体において、Ｓ．ｍｕｔａｎｓなどの毒性種が如
何にして表面上に蓄積・保持されるかの例である（Koo et al., J Dent Res, 2013）。マ
トリックスに埋め込まれた病原体はｐＨ値が４．５付近の高酸性のミクロ環境を生成し、
エナメル質−アパタイトの酸溶解をもたらし、齲蝕として知られる歯腐食プロセスの発症
および進行をもたらし得る（Koo et al., J Dent Res, 2013; Fejerskov et al., J Dent
Res, 1992)。これらの病理学的状態を模倣する実験モデルを用いることにより、本実施
例は、触媒ナノ粒子（ＣＡＴ−ＮＰ）の抗バイオフィルムメカニズムおよびＣＡＴ−ＮＰ
のＨ_２Ｏ_２活性化有効性を実証する。本実施例はまた、Ｈ_２Ｏ_２と組み合わせたＣＡＴ−
ＮＰがバイオフィルム関連口腔疾患の発症を防止する有効性を示す。

バイオフィルム内の鉄ナノ粒子の効果的な保持および鉄ナノ粒子のｉｎ ｓｉｔｕの活
性は、インビボでの鉄ナノ粒子の生物学的有効性に寄与する（Hannig and Hannig, Natur
e Nanotechnol, 2010; Allaker and Memarzadeh, Int J. Antimicrob Agents, 2014）。
ＣＡＴ−ＮＰが短期曝露（５分または１０分）の局所処置後にバイオフィルム内に保持さ
れているかどうかを調べるために以下の実験を行った。下記のとおりソルボサーマル法に
よりＣＡＴ−ＮＰを合成した（Gao et al., Nat Nanotechnol, 2007; Deng et al., Ange
w Chem Int Edit, 2005も参照）。この方法を用いて直径２１３±２６ｎｍの内在性ペル
オキシダーゼ様活性を有するナノ粒子を生成した（図８）。簡潔に説明すると、０．８２
ｇのＦｅＣｌ_３を４０ｍｌのエチレングリコールに溶解して透明な溶液を得た。次いで、
３．６ｇのＮａＡｃを３０分間激しく撹拌しながら溶液に添加した。この混合物をテフロ
ン（登録商標）で裏打ちされたステンレス鋼製オートクレーブ（５０ｍｌ）に移し、２０
０℃で１２時間インキュベートした。室温に冷却した後、沈殿物を回収し、エタノールで
数回リンスし、次いで６０℃で３時間乾燥させた。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；Ｐｈｉｌ
ｉｐｓ ＸＬ−３０フィールド、１５ｋＶ）および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ；ＨＩＴＡ
ＣＨＩ Ｈ７６５０、１２０ｋＶ）を用いて合成したナノ粒子の特性解析を行った。鉄ナ
ノ粒子のペルオキシダーゼ様活性を、２０μｇのＣＡＴ−ＮＰ、１％のＨ_２Ｏ_２および１
００μｇのＴＭＢを含む５００μｌ ＮａＯＡｃ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ４．５）の混合
物中で試験した。生成した青色は６５２ｎｍの吸光度で分光光度計により記録した。これ
らの条件はバイオフィルム上のＣＡＴ−ＮＰの活性のアッセイにも使用した。ＣＡＴ−Ｎ
Ｐの活性を確認するために、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）およびＡＭＰＬＥ
Ｘ（登録商標）ＵｌｔｒａＲｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
；５６８／５８１ｎｍ）の２つの追加の基質も同じ反応条件下で使用した。化学物質およ
び材料は、別段の指定がない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のものを使用した。

十分に確立されたバイオフィルム形成性・酸生成性・マトリックス生成性の口腔内病原
体であるストレプトコッカス・ミュータンスを用いて、バイオフィルムを唾液被覆ヒドロ
キシアパタイト（ｓＨＡ）表面（歯エナメル質様物質）上に形成した（図９）。ヒドロキ
シアパタイトディスク（表面積２．７±０．２ｃｍ^２）はＣｌａｒｋｓｏｎ Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒａｐｈｙから購入し、細菌株ストレプトコッカス・ミュータンスＵＡ１５９は
ＡＴＣＣから購入した。このバイオフィルム法は、唾液被覆ハイドロキシアパタイト（ｓ
ＨＡ）ディスクモデルに基づく（Xiao et al., PLoS Pathog. 2012; Klein et al., J Vi
s Exp. 2011; Falsetta et al., Infect Immun., 2014; Koo et al., J Bacteriol, 2010
; Koo et al., J Antimicrob Chemother, 2003を参照）。ハイドロキシアパタイトディス
クをフィルター滅菌した浄化全唾液でコーティングし、歯の自由な平滑表面を模倣するよ
うに設計されたカスタムメイドのワイヤーディスクホルダーを用いて２４ウェルプレート
に垂直に懸濁した（図９）（Klein et al., J Vis Exp. 2011）。ストレプトコッカス・
ミュータンスＵＡ１５９細胞を、１％スクロースを含有する限外濾過（１０−ｋＤａカッ
トオフ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）トリプトン−酵母抽出物（Ｕ
ＦＹＴＥ）ブロス中、３７℃、５％ＣＯ_２で、中間指数増殖期まで増殖させた。各ｓＨＡ
ディスクを、ストレプトコッカス．ミュータンス（１０^５ＣＦＵ ／ｍｌ）の規定された
微生物集団を有する接種材料を含む１％（ｗ／ｖ）スクロースを含む２．８ｍｌのＵＦＹ
ＴＥ培地に入れ、３７℃、５％ＣＯ_２で１９時間インキュベートした。実験期間（４３時
間）が終了するまで、培地を新鮮な培地と１日２回交換した（１９時間目および２９時間
目）。特定の時点（１９時間、２９時間および４３時間）で、バイオフィルムを収集し、
共焦点蛍光イメージング、微生物学的分析および生化学的分析によって分析した（Xiao e
t al., PLoS Pathog. 2012; Klein et al., J Vis Exp.2011; Falsetta et al., Infect
Immun., 2014; Koo et al., J Bacteriol, 2010; Koo et al., J Antimicrob Chemother,
2003）。

病原性の状態を模倣するために、スクロースの存在下でバイオフィルムを形成する。ス
クロースは、エキソポリサッカライド（ＥＰＳ）合成および酸生成（ｐＨ値はこのバイオ
フィルムモデルにおいて４．５〜５．０に達し、ヒトの病変部位におけるプラークのｐＨ
と一致する）の基質を提供する（Koo et al., J Dent Res. 2013）。走査型電子顕微鏡法
（図１０Ａ１）、エネルギー分散型分光法（ＥＤＳ）（図１０Ａ２）、および、誘導結合
プラズマ発光分析法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）（図１０Ｂ）はすべて、ＣＡＴ−ＮＰがバイオフ
ィルムに結合することを示した。バイオフィルムへのＣＡＴ−ＮＰの最大結合は、０．５
ｍｇ／ｍｌの濃度で達成された（図１０Ｂ）。

