JP2006062966A - Dna合成酵素阻害組成物、dnaトポイソメラーゼ阻害組成物、テロメラーゼ阻害組成物、癌細胞増殖抑制組成物および抗炎症組成物 - Google Patents
Dna合成酵素阻害組成物、dnaトポイソメラーゼ阻害組成物、テロメラーゼ阻害組成物、癌細胞増殖抑制組成物および抗炎症組成物 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】製造が容易なDNA合成酵素阻害組成物を提供する。
【解決手段】DNA合成酵素阻害組成物は、いわしの頭部および内臓から抽出したブタノール層画分を有効成分として含有している。DNA合成酵素阻害組成物は、α型およびβ型DNA合成酵素に対する阻害作用、およびDNAトポイソメラーゼ群に対する阻害作用を有している。DNA合成酵素阻害組成物は、テロメラーゼに対する阻害活性作用、ヒト癌細胞増殖抑制作用、および抗炎症作用を有している。DNA合成酵素阻害組成物は、癌治療剤、エイズ治療剤あるいは免疫抑制剤となる。
【選択図】図1
【解決手段】DNA合成酵素阻害組成物は、いわしの頭部および内臓から抽出したブタノール層画分を有効成分として含有している。DNA合成酵素阻害組成物は、α型およびβ型DNA合成酵素に対する阻害作用、およびDNAトポイソメラーゼ群に対する阻害作用を有している。DNA合成酵素阻害組成物は、テロメラーゼに対する阻害活性作用、ヒト癌細胞増殖抑制作用、および抗炎症作用を有している。DNA合成酵素阻害組成物は、癌治療剤、エイズ治療剤あるいは免疫抑制剤となる。
【選択図】図1
Description
本発明は、魚類から抽出した有効成分を含有するDNA合成酵素阻害組成物、DNAトポイソメラーゼ阻害組成物、テロメラーゼ阻害組成物、癌細胞増殖抑制組成物および抗炎症組成物に関する。
従来から、DNA合成酵素群およびDNAトポイソメラーゼ群が細胞の増殖、分裂および分化などに関与していることが知られている。そして、DNA合成酵素阻害剤、DNAトポイソメラーゼ阻害剤およびテロメラーゼ阻害剤は、癌の場合に癌細胞の増殖抑制作用を有し、エイズの場合にHIV由来逆転写酵素に対する阻害作用を有し、さらに免疫抑制作用の場合に抗原に対する特異的抗体産生を抑制する作用を有すると考えられている。そこで、これらDNA合成酵素阻害剤、DNAトポイソメラーゼ阻害剤およびテロメラーゼ阻害剤は、癌、エイズおよび免疫疾患治療薬あるいは予防効果のある医薬品として開発が期待されている。
そして、DNA合成酵素阻害群としては、癌あるいはエイズなどの疾病や、免疫担当細胞による抗体生産などにおいて重要な要因の一つであることが知られている(例えば、特許文献1参照。)。また現在、DNA合成酵素阻害剤としては、ジデオキシTTP(ddTTP)、N・メチルマイレミド、ブチルフェニル・dGTPなどが知られている(例えば、非特許文献1参照。)。さらに、植物由来の糖脂質であるスルホキノボシルアシルグリセリドにも、DNA合成酵素阻害作用が見出されている(例えば、特許文献2参照。)。
なお、DNAトポイソメラーゼは、DNAの複製、転写および組換えなどあらゆるDNA代謝に関わる重要な酵素であり、DNAトポイソメラーゼ阻害剤は、ヒト癌の治療においてイリノテカンやエトポシドなど多くの重要な抗癌剤として使用されている。
一方、従来の抗癌剤は、その多くが発生した癌細胞を殺すこと並びに癌細胞の増殖抑制作用を有するものであったが、近年発癌防止を目的とした抗発癌剤の開発も進められている。この点については、正常細胞の癌化のステップにおいて「イニシエータ」と「プロモータ」とが関係しており、正常細胞の癌化は「(1)正常細胞の染色体がイニシエータによりDNAレベルでの障害を受けて潜在的腫癌細胞に変化する。(2)潜在的腫癌細胞にプロモータが作用して腫癌細胞に変化させる。」の2段階を経て起こるという発癌2段階説が知られている(例えば、特許文献3参照。)。
また、発癌プロモータとしての作用を持つ化合物の代表としては、TPA(12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate)などが知られている。そして、癌研究の場でこのような発癌プロモータを用いた発癌実験が行われるとともに、発癌予防および抗発癌剤の探索においてこのような発癌プロモータの作用を阻害する抗発癌プロモータの探索が進められている。
特開平11−106395号公報
特開2000−143516号公報
特開平9−176184号公報
アニュアル レビュー オブ バイオケミストリー誌(Annual Review of Biochemistry)、1991年,第60巻,p.513−552
