KR20220087969A

KR20220087969A - 도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20220087969A
Application number: KR1020200178544A
Authority: KR
Inventors: 김형돈; 장귀영; 지윤정; 문민호; 남윤권; 김민정
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장); 건양대학교산학협력단
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2022-06-27

Abstract

본 발명은 도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 도라지 추출물은 알츠하이머 동물모델인 5XFAD 마우스에서, Aβ의 축적을 효과적으로 억제하며, Aβ 독성으로 유발된 신경세포의 손상을 효과적으로 회복시키고, ROS 생성을 억제시키며, 인지능력을 개선시키는 것을 확인하여, 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료에 효과적으로 이용할 수 있는 것을 확인하였다.

Description

도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating degenerative brain diseases comprising bellflower extract as an active ingredient}

본 발명은, 도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

우리나라의 평균수명은 1990년 71.3세에서, 2000년 74.3세, 2020년 76.95세에 이를 것으로 예상되고, 65세 이상의 노인인구도 1990년 2,144천 명에서 2000년 3,168천 명, 2020년에는 6,333천 명에 이르러 전체 인구의 약 12.5%를 점할 것으로 예측되는바, 우리나라도 21세기에 들어서자마자 노인인구에 많은 각종 퇴행성 뇌질환들이 커다란 의료 및 사회적 문제로 대두하게 될 것이다. 게다가 가족구성이 핵가족 중심으로 급격히 변화하고 전통적인 효에 대한 가치관이 변화함에 따라 퇴행성 질환으로 인해 정상적인 생활을 유지할 수 없는 노인들이 가족의 돌봄을 받지 못하고 길거리를 떠도는 사태도 예측 가능하다. 더욱이 노인성 치매 또는 '노망'은 노령인구에서 '당연히' 일어나는 것이라는 사회적 통념 때문에 노인성 치매환자들이 의료기관에서 집중적인 치료를 받기가 어렵고, 퇴행성 뇌질환 환자를 대상으로 한 새로운 치료법의 개발이 어려운 형편이다. 따라서 의학적 관점에서 뿐 아니라 사회-경제적 측면에서도 퇴행성 뇌질환의 연구가 절실한 상태이며, 21세기 복지국가 실현을 위한 보건의료정책을 수립하는데 있어서도 우선적으로 고려되어야 할 분야이다.

신경세포는 발생 및 시냅스를 재구성하는 과정에서 끊임없이 세포사멸하며, 스트레스와 세포독성 약물에 의한 세포사멸이 퇴행성 뇌질환의 주요 요인이 된다. 이중 산화적 스트레스는 치매, 알츠하이머, 건망증, 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환과 같은 퇴행성 신경질환의 유발원인과 많은 연관관계를 가진 것으로 알려져 있으며, 최근 연구에 따르면 만성적인 스트레스 및 산화적 스트레스는 시상하부-뇌하수체-부신피질계, 해마, 선조체, 흑질 그리고 전뇌피질 부위에서 산화적 스트레스를 유발하여 세포사멸을 증가시키고 뉴런 및 성장인자를 감소시켜 알츠하이머, 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환을 초래하는 원인이 되는 것으로 알려져 있다.

한편, 치매는 뇌신경세포 손상에 따른 신경학적 증상으로 퇴행성 뇌질환의 일종이며, 사회생활에 지장이 되며 타인의 도움 없이는 일상생활을 영위할 수 없을 정도의 정신적 능력의 저하인 병적 상태를 의미하는데 알츠하이머성 치매와 뇌혈관성 치매가 가장 많고 그 외 파킨슨씨병이나 뇌종양의 원인이되기도 한다. 치매를 포함하는 퇴행성 신경질환은 발병원인이 다양하며 세포생물학적으로 혈액공급의 저하, 신경세포의 손상, 뇌 염증세포인 신경교세포(microglia)로부터 분비되는 염증물질, 이로 인한 신경세포사멸이 중요하며 특히 신경교세포의 활성조절과 신경세포보호는 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방, 조절 및 치료법 개발의 핵심표적이다.