バイオフィルム内のＣＡＴ−ＮＰ結合の定量的評価は誘導結合プラズマ発光分析法（Ｉ
ＣＰ−ＯＥＳ）を用いて行った。簡潔に説明すると、特定の時点において、室温で５分ま
たは１０分間、０．１Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）中のＣＡＴ−ＮＰ（０ｍｇ／ｍｌ、
０．１２５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌまたは２
ｍｇ／ｍｌ）でバイオフィルムを処理した（図９）。バイオフィルムをｓＨＡディスクか
ら取り出し、標準的な水浴超音波処理、その後のプローブ音波処理によってホモジナイズ
した（Xiao et al., PLoS Pathog, 2012）。懸濁液を遠心分離し、バイオフィルムペレッ
トを水で２回洗浄して非結合物質を除去した。次いでペレットを６０℃で一晩、２５０μ
ｌの王水（ＨＣｌ／ＨＮＯ_３＝３：１）で溶解した（Naha et al., J Mater. Chem. Biol
. Med., 2014）。次いで、４．７５ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加え、サンプルの鉄含有量
をＩＣＰ−ＯＥＳによりについて分析した。別個の実験でｉｎｔａｃｔなバイオフィルム
を環境制御型ＳＥＭで検査し、同じＳＥＭ上でエネルギー分散分光法（ＥＤＳ）によって
鉄の量を分析した。

ｉｎｔａｃｔなバイオフィルムの３次元アーキテクチャ内のＣＡＴ−ＮＰの保持および
空間分布を決定するために、多光子共焦点顕微鏡法およびコンピュータ分析を用いた（Xi
ao et al., PLoS Pathog. 2012; Klein et al., J Vis Exp, 2011; Koo et al., J Bacte
riol, 2010）。１μＭのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識デキストランコンジュゲー
ト（１０ｋＤａ；６４７／６６８ｎｍ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．，
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてエキソ
ポリサッカライド（ＥＰＳ）（赤色）を標識し、細菌（緑色）を２．５μＭのＳＹＴＯ
９（４８５／４９８ｎｍ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）で染色した。
ＣＡＴ−ＮＰ（白色）は、多光子共焦点顕微鏡法を用いて、それらの固有の非線形光学特
性により検出した（Xiao et al., PLoS Pathog, 2012; Klein et al., J Vis Exp, 2011;
Liao et al., Adv Funct Mater, 2013; Koo et al., J Bacteriol, 2010; Liao et al.,
Adv Funct Mater, 2013）。画像化は２０×ＬＰｌａｎ Ｎ（開口数１．０５）の水浸対
物レンズを備えたＬｅｉｃａ ＳＰ５多光子共焦点顕微鏡を用いて行った。励起波長は７
８０ｎｍであり、ＳＹＴＯ ９の検出に使用した発光波長フィルタは４９５／５４０ Ｏ
ｌｙＭＰＦＣ１フィルタであり、また、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７の検出に使用し
たフィルタはＨＱ６５５／４０Ｍ−２ｐフィルタである。ＣＡＴ−ＮＰの励起波長は９１
０ｎｍであり、これは、ＳＹＴＯ ９またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７を励起しない
。ソフトウェアを用いて共焦点画像を分析し、ｉｎｔａｃｔなバイオフィルム内のＥＰＳ
、細菌細胞およびＣＡＴ−ＮＰを同時に可視化および定量化した。Ａｍｉｒａ ５．０．
２ソフトウェア・プラットフォーム（Ｍｅｒｃｕｒｙ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ Ｉｎｃ．，Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＭＳ）を使用して、バイオフィルム内の各成分（
ＥＰＳ、細菌およびＣＡＴ−ＮＰ）の三次元レンダリングを作成し、三次元アーキテクチ
ャを視覚化した。ＣＯＭＳＴＡＴおよびＩｍａｇｅＪを使用して従来のとおりに定量分析
した（Xiao et al., PLoS Pathog. 2012; Klein et al., J Vis Exp. 2011; Koo et al.,
J Bacteriol, 2010）。

図１０Ｃに示すように、ｉｎ ｓｉｔｕイメージングにより、ＣＡＴ−ＮＰが局所処理
後にバイオフィルム構造全体に効果的に保持されることが明らかとなった。バイオフィル
ムの厚さ全体（トップからボトムまで）の定量分析により、ＥＰＳおよび細菌バイオマス
の両方が最も多い２５〜１５０μｍの深さの位置にナノ粒子の大部分が見出されたことが
示された（図１０Ｄ）。

バイオフィルムに結合したＣＡＴ−ＮＰが酸性ｐＨ（ｐＨ４．５）でＨ_２Ｏ_２を迅速に
触媒してｉｎ ｓｉｔｕでフリーラジカルを生成できるかどうかを調べるために、３，３
’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いた比色法を用いた（Gao et al.
, Nat Nanotechnol. 2007）。バイオフィルムに結合したナノ粒子は、Ｈ_２Ｏ_２の存在下
でＴＭＢ（ペルオキシダーゼ基質として働く）の反応を触媒し、フリーラジカル生成の結
果として青色を生成した（図１０Ｅ）。青色は６５２ｎｍで最大吸光度を有する。ＣＡＴ
−ＮＰで処理したバイオフィルムにペルオキシダーゼ様活性が存在するかさらに確認する
ために、さらなるペルオキシダーゼ基質（ジアゾ−アミノベンゼン）を用いて実験を繰り
返した（図１１）。

バイオフィルム内に吸着したＣＡＴ−ＮＰ量と一致して、試験条件下、０．５〜２．０
ｍｇ／ｍｌの濃度において最大触媒活性が達成された（図１０Ｅ）。ＣＡＴ−ＮＰによる
Ｈ_２Ｏ_２触媒作用はｐＨに依存する（Gao et al., Nat Nanotechnol, 2007）。したがっ
て、バイオフィルムに結合したＣＡＴ−ＮＰのペルオキシダーゼ様活性をｐＨ値４．５〜
６．５の範囲の緩衝液中で測定した。図１０Ｆに示すように、バイオフィルムに結合した
ＣＡＴ−ＮＰは、酸性ｐＨ（４．５〜５．５）でより大きい触媒効率を発揮し、これは病
理学的条件で見出されるｐＨ値と一致する（Mercier et al., J Antimicrob Chemother,
2002; Poschet et al. Trends Mol Med, 2002; Fejerskov et al., J Dent Res, 1992）
。これらのデータは、短時間の局所適用後に、ＣＡＴ−ＮＰがバイオフィルム内に保持さ
れ、ｉｎ ｓｉｔｕでＨ_２Ｏ_２のｐＨ応答性触媒作用を示したことを示す。

ＣＡＴ−ＮＰ介在型のＨ_２Ｏ_２触媒作用およびｉｎ ｓｉｔｕでのフリーラジカルの生
成が、バイオフィルム内に埋め込まれた細菌を殺菌し、またＥＰＳマトリックスを分解す
ることができるかどうかを調べるために、以下の実験を行った。ＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ_２Ｏ_２
コンビネーションの抗バイオフィルム有効性を評価するために下記４つの処理液を調製し
た：対照（０．１Ｍ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５）、ＣＡＴ−ＮＰ単独（０．１Ｍ ＮａＯ
Ａｃ、ｐＨ４．５中、０．５ｍｇ／ｍｌ）、１％Ｈ_２Ｏ_２（０．１Ｍ ＮａＯＡｃ、ｐＨ
４．５）、ＣＡＴ−ＮＰ＋Ｈ_２Ｏ_２（０．１Ｍ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５中、１％Ｈ_２Ｏ
_２と０．５ｍｇ／ｍｌのＣＡＴ−ＮＰ）。ＣＡＴ−ＮＰ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で処理した
バイオフィルムを直ちにＨ_２Ｏ_２（０．１〜１％、ｖ／ｖ）に暴露し、生存細胞数および
ＥＰＳ含量を決定した（図１３Ａおよび図１４）。