そして、上記DNA合成酵素阻害剤やDNAトポイソメラーゼ阻害剤などとしては、ジデオキシTTP(ddTTP)、N・メチルマイレミド、ブチルフェニル・dGTPやスルホキノボシルアシルグリセリドなどが有効成分として用いられているが、これら有効成分の製造が容易ではないから、これら有効成分を用いたDNA合成酵素阻害剤やDNAトポイソメラーゼ阻害剤などの製造が容易ではないという問題を有している。
本発明は、このような点に鑑みなされたもので、製造が容易なDNA合成酵素阻害組成物、DNAトポイソメラーゼ阻害組成物、テロメラーゼ阻害組成物、癌細胞増殖抑制組成物および抗炎症組成物を提供することを目的とする。
請求項1記載のDNA合成酵素阻害組成物は、魚類から抽出した有効成分を含有し、DNA合成酵素に対する阻害作用を有するものである。
そして、魚類から抽出した有効成分を含有させることにより、DNA合成酵素に対する阻害作用を有する組成物の製造が容易になる。
請求項2記載のDNA合成酵素阻害組成物は、請求項1記載のDNA合成酵素阻害組成物において、有効成分は、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分であるものである。
そして、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分を有効成分とすることにより、DNA合成酵素に対する阻害作用がより確実となる。
請求項3記載のDNA合成酵素阻害組成物は、請求項1または2記載のDNA合成酵素阻害組成物において、魚類は、いわしの頭部および内臓の少なくともいずれかであるものである。
そして、廃棄物とされるいわしの頭部および内臓を用いることにより、DNA合成酵素に対する阻害作用を有する組成物を製造性良く安価に製造できる。
請求項4記載のDNAトポイソメラーゼ阻害組成物は、魚類から抽出した有効成分を含有し、DNAトポイソメラーゼ群に対する阻害作用を有するものである。
そして、魚類から抽出した有効成分を含有させることにより、DNAトポイソメラーゼ群に対する阻害作用を有する組成物の製造が容易になる。
請求項5記載のDNAトポイソメラーゼ阻害組成物は、請求項4記載のDNAトポイソメラーゼ阻害組成物において、有効成分は、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して分けた脂溶性のブタノール層画分および水溶性の水層画分の少なくともいずれかであるものである。
そして、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して分けた脂溶性のブタノール層画分および水溶性の水層画分の少なくともいずれかを有効成分とすることにより、DNAトポイソメラーゼ群に対する阻害作用がより確実となる。
請求項6記載のDNAトポイソメラーゼ阻害組成物は、請求項4または5記載のDNAトポイソメラーゼ阻害組成物において、魚類は、いわしの頭部および内臓の少なくともいずれかであるものである。
そして、廃棄物とされるいわしの頭部および内臓を用いることにより、DNAトポイソメラーゼ群に対する阻害作用を有する組成物を製造性良く安価に製造できる。
請求項7記載のテロメラーゼ阻害組成物は、魚類から抽出した有効成分を含有し、テロメラーゼに対する阻害作用を有するものである。
そして、魚類から抽出した有効成分を含有させることにより、テロメラーゼに対する阻害作用を有する組成物の製造が容易になる。
請求項8記載のテロメラーゼ阻害組成物は、請求項7記載のテロメラーゼ阻害組成物において、有効成分は、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分であるものである。
そして、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分を有効成分とすることにより、テロメラーゼに対する阻害作用がより確実となる。
請求項9記載のテロメラーゼ阻害組成物は、請求項7または8記載のテロメラーゼ阻害組成物において、魚類は、いわしの頭部および内臓の少なくともいずれかであるものである。
そして、廃棄物とされるいわしの頭部および内臓を用いることにより、テロメラーゼに対する阻害作用を有する組成物を製造性良く安価に製造できる。
請求項10記載の癌細胞増殖抑制組成物は、魚類から抽出した有効成分を含有し、癌細胞増殖抑制作用を有するものである。
そして、魚類から抽出した有効成分を含有させることにより、癌細胞増殖抑制作用を有する組成物の製造が容易になる。