국내ㆍ외적으로 많은 연구진들이 이러한 신경세포의 사멸에 대한 기전을 연구함으로써 뇌질환을 막고자하는 노력을 기울여 왔으나, 뇌졸중의 경우 현재 뚜렷한 치료제가 개발되어 있지 못하며, 지금까지 많은 연구진들이 흥분성신경전달물질인 글루타민산 수용체에 대한 길항제나 항산화제를 퇴행성 신경질환 치료제로 개발하고자 하였으나 약효가 미미하거나 약물의 독성으로 인하여 모두 실패로 끝났다.

한편, 생약제제는 오래 전부터 전통적으로 인간의 질병을 치료하고 신체를 보호하는데 사용해 왔으며 대부분이 식물기원으로 주로 생약원료의 복합처방을 기초로 하며, 동의보감 등의 한약서 처방을 근원으로 하고 있다. 이러한 한약제제는 여러 질병의 예방 및 치료제로 사용되고 있으며 효과가 복합적이고 부작용이 적어 현재 양방학적 관점에서 개발되고 있는 많은 합성약품들의 화학적인 부작용으로 인해 관심이 증폭되고 있다. 대한민국 특허출원 제 2002-44507 호, 제 2002-30648 호 및 제 2002-30642 호 등에서는 당귀, 삼백초 및 오미자 등의 생약이 뇌신경세포의 보호활성을 나타낸다고 보고하고 있으나, 임상에 적용할 정도로 우수한 효과는 아니었다. 따라서, 퇴행성 뇌 질환의 예방과 개선을 위해 뇌 세포의 파괴와 노화를 지연시켜 뇌 세포를 보호하고, 인지 기능을 회복시키며, 뇌 세포의 재생을 촉진시키는 새로운 인지기능 개선 물질의 개발이 요구되고 있다.

도라지(Platycodon grandiflorum)는 길경·도랏·길경채·백약·질경·산도라지라고도 한다. 산과 들에서 자라며, 뿌리는 굵고 줄기는 곧게 자라며 자르면 흰색 즙액이 나오며, 열매는 삭과로서 달걀 모양이고 꽃받침조각이 달린 채로 익는다. 번식은 종자로 이루어지고, 봄·가을에 뿌리를 채취하여 날것으로 먹거나 나물로 먹는다. 도라지의 주요 성분은 사포닌으로 알려져 있으며, 생약의 길경(桔梗)은 뿌리의 껍질을 벗기거나 그대로 말린 것이고, 한방에서는 치열(治熱)·폐열·편도염·설사에 사용한다. 그러나, 도라지 추출물을 이용하여, 퇴행성 뇌질환에 대한 효과 및 신경세포 사멸 보호 효과에 이용하고자 하는 연구는 미비한 실정이다.