ｓＨＡディスクおよびバイオフィルムを各溶液で５分間または１０分間局所処置し、滅
菌生理食塩水（０．８９％ＮａＣｌ）で３回洗浄して非結合物質を除去し、次いで培地に
移した（図９）。最初の処理を唾液薄膜形成（ｓＨＡ）の直後に施し、処理ｓＨＡディス
クをストレプトコッカス．ミュータンスを含む培地（１０^５ ＣＦＵ／ｍｌ）に移した。
バイオフィルムをｓＨＡディスク上に６時間形成させ、その時点で二回目の処理を施した
。翌日、バイオフィルムを１日２回（１９時間目および２９時間目に）処理した。実験期
間（４３時間）の終わりに、各バイオフィルム中の生存細胞の総数を、形成されたコロニ
ーの数を数えることによって評価した（Koo et al., J Bacteriol, 2010; Klein et al.,
J Vis Exp, 2011; Koo et al., J Antimicrob Chemother, 2003）。ＣＦＵおよび乾燥重
量を評価するため、バイオフィルムをｓＨＡディスクから除去し、最大回収可能生菌カウ
ントを得つつ、細菌細胞を死滅させない標準的な超音波処理によってホモジナイズした。
均質化されたバイオフィルム懸濁液のアリコートを連続希釈し、血液寒天プレート上に播
種し、４８時間のインキュベーション後に、コロニーを目視で計数した。残りのバイオフ
ィルム懸濁液をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で２回洗浄し、（予め秤量したフォイル製ボート内で）
２時間オーブン乾燥し、秤量した。

図１３Ａおよび図１４に示すように、バイオフィルム内のストレプトコッカス・ミュー
タンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に対する非常に強い殺生物効果があり、５分で＞９９．９％
の細菌が死滅した。１％Ｈ_２Ｏ_２曝露と組み合わせたＣＡＴ−ＮＰは、対照バイオフィル
ムまたはＨ_２Ｏ_２を含まないＣＡＴ−ＮＰ処理バイオフィルムと比較して、生存細胞の数
が＞５−ｌｏｇ減少した（図１３Ａ）。図１３Ａに示されるように、ＣＡＴ−ＮＰおよび
Ｈ_２Ｏ_２の組み合わせは、Ｈ_２Ｏ_２単独よりも、ストレプトコッカス．ミュータンスの殺
菌に対して＞５，０００倍効果があり、これは、ＣＡＴ−ＮＰとＨ_２Ｏ_２との間に殺菌効
力を増強する明らかな相乗効果があることを示している。

Ｈ_２Ｏ_２触媒作用により生成したフリーラジカルがインビトロで多糖類を分解すること
もできることを考慮し（Gao et al., Nanoscale, 2014）、Ｈ_２Ｏ_２暴露後、ＣＡＴ−Ｎ
Ｐ処理バイオフィルム中のＥＰＳ量を分析した。ＥＰＳ分解の評価のために、精製グルコ
シルトランスフェラーゼ（ＧｔｆＢまたはＧｔｆＤ）によって産生された１００μｇの（
不溶性または可溶性）グルカン（Koo et al., Antimicrob Agents Chemother, 2002）を
各処理溶液（０．１Ｍ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５）と混合し、３７℃で３０分間インキュ
ベートした。グルカンは以下のように製造した。各Ｇｔｆ酵素（１０Ｕ）をスクロース基
質緩衝液（１００ｍＭスクロース、２０μＭデキストラン ９，０００、５０ｍＭ ＫＣ
ｌ、１．０ｍＭ ＫＰＯ_４，１．０ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ６
．５）と混合し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、産生され
たグルカンを遠心分離によって集め、洗浄し、総量を標準的なフェノール−硫酸比色アッ
セイにより求めた（Koo et al., J Antimicrob Chemother, 2003; Koo et al., Antimicr
ob Agents Chemother, 2002）。１００μｇのグルカンを各処理溶液（０．１Ｍ ＮａＯ
Ａｃ、ｐＨ４．５中、３００μｌの総反応容量）と混合し、振盪しながら３７℃で３０分
間インキュベートした。インキュベーション後、Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ比色分析
によって還元糖の量を決定した。

図１３Ｂに示すように、不溶性ＥＰＳの量と、また、それほどではないが可溶性ＥＰＳ
の量は、ＣＡＴ−ＮＰおよびＨ_２Ｏ_２の存在下では、対照と比較して、あるいはＨ_２Ｏ_２
またはＣＡＴ−ＮＰ単独での処理と比較して、有意に減少した。不溶性ＥＰＳは主にα１
，３結合型グルカンで構成され、可溶性ＥＰＳは主にα１，６結合型グルカンであり、両
者が産生される（Bowen and Koo, Caries Res, 2011）。そのため、ＧｔｆＢ（α１，３
結合グルカンを合成）およびＧｔｆＤ（α１，６結合型グルカンを合成）によって産生さ
れた精製細胞外グルカンがＨ_２Ｏ_２の存在下または非存在下でＣＡＴ−ＮＰとのインキュ
ベーション後に分解されるかどうかをさらに分析した。図１３Ｃは両方のグルカン（特に
ＧｔｆＢ由来のもの）が分解されたことを示し、これはＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ_２Ｏ_２処理後に
当該多糖類から放出されたグルコースの量を測定して決定した。対照的に、Ｈ_２Ｏ_２単独
またはＣＡＴ−ＮＰ単独ではいずれもグルカンを切断することができず、バイオフィルム
内でＥＰＳを減少させることができないという観察と一致した。グルカンまたは同等の多
糖類は他のバイオフィルムの多くのマトリックスのコアを形成するため（Flemming and W
ingender, Nat Rev Microbiol, 2010; Koo et al., J Dent Res. 2013）不溶性ＥＰＳの
分解は非常に関係しており、また、齲蝕および他のバイオフィルム関連疾患に関連してい
る（Hall-Stoodley et al., Nat Rev Microbiol, 2004; Flemming and Wingender, Nat R
ev Microbiol, 2010; Lebeaux et al., Microbiol Mol Biol Rev, 2014; Koo et al., J
Dent Res, 2013; Bowen and Koo, Caries Res, 2011）。まとめると、このインビトロ・
データは、ＣＡＴ−ＮＰとＨ_２Ｏ_２との組み合わせは有害なバイオフィルムを有意に抑制
できることを示唆している。

ＣＡＴ−ＮＰがバイオフィルム内に保持され、Ｈ_２Ｏ_２をｉｎ ｓｉｔｕで触媒してバ
イオフィルム破壊を促進することが示されたことから、１日２回、ＣＡＴ−ＮＰ（０．５
ｍｇ／ｍｌ）で局所処置した直後にＨ_２Ｏ_２（１％、ｗ／ｖ）に暴露する（ＣＡＴ−ＮＰ
／Ｈ_２Ｏ_２）、臨床的に実現可能な併用療法が開発された。Ｈ_２Ｏ_２と組み合わせたＣＡ
Ｔ−ＮＰによってバイオフィルムが破壊され得るか否かを評価するために、この治療レジ
メンをまずインビトロで試験した。共焦点顕微鏡によるイメージングによって、ＣＡＴ−
ＮＰ／Ｈ_２Ｏ_２による処理が細菌細胞（緑色）の蓄積およびＥＰＳ−マトリックス（赤色
）の発達の両方を害することが明らかとなった（図１３Ｄおよび図１５）。対照的に、Ｃ
ＡＴ−ＮＰまたはＨ_２Ｏ_２単独による局所処理では、これらの薬剤を併用した場合の相乗
的増強と一致して、インビトロでは抗バイオフィルム効果が制限された。