請求項11記載の癌細胞増殖抑制組成物は、請求項10記載の癌細胞増殖抑制組成物において、有効成分は、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分であるものである。
そして、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分を有効成分とすることにより、癌細胞増殖抑制作用がより確実となる。
請求項12記載の癌細胞増殖抑制組成物は、請求項10または11記載の癌細胞増殖抑制組成物において、魚類は、いわしの頭部および内臓の少なくともいずれかであるものである。
そして、廃棄物とされるいわしの頭部および内臓を用いることにより、癌細胞増殖抑制作用を有する組成物を製造性良く安価に製造できる。
請求項13記載の抗炎症組成物は、魚類から抽出した有効成分を含有し、抗炎症作用を有するものである。
そして、魚類から抽出した有効成分を含有させることにより、抗炎症作用を有する組成物の製造が容易になる。
請求項14記載の抗炎症組成物は、請求項13記載の抗炎症組成物において、有効成分は、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分と、このブタノール層画分をヘキサンと水とで分配して分けた水溶性の水層画分と脂溶性のヘキサン層画分との少なくともいずれかであるものである。
そして、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分と、このブタノール層画分をヘキサンと水とで分配して分けた水溶性の水層画分と脂溶性のヘキサン層画分との少なくともいずれかを有効成分とすることにより、抗炎症作用がより確実となる。
請求項15記載の抗炎症組成物は、請求項13または14記載の抗炎症組成物において、魚類は、いわしの頭部および内臓の少なくともいずれかであるものである。
そして、廃棄物とされるいわしの頭部および内臓を用いることにより、抗炎症作用を有する組成物を製造性良く安価に製造できる。
請求項1記載のDNA合成酵素阻害組成物によれば、魚類から抽出した有効成分を含有しているので、DNA合成酵素に対する阻害作用を有する組成物の製造を容易にできる。
請求項2記載のDNA合成酵素阻害組成物によれば、請求項1記載のDNA合成酵素阻害組成物の効果に加え、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分を有効成分とすることにより、DNA合成酵素に対する阻害作用をより確実にできる。
請求項3記載のDNA合成酵素阻害組成物によれば、請求項1または2記載のDNA合成酵素阻害組成物の効果に加え、廃棄物とされるいわしの頭部および内臓を用いるので、DNA合成酵素に対する阻害作用を有する組成物を製造性良く安価に製造できる。
請求項4記載のDNAトポイソメラーゼ阻害組成物によれば、魚類から抽出した有効成分を含有しているので、DNAトポイソメラーゼ群に対する阻害作用を有する組成物の製造を容易にできる。
請求項5記載のDNAトポイソメラーゼ阻害組成物によれば、請求項4記載のDNAトポイソメラーゼ阻害組成物の効果に加え、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して分けた脂溶性のブタノール層画分および水溶性の水層画分の少なくともいずれかを有効成分とすることにより、DNAトポイソメラーゼ群に対する阻害作用をより確実にできる。
請求項6記載のDNAトポイソメラーゼ阻害組成物によれば、請求項4または5記載のDNAトポイソメラーゼ阻害組成物の効果に加え、廃棄物とされるいわしの頭部および内臓を用いるので、DNAトポイソメラーゼ群に対する阻害作用を有する組成物を製造性良く安価に製造できる。
請求項7記載のテロメラーゼ阻害組成物によれば、魚類から抽出した有効成分を含有しているので、テロメラーゼに対する阻害作用を有する組成物の製造を容易にできる。
請求項8記載のテロメラーゼ阻害組成物によれば、請求項7記載のテロメラーゼ阻害組成物の効果に加え、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分を有効成分とすることにより、テロメラーゼに対する阻害作用をより確実にできる。
請求項9記載のテロメラーゼ阻害組成物によれば、請求項7または8記載のテロメラーゼ阻害組成物の効果に加え、廃棄物とされるいわしの頭部および内臓を用いるので、テロメラーゼに対する阻害作用を有する組成物を製造性良く安価に製造できる。
請求項10記載の癌細胞増殖抑制組成物によれば、魚類から抽出した有効成分を含有しているので、癌細胞増殖抑制作用を有する組成物の製造を容易にできる。