따라서 본 발명자들은, 도라지 추출물을 이용하여, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 조성물을 연구하던 중, 도라지 추출물이 신경세포 독성인자인 Aβ 의 축적을 억제하고, 신경세포를 회복시키는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 도라지 추출물에서 플라티코사이드 E(platycoside E) 및 플라티코딘 D(platycodin D)의 함량을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 플라티코사이드 E(platycoside E) 및 플라티코딘 D(platycodin D)가 증가된 도라지 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 도라지 추출물에서 플라티코사이드 E(platycoside E) 및 플라티코딘 D(platycodin D)의 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 플라티코사이드 E(platycoside E) 및 플라티코딘 D(platycodin D)가 증가된 도라지 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 도라지 추출물은 알츠하이머 동물모델인 5XFAD 마우스에서, Aβ의 축적을 효과적으로 억제하며, Aβ 독성으로 유발된 신경세포의 손상을 효과적으로 회복시키고, ROS 생성을 억제시키며, 인지능력을 개선시키는 것을 확인하여, 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료에 효과적으로 이용할 수 있는 것을 확인하여 관련 산업에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 도라지 추출물의 플라티코사이드 E(platycoside E) 및 플라티코딘 D(platycodin D)를 HPLC-ELSD로 분석한 도이다(A: 검출 시간 확인, B: 표준 물질과의 함량 비교)
도 2는 본 발명의 도라지 추출물이 야생형 마우스 및 알츠하이머 동물모델에서의 인지능력 개선 효과를 Y-미로 실험으로 확인한 결과를 나타낸 도이다(A: 실험 일정, B: 변경 행동력 수치화, C: 총 가지 변경 비교).
도 3은 본 발명의 도라지 추출물의 투여에 따른, 5XFAD 마우스의 뇌조직에서, 4G8 양성세포의 변화를 확인한 도이다(A: 면역형광 분석 결과, B, 면역 형광 분석 정량화, C: 플라크 크기 정량화, D: 플라크 개수 정량화).
도 4는 본 발명의 도라지 추출물의 투여에 따른, 야생형 마우스 및 5XFAD 마우스의 뇌조직에서 면역형광분석을 시행하여, 시넵토파이신(synaptophysin, SYN) 및 신경핵(neuronal nuclei, NeuN) 양성 세포를 관찰한 도이다(A: SYN 및 NeuN 양성 세포 면역형광 분석 결과, B: SYN 인자 CA1 분석 정량화, C: SYN 인자 CA3 분석 정량화, D: SYN 인자 ML 분석 정량화, E: NeuN 양성 세포 분석 정량화).
도 5는 본 발명의 도라지 추출물의 투여에 따른, 야생형 마우스 및 5XFAD 마우스에서의 신경염증인자인 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1(ionized calcium binding adapter molecule, Iba1) 및 신경교 섬유질 산성 단백질(Glial fibrillary acidic protein, GFAP) 양성 세포의 발현을 면역화학분석으로 분석한 도이다(A: Iba1 및 GFAP 양성 세포의 발현 분석, B: Iba1 면적 분석, C: Iba1 양성 세포 개수 정량화, D: GFAP 면적 분석, E: GFAP 양성 세포 개수 정량화).
도 6은 본 발명의 도라지 추출물의 투여에 따른, 야생형 마우스 및 5XFAD 마우스에서, 인지기능과 관련된 Ki67 및 DCX 양성 세포를 면역퍼옥시데이즈 분석으로 분석한 도이다(A: Ki67 및 DCX 양성 세포 분석 결과, B: Ki67 분석 정량화, C: DCX 분석 정량화).
도 7은 본 발명의 Aβ로 세포 사멸이 유도된 HT22 세포주에서, 도라지 추출물의 처리 농도에 따른 세포 생존율을 확인한 도이다.
도 8은 본 발명의 Aβ로 ROS 생성이 유도된 HT22 세포주에서, 도라지 추출물의 처리 농도에 따른 ROS 생성 억제를 확인한 도이다.

본 발명에서 사용되는 용어 “예방”은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “개선”은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 식품 조성물은 본 발명의 유효성분을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 기능성 식품 조성물은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능성 식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 도라지 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 저급 알코올 수용액, 헥산, 클로로포름 및 아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 용매로 추출되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 물이나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 도라지 추출물은 Aβ 플락의 형성을 억제시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 도라지 추출물은 플라티코사이드 E(platycoside E) 및 플라티코딘 D(platycodin D)를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 도라지 추출물은 해마이행부(subiculum)의 Aβ 독성으로 유발된 신경세포사멸을 억제시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 도라지 추출물은 인지기능을 개선시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 도라지 추출물은 신경세포인자인 신경핵(neuronal nuclei, NeuN) 및 시넵토파이신(synaptophysin, SYN) 양성 세포의 수를 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 도라지 추출물은 신경 염증 지표인 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1(ionized calcium binding adapter molecule, Iba1) 및 신경교 섬유질 산성 단백질(Glial fibrillary acidic protein, GFAP) 양성 세포의 수를 감소시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 퇴행성 뇌질환은 치매, 뇌질환은 알츠하이머병(Alzheimer disease), 픽병(Pick disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis) 및 헌팅턴병(Huntington's disease)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 바람직하게는 치매 또는 알츠하이머이나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 “치료”는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약학 조성물에는 유효성분 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 효과를 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 유효성분의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 도라지 추출물 및 동물 모델

<1-1> 도라지 추출물의 제조

본 발명의 도라지(Platycodon grandiflorum)추출물(PEG)을 제조하기 위하여, 충북 보은에서 2018년도 수확한 3년생 도라지를 이용하여 추출하였다. 도라지를 원통형 세척기에 넣고 흙, 비닐 등 이물질을 완전히 제거하였다. 세척한 도라지를 55℃의 열풍건조기에서 72시간 동안 건조하였다. 건조된 도라지는 10배의 물에 담근 후, 90℃에서 6시간 동안 환류 추출을 하고, 여과하여 얻어진 여액을 합쳐서 동결건조하여 도라지 추출물을 제조하였다.

