CN105307695B - 具有提高稳定性的抗血栓/杀菌s‑亚硝基‑n‑乙酰基青霉胺(snap)掺杂氧化氮释放聚合物 - Google Patents

具有提高稳定性的抗血栓/杀菌s‑亚硝基‑n‑乙酰基青霉胺(snap)掺杂氧化氮释放聚合物 Download PDF

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Abstract

一种聚合物膜包括具有离散RSNO加合物或聚合性RSNO加合物至少之一的聚合物基质，所述加合物通过共价连接到聚合物基质、在聚合物基质内分散或这两种方式与其结合，且离散RSNO加合物或聚合性RSNO加合物至少之一能够释放氧化氮(NO)。聚合物基质为聚氨酯聚合物基质、硅橡胶聚合物基质或聚氨酯和硅橡胶的共聚物基质。该聚合物膜在干燥条件下在37℃显示稳定性，且在暴露于水分或能够使RSNO键光解的光经预定量时间时显示从离散RSNO加合物或聚合性RSNO加合物至少之一的长期且可控的NO释放速率。

Description

具有提高稳定性的抗血栓/杀菌S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺 (SNAP)掺杂氧化氮释放聚合物
相关申请交叉引用
本申请要求2013年2月7日提交的美国临时申请序号61/762,013的权益，所述申请全文通过引用结合到本文中。
关于联邦资助的研究或研发的声明
本发明根据美国国立卫生研究院(the National Institutes of Health)授予的EB-004527和K25HL111213在政府支持下完成。政府拥有本发明的某些权利。
背景
已显示氧化氮(NO)有数个重要生理功能，包括其独特的血管舒张性质、抗癌效能、抗菌性质和抗血小板活性。虽然NO是稳定的自由基，但它可具有与血红蛋白和氧的高度反应性，因此将NO输送到靶部位竞争。稳定的亲水和疏水NO供体可最好利用NO用于宽范围生物医疗应用的效力。这些包括释放NO的药物和用于医疗器件(例如，血管内导管和体外回路)的抗血栓疏水聚合涂料的制备(基于NO的抗血小板活性)。然而，尽管NO的益处，NO供体用于聚合系统由于各种原因相对受到限制。
附图简述
参考以下详述和附图，本发明的实例的特征和优点将变得显而易见，其中相似的附图标记对应于相似(尽管可能不同)的组件。为简洁起见，可或可不与其中它们可能出现的其它附图相关描述具有前述功能的附图标记或特征。
图1A为显示在硅氧烷基聚氨酯弹性体(例如，Elast-EonTM E2As)对照涂覆体外循环(ECC)回路上形成血栓的示意剖视图；
图1B为显示释放含氮NO并减少血栓形成的S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺(SNAP)/E2As涂覆的ECC回路的示意剖视图；
图2A显示S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺(SNAP)的结构。
图2B显示S-亚硝基硫醇(RSNO)分解的示意图，分解可通过金属离子(例如，Cu+)、光和热催化，产生二硫化物(RSSR)产物和氧化氮(NO)；
图3A和3B显示在340nm监测从包含10%重量SNAP的不同聚合物膜的SNAP扩散，膜在暗处在室温22℃(图3A)或37℃(图3B)浸入4mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)(数据为平均值±SEM(n=3))；
图4A显示在37℃在暗处、环境光和100W泛光灯下10%重量SNAP/E2As膜的NO释放性能(数据为平均值±SEM(n=3))；
图4B显示在37℃且用100W泛光灯连续照射从硅橡胶(SR)、CarboSil和Elast-EonTME2As膜中10%重量SNAP的NO释放(数据为平均值±SEM(n=3))；
图4C显示在37℃连续地在环境光(amb)或100W泛光灯下从Elast-EonTM E2As膜中5%重量和10%重量SNAP的NO释放(数据为平均值±SEM(n=3))；
图5A显示10%重量SNAP/E2As膜、1.0mM SNAP和溶于N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)的E2As的UV-vis光谱(数据为平均值±SEM(n=3))；
图5B显示从不同条件下在PBS中培育的10%重量SNAP/E2As膜的NO释放：室温(22℃)利用环境光、37℃在暗处、37℃在环境光下和37℃在100W泛光灯下(数据为平均值±SEM(n=3))；
图6A显示在340nm监测从在室温(RT，22℃)或37℃在暗处在1mL PBS中浸渍的10%重量SNAP掺杂E2As膜的SNAP扩散；
图6B显示从在37℃在暗处在PBS中浸渍的10%重量SNAP掺杂E2As膜的累积SNAP浸出和累积SNAP释放(来自基于NOA或基于SNAP的NO释放数据)的比较。从聚合物相内SNAP的热和/或光化学分解，或者从浸入水相的SNAP，可发生从SNAP掺杂E2As膜释放氧化氮。对于SNAP掺杂E2As膜，总NO释放的约26%归于SNAP浸出；
图7为显示通过UV-vis在340nm监测从具有0、2或4个E2As面涂层的E2As膜中10%重量SNAP的SNAP扩散的图，膜在37℃在暗处浸入包含100μM EDTA的10mM PBS中，PBS每天在UV-vis检测后更换(数据为平均值±SEM(n=3))；
图8为显示在不同温度和光条件下利用干燥剂干燥储存的E2As膜中10%重量SNAP的稳定性的图，使膜溶于DMAc，以通过UV-vis在340nm监测在不同时间剩余的SNAP的量(与初始量比较)(数据为平均值±SEM(n=3))；
图9为显示从在37℃在暗处10%重量SNAP/E2As干燥膜的NO释放性能的图；
图10为用5%重量SNAP/E2As随后用E2As面涂层涂覆的体外回路(ECC)管的示意图；
图11A和11B为显示在血液暴露之前(图11A)和之后(图11B)从用E2As中5%重量SNAP涂覆的ECC管区段的代表性NO表面通量曲线的图，NO释放通过化学发光在37℃在环境光下测定；
图12A和12B为显示在兔凝血性模型中在4小时血液暴露期间5%重量SNAP/E2As涂层对血小板计数(例如，消耗)(图12A)和血浆纤维蛋白原水平(图12B)的时间依赖性影响的图(数据为平均值±SEM(n=4))；