実施例３
齲蝕のげっ歯類モデルを使用して、ＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ_２Ｏ_２のインビボでの有効性を試
験し、またＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ_２Ｏ_２がインビボで齲蝕の発症および重症度を抑制できるか
どうかを決定した（Bowen, Odontology, 2013; Falsetta et al., Infect Immun, 2014;
Horev et al., ACS Nano, 2015）。

簡単に説明すると、十分に確立された齲蝕のげっ歯類モデルで動物実験を行った（Bowe
n, Odontology, 2013; Falsetta et al., Infect Immun, 2014; Horev, ACS Nano, 2015;
Koo et al., J Dent Res, 2005）。すなわち、１５日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅ
ｙラットをＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）
からダムと共に購入し、ストレプトコッカス．ミュータンスの感染についてスクリーニン
グした。接種前にストレプトコッカス．ミュータンスに感染していた全ての動物を研究か
ら排除した。次いで、動物を、ストレプトコッカス．ミュータンスＵＡ１５９の活発増殖
（対数中期）培養物を用いて口腔感染させ、感染を口腔スワブでチェックした。感染させ
た動物をランダムに４つの処置群（１２匹／群）に分け、歯をカスタムメイドのアプリケ
ータを用いて１日２回局所的に処置した。処置群は下記の通りである：（１）対照（０．
１Ｍ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５）、（２）ＣＡＴ−ＮＰ単独（０．１Ｍ ＮａＯＡｃ、ｐ
Ｈ４．５中、０．５ｍｇ／ｍｌ）、（３）１％Ｈ_２Ｏ_２（０．１Ｍ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４
．５）、（４）ＣＡＴ−ＮＰ＋Ｈ_２Ｏ_２（０．１Ｍ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５中、１％Ｈ
_２Ｏ_２と０．５ｍｇ／ｍｌのＣＡＴ−ＮＰ）。臨床使用をシミュレートするために、薬剤
は、短時間（３０秒）で、３週間毎日２回、局所適用した（経口；各ラット１００μＬ）
。

各群には、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈの齲蝕原性
食餌２０００および５％スクロース水を自由に与えた。実験は３週間続けた。すべての動
物の体重を毎週測定し、また身体の外観を毎日記録した。すべての動物は実験群の間で等
しく体重が増加し、また実験期間中の状態は良好であった。実験期間の終わりに、動物を
屠殺し、顎を外科的に除去し、切り裂いた。全ての顎から肉を除去し、Ｋｅｙｅｓのシス
テムのＬａｒｓｏｎ改良に従って齲蝕を評価するために歯を準備した（Larson, Animal m
odels in cariology: symposium and workshop proceedings special supplement of mic
robiology abstracts, 1981; Bowen, Odontology, 2013; Falsetta et al., Infect Immu
n, 2014; Horev, ACS Nano, 2015を参照）。顎の齲蝕スコアの決定は、キャリブレート
された１人の試験官によって行われた。さらに、歯肉組織および口蓋組織の両方を採取し
、組織病理学的分析のためにヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色処理した。

この動物モデルでは、歯は、エナメル質脱灰の最初の領域（図１６Ａ、緑色の矢印）か
らさらに破壊（青色の矢印）に進んで齲蝕病変（ヒトで観察されるものに類似）を発症し
、キャビテーションにより特徴付けられる最も重篤な病変（赤色の矢印）が生じた。齲蝕
の発症に対するＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ_２Ｏ_２処理の効果は顕著であった。定量的齲蝕スコアリ
ング分析により、ＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ_２Ｏ_２は、病変の発現および重症度の両方をビヒクル
対照に対して有意に軽減し（図１６Ｂ）、また広範なエナメル質の損傷を完全にブロック
し、それによりキャビテーションの発症を防止することが明らかとなった。対照的に、Ｈ
_２Ｏ_２単独での処置は有意な効果がなかったが、ＣＡＴ−ＮＰ単独での処置は、齲蝕病変
の重篤度をビヒクル対照と比較して若干低減させた（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。ＣＡＴ
−ＮＰ／Ｈ_２Ｏ_２の優れた齲蝕防止効果は、臨床関連モデルにおけるインビボ有効性の強
力な証拠を提供する。さらに、ＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ_２Ｏ_２を局所適用したラットでは有害な
影響は観察されなかった。特に、ＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ_２Ｏ_２処置動物由来の歯肉組織および
口蓋組織の組織病理学的分析は、未処置（またはビヒクル処置）動物と比較した場合、増
殖の変化、炎症反応および／または壊死などの細胞毒性作用の兆候を示さなかった（図１
７）。

上に示したとおり、ＣＡＴ−ＮＰ単独の処置は齲蝕病変の重篤度をある程度低下させた
。特定の理論に縛られることなく、鉄イオンが、鉄イオンの抗菌効果に加えて、エナメル
質の脱灰プロセスを妨害することによって齲蝕を抑制すると思われる（Rosalen et al.,
Arch Oral Biol, 1996; Pecharki et al., Caries Res, 2005; Delbem et al., Caries R
es, 2012; Ribeiro et al., Braz Oral Res, 2012）。酸性ｐＨ（４．５）でインキュベ
ートした場合、鉄イオンは数分以内でＣＡＴ−ＮＰから迅速に放出することができるが、
ｐＨ７．０では放出されない（図１８Ａ）。

ＣＡＴ−ＮＰが酸性ｐＨで鉄を放出することによってアパタイトの酸溶解を低減させる
ことができるかどうかを調べるために、以下の唾液被覆ＨＡビーズ酸溶解アッセイおよび
鉄放出アッセイを使用した。ハイドロキシアパタイト（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）ビーズを濾過滅菌した浄化全唾液でコーティングして唾液被覆ハイドロキシア
パタイト（ｓＨＡ）を得た（Koo et al., Antimicrob Agents Chemother, 2002; Gregoir
e et al., Appl Environ Microbiol, 2011; Ambatipudi et al., J Proteome Res, 2010
）。ｓＨＡ酸溶解アッセイのために、１０ｍｇのｓＨＡビーズを０．５ｍｇ／ｍｌのＣＡ
Ｔ−ＮＰを含有する０．１Ｍ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４．５）１ｍｌ中、２時間室温で
振盪しながらインキュベートした。次いで、上清を除去し、ｓＨＡビーズを１ｍｌの新し
い酸性ＮａＯＡｃ緩衝液に再懸濁し、上記のとおりインキュベートした。このプロセスを
６回繰り返した。同じ手順をＣＡＴ−ＮＰを含まないｓＨＡビーズ（対照）で行った。酸
溶解の直前および直後のｓＨＡのアリコートを採取し、光学顕微鏡（ＯＭ）およびＳＥＭ
により分析した。並行して、残りのｓＨＡビーズを遠心分離によって収集し、オーブン乾
燥し、その乾燥重量を測定するために秤量した。ＣＡＴ−ＮＰで処理したｓＨＡの残りの
乾燥重量を対照群と比較して、ＣＡＴ−ＮＰの脱灰減少効率を評価した。鉄放出アッセイ
のために、０．５ｍｇ／ｍｌのＣＡＴ−ＮＰを０．１Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）中、
室温で０分間、３分間、５分間、１０分間、３０分間、６０分間、１２０分間インキュベ
ートした。混合物を１０，０００ｇで５分間遠心分離し、上清を回収して、鉄濃度をＩｒ
ｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を製造元のプロトコールに従
って測定した。対照として、０．１Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ７）中で放出された鉄の量を上
記と同じ手順を用いて測定した。