<1-2> HPLC-ELSD 분석을 이용한 도라지 추출물 분석

다양한 도라지 사포닌 중에서, 플라티코사이드 E(platycoside E) 및 플라티코딘 D(platycodin D)는 주요 생리 활성 분자 및 지표성분으로 알려져 있으며, 본 발명의 도라지 추출물의 성분 분석을 위하여, 표준물질인 플라티코사이드 E 및 플라티코딘 D의 함량을 분석하였다. 구체적으로 분석 등급(analysis grade)의 플라티코사이드 E 및 플라티코딘 D는 Phytochemical Ltd. (Cheongdu, Sichuan, China)에서 구입하여 사용하였다. 구체적으로 도라지 추출물을 증류수 40 mL에 녹인 후 분액 깔대기에서 디에틸에테르로 탈지하였다. 분액된 수층(aqueous layer)을 물포화 n-부탄올로 3회 추출하였으며, n-부탄올층을 50℃에서 증발시키고 생성된 잔류물을 메탄올에 녹여 분석하였다. 플라티코사이드 E 및 플라티코딘 D의 머무름 시간을 해당 분석 등급의 표준물질과 일치시켜 확인하고, 표준곡선을 이용하여 함량을 분석하였으며, 함량분석은 고성능 액체 크로마토 그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC) 및 증발 광산란 검출기(evaporative light scattering detector, ELSD)로 구성된 Waters Alliance 2695 HPLC 시스템 (2424 ELSD, Waters, Milford, MA, USA)을 이용하여 분석하였으며, 사용한 컬럼은 C-18 컬럼(Luna C-18, Phenomenox, 250 × 4.6mm, 5μm, Torrance, CA, USA)을 이용하였다. 이동상으로는 A 용매는 물, B용매는 아세토니트릴을 사용하였으며, 구체적인 분석 조건으로는 A 용매의 부피비에 대하여, 0-3 분간 21-21% 용매 B; 3-23 분간 21-23% 용매 B; 23-38 분간 23-24% 용매 B; 38-70 분간 24-100% 용매 B; 70-75 분간 100-100% 용매 B로 용매 구배로 분석하였으며, 유속은 1.0 mL/min, 샘플 주입 부피는 30 μL이고 컬럼 온도는 40 ℃로 유지하였다. ELSD의 조건으로는 분무기 온도 42 ℃, 드리프트 튜브 온도 85 ℃ 및 N₂ 가스 압력이 50 psi가 되도록 유지하여, 분석하였다.

그 결과, 플라티코사이드 E는 14.2 분에, 플라티코딘 D는 44.3 분에 검출되었으며(도 1A), 플라티코사이드 E는 1597.14 ± 21.71 μg/g, 플라티코딘 D는 942.32 ± 97.97 μg/g이 포함된 것을 확인하였다(도 1B).

<1-3> 알츠하이머 동물 모델

본 발명의 도라지 추출물의 효과를 확인하기 위하여 유전적으로 AD 조기 발병과 관련된 5가지 돌연변이를 발현하는 6개월 된 암컷 5XFAD 마우스를 이용하였다. 5가지의 돌연변이는 인간 PSEN1 돌연변이 M146L 및 L286V와, APP 돌연변이인 스웨덴(Swedish, K607N 및 M671L), 플로리다(Florida, I716V) 및 런던(London, V717I)을 포함하며, 대조군인 야생형 마우스는 암컷 B6SJL/F1 마우스와 수컷 5XFAD 마우스를 교배하여 얻었다. 구체적으로 마우스를 분류하기 위하여, 마우스의 꼬리로부터 DNA를 분리하고 하기 표 1에 기재된 프라이머를 이용하여, 유전형을 분석하여, 야생형 마우스(WT) 및 알츠하이머 마우스(5XFAD)로 분류 하고, 추가적으로 분류하여 4개의 군으로 나누었다.