图13为显示在5%重量SNAP/E2As和E2As对照涂层上体外纤维蛋白原吸附测定的结果的图(在96孔板中荧光测定，用山羊抗人纤维蛋白原-FITC缀合抗体测定涂层上吸附人纤维蛋白原(3mg/mL)的水平，数据为平均值±SEM(n=24))；
图14为在兔凝血性模型中在4小时血液暴露后SNAP/E2As和对照ECCs上形成血栓的二维表示，用来自NIH的ImageJ软件定量(数据为平均值±SEM(n=4))；
图15为显示用SNAP浸渍的聚氨酯管(微聚氨酯管，购自Scientific Commodities,Inc.)的NO释放曲线的图，管已在SNAP/丙酮溶液中浸渍1或2天；
图16A为用5%重量或10%重量SNAP/E2As活性层随后用E2As面涂层涂覆的导管的示意图解；
图16B为沿图16A的线16B-16B截取的图16A的导管的横截面图；
图17显示在37℃在暗处5%重量和10%重量SNAP/E2As导管的NO释放曲线(n=5)；
图18为显示在绵羊7天植入后在SNAP/E2As导管和E2As对照导管上血栓面积的定量的图解，利用ImageJ软件用血栓的2D表示定量(数据为平均值±SEM(n=5))，*=p<0.05；并且
图19为在外植的SNAP/E2As导管和E2As对照导管的1cm片上细菌粘附(CFU/cm2)的比较(数据为平均值±SEM(n=5))，*=p<0.05。
发明详述
本公开的实例包括用于制造生物医疗器件的新RSNO掺杂聚合物制剂。新聚合物制剂形成均匀膜，且甚至在37℃经4个月显示RSNO稳定性(NO仅损失约10%-15%)。新聚合物制剂可用作涂层防止在例如体外循环(ECC)回路中形成血栓(即，血凝块)。图1A为显示表现血栓形成的硅氧烷基聚氨酯弹性体(例如，Elast-EonTM E2As)对照涂覆ECC回路12的示意剖视图。如图所示，红细胞14和血小板16凝结在一起。相比之下，图1B为显示不表现血栓形成的SNAP掺杂硅氧烷基聚氨酯弹性体(例如，SNAP/E2As)涂覆ECC回路的本公开的实施例10的示意剖面图。如图1B中所绘，产生NO，这有助于红细胞14和血小板16不凝结在一起。
血液/材料相互作用对日常用于数千患者的从简单的导管、支架和移植物到复杂的体外人工器官的可植入医疗器件的成功是重要的。血栓形成是与血液接触材料临床应用相关的主要问题之一。尽管有血液表面相互作用机制的彻底认识和数十年生物工程研究工作，但理想的非凝血假体表面仍是未解决的难题。在过去50年间，关于表面诱导血栓形成已认识很多，很多试图用系统抗凝和表面改性防止血栓形成。表面改性包括使用纯的很光滑的硅橡胶或聚氨酯，表面预暴露于清蛋白和其它涂层蛋白，和肝素以离子和共价方式表面结合。尽管广泛研究研发模拟内皮的非凝血表面，但这些改性均未成功。
已发现氧化氮(NO)为由正常内皮分泌的有能力抑制血小板粘附/活化和聚集到血管壁的两种有效血管扩张剂之一。已估计来自正常和受刺激内皮的NO通量在0.5x10-10 molcm-2 min-1至4x10-10 mol cm-2 min-1的范围内。已广泛研究氧化氮对循环血小板和导致聚集和最终引发血栓形成的单核细胞活化的抑制作用。至少在过去十年中，已研究了宽范围NO供体，例如S-亚硝基硫醇(RSNO)、N-羟基-N-亚硝基胺、N-二醇二氮烯鎓和亚硝酰金属络合物。
氧化氮(NO)可从附到聚合物涂层内聚合物的NO加合物/供体物类释放。“氧化氮加合物”(NO加合物)和“NO供体”是指能够在生理条件下供给和/或释放NO，使得在作用的预期部位/靶部位表达NO生物活性的化合物和官能团。
本公开的一些实例包括在聚合物涂层内的NO供体/加合物。NO供体/加合物可以任何适合方式结合到聚合物涂层，其实例为掺杂。适合的NO加合物(其实例包括离散加合物)一般为显示嵌入(通过共价连接和/或分散)聚合物基质并显示过程制备稳定性能力的那些加合物。
本文涉及的“离散NO加合物”为在置入聚合物基质时从聚合物相释放约0.2x10-10 mol cm-2 min-1至约20x10-10 mol cm-2 min-1治疗相关NO通量的那些NO加合物(其实例为RSNO)。具有共价结合到聚合物主链的NO释放部分的那些化合物一般被称为“聚合性NO加合物”。适合的聚合性NO加合物的实例包括但不限于S-亚硝基硫醇化聚氨酯、S-亚硝基硫醇化硅橡胶和/或其混合物。离散NO加合物的一些实例显示一些亲脂性，但可通过用一个或多个烷基衍生变得更亲脂。
因此，本公开的实例为由用S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺(SNAP)掺杂的聚合物形成的新氧化氮(NO)释放涂层，以防止在例如体外循环(ECC)回路和导管中形成血栓。
不同疏水聚合物材料可用于本文所述材料、方法和器件的实例。这些包括但不限于例如聚氨酯(PU)、硅橡胶(SR)、聚氨酯和硅橡胶的共聚物(例如，E2A)、聚(氯乙烯)(PVC)、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚己内酯和/或其混合物的材料。在其它实例中，聚合物材料可包括疏水微区和亲水微区二者。选择的聚合物为能够从聚合物内例如共价结合和/或分散的S-亚硝基硫醇(RSNO)类型NO加合物释放NO的聚合物。也可取决于其中使用聚合物涂层/膜的应用和用于那种应用的所需NO释放速率选择聚合物。例如，具有较高吸水率的聚合物可适用于快NO释放合乎需要的应用，而具有较低吸水率的聚合物可适用于慢NO释放合乎需要的应用。在长期NO释放合乎需要的情况下，也可在聚合物涂层/膜中包括乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)添加剂，以产生酸性环境，进一步使RSNO物类稳定化。
另外，在本公开的范围内涵盖一种系统，该系统包括掺入聚合物的离散RSNO，且聚合物也具有附加其上的RSNO(例如，共价结合)。例如，具有附加RSNO官能团的以前制备的聚氨酯聚合物可与离散RSNO或类似物类混合，以能够产生由本公开实现的长期NO释放聚合物。
在一些实例中，选择的NO加合物为聚合物在生理条件下暴露于溶液和/或血液时能够自发释放NO的加合物。在其它实例中，选择的NO加合物为在聚合物暴露于某些光条件时能够自发释放气相NO的加合物。NO加合物的一些实例包括离散S-亚硝基硫醇(RSNO)。
相信包括SNAP掺入硅氧烷基聚氨酯弹性体(一个实例是E2As)的本公开的实例可帮助稳定RSNO加合物，因此，有利地允许从RSNO物类较长的NO释放和提高的储存稳定性，甚至在较高温度(例如，37℃)。