図１８Ｂおよび図１８Ｃは、ＣＡＴ−ＮＰの存在下または非存在下で、酸性酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ４．５）中でインキュベートし、次いでＳＥＭで調べ、酸インキュベー
ション後に残留した唾被覆ヒドロキシアパタイト（ｓＨＡ）ビーズの量を分析して測定し
た唾被覆ヒドロキシアパタイト（ｓＨＡ）ビーズのグラフを示す。図１８Ｂに示すように
、ＣＡＴ−ＮＰで処理しなかったｓＨＡビーズは、ほとんど完全に溶解した。対照的に、
ｓＨＡの酸溶解はＣＡＴ−ＮＰの存在下で減少した（図１８Ｂ）。これらの知見は、ＣＡ
Ｔ−ＮＰが、アパタイトの酸溶解を低減させることによる齲蝕防止の更なる機序を提供し
得ることを示唆している。上記実験データの統計解析はＳＡＳ９．５（ＳＡＳ Ｉｎｓｔ
ｉｔｕｔｅ）を用いて行った（Falsetta et al., Infect Immun, 2014）。

抗菌性ナノ粒子などの現在の治療アプローチは、主として細菌の活性阻害や細菌の死滅
に焦点を当てており、バイオフィルムによって引き起こされる感染に対するそれらの有効
性を制限し得る保護性バイオフィルム・マトリックスや酸性ミクロ環境の存在に対処して
いない（Lebeaux et al., Microbiol Mol Biol Rev, 2014; Allaker and Memarzadeh, In
t J Antimicrob Agents, 2014)。

本開示は、臨床的に意義のあるｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいてバイオフィルム関連疾患
に対抗するためにナノ粒子がどのように利用され得るかに関する証拠を提示する。図１は
生体適合性・ｐＨ応答性戦略をまとめたものであり以下の４つの主要な特徴を有する。す
なわち、（１）短時間の局所暴露後にＣＡＴ−ＮＰが三次元バイオフィルム構造内に保持
され、（２）ＣＡＴ−ＮＰは酸性ｐＨでＨ_２Ｏ_２を速やかに触媒してｉｎ ｓｉｔｕでフ
リーラジカルを生成し、（３）同時にフリーラジカルはＥＰＳを分解し、（４）バイオフ
ィルム内に埋め込まれた細菌を殺菌することである。さらに、ＣＡＴ−ＮＰは、酸性ｐＨ
で、アパタイトの脱灰を低下させる鉄イオンを放出し、これはバイオフィルム関連骨疾患
に対して潜在的な価値があり得る（Katsarelis et al., J Dent Res, 2015; Arciola et
al, Adv Exp Med Biol, 2015）。ＣＡＴ−ＮＰは、インビボで正常組織に影響を与えずに
、一般的なバイオフィルム関連疾患の発症を抑制し得る。Ｃａｔ−ＮＰは大規模かつ低コ
ストで合成できる一方、ＣＡＴ−ＮＰ化学の柔軟性は、触媒性能をさらに向上させること
ができる更なるナノクリスタルコアの開発につながり得る（図１９）。したがって、この
アプローチは、口腔疾患および他のヒト感染症、ならびに、工業における生物生着および
海の生物付着に対して局所使用するナノ触媒ベースの抗バイオフィルム治療剤を開発する
ための実現可能な新しいプラットフォームとなる可能性がある。

実施例４
この実施例では、ＩＯ−ＮＰ合成化学の柔軟性を利用してＩＯ−ＮＰの保持、触媒活性
および脱灰ブロック効果をさらに向上させ、その結果、インビトロでのバイオフィルム抑
制に対するＩＯ−ＮＰ／Ｈ_２Ｏ_２システムの有効性を最適化する。

ナノ粒子によるＨ_２Ｏ_２触媒作用の速度およびレベルを高めるために様々な金属塩（Ｍ
ｎＣｌ_２など）をＩＯ−ＮＰ構造に組み込むことができる。さらに、ＩＯ−ＮＰは、歯／
バイオフィルム界面およびバイオフィルム内のＩＯ−ＮＰの保持を高める目的で、生体適
合性デキストランのバリエーションでコーティングすることができる。非晶質リン酸カル
シウムをＩＯ−ＮＰに添加して、酸性ｐＨでのエナメル質脱灰に対する効果を改善するこ
とができる。最適化されたＩＯ−ＮＰの有効性はインビトロで評価することができ、また
（現行のＩＯ−ＮＰに対して）最も有効なナノ粒子をさらなる評価のために選択すること
ができる。

この実施例では、（保持強化のための）デキストランの表面コーティングおよび（触媒
作用強化のための）様々なドーパント材料を有する新規ナノクリスタルコアの小さなライ
ブラリーを製造した。以下に論じるデータは、かかる改変が可能であり、本開示の治療ア
プローチの有効性を高め得ることを実証する。様々なＩＯ−ＮＰ配合物およびドープＩＯ
−ＮＰ配合物を下記表１に示す。表１に示すデキストラン被覆酸化鉄ナノ粒子は、従来の
とおり合成した（Naha et al., J Mater Chem Biol Med, 2014）。簡単に説明すると、１
２．５ｇのデキストラン（分子量：１０，０００）を２５ｍｌの脱イオン水に溶解した。
得られた溶液を氷浴に入れ、攪拌しながら３０分間窒素ガスでパージして、フラスコから
酸素を完全に除去した。各配合物について、９８０ｍｇの塩化第二鉄および３６０ｍｇの
塩化第一鉄をデキストラン溶液に添加した。シリンジポンプを用いて、１５ｍｌの濃縮水
酸化アンモニウムを６時間かけてデキストラン−鉄溶液に添加した。次いで、ナノ粒子懸
濁液を９０℃に１時間加熱し、次いで室温で一晩攪拌した。得られたナノ粒子懸濁液を２
０ｋ ｒｃｆで３０分間遠心分離して凝集物を除去した。ＩＯ−ＮＰ含有上清を集め、１
５ｍｌに濃縮し、１００ｋＤａ ＭＷダイアフィルトレーションカラムを用いてクエン酸
緩衝生理食塩水で洗浄した。様々な分子量の非修飾デキストラン（１ｋＤａ、５ｋＤａ、
１０ｋＤａ、２０ｋＤａおよび４０ｋＤａ）で被覆したＩＯ−ＮＰを合成した。

表１：デキストラン被覆ＩＯ−ＮＰ配合物およびドープＩＯ−ＮＰ配合物の合成および
特性評価

新しく開発したナノ粒子は新規なものであるが、これらは、生体適合性が高く、また既
にＭＲＩ造影剤として臨床的に認可されている材料をベースとしている（Fan et al., Wi
res Nanomed Nanobi, 2013）。ドーパント金属はＩＯ−ＮＰの触媒活性を高めることが示
され（例えば、ＭｎＣｌ_２）、体内に見出される。さらに、ナノ粒子は大規模に合成する
ことができ、最終生成物は非常に手頃である。したがって、開示されたシステムの臨床用
途の可能性は大きい。