Gene	Sequence(5’ - 3’)
APP	F: AGG ACT GAC CAC TCG ACC AG
APP	R: CGG GGG TCT AGT TCT GCA T
PSEN1	F: AAT AGA GAA CGG CAG GAG CA
PSEN1	R: GCC ATG AGG GCA CTA ATC AT

구체적으로, 1) 야생형 마우스에 식염수를 투여한 군(WT+vehicle); 2) 야생형 마우스에 도라지 추출물을 투여한 군(WT+PEG); 3) 알츠하이머 마우스에 식염수를 투여한 군(5XFAD+vehicle); 및 4) 알츠하이머 마우스에 도라지 추출물을 투여한 군(5XFAD+PEG);으로 분류하였으며, 도라지 물 추출물은 3주간 100 mg/kg의 농도로 매일 경구 투여하였으며, 대조군은 동량의 식염수를 투여하였다.

<실시예 2> 행동실험(Y-미로 실험)

상기 실시예 1-2의 대조군 및 알츠하이머 마우스 동물모델은, 3주 후 Y-미로실험 전 일주일간 실험환경에 적응 시켰으며, 마지막 PEG 투여 후 Y-미로(각각 폭 8 cm, 길이 30 cm, 높이 15 cm)에 넣어 A, B 및 C 각 가지에 마우스가 자유롭게 각 가지에 들어가는 것을 측정하였다. 구체적인 실험 계획은 도 2A에 나타내었다. 마우스가 새로운 각 가지에 들어가면 1점을 주게 되며(실제 변경), 교차행동에 대한%를 하기 수학식1을 통해 계산하였다.

<수학식 1>

그 결과, 도 2B에 나타낸 바와 같이, WT 마우스(WT+vehicle)와 비교하여, 5XFAD 마우스(5XFAD+vehicle)의 교차행동은 유의적으로 감소한 것을 확인하였다. 또한 도라지 추출물이 처리된 5XFAD 마우스(5XFAD+PEG)는 비히클 처리군과 비교하여 교차행동이 현저하게 증가한 것을 확인하였으며, 총 가지 변경은 각 그룹간 큰 차이가 없어(도 2C), 결론적으로 도라지 추출물의 투여가 운동 활동에는 영향을 미치지 않으면서, 기억력을 개선시키는 것을 확인하였다.

<실시예 3> 면역조직화학 분석

<3-1> 조직 준비

상기 실시예 2의 마우스를 행동실험이 끝난 후 마취하여, 0.05 M의 PBS 용액과 0.1 M의 PB에 4% 포름알데하이드(paraformaldehyde, PFA)를 혼합한 용액으로 심장 관류 고정 하였다. 그 후 뇌를 적출하고, 4% PFA에 침지하여 4℃에서 20시간동안 고정한 후 동결방지를 위해 0.05M PBS에 30% 수크로오즈가 용해된 용액에 침지시켰다. 침지된 뇌 조직은 -25℃의 저온 유지장치를 사용하여 30 μm 두께의 관상 절편으로 절단하였다. 절단된 조직은 면역조직화학 분석의 시행 전까지 4℃에서 25% 에틸렌글리콜 및 글라이세롤이 포함된 0.05M의 PBS 버퍼에 보관하였다.