通过NO加合物和周围环境之间发生的至少一个过程，可控制从聚合物自发释放NO。对于RSNO物类，这些包括但不限于温度、水分和存在一定波长的光。例如，RSNO物类中S-N键的光解释放NO气。利用300nm至400nm波长范围或500nm至600nm波长范围的光，可发生光解。在此实例中，NO释放效率一般在较高波长范围较大。
应了解，离散氧化氮加合物可共价结合到聚合物基质，或者可分散于其中，或二者都有。离散RSNO的一些实例包括但不限于S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)、S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺(SNAP，显示于图2A)、S-亚硝基半胱氨酸(CysNO)等和衍生的离散RSNO。衍生的RSNO可用烷基改性。例如，衍生物可具有结合到SNAP的游离羧基的烷基，并且/或者可具有结合到S-亚硝基青霉胺的胺基的较长烷基(即，长于乙酰基)。例如，可在所需烷基和SNAP的游离羧基之间形成酯键。作为另一个实例，长链烷基(包括4至10个碳原子)可替代SNAP的乙酰基，以使长链烷基结合到胺氮。作为另一个实例，糖可结合到SNAP的羧基(例如，葡糖-SNAP、甘露糖-SNAP、果糖-SNAP等)。
本公开的实例的SNAP掺杂NO释放硅氧烷基聚氨酯弹性体涂层在体外和在凝血性短期体内兔模型内评价。本公开的实例的新涂层在暗处在37℃在PBS中浸渍经20天连续释放0.5至1x10-10 mol cm-2 min-1 NO。另外，在暗处(即，不暴露于可使RSNO键光解的波长)和在干燥条件(即，在干燥剂存在下)在37℃下4个月后，新涂层保留约78%的SNAP。如本文进一步讨论，新涂层材料的实例用作凝血性兔模型中4小时体外循环(ECC)所用的体外回路的内壁涂层，以检验涂层对血小板功能、凝固和纤维蛋白原吸附的影响。SNAP掺杂NO释放涂层也用于制造导管，该导管植入绵羊静脉7天，以评价对血栓和细菌粘附的影响。
如上提到，氧化氮(NO)是一种起数种关键生理作用的内源性气体分子，包括防止血小板粘附和活化、抑制细菌粘附和增殖、促进血管扩张、促进血管生成和帮助伤口愈合。NO的作用高度依赖生理系统中NO的位置及其浓度。例如，衬于健康血管内壁的内皮细胞产生0.5mol cm-2 min-1至4.0x10-10 mol cm-2 min-1范围的估计NO表面通量。由于血小板活化和形成血栓，可削弱很多血液接触器件的功能，包括血管移植物、支架、血管内传感器、血管内支架和体外生命支持回路。提高这些器件的血液相容性的一种方法是使用关于NO释放模拟内皮细胞的涂料。实际上，近年来，已相当多关注研发可用于提高这些器件生物相容性的NO释放和NO产生材料。
氧化氮也显示抗微生物活性，包括杀死细菌，并防止形成生物膜。细菌感染和形成生物膜是可用生物医疗器件导致并发症的问题。在有机体分泌细菌将在其中生活的多糖基质时，细菌也有能力在表面上形成生物膜。该基质提供营养物，也提供抗宿主防御和抗生素的保护。生物膜可作为慢性感染源，从而延长痊愈时间。在其很多生物作用中，氧化氮作为抗微生物剂，也作为伤口愈合过程的加速剂。氧化氮具有广谱抗菌性质，能杀死格兰氏阳性菌和格兰氏阴性菌二者。也报道低水平氧化氮有效分散已在留置医疗器件表面上形成的生物膜。
氧化氮在生理条件下为高度反应性，因此，已关于潜在生物医疗应用研究了具有能够储存并释放NO的官能团的宽范围NO供体分子。这些分子包括有机硝酸盐、金属-NO络合物、N-二醇二氮烯鎓和S-亚硝基硫醇(RSNO)。生理RSNO被认为是体内NO内源贮库，例如，S-亚硝基血红蛋白和S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)。其它合成RSNO，例如S-亚硝基-N-乙酰基-L-半胱氨酸(SNAC)和S-亚硝基-N-乙酰基-青霉胺(SNAP，图2A)，已显示表现显著的抗菌和抗血栓作用。也已证明RSNO既是血管扩张剂也是血小板聚集的有效抑制剂。RSNO经历热分解，释放NO，并产生相应的二硫化物物类(RSSR)，如图2B中所示。通过金属离子(例如，Cu+)和由光通过相当于340nm和/或590nm的S-亚硝基吸收带的能量的照射，可催化从RSNO释放NO。已提出，RSNO相对于NO作为抗血小板剂的更有效活性产生于RSNO相对于NO的提高稳定性，和通过包含催化部位以使RSNO转化成NO的膜蛋白质局部在血小板表面从RSNO产生NO。
RSNO加入聚合物可扩展这些NO供体可在生物医疗器件中用作涂层的实用性，从而在血液/器件界面提供局部化的NO释放。已提出由分散于不同聚合物基质的小分子RSNO组成的数种NO释放聚合物，包括聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)和Pluronic® F127水凝胶。这些材料具有通过亲水RSNO从聚合物扩散到组织在伤口上局部NO释放的潜在应用。实际上，已显示每日施用包含GSNO的水凝胶加速伤口愈合过程。然而，从这些聚合物快速浸出RSNO可显著缩短NO/RSNO释放期限，持续仅数个小时。已用一种替代方法合成RSNO改性材料，其中RSNO官能共价结合到基质。热解法二氧化硅颗粒、树枝状大分子、聚氨酯、聚酯、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、干凝胶、自组装单层和乙烯基·甲基醚-马来酸酐共聚物(PVMMA)均已用RSNO官能改性。已发现RSNO改性的干凝胶释放NO多达14天，并显示减小的血小板和细菌粘附。然而，这些RSNO改性干凝胶遭受合成复杂(导致破裂和不均匀膜)、低RSNO转化效率(最大40%，对于叔RSNO改性干凝胶)和在限制其使用期限的室温的热不稳定性。至今报道的很多其它RSNO改性材料显示热和光引发NO释放二者，但由于在储存期间其有限的NO释放期限或缺乏RSNO官能稳定性，或者在合成期间到RSNO的低转化，很多这些材料在临床上未证明有用。
报道在聚合物/血液界面实现局部化NO递送的另一种方法是使用生成NO的涂层，其中固定的催化剂(Cu(I/II)或有机硒物类)可从内源RSNO产生NO。例如，最近用体外循环(ECC)兔模型评价包含Cu0纳米颗粒的生成NO的涂层。然而，为了得到减少血栓形成的良好效力，需要连续灌注SNAP，以补充内源RSNO水平。
为了避免连续灌注RSNO物类，本公开包括能够储存RSNO物类的数种生物医疗聚合物。本公开的RSNO掺杂涂层可有利地释放NO，并潜在补充内源RSNO水平，如果也利用生成NO的催化剂。