酸化鉄ナノ粒子は、Ｆｅｒｉｄｅｘ、ＣｏｍｂｉｄｅｘおよびＦｅｒａｈｅｍｅなど、
患者での使用が認可されているデキストラン被覆酸化鉄ナノ粒子をベースとしている（Wa
ng, Quantitative imaging in medicine and surgery, 2011）。これらの酸化鉄ナノ粒子
は、無害の天然物質（すなわち、鉄および糖分子）に分解するため、生体適合性が高いと
見なされている（Tassa et al., Accounts of chemical research, 2011; Koo et al., J
ournal of bacteriology, 2010）。プラットフォームを改善・最適化するために、コーテ
ィング、コアのドーピング、および、リン酸カルシウム含有、の３つの修飾を行うことの
効果を調査できる（図２０）。

コーティングがＩＯ−ＮＰの活性に及ぼす効果を調べるために、デキストラン被覆酸化
鉄ナノ粒子を上記のように合成することができる（Naha et al., J Mater Chem Biol Med
, 2014）。様々な分子量の未修飾デキストラン（１ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０
ｋＤａおよび４０ｋＤａ）または修飾デキストラン（例えば、アミノ化、架橋、カルボキ
シおよびジエチルアミノエチル）被覆ＩＯ−ＮＰを合成する。 また、臨床的に利用可能
な製剤であるＦｅｒａｈｅｍｅも研究する。デキストランコーティングの種類を変化させ
ると、Ｈ_２Ｏ_２のナノ粒子表面へのアクセス性が変化し、これは触媒性能を変化させ得る
。ＩＯ−ＮＰコーティングがＨ_２Ｏ_２の触媒作用に及ぼす効果を前述のＴＭＢアッセイを
用いて測定した。図１９Ｂ（薄灰色のバー）は、デキストラン被覆酸化鉄が過酸化水素の
活性化を触媒すること、および、デキストランは被覆を有していないＩＯ−ＮＰに最も近
い触媒活性を提供する生体適合性コーティングであることを示している。さらに、様々な
タイプのデキストランコーティングが歯／バイオフィルム界面およびＥＰＳ豊富な齲蝕原
性バイオフィルム内でのＩＯ−ＮＰ保持を高め得る。従前の研究により、歯薄膜上に存在
するストレプトコッカス・ミュータンス由来のグルコシルトランスフェラーゼ（Ｇｔｆｓ
）によるＥＰＳ合成に外因性デキストランがプライマーとして使用され得、バイオフィル
ムの発生に、触媒活性に影響を及ぼすことなく（Gao et al., Nat Nanotechnol, 2007）
、マトリックスに組み込まれ得ることが示されている（Xiao et al., PLoS pathogens, 2
012; Bowen and Koo, Caries research, 2006; Koo et al., Journal of dental researc
h, 2013）。さらに、グルカン同士の接着相互作用を介して保持が増強され得る（図２１
）（Xiao et al., PLoS pathogens, 2012; Bowen and Koo, Caries research, 2011; Koo
et al., Journal of dental research, 2013; Banas and Vickerman, Critical reviews
in oral biology and medicine: an official publication of the American Associati
on of Oral Biologists, 2003）。

ＩＯ−ＮＰコアの金属ドーピング効果を調べるために、以下の方法を用いることができ
る。ＭｎＣｌ_２、ＣｏＣｌ_２およびＮｉＣｌ_２（１％、５％、１０％および２０％、また
はそれ以上）などの様々な割合のドーパント金属塩をコアに含有させて合成を行う。ドー
パント金属の添加は触媒性能を向上させる戦略である（Mohamed et al., Mat Sci Eng R,
2012; Bin Asif et al., Nanoscale research letters, 2014; Wang et al., Journal o
f Molecular Catalysis a-Chemical, 2013）。２０％Ｍｎドープデキストラン被覆ＩＯ−
ＮＰを合成し、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）によりＭｎの含有量を確認
した。図１９Ｂは、過酸化水素の活性化速度が未ドープのＩＯ−ＮＰと比較して４．７倍
増加したことを示す。このプロセスにより、元のＩＯ−ＮＰ、例えばドープされたコアを
有さないＩＯ−ＮＰと比較して、大幅に改善された触媒性能を有するコアを開発すること
ができる。

ＩＯ−ＮＰは、ナノ粒子の脱灰ブロック効果を向上させ（かつ場合によっては再石灰化
を促進する）ために、添加剤としてのリン酸カルシウムを含有させて修飾することができ
る。ＩＯ−ＮＰ溶液を硝酸カルシウムと混合し、次いでリン酸カリウムを１．６７：１の
Ｃａ：Ｐ比で滴下することにより、リン酸カルシウムをＩＯ−ＮＰに含有させることがで
きる（Sun et al., J Res Natl Inst Stan, 2010; Liou et al., Biomaterials, 2004）
。リン酸カルシウムに対するＩＯ−ＮＰの比率を変更することによってバリエーションを
合成することができる。脱灰ブロック、ＩＯ−ＮＰ保持およびＨ_２Ｏ_２触媒作用に対する
リン酸カルシウムの効果を調べることができる。あるいは、上記のドーピング法によって
、または逆マイクロエマルジョン合成法（Kong et al., Curr Appl Phys, 2005）を使用
してカルシウムを含有させることができる。また、リン酸カルシウムを含有させることが
ナノ粒子の触媒活性に著しく悪影響を与える場合、リン酸カルシウムナノ粒子（ＣＰ−Ｎ
Ｐ）を別途作製しておき、ＩＯ−ＮＰおよびＣＰ−ＮＰの混合物を適用することができる
。これらのＩＯ−ＮＰは、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｔ１２）
、動的光散乱（ＤＬＳ）によるサイズの特性解析、またゼータ電位（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ
ＺＳ９０、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）の特性解析ができ、濃度はＩＣ
Ｐ−ＭＳを用いて決定することができる（Naha et al., J Mater Chem, 2014）。これら
の分析により、ナノ粒子の標準化されたサイズおよび濃度が保証される。これらの様々な
パラメーターの最適化は後述するアッセイを用いて行うことができ、最良の特徴（例えば
、リン酸カルシウムを含む改変されたコーティングを有するドープコア）を組み合わせた
ＩＯ−ＮＰを合成することができる。

以下の方法を用いて修飾ＩＯ−ＮＰの触媒活性および生物活性を評価することができる
。ナノ粒子がＨ_２Ｏ_２活性化触媒として機能する能力は、ルミノールアッセイを用いた経
時的な発光強度の測定により評価される。簡潔に説明すると、ナノ粒子を過酸化水素およ
びルミノールと最大１０分間混合する。過酸化水素は酸化鉄ナノ粒子表面上で反応して、
ルミノールを活性化させて光を生成するラジカルを生成する（Triantis et al., Chem En
g J, 2008）。図２１はルミノールアッセイからのデータを示す。最良の触媒は最も強い
発光を生じる。ルミノールアッセイはまた、基質として３，３’，５，５’−テトラメチ
ルベンジジン（ＴＭＢ）を使用する確立された比色法で補完される。ＴＭＢはＩＯ−ＮＰ
によって触媒されるフリーラジカルと反応した後、６５２ｎｍに特異的な吸収を有する青
色を経時で生成する（Gao et al., Nat Nanotechnol, 2007）。全てのナノ粒子を同じ条
件下（すなわち、上で使用したように０．５ｍｇ／ｍｌおよび０．５％Ｈ_２Ｏ_２）で試験
して、触媒速度および触媒レベルに関して活性を比較する。スクリーニングは吸着緩衝液
（唾液のイオン強度を模倣する）および浄化ヒト全唾液（生物学的環境をシミュレートす
るため）で行う（Horev et al., ACS nano, 2015）。その後選択されるリードナノ粒子候
補について、最小の用量で最大の有効性を達成するために、様々なＩＯ−ＮＰおよびＨ_２
Ｏ_２濃度の組み合わせを試験することができる。