<3-2> 면역형광 라벨링

Aβ(amyloid-β, 4G8)의 축적은 인지기능 저하의 발병과 진행에 직접적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있어, Aβ 플락 형성을 확인하고자 하였다. 또한 신경 세포의 사멸을 관찰하기 위하여, 뉴런 바이오 마커인 신경핵(neuronal nuclei, NeuN) 및 시냅스 소포체 단백질인 시넵토파이신(synaptophysin, SYN)을 분석하였으며, 신경 염증 지표인 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1(ionized calcium binding adapter molecule, Iba1) 및 신경교 섬유질 산성 단백질(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)에 대한 양성세포를 각각 분석하고자, 면역형광 분석을 시행하였다. 구체적으로, 실시예 3-1의 준비된 뇌조직을 150-180 μm(bregma에 대하여 -1.46 및 -2.06 mm) 간격과, 270-350 μm(bregma에 대하여 -2.70 및 -3.80 mm) 간격에서 3-4장의 절편을 골라 염색했다. 제작된 절편은 PBS로 간단히 세척하고, 0.5 mg/ml 농도의 BSA 및 0.3% 트리톤 X-100을 포함하는 PBS로 1차 항체를 희석하여 18 시간동안 반응시켰다. 사용된 1차 항체는 마우스 항-4G8 항체(1:2,000), 마우스 항-신경핵(NeuN)항체(1:500), 마우스 항-시넵토파이신(synaptophysin, SYN 1:500), 염소 항-이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1(ionized calcium binding adapter molecule 1, Iba1, 1:1,000) 항체 및 래트 항-아교세포섬유산 단백질(glia fibrillary acidic protein, GFAP, 1:500) 항체를 사용하였다. 뇌 조직은 마우스 항-4G8 항체로 반응시키기 전 항원 검출을 위해 20 분간 70% 포름산으로 처리하였다. 2차 항체는 당나귀 Alexa 488-접합 항-마우스 IgG(1:200) 및 당나귀 Alexa 594-접합 항-마우스 IgG (1:200)을 0.3% 트리톤 X-100를 함유하는 PBS로 희석하여 실온에서 50분동안 2차 항체와 반응시켰다. 면역조직화학 염색된 절편은 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 포함하는 Fluoroshield^™를 사용하여 슬라이드에 장착하고 커버 슬립으로 오버레이하였다.

그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 5XFAD 마우스에서 도라지 추출물을 처리하면 대조군(5XFAD+vehicle)과 비교하여, 4G8 양성 영역, 평균 플라크 크기 및 플라크 수가 감소하는 것을 확인하여, 도라지 추출물이 Aβ의 축적을 억제하는 것을 확인하였다.

또한, 5XFAD+vehicle 마우스의 해마에서는 야생형 마우스와 비교하여, SYN(CA1, CA3 및 ML)의 밀도가 현저하게 감소한 것을 확인하였으며, 5XFAD 마우스에 도라지 추출물을 투여하면, SYN의 밀도가 유의적으로 증가하는 것을 확인하였으며(도 4A 내지 도 4D), 야생형 마우스와 비교하여, 5XFAD+vehicle군의 마우스에서 NeuN 양성세포가 감소하였으나, 5XFAD 마우스에 도라지 추출물을 투여하면 NeuN 양성세포가 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 4E).

또한, 신경 염증인자인 Iba1 양성 영역 및 GFAP 양성 영역은 야생형 마우스와 비교하여, 5XFAD+vehicle 마우스에서 유의미하게 증가된 것을 확인하였으며, 5XFAD 마우스에 도라지 추출물을 처리하면 Iba1 양성 영역 및 GFAP 양성 영역이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 5).

<3-2> 면역퍼옥시데이즈(Immunoperoxidase) 라벨링

도라지 추출물의 성체 해마의 신경발생에 따른 신경 보호효과를 확인하기 위하여, 성체신경발생인자인 DCX와 Ki-67을 이용해 면역퍼옥시데이즈 분석을 시행하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3-1의 준비된 뇌조직을 의 절편을 120~180 μm (bregma에 대하여 -1.70~ 및 2.18 mm)사이의 간격에서 3-4장의 절편을 얻었다. 얻어진 절편을 PBS로 세척하고, 1% H₂O₂를 포함하는 PBS로 상온에서 15분간 처리하였다. 그 후 조직을 4℃에서 1차 항체인 염소 항-더블 코르틴(doublecortin, DCX 1:1,000)항체, 및 토끼 항-Ki67 항체(1:2,000)로 처리하였다. 1차 항체가 처리된 절편은 비오틴화된 2차 항체(1:200)로 1시간동안 실온에서 반응시켰다. 반응 종료후, 발색을 위해 avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) 용액과DAB(3,3-diaminobenzidine)를 사용했다. 시각화된 절편은 슬라이드에 올려 알코올과 자일렌으로 탈수시킨 후 mounting medium (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 커버 슬립으로 오버레이 하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, Ki67 및 DCX 양성 세포는 야생형 마우스보다 5XFAD+vehicle 마우스에서 유의미하게 감소된 것을 확인하였으나, 5XFAD 마우스에 도라지 추출물을 투여했을 때, Ki67 및 DCX 양성 세포가 유의하게 증가하지 않았다.