在本公开中，研究掺有S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺(SNAP)的五种生物医疗级聚合物控制从聚合物内的SNAP释放NO并进一步控制SNAP自身释放的潜力。如本文进一步讨论，SNAP在Elast-EonTM E2As聚合物中很稳定，从而产生能够局部递送NO(通过热和光化学反应)和缓慢释放SNAP的均匀涂层。E2As是作为在本公开范围内涵盖的适合硅氧烷基聚氨酯弹性体的一个实例。E2As为E2A的溶液级(见以下表1)。包含SNAP的E2As聚合物涂在体外回路(ECC)壁上，并在体外循环兔模型中暴露于4小时血流，以检验对血小板计数、血小板功能、凝块面积和纤维蛋白原吸附的影响。4小时后，与E2As对照回路的60±6%比较(n= 4)，对于SNAP/E2As涂覆回路，血小板计数保持在基线的100±7%。与对照(分别为2.3±0.6和3.4±1.1cm2)比较，SNAP/E2As涂层也减小血栓面积。如本文进一步讨论，在植入绵羊静脉7天后，SNAP/E2As导管也能够显著减小血栓面积和细菌粘附。所有结果表明，新SNAP/E2As涂层有潜力改善血管内导管、移植物和其它血液接触医疗器件的抗血栓性。
发明人也检验了五种生物医疗聚合物(硅橡胶(SR)、Elast-EonTM E2As(硅氧烷基聚氨酯弹性体，购自Aortech Biomaterials, Scoresby Victoria, Australia)、CarboSil®(热塑性聚硅酮-聚碳酸酯-氨基甲酸酯，购自DSM Biomedical Inc., Berkeley, CA)、TecoflexTM SG80A和TecophillicTM SP-60D-60(两种聚氨酯，购自The LubrizolCorporation, Wickliffe, Ohio))作为SNAP的储库的潜力。Elast-EonTM聚合物具有优良的内在生物相容性和生物稳定性，并显示低水平血蛋白吸附。表征各SNAP掺杂聚合物的体外NO/SNAP释放。发明人已发现，SNAP本身在Elast-EonTM E2As聚合物中稳定至少4个月，从而产生热释放NO(在生理温度)且也可作为储库补充内源RSNO水平(通过SNAP从聚合物扩散进入血液)的涂层。试验新SNAP/E2As聚合物用于潜在生物医疗应用，例如，通过凝血性的ECC兔模型评价4小时ECC后血小板计数和功能保持及血栓面积。
应了解，也涵盖适用于本公开的其它硅氧烷基聚氨酯弹性体(除了E2As)。另外，应了解，也涵盖适用于本公开的其它级别的Elast-EonTM硅氧烷基聚氨酯弹性体(购自AortechBiomaterials, Scoresby Victoria, Australia)。以下表1为不同级别的Elast-EonTM聚合物性质的列表。除了表1中所示的那些实例外，相信其它适合聚合物包括CarboSil®、PuriSilTM或硅橡胶。
表1
*也可以溶液级提供，并可溶于THF和DMAc二者。
**也以分散体形式提供。
不同SNAP掺杂聚合物膜的初步体外表征
掺入所有五种生物医疗聚合物的SNAP产生均匀透明的绿色膜，没有任何可观察的相分离。10%重量SNAP膜储存约0.42μmol SNAP/mg聚合物膜(或6μmol/cm2)，而5%重量SNAP膜储存约 0.21μmol SNAP/mg聚合物膜(或3μmol/cm2)。
5%重量和10%重量SNAP/聚合物膜在室温(即，22℃)或在37℃在暗处在1mL PBS中浸渍。SNAP从包含5%重量和10%重量SNAP的不同聚合物膜扩散进入PBS用UV-Vis吸收监测。如图3A和3B中所示，在室温(见图3A)和在37℃(见图3B)在PBS中浸渍第一天期间，所有SNAP从SG80A和SP-60D-60聚合物膜扩散出来。SP-60D-60聚合物为亲水性，吸水率为约60%重量，而SG80A更疏水，具有约 6%重量的吸水率(见以下表2)。
表2说明用于本公开的5种生物医疗聚合物的吸水率。在Teflon®板上在Teflon®环(d=2.5cm)中流延聚合物膜(200mg聚合物)。从母膜切割小圆盘(d=0.7cm)，称量，并在37℃浸入PBS经历48小时。将湿膜擦干，并再次称重。聚合物膜的吸水率在表2中如下以重量百分数报告：吸水率(%重量)=(W湿–W干)/W干x100，其中W湿和W干分别为湿膜和干膜的重量。
表2
聚合物 吸水率[%重量]
硅橡胶 1.2 ± 0.3
CarboSil 1.5 ± 0.3
Elast-EonTM E2As 1.2 ± 0.1
Tecoflex SG80A 6.2 ± 0.7
Tecophilic SP-60D-60 64.5 ± 0.1
如图3A和3B中所示，在初始2小时浸渍期间，所有SNAP均离开更亲水的SP-60D-60聚合物，而在24小时后更疏水的SG80A浸出所有SNAP。由于SNAP从SP-60D-60和SG80A聚合物快速损失，在第一天浸渍(天0)期间通过化学发光(利用氧化氮分析仪(NOA))观察到很大初始NO突发，并且膜在1天后不显示SNAP/NO释放(数据未显示)。因此，这两种聚合物提供NO/SNAP快速突发，并发现其不适用于NO/SNAP长期释放。
相比之下，硅橡胶、CarboSil®和E2As聚合物显示在1天后显著较低量的SNAP扩散进入浸渍缓冲剂(见图3A和3B)。对于所有这三种聚合物，在第一天浸渍期间观察到初始突发SNAP浸出，对应于由聚合物快速吸水。这种初始突发为结合到膜的总SNAP分子的约10%。在随后几天浸渍期间，少量SNAP继续从这些聚合物浸出。硅橡胶、CarboSil®(热塑性聚硅酮-聚碳酸酯-氨基甲酸酯)和E2As(硅氧烷基聚氨酯弹性体)由于其高PDMS含量均为疏水聚合物，也具有最低吸水率(见以上表1)。SNAP略微疏水。因此，SNAP应优先在这些更疏水聚合物膜中保持。另外，相信这些聚合物的疏水性质也在限制SNAP扩散进入缓冲剂中起重要作用，这至少部分由于这些聚合物的最低吸水率。