請求項11記載の癌細胞増殖抑制組成物によれば、請求項10記載の癌細胞増殖抑制組成物の効果に加え、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分を有効成分とすることにより、癌細胞増殖抑制作用をより確実にできる。
請求項12記載の癌細胞増殖抑制組成物によれば、請求項10または11記載の癌細胞増殖抑制組成物の効果に加え、廃棄物とされるいわしの頭部および内臓を用いるので、癌細胞増殖抑制作用を有する組成物を製造性良く安価に製造できる。
請求項13記載の抗炎症組成物によれば、魚類から抽出した有効成分を含有しているので、抗炎症作用を有する組成物の製造を容易にできる。
請求項14記載の抗炎症組成物によれば、請求項13記載の抗炎症組成物の効果に加え、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分と、このブタノール層画分をヘキサンと水とで分配して分けた水溶性の水層画分と脂溶性のヘキサン層画分との少なくともいずれかを有効成分とすることにより、抗炎症作用をより確実にできる。
請求項15記載の抗炎症組成物によれば、請求項13または14記載の抗炎症組成物の効果に加え、廃棄物とされるいわしの頭部および内臓を用いるので、抗炎症作用を有する組成物を製造性良く安価に製造できる。
以下、本発明の一実施の形態のDNA合成酵素阻害組成物について説明する。
まず、DNA合成酵素阻害組成物は、DNA合成酵素に対する阻害作用を有するDNA合成酵素阻害剤である。そして、このDNA合成酵素阻害剤は、DNAトポイソメラーゼ群に対する阻害作用を有しているので、DNAトポイソメラーゼ阻害組成物であるDNAトポイソメラーゼ阻害剤としても用いることができる。したがって、このDNA合成酵素阻害剤は、換言するとα型およびβ型DNA合成酵素や、DNAトポイソメラーゼ阻害作用を有しているので、癌治療剤、エイズ治療剤あるいは免疫抑制剤となり得る。
また、このDNA合成酵素阻害剤は、テロメラーゼに対する阻害活性作用を有しているので、テロメラーゼ阻害組成物であるテロメラーゼ阻害剤としても用いることができる。さらに、このDNA合成酵素阻害剤は、ヒト癌細胞増殖抑制作用を有しているので、ヒト癌細胞増殖抑制組成物である癌細胞増殖抑制剤としても用いることができる。また、このDNA合成酵素阻害剤は、抗炎症作用を有しているので、抗炎症組成物である抗炎症剤として用いることができる。
具体的に、このDNA合成酵素阻害剤は、魚類であるいわしの頭部および内臓の少なくともいずれかから、アセトンやブタノールなどの溶媒を用いて効率よく抽出させた有効成分を含有している。そして、この有効成分としては、いわしの頭部あるいは内臓から溶媒を用いて抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の第1の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分や、このブタノール層画分をヘキサンと水とで分配して分けた水溶性の第2の水層画分、および脂溶性のヘキサン層画分などである。
この結果、いわしの頭部または内臓から抽出される成分は、DNA合成酵素阻害剤およびDNAトポイソメラーゼ阻害剤として有効であり、抗癌剤、抗炎症剤および健康食品として期待できる。具体的には、いわし由来の脂溶性画分であるブタノール層画分やヘキサン層画分などを含有させることにより、DNA合成酵素阻害剤、生化学試薬、さらには抗癌剤および抗炎症剤として医薬品などへ利用できるとともに、種々の有用性を有する組成物とすることができる。
なお、上記一実施の形態では、いわしの頭部や内臓から抽出した有効成分を含むDNA合成酵素阻害組成物について説明したが、上記一実施の形態と同様の作用効果を有する有効成分を含有していれば、いわし以外の魚類のいずれの部位であってもよい。
次に、上記DNA合成酵素阻害組成物の一実施例について説明する。
まず、いわしの画分の調製について説明する。
図1に示すように、冷凍いわしの頭部と内臓とをミキサで粉砕しながらアセトンで成分を抽出してからアセトンを除去して、n−ブタノールと水とで分配した。そして、脂溶性のブタノール層と水溶性の水層とのそれぞれの各溶媒を除去して、脂溶性のブタノール層画分と、水溶性の第1の水層画分とに分けた。
さらに、このブタノール層画分をn−へキサンと水とで分配した。そして、脂溶性のへキサン層と水溶性の水層とのそれぞれの各溶媒を除去して、脂溶性のへキサン層画分と、水溶性の第2の水層画分とに分けた。