<실시예 4> 세포생존율 확인

쥐 해마 신경세포주인 HT22 세포는 Dulbeccos Modified Eagles Media(DMEM)으로 배양하였으며, 구체적으로 10% 우태아 혈청 및 100 U/ml의 페니실린-스트렙토 마이신이 보충된 배지에서 배양하였고, 5% CO2, 37 ℃ 조건으로 배양하였다. 배양된 세포는 96 well plate에 1 x 10^4개 세포가 되도록 접종하였다. 접종 24시간 후 도라지 추출물(PEG)를 50, 100, 200 μg/ml의 농도로 1시간동안 전처리하고, Aβ25-35를 처리하였다. Aβ25-35를 처리하고 48시간 후 제조업체의 가이드에 따라 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시 메톡시페닐)-2-(4 설포페닐) -2H-테트라 졸륨 (MTS) 분석을 사용하여 세포 생존율을 정량화 하였으며, 멀티 모드 마이크로 플레이트 리더 (Biotek Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 실험은 3번 수행하였다.

그 결과, Aβ가 처리된 HT22 세포는 대조군과 비교하여 세포생존율이 50% 감소한 것을 확인하였으며, 도라지 추출물이 처리된 HT22세포에서는 세포 생존율이 증가하는 것을 확인하였다(도 7).

<실시예 5> 세포 내 ROS 생성 확인

세포 내 ROS 생성은 변형된 디클로로-디하이드로-플루오렌스-디아세테이트 (dichloro-dihydro-fluorescein diacetate, DCFH-DA)방법으로 분석하였다. HT22 세포를 1x10^4 세포수가 되도록 96 well plate에 접종하고, 24시간 동안 배양하였다. 그 후 도라지 추출물을 상기 실시예 4에 기재된 농도로 처리한 후 24시간 동안 추가배양 하였다. 배양된 세포를 10 μM Aβ25-35가 포함된 무혈청 배지(serum-free medium, SFM)를 20분간 처리하였으며, 이 후 DCF-DA가 포함된 SFM을 30분간 처리하였습니다. 30분 후 세포를 세척하고, 100 μL의 Dulbecco’s 인산-버퍼를 각 웰에 첨가하였다. 그 후 485 nm/535 nm에서 각각의 형광을 측정하였다.

그 결과, HT22 세포에 Aβ가 처리되면 ROS의 생성이 대조군보다 1.7배 가량 증가하는 것을 확인하였다. 그러나, 도라지 추출물이 처리된 세포에서는 Aβ에 의해 유도된 ROS 생성이 현저히 감소하여, 도라지 추출물이 신경 보호 및 항산화 효과가 있는 것을 확인하였다(도 8).

<실시예 6> 이미지 분석

상기 실시예 3-2 내지 3-3에서의 면역 반응을 정량화하기 위하여 Zeiss LSM 700 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany) 및 Olympus CX23 (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) 현미경을 사용하여 항체로 염색된 뇌 절편에서 이미지를 얻어, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 분석은 각 동물의 뇌 절편의 동측(ipsilateral) 및 반대측(contralateral) 해마에서 수행하였다. 4G8 면역 반응성을 측정하기 위하여 배측(dorsal) 해마 이행부의 면역 양성 신호에 대한 면적분율(%), 면적당(mm²) 평균 플락 크기 및 평균 플락수를 정량화 하였다. 또한, Iba1 및 GFAP의 면역 반응은 동일한 배측 해마 이행부에서 면역 양성 신호의 면적분율로 정량화 하였다. SYN 면역 반응성은 해마의 형광 강도(광학 밀도)로 정량화 하였으며, DCX와 Ki67의 면역 반응성은 해마 치상회(hippocampal dentate gyrus, DG)에서 과립화된 영영(subgranular zone)의 길이(mm)당 양성 세포의 수로 정량화 하였다. 조직학적 정량화, 통계 분석 및 이미지 수득은 4개의 군에 대하여 블라인드 방식으로 수행하였다.