也通过NOA测定研究从三种SNAP掺杂聚合物(即，硅橡胶、CarboSil®和E2As聚合物)的热和光引发NO释放。对于所有3种膜类型，可用100W泛光灯打开/关闭氧化氮释放。图4A显示在37℃在暗处、在环境光和在100W泛光灯10%重量SNAP/E2As膜的NO释放性能。如图4A中所示，在暗处或在环境实验室光下从10%重量SNAP/E2As膜的NO释放有很小差异，因为环境荧光照明不发射造成RSNO分解的波长(340nm或590nm)。虽然显示关于10%重量SNAP/E2As膜的数据，但应了解，对于所有三种聚合物，对用100W泛光灯连续照射的膜由NOA检测的总NO释放为掺入膜的约100%SNAP。通过在37℃用100W泛光灯连续照射，并用NOA监测释放的NO，检验从这三种膜的光引发NO释放(见图4B)。SNAP掺杂E2As和CarboSil®膜显示在经3天时间光诱导NO能量逐步减小，而在相同条件下SR基膜释放NO仅两天。在环境光下在37℃培育的所有三种类型的膜在浸渍第1天产生初始NO突发，相当于SNAP释放进入溶液，而在随后几天，NO通量为1x10-10 mol cm-2 min-1至2x10-10 mol cm-2 min-1。该NO通量仍可潜在用于抑制血小板功能，并杀死细菌。
似乎从E2As中10%重量SNAP组成的膜在100W泛光灯下NO释放可能更有希望。因此，使E2As中SNAP的%重量改变到5%重量，并更详细检验(见图4C)。对于5%重量SNAP/E2As膜，NO释放和SNAP浸出图形是类似的，但NO释放经较短时间发生。Elast-EonTM聚合物的生物稳定性和生物相容性与从SNAP释放NO组合使该制剂有吸引力地用于其它体外和可能的生物医疗应用。
SNAP/E2As制剂的长期NO释放
用SNAP/E2As膜进行体外研究，以检验从这些膜的长期NO释放和SNAP浸出。根据聚合物相内分解的SNAP的量测定随时间从SNAP/E2As膜释放NO(即，通过测定在指定时间点溶解膜后剩余的SNAP)。10%重量膜中SNAP的初始浓度为420nmol SNAP/mg膜。图5A显示1.0mMSNAP溶液、再溶于N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)的E2As膜中10%重量SNAP和溶于DMAc的E2As的UV-vis光谱。
由于SNAP热和/或光化学分解，在10%重量SNAP/E2As膜在不同条件下浸入PBS时，观察到在340nm吸收带减小，基于吸收度减小的累积NO释放显示于图5B中。10%重量SNAP/E2As膜在第一天浸渍期间显示初始突发NO(见图3A和3B)，相当于热分解和SNAP扩散出膜。在室温浸渍的膜具有最低NO释放通量。然而，在37℃在暗处或在环境光下培育的膜显示高于在室温膜的NO释放。这是由于增加的SNAP热分解。暴露于环境光的膜显示得到与在暗处浸渍的膜基本相同的NO释放曲线。由于其快速耗尽SNAP贮库的较高NO通量，从在37℃用100W泛光灯连续照射的SNAP/E2As膜的氧化氮释放只在3天内释放NO。这些膜通过SNAP的热分解和光引发分解二者提供NO释放。
可在聚合物相内或者在SNAP通过扩散出聚合物进入水相后，出现由SNAP的热和/或光化学分解从SNAP掺杂E2As释放氧化氮。为了更好地理解SNAP/E2As涂层的NO释放机制，经20天时间监测SNAP扩散进入PBS。如图6A中所示，在37℃包含10%重量SNAP的膜显示在第一天初始突发SNAP浸出。在此初始突发后，SNAP继续从E2As缓慢扩散，直至SNAP贮库接近耗尽(在第20天仍有可检测量的SNAP)。在20天期间，从膜浸出的SNAP的总量占总释放NO的约27%(通过NOA测定检测)(见图6B)。
另外，也评价聚合物面涂层数对SNAP损失的影响。没有任何面涂层的SNAP掺杂E2As膜显示比具有至少2个面涂层的膜更高水平的SNAP扩散进入缓冲剂(见图7)。面涂层的厚度允许控制SNAP从聚合物贮库的扩散速率。因此，在本文所公开的实例中，可用聚合物面涂层涂覆SNAP掺杂膜。用于面涂层的适合聚合物的实例包括硅氧烷基聚氨酯弹性体、聚(氯乙烯)，交联聚氨酯、交联硅橡胶、聚四氟乙烯等(其中没有NO供体)。在一些实例中，用于面涂层的聚合物为用于下面的膜的相同聚合物。
SNAP/E2As膜的稳定性研究
也评价在干燥储存期间E2As聚合物中掺杂的SNAP的稳定性。E2As中加入的SNAP可在储存期间潜在经历热或光化学分解，因此，限制使用时可用的NO释放能力。因此，利用干燥剂在冷冻器中在暗处、在暗处或在环境光利用干燥剂在室温干燥和在暗处利用干燥剂在37℃和50℃干燥储存10%重量SNAP/E2As膜。这些稳定性研究也用与累积NO释放试验类似的方式进行，其中使膜溶于DMAc，以测定在不同时间点聚合物中剩余的SNAP的量(如本文所述)。结果表明，在4个月后，SNAP在E2As聚合物基质内稳定。例如，与在室温储存的膜保持89%和在37℃储存的膜保持82%比较，在2个月后，在冷冻器(-20℃)中在暗处储存的10%重量SNAP膜保持约96%的初始SNAP物类(见图8)。表8中所示结果说明在储存期间SNAP的提高稳定性。由于围绕硫原子的空间位阻，叔RSNO，例如SNAP，具有比伯RSNO更大的稳定性。SNAP的提高热稳定性与E2As聚合物的稳定作用组合提供SNAP/E2As材料的极佳储存稳定性。
已关于包含这些NO供体的不同聚合物基质研究RSNO的稳定性，包括聚乙二醇、Pluronic® F127水凝胶、聚(乙烯醇)和聚(乙烯吡咯烷酮)。RSNO按照以下反应次序分解：
RSNO → RS˙ + NO˙ (1)
RS˙ + RSNO → RSSR + NO˙ (2)
总反应：2RSNO → RSSR + 2NO˙ (3)
聚合物基质的粘度提供对键裂和自由基对重组的笼效应。另外，粘性聚合物基质也限制自由基物类扩散，这有利于双重组，再生成RSNO。因此，E2As聚合物不仅限制SNAP扩散进入PBS，而且似乎提供另外的稳定作用，以减小SNAP分解速率。
进行试验以检验E2A基质中SNAP的储存稳定性。图9显示所述结果。具体地讲，图9显示从在37℃在暗处E2As干燥膜中10%重量SNAP的NO释放性质(n=1)。使膜在37℃干燥，然后在37℃储存。在第一小时储存期间释放膜中总NO的约5%，随后是很低水平的NO释放。这对应于本文中公开的其它储存/稳定性数据(见图8)，其显示在37℃干燥储存期间SNAP缓慢失去其NO(在干燥状态储存两个月后只失去10-15%的SNAP)。
SNAP/E2As涂覆ECC回路和对兔血流动力学的影响