また、冷凍いわしの頭部と内臓に50質量%メタノールを加えてからミキサで粉砕したものから残渣を除いて抽出した溶液を乾固させて50%メタノール画分とした。
次に、いわし画分の構成成分について説明する。
上記へキサン層画分と第2の水層画分について、シリカゲルカラムクロマトグラフィおよび高速液体クロマトグラフィを用いて、主成分の単離および精製をしてから、これらの化学構造を核磁気共鳴装置(Nuclear Magnetic Resonance:NMR)およびガスクロマトグラフィで分析した。この結果、ヘキサン層画分には、トリグリセロール、長鎖不飽和脂肪酸およびコレステロールが主として含まれていることがわかった。また、第2の水層画分には、ウラシルなどの核酸系化合物が含まれていることがわかった。
次に、DNA合成酵素阻害活性の検証について説明する。
上記いわしの画分の調製で得た有効成分のDNA合成酵素群に対する活性を測定した。
まず、DNA合成酵素として哺乳類由来のDNAポリメラーゼとしてのDNA合成酵素αおよびDNA合成酵素βについて試験した。このとき、DNA合成酵素αとしては牛胸腺から常法にて抽出精製した標品を、DNA合成酵素βとしてはラット由来の該当遺伝子を用いた。
そして、これらDNA合成酵素に対する阻害作用の測定には、一般的なDNA合成酵素反応系(日本生化学会編、新生化学実験講座2、核酸IV、東京化学同人、p.63−66)を用いた。すなわち、このDNA合成酵素反応系では、放射性同位元素で標識した[3H]−TTPを含む系においてDNA合成反応をし、放射比活性を生成物(合成DNA鎖)量の指標とするものである。
また、阻害率は、コントロールでの合成DNA量(a)と、被検物質存在下での合成DNA量(b)とについて、(a−b)/a×100=阻害率(%)の計算式に代入して評価した。なお、この阻害率=100%−活性(%)である。そして、これらDNA合成酵素α(複製型)およびDNA合成酵素β(修復型)に対する阻害結果を図2および図3に示す。このとき、これら図2および図3は、いわし画分非存在下におけるDNA合成酵素αおよびβの残存活性を示している。
そして、これら図2および図3に示すように、ブタノール層画分は、DNA合成酵素αおよびβを100μg/mlで完全に阻害した。また、第1の水層画分および50%メタノール画分のそれぞれは、DNA合成酵素βを阻害しなかったが、1000μg/mlではDNA合成酵素αを阻害した。
次に、DNAトポイソメラーゼ阻害活性の検証について説明する。
まず、DNAトポイソメラーゼ群に対する活性を測定した。
I型DNAトポイソメラーゼおよびII型DNAトポイソメラーゼのそれぞれは、組換えヒト由来の市販標品(トポゲン社(TopoGEN Inc.,)製,米国)を用いた。文献(ミズシナ(Mizushina)他,バイオケミストリー ジャーナル誌(Biochemistry Journal)、2002年,第350巻,p.757−763)に記載の方法に従って、I型DNAトポイソメラーゼ活性はカンプトテンシン(camptothecin,CPT)を、II型DNAトポイソメラーゼはエトポシド(etoposide,VP−16)を陽性対照として、スーパーコイル(超ラセン,フォームI)を持った環状プラスミドDNAの弛緩(relaxation,フォームII)反応で酵素活性を測定した。この反応後、反応液を平板アガロースゲル電気泳動させて、ゲルを臭化エチジウム染色した後に反応生成物のDNA量を解析した。
この結果、I型DNAトポイソメラーゼに対する結果が図4に示すようになった。このI型DNAトポイソメラーゼによって基質である環状二本鎖DNAにニック(欠け)が入るとフォームI型からフォームII型へ移行する。図4に示すように、レーン1は酵素非存在下のネガティブ・コントロールであり、レーン2は酵素存在下のポジティブ・コントロールである。そして、I型DNAトポイソメラーゼは、第1の水層画分およびブタノール層画分によって10μg/ml以上の濃度で阻害が見られた。一方、50%メタノール画分では全く阻害が見られなかった。
次に、テロメラーゼ阻害活性の検証について説明する。
ヒト子宮癌細胞(HeLa cell)抽出液を用いて、ストレッチポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction:PCR)法によってテロメラーゼを測定した。この結果、図5に示すポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真のように、テロメラーゼによる6塩基の繰り返し配列(テロメア配列)の生成が検出された。このとき、レーン1は、酵素非存在下のネガティブ・コントロールである。したがって、この図5に示すように、ブタノール層画分の75μg/mlにおいてテロメラーゼ阻害活性が見られ、第1の水層画分および50%メタノール画分ではテロメラーゼ阻害活性が見られなかった。