ＩＯ−ＮＰ保持アッセイには、以下の方法を用いることができる。バイオフィルム内の
ナノ粒子の保持は、唾液被覆ヒドロキシアパタイトバイオフィルムモデルを用いて評価さ
れる。臨床治療レジメンをシミュレートするために、各ＩＯ−ＮＰ（０．５ｍｇ／ｍｌ）
の短時間の暴露（１分または５分）を１日２回する局所適用が使用される。局所処理され
たバイオフィルムを洗浄して、未結合または緩く結合したＩＯ−ＮＰを除去する。次いで
、バイオフィルムを除去し、ホモジナイズする（Bowen and Koo, Caries research, 2011
; Koo et al., J Antimicrob Chemoth, 2003）。バイオフィルム内に保持されているＩＯ
−ＮＰの量は、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）（Naha et al., J Mater Che
m B, 2014）によってバイオフィルムの鉄含有量を分析することによって決定される。バ
イオフィルム内に結合したＩＯ−ＮＰが活性であることを確認するために、比色分析（Ｔ
ＭＢ）アッセイ（Gao et al., Nat Nanotechnol, 2007）でＨ_２Ｏ_２（０．５％）の触媒
活性を測定する（図２２）。

Ｈ_２Ｏ_２存在下でのＩＯ−ＮＰの殺菌効果は、上記と同じバイオフィルムモデルおよび
局所処置を用いて評価することができる。ＩＯ−ＮＰ処理したバイオフィルムをＨ_２Ｏ_２
に暴露し、ストレプトコッカス・ミュータンスの乾燥重量および全生存細胞を標準的な培
養法およびｑＰＣＲベースの方法を用いて決定する（Cury and Koo, Analytical biochem
istry, 2007; Klein et al., Mol Oral Microbiol, 2012）。このモデルでは、最大７２
個のバイオフィルムを１回の実験で同時に形成することができるため、新規開発ＩＯ−Ｎ
Ｐのスクリーニングが容易となる。

さらに、Ｈ_２Ｏ_２の存在下で酸化的切断によりグルカンを分解するＩＯ−ＮＰの能力は
以下の方法によって決定することができる。簡潔に説明すると、不溶性グルカンおよび可
溶性グルカン（ストレプトコッカス・ミュータンスのＧｔｆｓによって産生されるもの）
を使用する。１００μｇの不溶性グルカンまたは可溶性グルカンを同じ条件でＩＯ−ＮＰ
およびＨ_２Ｏ_２とともにインキュベートし、それらの活性を比較し、標準的な比色法を使
用して分解生成物の量を測定することができる（Koo et al., J Antimicrob Chemoth, 20
03; Kopec et al., Glycobiology, 1997）。

ＩＯ−ＮＰの存在下または非存在下で唾液被覆ＨＡビーズおよび唾液被覆歯エナメル質
（ｓＴＥ）スラブの酸溶解量を測定することによって、ナノ粒子の脱灰ブロック効果を分
析することができる。簡単に説明すると、ｓＨＡビーズまたはｓＴＥスラブを３７℃で４
時間、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中でインキュベートする。ｓＨＡビーズを遠
心分離し、３回洗浄して溶解アパタイトを除去し、カルシウムおよびリン酸の量をＩＣＰ
−ＭＳおよび比色アッセイを用いて測定する（Naha et al., J Mater Chem B, 2014）。
残ったｓＨＡビーズ（非溶解）を収集して乾燥重量を測定する。ＳＴＥスラブ（処理後）
を高度に標準化された表面微小硬度（ｓｕｒｆａｃｅ ｍｉｃｒｏｈａｒｄｎｅｓｓ；Ｓ
ＭＨ）法を用いて脱灰量について分析する（Arthur et al., Journal of oral diseases,
2014; Hara et al., Caries research, 2005; Zero et al., Journal of dental resear
ch, 1992; Hara et al., European journal of oral sciences, 2014; Cury et al., Car
ies research, 1997）。簡単に説明すると、電動式マイクロメータ・ステージに接続した
硬度計を用いてエナメル質のＳＭＨを測定する。負荷５０ｇ、滞留時間１１秒のヌープダ
イヤモンドを使用する。エナメル質のＳＭＨは、ベースライン（処置前）および処置後で
専用画像解析システムを使用して窪みの長さ（μｍ）を測定することによって決定し、Ｓ
ＭＨ変化率（％）として算出する。ＳＭＨ変化率（％）は脱灰レベルと直接関連する。

生体適合性のインビトロ評価をするために、以下の方法を用いることができる。このシ
ステムは、生体適合性でかつ臨床的使用が承認されているＩＯ−ＮＰおよびＨ_２Ｏ_２を含
むことができる。さらに、使用濃度は臨床現場で現在使用されている濃度よりも低く、Ｉ
Ｏ−ＮＰとバイスタンダー組織との接触は、処置が短期的・局所的であるため最小限であ
る。インビボデータは、ＩＯ−ＮＰ／Ｈ_２Ｏ_２コンビネーションの１日２回の暴露は細胞
毒性効果を引き起こさないことを示した。しかしながら、最適化されたナノ粒子（Ｈ_２Ｏ
_２有りまたはＨ_２Ｏ_２無し）の潜在的な細胞傷害性は、哺乳類細胞の生存率に影響を与え
ないように、口腔（歯肉および粘膜）の上皮細胞および線維芽細胞を用いて評価すること
ができる。簡単に説明すると、生体適合性は、これらの細胞をナノ粒子単独でまたはＨ_２
Ｏ_２と組み合わせて最大１０分間（局所曝露を模倣するために）曝露することによって評
価することができる。標準的なプロトコールを用いて、ＩＯ−ＮＰ濃度（１０〜１，００
０μｇ／ｍｌ）およびＨ_２Ｏ_２（０．５〜１％ｖ／ｖ）の範囲を評価し、またＭＴＳまた
はＭＴＴアッセイを実施して細胞生存率を決定する（Naha et al., J Mater Chem B, 201
4）。このアッセイは、顕微鏡下の細胞の定性的観察によって補完することができる。細
胞をＩＯ−ＮＰで１０分間インキュベートした後、経時的に追跡し、細胞の生存率を２４
時間、７２時間および１６８時間の時点で測定する、タイムフレーム１〜１０分の範囲の
インキュベーションおよびパルスチェイス実験を行うことができる。図２３は、デキスト
ラン被覆ＩＯ−ＮＰの生体適合性を示す。包括的スクリーニングにより、齲蝕原性バイオ
フィルムの抑制および齲蝕防止のための最も効果的で生体適合性のあるＩＯ−ＮＰを確実
に選択することができる。

ＩＯ−ＮＰ合成の柔軟性を利用することによって、触媒活性および生物活性を向上する
ためにＩＯ−ＮＰ特性のさらなる最適化を実施することができる。Ｈ_２Ｏ_２の活性化を触
媒することができる様々な新規ナノ粒子を合成することができる。未触媒の速度よりも１
，０００倍速い速度で過酸化水素を活性化する触媒を同定することができる。また、それ
らの触媒特性について研究するために様々なドープ酸化鉄ナノ粒子を作製することができ
る（Cormode et al., Contrast Media Mol Imaging, 2014; Naha et al., J Mater Chem
B, 2014）。困難が生じた場合には、様々なドーパント金属塩比、様々なドーパント金属
（例えば、Ｍｇ、Ｃａ）、様々なコーティング（ドーパミンまたはリン酸塩ベースのリガ
ンドなど）を使用することによってＩＯ−ＮＰの合成を変更することができる。