制备用E2As中5%重量SNAP和E2As面涂层涂覆的活性ECC回路(其示意横截面显示于图10中)和只用E2As涂覆的对照回路。部分由于ECC试验的短持续时间，在这些试验中使用5%重量SNAP。如上所述，SNAP/E2As涂层在第一天浸渍期间SNAP初始突发扩散进入溶液。为了减小短期ECC试验期间这种突发的影响，所有回路首先在盐水中浸渍过夜，并在ECC试验前弃去浸渍溶液。在血液暴露前(在盐水中浸渍过夜后)，关于NO释放用NOA测定从经涂覆ECC回路样品释放的氧化氮。SNAP/E2As涂覆回路的NO释放保持约2x10-10 mol cm-2 min-1的平均通量4小时(在37℃利用环境光)(见图11A)。在暴露于流动血液4小时后，ECC回路仍经另外1小时时间显示至少1.5x10-10 mol cm-2 min-1的NO通量(见图11B)。
也在兔ECC模型中经4小时血液暴露监测SNAP/E2As涂覆ECC回路的血流动力学作用。对于SNAP/E2As和对照回路二者，平均动脉压(MAP)在第1小时内显著下降，分别下降到35±2mmHg和46±2mmHg。通过连续IV流体维持，MAP保持在这些水平4小时。对于SNAP/E2AsECC，ECC血流量下降并保持在64±5mL/min，而对于对照，在4小时内保持在基线水平(76±6mL/min)。对于SNAP/E2As回路，MAP下降和较慢血流量可能是由于SNAP从涂层扩散进入血液的血管扩张效应。心率在4小时内保持，且没有注意到在SNAP/E2As和对照ECC回路之间有显著差异，平均为205±2次搏动/min。对于SNAP/E2As和对照回路两者，活化凝固时间均在4小时内增加，这可能是由于血管内流体增加(血液稀释效应)。已用SNAP灌注观察到对MAP和流速的类似影响。
SNAP/E2As涂层对兔血小板功能和血栓形成的影响
通过记录血小板计数(例如，消耗，见图12A)和血浆纤维蛋白原水平(见图12B)评价在整个4小时ECC的血小板活化和功能，两者由于增加的IV流体和%血小板聚集均对血液稀释校正。对于5%重量SNAP/E2As和E2As对照回路，基线血小板计数(x108个血小板/mL)分别为3.5±0.6和4.8±0.5。对于SNAP/E2As回路，血小板计数最初略微上升，并在ECC上在4小时结束保持在基线水平的100±7%。对照回路的血小板计数显示血小板的时间依赖性损失，4小时后下降到基线的60±6%。通过PRP先体外后体内胶原蛋白刺激并通过光学浊度测定血小板功能聚集的百分数。在4小时血液暴露期间，通过SNAP/E2As和对照回路从循环所取血液的血小板显示类似对胶原蛋白刺激血小板聚集的响应，两者均保持56±12%(基线值在68±6%)。
如图12B中所示，对于对照回路，血浆纤维蛋白原水平保持在基线水平。对于5%重量SNAP/E2As回路，在ECC的第1小时期间血浆纤维蛋白原水平下降到基线水平的83%，并在那个水平保持4小时ECC。血浆纤维蛋白原水平的这种下降可归因于纤维蛋白原结合到表面，如体外纤维蛋白原测定结果所示(见图13)。意外的是，即使增强的纤维蛋白原在SNAP/E2As涂层上吸附，这些材料仍显示比对照小的血小板损失，表明产生的NO水平克服正常促进血小板活化的增强纤维蛋白原吸附。
为了确定ECC回路的凝血室(即，在ECC回路中3/8英寸内径Tygon®管，8cm长度)中血栓的差别形成，在4小时血液暴露后进行二维(2D)图像分析。血栓面积用Image J软件分析，表示在各凝血室中血栓形成的2D面积(像素/cm2)。对血栓面积定量，数据显示于图14中。与对照比较时，对于SNAP/E2As回路，血栓面积显著减小，虽然E2As对照也具有相对低的血栓面积，这可能是由于E2As聚合物的增强的内在生物相容性。
新SNAP/E2As涂层的影响之一是由SNAP扩散进入血流引起的低血压。同时给予静脉流体抵消这一影响，但在某些情况下可能造成临床状况困难。已报道应用SNAP导致低血压、高血糖和削弱胰岛素分泌，和减小的细胞活力。然而，在作为导管用于可植入小器件的涂层时，表面积/(血)体积比会很小，因此，损失到血液的SNAP的量一般不是重要问题。另外，内源硫醇和过氧化物歧化酶可减小很多这些不利作用。然而，临床上已用母体硫醇N-乙酰基-DL-青霉胺(NAP)治疗汞中毒和胱氨酸尿，有轻微的副作用。虽然本文公开的SNAP/E2As涂层确实显示低血压影响，但涂层递送的每日SNAP水平远低于导致上述其它潜在不利副作用的报道水平。
制备SNAP掺杂聚合物的浸渍方法
本公开进一步包括用SNAP填充商业SR或PU管的方法。商业SR和PU包括医疗级管，包括购自US plastics、Cole Palmer、Professional Plastics、ICORally和Thermedics,Inc的那些管。图15显示在SNAP/丙酮溶液中浸渍1或2天的聚氨酯(PU)管的NO释放曲线。然后，在NOA检验前，用丙酮清洗管，并干燥。为了NOA检验，将管在37℃在PBS中浸渍。
这种浸渍方法使SNAP物类能够结合到现有商业导管/管的壁内。这种方法避免在正常热挤出条件下试图使SNAP挤入聚合物管时由于在高温下的NO供体(例如，SNAP和相关物类)的热不稳定性可能出现的问题。虽然在本文所述浸渍方法中使用丙酮，但相信可使用的其它溶剂(或溶剂的混合物)包括乙酸乙酯、环己烷、异丙醇、甲醇、丁酮等。
用于导管应用的SNAP掺杂聚合物
图16A为根据本公开的实施例用5%重量或10%重量SNAP/E2As制备随后涂敷E2As面涂层的E2As导管的示意图解。图16B为图示不同层的导管的横截面图。通常，通过浸涂5个E2As溶液底涂层、25个相应活性溶液涂层和5个E2As溶液面涂层制备三层导管。将SNAP/E2As导管在暗处在37℃保持在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
图17显示在37℃在暗处在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中SNAP/E2As导管的20天NO释放。图17中的结果图示说明在规定条件下10%重量SNAP/E2As导管能够释放NO多达20天，5%重量SNAP/E2As导管能够释放NO多达7天。
E2As对照导管和10%重量SNAP/E2As导管在绵羊静脉中植入7天。移出后，发现SNAP/E2As导管具有比E2As对照导管显著较少的血栓(图18)，且减少90%细菌粘附(图19)。图17至19一起说明SNAP掺杂聚合物潜在应用于导管结构。
为了进一步说明本公开，在本文中给出不同的实施例。应了解，提供这些实施例是为了说明目的，不应解释为限制本公开的范围。
实施例
应了解，SNAP掺杂聚合物和本文前述数据用实施例部分中所述的材料和技术产生。也使用实施例部分中所述的不同检验步骤。
村料