次に、細胞増殖阻害活性の検証について説明する。
まず、細胞としてヒト胃癌由来NUGC−3細胞を用い、培地としてRPMI1640培地(日水製薬株式会社製)を用い、この培地に牛胎児血清10質量%を添加したものを用いた。このとき、この培地の培養としては、5質量%CO2インキュベータで37℃とした。
そして、この培地に、最終濃度が100μMになるように第1の水層画分、ブタノール層画分および50%メタノール画分のそれぞれを溶解させた。ただし、これら画分は水に難溶であるため、一度DMSO(ジメチルスルフォキシド)に溶解してから培地に溶解させた。なお、培地内に存在するDMSOの最終濃度は、すべての試験区で1%以下になっており、この検証で用いたNUGC−3細胞の増殖抑制にDMSOが関わる可能性が否定できる状態となっている。
さらに、この検証での培養は、96穴マイクロプレートを用いた。そして、各ウエルに3.0×105個の細胞を植え込んでから、1つの試験濃度に対して3ウエルずつ与えた。また、ポジティブコントロールとして培地に1%のDMSOを含むものを用いた。
そして、各培地に化合物を添加後は、5%CO2インキュベータで37℃24時間培養してから、各試験区の細胞生存率を判定した。このとき、この細胞生存率の判定としては、文献(「細胞の成長および生存の迅速な比色分析:細胞増殖および細胞傷害分析の適用(Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival:Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays)」、ティム モスマン(Tim Mosmann)、ジャーナル オブ イムノロジー メソッド(Journal of Immunological Methods),1983年、第65巻、p.55−63)に記載の細胞毒性試験であるMTTアッセイ法を用いた。このMTTアッセイ法は、24時間後にテトラゾリウム塩(MTT)を添加してから、さらに4時間培養するものである。そして、生細胞による還元を経て生産するホルマザン量が生細胞に比例するとみなして、570nmの光学密度(Optical Density:O.D.)で定量した。
このとき、細胞生存率は、細胞生存率(%)=試験区の光学密度(O.D.)[570nm]/対照区の光学密度(O.D.)[570nm]の式にて算出した。そして、この式にて得られた結果を、化合物のヒト胃癌細胞NUGC−3に対する細胞増殖阻害効果として図6に示した。なお、この図6に示されているデータは、3ウエルの平均値である。この結果、図6に示すように、ブタノール層画分が癌細胞の増殖を濃度依存的に阻害した。また、このブタノール層画分の50%増殖阻害濃度(LD50)が72μg/mlであった。一方、第1の水層画分および50%メタノール画分では、癌細胞への影響が見られなかった。
次に、抗炎症活性の検証について説明する。
まず、TPA(12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate)は、慢性炎症を誘発するのみならず、発癌プロモータとして哺乳類の細胞増殖を促進する。そこで、DNA合成酵素阻害作用、抗炎症作用および抗発癌プロモータ活性の間には互いに関連性があるのではないかとの推測から、DNA合成酵素を阻害するいわし画分が抗炎症活性を有するかを調べた。
具体的には、マウスの耳に予め所定量のいわし画分としての各画分を塗布した後、TPAによって誘発されるマウス耳の炎症性浮腫の質量を測定することで各阻害効果を算出した。このとき、試験は、基本的に(キャンサー レター(Cancer Letters).1984年,第25巻,p.177−185)記載の方法に従って、マウスの一方の耳にいわし画分を500μg塗布してから30分経過した後に、これら各画分を塗布した箇所と反対側の耳にTPAを0.5μg塗布する。この後、7時間経過した後に、TPAによって誘発される炎症性浮腫の質量を測定して反対側の耳(コントロール)と比較し、これら炎症生浮腫の質量減少を抗炎症活性として各阻害効果を算出した。