本開示は、言及された目的および利点ならびにその中に内在する利点を達成するために
十分に適合される。上述の特定の実施形態は例示のみを目的とする。本開示は、異なる方
法であるが、本明細書の教示の利益を有する当業者に明らかな均等な方法で改変、実施さ
れ得るからである。さらに、添付の特許請求の範囲に記載されたもの以外に、本明細書に
示された構成または設計の詳細に制限は意図されていない。したがって、上で開示した特
定の例示的な実施形態は、変更または改変することができ、そのようなすべての変形は、
本開示の範囲および趣旨内にあると考えられることは明らかである。

様々な刊行物、特許および特許出願が本明細書に引用されており、その内容は参照によ
りその全体が本明細書に援用される。

Claims (26)

1. （ａ）１つ以上の鉄ナノ粒子と、
   （ｂ）過酸化水素と
   を含み、
   前記１つ以上の鉄ナノ粒子は、マトリックス分解酵素、過酸化物生成酵素、および、それらの組み合わせからなる群から選択される酵素にコンジュゲートされているナノ粒子を含む、バイオフィルムを防止および／または処理するための組成物。
2. 前記１つ以上の鉄ナノ粒子は、直径が約１ｎｍ〜約１，０００ｎｍのナノ粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
3. フッ化物、銅、リン酸カルシウム、または、それらの組み合わせをさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記ナノ粒子は金属でドープされている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記金属は、マンガン、コバルト、カルシウム、ニッケル、銅、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、亜鉛、アルミニウム、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、銅、および、それらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
6. 前記１つ以上の鉄ナノ粒子は、ポリマーコーティングを有するナノ粒子を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記ポリマーコーティングは、生体ポリマー、デキストラン、キトサン、または、それらの組み合わせを含む、請求項６に記載の組成物。
8. 前記１つ以上の鉄ナノ粒子は、ポリマーコーティングを有さないナノ粒子を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
9. １つ以上の鉄ナノ粒子と、過酸化水素と、過炭酸ナトリウム、フッ化物、銅、リン酸カルシウム、および、それらの組み合わせからなる群から選択される化合物とを含み、
   前記１つ以上の鉄ナノ粒子は、マトリックス分解酵素、過酸化物生成酵素、および、それらの組み合わせからなる群から選択される酵素にコンジュゲートされているナノ粒子を含む、バイオフィルムを排除するための組成物。
10. 前記化合物は過炭酸ナトリウムである、請求項９に記載の組成物。
11. 前記バイオフィルムはバイオフィルム形成微生物により産生される、請求項１または９に記載の組成物。
12. 前記バイオフィルム形成微生物は、ストレプトコッカス・ミュータンス、シュードモナス・エルジノーサ、エシェリヒア・コリー、エンテロコッカス・フェカーリス、バチリス・サブチリス、スタフィロコッカス・アウレウス、ビブリオ・コレラ、カンジタ・アルビカンス、および、それらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記バイオフィルムは、歯の表面、工業材料、船舶材料、皮膚、粘膜／軟組織、歯の内部（例えば、歯内管）、肺（例えば、嚢胞性線維症）、尿路、または、医療デバイスに存在する、請求項１または９に記載の組成物。
14. バイオフィルムを防止、排除および／または処理するための配合物を製造するための組成物の使用であって、
    前記組成物は、過酸化水素と、マトリックス分解酵素および／または過酸化物生成酵素にコンジュゲートされた１つ以上の鉄ナノ粒子とを含む、使用。
15. 前記バイオフィルムは、歯の表面、粘膜組織表面、軟組織表面、皮膚表面、アパタイト表面、インプラント表面、医療デバイス表面、歯の内面、肺表面、尿路表面、工業材表面、船舶表面、ウォータークラフト表面、船体、またはパイプ表面に存在する、請求項１４に記載の使用。
16. 表面上のバイオフィルムの形成を防止するための配合物を製造するための組成物の使用であって、
    前記組成物は、過酸化水素と、マトリックス分解酵素、過酸化物生成酵素、および、それらの組み合わせからなる群から選択される酵素にコンジュゲートされているナノ粒子を含む１つ以上の鉄ナノ粒子とを含む、使用。
17. 前記表面は、歯の表面、粘膜組織表面、軟組織表面、皮膚、アパタイト表面、インプラント表面、医療デバイス表面、工業材表面、船舶表面、ウォータークラフト表面、船体、またはパイプ表面からなる群から選択される、請求項１６に記載の使用。
18. 前記組成物は過酸化水素を含む溶液を更に含み、前記１つ以上の鉄ナノ粒子および過酸化水素が反応して、バイオフィルムの形成を防止する１つ以上のラジカルが形成される、請求項１６に記載の使用。
19. バイオフィルムを防止および／または処理するための配合物を製造するための組成物の使用であって、
    前記組成物は、過酸化水素と、マトリックス分解酵素、過酸化物生成酵素、および、それらの組み合わせからなる群から選択される酵素にコンジュゲートされているナノ粒子を含む１つ以上の鉄ナノ粒子とを含む、使用。
20. 前記組成物は過酸化水素を含む溶液を更に含み、前記１つ以上の鉄ナノ粒子および過酸化水素が反応して、バイオフィルムのマトリックスを消化し、かつ同時に埋め込まれた細菌を殺菌する１つ以上のラジカルが形成される、請求項１９に記載の使用。
21. バイオフィルム内の細菌の成長を防止するための配合物を製造するための組成物の使用であって、
    前記組成物は、過酸化水素と、マトリックス分解酵素、過酸化物生成酵素、および、それらの組み合わせからなる群から選択される酵素にコンジュゲートされているナノ粒子を含む１つ以上の鉄ナノ粒子とを含み、前記１つ以上の鉄ナノ粒子は、バイオフィルムを有する表面に結合して鉄を放出し、前記バイオフィルム内の細菌の成長を阻害する、使用。
22. バイオフィルムの形成および／または発生を防止するための配合物を製造するための組成物の使用であって、
    前記組成物は、過酸化水素と、マトリックス分解酵素、過酸化物生成酵素、および、それらの組み合わせからなる群から選択される酵素にコンジュゲートされているナノ粒子を含む１つ以上の鉄ナノ粒子とを含む、使用。
23. （ａ）マトリックス分解酵素、過酸化物生成酵素、および、それらの組み合わせからなる群から選択される酵素にコンジュゲートされているナノ粒子を含む１つ以上の鉄ナノ粒子を含む組成物を含む第１の容器と、
    （ｂ）過酸化水素を含む第２の容器と
    を含む、バイオフィルムを防止、排除および／または処理するためのキット。
24. 過酸化水素と、マトリックス分解酵素、過酸化物生成酵素、および、それらの組み合わせからなる群から選択される酵素にコンジュゲートされているナノ粒子を含む１つ以上の鉄ナノ粒子とを含む組成物を含む、バイオフィルムを防止、排除および／または処理するためのキット。
25. 前記組成物は、単一容器内に過酸化水素または過炭酸ナトリウムをさらに含む、請求項２４に記載のキット。
26. 前記組成物はフッ化物をさらに含む、請求項２４または２５に記載のキット。

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