N-乙酰基-DL-青霉胺(NAP)、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、乙二胺四乙酸(EDTA)、四氢呋喃(THF)、硫酸和N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)购自Sigma-Aldrich(St.Louis, MO)。甲醇、盐酸和硫酸购自Fisher Scientific(Pittsburgh, PA)。TecophilicTMSP-60D-60和TecoflexTM Sg-80A为Lubrizol Advanced Materials Inc.公司(Cleveland,OH)的产品。Dow Corning RTV 3140硅橡胶(SR)购自Ellsworth Adhesives(Germantown,WI)。CarboSil® 20 90A购自Polymer Technology Group(Berkeley, CA)。Elast-EonTME2As得自AorTech International, PLC(Scoresby, Victoria, Australia)。包含>90%可凝固蛋白的人血浆纤维蛋白原为Calbiochem(La Jolla, CA)的产品，抗变性人纤维蛋白原的荧光素标记山羊IgG(多克隆)购自MP Biomedicals, LLC(Solon, OH)。用于荧光检测的黑色聚丙烯96-孔微量滴定板得自Nalge Nunc International (Rochester, NY)。所有水溶液使用Milli-Q滤器(Millipore Corp., Billerica, MA)用18.2MΩ去离子水制备。包含138mM NaCl、2.7mM KCl、10mM磷酸钠、100μM EDTA的磷酸盐缓冲盐水(PBS) pH 7.4用于所有体外试验。
合成SNAP
用先前报道的方法(I.Chipinda,R.H.Simoyi,Journal of Physical ChemistryB 2006,110,5052)的改进形式合成SNAP。简而言之，向包含2M HCl和2M H2SO4的水和甲醇的1:1混合物加入等摩尔比NAP和亚硝酸钠。搅拌30分钟后，在冰浴中冷却反应容器，以使绿色SNAP结晶沉淀。通过过滤收集结晶，用水洗涤，并空气干燥。始终保护反应和结晶免受光。
制备SNAP掺杂膜
通过溶剂蒸发制备包含5%重量和10%重量SNAP的聚合物膜。对于10%重量SNAP膜，通过180mg相应聚合物溶于THF制备流延溶液。使聚氨酯(SP-60D-60、SG-80A、CarboSil®和Elast-EonTM E2As)溶于3mL THF，SR溶于1mL THF。然后向聚合物溶液加入SNAP(20mg)，并搅拌混合物10分钟。类似地用SNAP(10mg)和聚合物(190mg)制备5%重量SNAP膜。在Teflon®板上在Teflon®环(d=2.5cm)中流延膜溶液，并在环境条件下干燥过夜。从母膜切割小圆盘(d=0.7cm)，用面涂层溶液(200mg相应聚合物(不加SNAP)，在4mL THF中)浸涂两次，并干燥过夜。因此，用于各样品的面涂层由与母膜相同的聚合物组成。在面涂之前，记录各小圆盘的重量。保护所有膜和膜溶液免受光。最终膜具有约150μm厚的SNAP掺杂层和约50μm厚的面涂层。
制备SNAP/E2As涂覆ECC回路
用于体内兔研究的ECC结构由16-规格(gauge)和14-规格的IV聚氨酯血管导管(Kendall Monoject Tyco Healthcare, Mansfield, MA)、两个16cm长度1/4英寸内径(ID)Tygon®管和产生凝血室的8cm长度3/8英寸ID Tygon®管组成，在凝血室中由于湍动更强的血流能够更容易形成血栓。
如前所述，由于短的ECC试验持续时间(4小时)，只用E2As中的5%重量SNAP涂覆NO释放ECC回路。通过在THF(15mL)中溶解SNAP(125mg)和E2As(2375mg)制备SNAP/E2As溶液。E2As对照溶液由E2As组成(2500mg，在15mL中)。首先用两层SNAP/E2As溶液涂覆SNAP/E2As回路，随后是1个E2As对照溶液涂层。E2As对照回路用两个E2As对照溶液涂层涂覆。使ECC回路在暗处在各涂层之间经空气干燥1小时。使用THF使完全涂覆的ECC融接在一起，在左颈动脉侧开始，利用16-规格血管导管，一个15cm长度1/4英寸ID管、8cm长度凝血室、第二个15cm长度1/4英寸ID管、最后为14-规格血管导管。使用两个luer-锁紧套口PVC连接器用管连接血管导管。在真空下干燥组装的ECC回路，同时保护免受光至少48小时。在ECC试验前，回路用盐水溶液填充，用于过夜浸渍，并在兔试验之前立即弃去此溶液。
SNAP掺杂膜的体外表征
UV-Vis光谱
在室温用UV-Vis分光光度计(Lambda 35, Perkin-Elmer, MA)在200nm-700nm波长范围记录所有UV-Vis光谱。存在SNAP的S-NO基团提供在340nm和590nm的最大特征吸收度，对应于π→π*和nN→π*电子跃迁。
从PBS中浸渍的SNAP掺杂聚合物膜的SNAP扩散
将面涂覆膜放在浸入包含100μM EDTA的10mM PBS, pH 7.4的单独的管形瓶中，以使SNAP的任何微量金属催化分解最大限度地减少。将膜在暗处在室温(22℃)或37℃培育。在不同时间点，取1mL PBS等分试样的UV-Vis光谱，用于快速测定SNAP浓度。保护等分试样免受光，并立即返回到样品管形瓶经历试验时间。膜每日放入新鲜的PBS缓冲剂中。经测定，对于PBS中的SNAP在340nm的摩尔吸收系数为：εSNAP=1024 M-1 cm-1。
从SNAP/E2As膜的NO累积释放
在制备E2As膜中的10%重量SNAP后，记录溶于DMAc的单独膜的UV-Vis光谱，以测定膜内SNAP的初始浓度(nmol SNAP/mg膜)。然后在含有包含100μM EDTA的3mL PBS(pH 7.4)的单独管形瓶中放入等效的膜。在不同条件下培育膜：在环境光下RT，在环境光下37℃，在暗处37℃，在100W泛光灯下37℃。将在实验室中的荧光灯称为环境光。膜每日放入新鲜的PBS中。在不同时间点，使膜溶于DMAc，用于快速测定膜中存在的SNAP。释放的NO的量在不同时间点间接从分解的SNAP的量测定。通过膜中SNAP的初始量([SNAP]0)和在时间点t的SNAP的量([SNAP]t)之差计算随时间释放的累积NO([NO]t)：[NO]t=[SNAP]0–[SNAP]t(其中浓度以nmol/mg膜计)。该计算基于SNAP的340nm吸收带的衰减直接与S-NO键的溶血键裂和伴随的NO释放相关。经测定，对于DMAc中的SNAP在340nm的摩尔吸收系数为：εSNAP=1025 M-1 cm-1。