この結果、図7に示すように、ブタノール層画分、ヘキサン層画分および第2の水層画分のそれぞれにおいて有意に炎症を抑制した。一方、50%メタノール画分および第1の水層画分のそれぞれにおいては抗炎症活性が見られなかった。この結果、脂溶性画分であるブタノール層画分、へキサン層画分および第2の水層画分のそれぞれは、抗炎症作用を有すると認められ、発癌プロモータTPAの働きを抑制する抗発癌プロモータ活性、換言すれば抗発癌作用を有するものと認められた。
上述したように、上記一実施例では、一般的に安価で廃棄物となるいわしの頭部や内臓からの抽出物のうち脂溶性成分であるブタノール層画分は、DNA合成酵素選択的阻害剤としての利用に止まらず、抗癌剤および抗炎症剤として医薬品などへの応用が可能であり、その薬理上許容される塩についても同様に医薬品などへの応用が可能である。したがって、このブタノール層画分を有効成分として含有したDNA合成酵素選択的阻害剤は、製造が容易で安価に製造できる。
さらに、上述したいわしの脂溶性画分であるブタノール層画分は、上述のようにTPAによって誘発される炎症を抑制する作用を有しており、発癌プロモータTPAの働きを抑制する作用を有するものと認められる。したがって、このブタノール層画分は、発癌プロモータ抑制剤および抗発癌剤、換言すれば発癌防止剤および発癌抑制剤として有用である。このとき、「抗癌剤」は、発癌プロモータ抑制作用を有する抗発癌剤を含む意味として用いている。
なお、上記いわしの各画分を体内投与する際は、経口投与よりも非経口投与が好ましく、またリボソームなどの運搬体に封入して投与することが好ましい。このとき、癌細胞を特異的に認識する運搬体などを利用すれば、標的部位、すなわち病変部位に有効成分を効率よく運ぶことができるので効果的である。また、上記いわしの各画分は、飲食品へ添加や配合することによって、抗癌効果、抗発癌効果、あるいは抗炎症効果をもった健康食品として利用することもできる。
次に、上記有効成分を配合した医薬用組成物および食用組成物について説明する。
まず、上記いわしの脂溶性画分であるブタノール層画分を有効成分とする抗癌剤および抗炎症剤としては、この有効成分をそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬用組成物とすることによって、動物やヒトに投与できる。このとき、医薬用組成物の剤形としては、特に制限されるものではなく必要に応じて適宜選択できる。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤など経口剤や、注射剤、坐剤などの非経口剤などが挙げられ、好適には非経口剤が挙げられる。
そして、これら錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤あるいは散剤などの経口剤としては、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類などを用いて常法に従って製造される。また、これら製剤中の成分の配合量は、特に限定されるものではなく適宜設計できる。この種の製剤には、上述の有効成分の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを適宜使用できる。
さらに、結合剤としては、デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴールなどが例として挙げられる。また、崩壊剤としては、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロースなどが例として挙げられる。
そして、界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、蔗糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどが例として挙げられる。また、滑沢剤としては、タルク、ロウ類、水素添加植物油、蔗糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコールなどが例として挙げられる。さらに、流動性促進剤としては、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムなどが例として挙げられる。そして、上記有効成分を、懸濁液、エマルション剤、シロップ剤あるいはエリキシル剤などとして投与してもよく、これら各種剤形には、矯味矯臭剤や着色剤などを含有させてもよい。