<실시예 7> 통계학적 분석

본 발명의 모든 실시예는 4가지 군에 대하여 블라인드 및 무작위로 수행하였다. 모든 통계분석은 GraphPad Prism 7.0 소프트웨어 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)를 사용하였으며, 모든 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로 표시하였고, 두 그룹 간의 차이의 유의성은 독립적인 t-검정을 사용하였다. 4 개 그룹 간의 통계 분석은 일원 분산 분석에 이어 Fisher의 LSD 및 Tukey의 사후 테스트로 수행하였으며, p값이 p<0.05이면 통계적으로 유의한 것으로 간주하여 분석하였다.

따라서 본 발명의 도라지 추출물은, 알츠하이머 동물모델인 5XFAD 마우스에서, Aβ의 축적을 효과적으로 억제하며, Aβ 독성으로 유발된 신경세포의 손상을 효과적으로 회복시키고, ROS 생성을 억제시키며, 인지능력을 개선시키는 것을 확인하여, 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료에 효과적으로 이용할 수 있는 것을 확인하였다.

Claims

도라지(Platycodon grandiflorum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 도라지 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 저급 알코올 수용액, 헥산, 클로로포름 및 아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 도라지 추출물은 플라티코사이드 E(platycoside E) 및 플라티코딘 D(platycodin D)를 포함하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 도라지 추출물은 Aβ 플락(4G8)의 형성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 도라지 추출물은 해마이행부(subiculum)의 Aβ 독성으로 유발된 신경세포사멸을 억제시키는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 도라지 추출물은 Aβ로 유도된 ROS 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 도라지 추출물은 인지기능을 개선시키는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 도라지 추출물은 신경세포인자인 신경핵(neuronal nuclei, NeuN) 및 시넵토파이신(synaptophysin, SYN) 양성 세포의 수를 증가시키는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 도라지 추출물은 신경 염증 지표인 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1(ionized calcium binding adapter molecule, Iba1) 및 신경교 섬유질 산성 단백질(Glial fibrillary acidic protein, GFAP) 양성 세포의 수를 감소시키는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 퇴행성 뇌질환은 치매, 알츠하이머병(Alzheimer disease), 픽병(Pick disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis) 및 헌팅턴병(Huntington's disease)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
도라지(Platycodon grandiflorum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 11항에 있어서,
상기 도라지 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 저급 알코올 수용액, 헥산, 클로로포름 및 아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 11항에 있어서,
상기 도라지 추출물은 플라티코사이드 E(platycoside E) 및 플라티코딘 D(platycodin D)를 포함하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 11항에 있어서,
상기 도라지 추출물은 Aβ 플락의 형성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 11항에 있어서,
상기 도라지 추출물은 해마이행부(subiculum)의 Aβ 독성으로 유발된 신경세포사멸을 억제시키는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 11항에 있어서,
상기 도라지 추출물은 Aβ로 유도된 ROS 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 11항에 있어서,
상기 도라지 추출물은 인지기능을 개선시키는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 11항에 있어서,
상기 도라지 추출물은 신경세포인자인 신경핵(neuronal nuclei, NeuN) 및 시넵토파이신(synaptophysin, SYN) 양성 세포의 수를 증가시키는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 11항에 있어서,
상기 도라지 추출물은 신경 염증 지표인 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1(ionized calcium binding adapter molecule, Iba1) 및 신경교 섬유질 산성 단백질(Glial fibrillary acidic protein, GFAP) 양성 세포의 수를 감소시키는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 11항에 있어서,
상기 퇴행성 뇌질환은 치매, 알츠하이머병(Alzheimer disease), 픽병(Pick disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis) 및 헌팅턴병(Huntington's disease)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
도라지 추출물에서 플라티코사이드 E(platycoside E) 및 플라티코딘 D(platycodin D)의 함량을 증가시키는 방법.
플라티코사이드 E(platycoside E) 및 플라티코딘 D(platycodin D)가 증가된 도라지 추출물의 제조방법.