一方、非経口剤として有効成分の効果を発現させるためには、患者の年齢や、体重、疾患の程度によって用いる量が異なるが、通常、成人であれば1日あたり1mg以上60mg以下を静注、点滴静注、皮下注射あるいは筋肉注射によって投与するのが適当である。この非経口剤である非経口投与剤としては、常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコールなどが用いられる。さらに必要に応じて、これら非経口剤に、殺菌剤、防腐剤、安定剤などを加えてもよい。また、この非経口剤は、安定性の点から、バイアルなどに充填した後に冷凍し、通常の凍結乾燥処理によって水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製するとよい。さらに必要に応じて、これら非経口剤に、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤などを加えてもよい。
これら製剤中の有効成分の配合量は、特に限定されるものではなく任意に設定できる。その他の非経口剤の例としては、外用液剤、軟膏などの塗布剤や、直腸内投与のための坐剤などが挙げられ、これら塗布剤および坐剤なども常法に従って製造される。
さらに、有効成分の好適な態様としては食用組成物が挙げられる。すなわち、この有効成分は、そのまま液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキーなどに添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉などの賦形剤や香料、色素などとともにペレット、錠剤、類粒などに加工したり、ゼラチンなどで被覆してカプセルに成形加工したりして健康食品や栄養補助食品などとして利用できる。
なお、ヒトと他の哺乳類のDNA合成酵素の構造はほとんど同じであるため、上述したDNA合成酵素阻害剤としては、ヒト以外の哺乳類由来のDNA合成酵素阻害剤としても利用可能である。
Claims (15)
- 魚類から抽出した有効成分を含有し、DNA合成酵素に対する阻害作用を有する
ことを特徴としたDNA合成酵素阻害組成物。 - 有効成分は、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分である
ことを特徴とした請求項1記載のDNA合成酵素阻害組成物。 - 魚類は、いわしの頭部および内臓の少なくともいずれかである
ことを特徴とした請求項1または2記載のDNA合成酵素阻害組成物。 - 魚類から抽出した有効成分を含有し、DNAトポイソメラーゼ群に対する阻害作用を有する
ことを特徴としたDNAトポイソメラーゼ阻害組成物。 - 有効成分は、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して分けた脂溶性のブタノール層画分および水溶性の水層画分の少なくともいずれかである
ことを特徴とした請求項4記載のDNAトポイソメラーゼ阻害組成物。 - 魚類は、いわしの頭部および内臓の少なくともいずれかである
ことを特徴とした請求項4または5記載のDNAトポイソメラーゼ阻害組成物。 - 魚類から抽出した有効成分を含有し、テロメラーゼに対する阻害作用を有する
ことを特徴としたテロメラーゼ阻害組成物。 - 有効成分は、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分である
ことを特徴とした請求項7記載のテロメラーゼ阻害組成物。 - 魚類は、いわしの頭部および内臓の少なくともいずれかである
ことを特徴とした請求項7または8記載のテロメラーゼ阻害組成物。 - 魚類から抽出した有効成分を含有し、癌細胞増殖抑制作用を有する
ことを特徴とした癌細胞増殖抑制組成物。 - 有効成分は、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分である
ことを特徴とした請求項10記載の癌細胞増殖抑制組成物。 - 魚類は、いわしの頭部および内臓の少なくともいずれかである
ことを特徴とした請求項10または11記載の癌細胞増殖抑制組成物。 - 魚類から抽出した有効成分を含有し、抗炎症作用を有する
ことを特徴とした抗炎症組成物。 - 有効成分は、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分と、このブタノール層画分をヘキサンと水とで分配して分けた水溶性の水層画分と脂溶性のヘキサン層画分との少なくともいずれかである
ことを特徴とした請求項13記載の抗炎症組成物。 - 魚類は、いわしの頭部および内臓の少なくともいずれかである
ことを特徴とした請求項13または14記載の抗炎症組成物。
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