NO释放测定
用Sievers化学发光氧化氮分析仪(NOA) 280(Boulder, CO)测定从膜释放的氧化氮。在包含100μM EDTA的PBS(pH 7.4)中浸入的样品容器中放入膜。用N2吹扫气体和鼓泡器从缓冲剂连续洗出氧化氮，并从顶部空间吹入化学发光检测室。将透明玻璃样品容器用于环境光和光引发NO释放试验。对于光解试验，在离样品池约60cm处放置100W卤素泛光灯(GE型号17986)。在与NOA测定相同的条件(环境光或100W泛光灯照射，在37℃)下在PBS中培育膜。
SNAP/E2As稳定性研究
利用干燥剂在管形瓶中在以下条件下放置SNAP/E2As膜(由10%重量SNAP组成)：利用环境光室温，在暗处室温，在暗处37℃，和在暗处在冷冻器(-20℃)中。经4个月时间在不同时间点使膜溶于DMAc，并记录UV-Vis光谱，以与初始10%重量SNAP比较，测定膜中剩余的%SNAP。
体外纤维蛋白原吸附测定
在96孔结构中进行体外纤维蛋白原吸附免疫荧光测定。用于制备ECC回路的SNAP/E2As和E2As对照聚合物溶液也用于涂覆96孔微量滴定板的微孔，并在与ECC回路相同的条件下干燥。简而言之，用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(dPBS)而不用CaCl2和MgCl2(GibcoInvitrogen, Grand Island, NY)将人纤维蛋白原稀释到3mg/mL，相当于人血浆浓度，然后用于吸附试验。向各孔加入100μL该溶液，并用此溶液在37℃培育经涂覆孔1.5小时。随后对各洗涤用洗涤缓冲剂(100μL)进行8个洗涤步骤，缓冲剂由包含0.05% Tween 20(Calbiochem La Jolla, CA)的AbD Serotec Block ACE缓冲剂(Raleigh, NC)的10倍稀释物组成。为了阻断非特异性抗体结合，在37℃用100μL阻断缓冲剂(Serotec Block ACE缓冲剂的4倍稀释物)培育经涂覆的孔30分钟。在用洗涤缓冲剂(100μL/孔)洗涤3次后，在Synergy 2荧光微量板读数器(Biotek Winooski, VT)上在485nm(激发)和528nm(发射)进行板的背景荧光测定。为了检测吸附的纤维蛋白原，在Serotec Block ACE缓冲剂的10倍稀释物中稀释(1:10)荧光素标记山羊抗人纤维蛋白原抗体，并向各孔加入100μL该最终溶液。使抗体在37℃结合到表面吸附纤维蛋白原1.5小时。用人纤维蛋白原吸附到未涂覆聚丙烯作为内部对照，以使不同板内的荧光信号归一化。所有检测一式三份进行。
兔ECC凝血性试验
由大学动物使用及护理委员会(University Committee on the Use and Careof Animals)根据大学和联邦法规批准所有所用的动物处理和手术步骤。在本研究中使用总共8只新西兰白兔(Covance, Battle Creek, MI)。所有兔(2.5kg-3.5kg)最初用肌内注射5mg/kg可注射赛拉嗪(AnaSed® Lloyd Laboratories Shenandoah, Iowa)和30mg/kg盐酸氯胺酮(Hospira, Inc., Lake Forest, IL)麻醉。通过机械通风以1.5%-3%速率经异氟烷气体吸入给予维持麻醉，机械通风通过气管切开术并用A.D.S. 2000通风器(EnglerEngineering Corp. Hialeah, FL)进行。吸气峰压(peek inspiratory pressure)设定到15cm H2O，通风器流速设定到8L/min。为了帮助保持血压稳定性，以10mL/kg/h速率给予乳酸林格氏IV流体。为了监测血压和收集血样，用16-规格IV血管导管(Jelco®, Johnson &Johnson, Cincinnati, OH)给兔的右颈动脉插入套管。用Series 7000 Monitor(Marquette Electronics Milwaukee, WI)监测血压和得到的心率。体温用直肠探针监测，并用水夹套加热毯保持在37℃。在布置动静脉(AV)定制体外回路(ECC)之前，分离兔左颈动脉和右外颈静脉，并用ABL 825血液气体分析仪和OSM3 Hemoximeter血气分析仪(Radiometer Copenhagen, DK)测定基线血流动力学和动脉血pH、pCO2、pO2、总血红蛋白和高铁血红蛋白。另外，收集基线血样用于血小板和总白细胞(WBC)计数，在Coulter CounterZ1(Coulter Electronics Hialeah, FL)上检测。用Dade Behring BCS凝固分析仪(Siemens, Deerfield, IL)测定血浆纤维蛋白原水平，用Hemochron Blood CoagulationSystem Model 801血液凝固系统(International Technidyne Corp., Edison, NJ)监测活化凝固时间(ACT)，用Chrono-Log optical aggregometer model 490光学聚集仪(Havertown, PA)评价血小板功能。
在基线血液测定后，通过对ECC流入给左颈动脉插入套管，对ECC流出给右外颈静脉插入套管，使AV定制ECC处于适当的位置。通过松开ECC的动脉侧和静脉侧开始流动通过ECC，并用超声流量探针和流量计(Transonic HT207, Ithaca, NY)监测回路中的血流量。在试验期间，动物未全身抗血凝。
在ECC上4小时后，将回路夹紧，从动物移开，用60mL盐水清洗，并排掉。给较大ECC管(即，凝血室)中的任何残余血栓照相，并用得自National Institutes of Health(Bethesda, MD)的Image J成像软件给血栓程度定量。在安乐死之前，给所有动物400U/kg肝素钠剂量，以防止坏死血栓形成。动物用Fatal Plus给药(130mg/kg戊巴比妥钠)(Vortech Pharmaceuticals, Dearborn, MI)安乐死。在安乐死后，所有动物经过尸体剖检，包括检查肺、心、肝和脾的任何血栓栓塞事件迹象。
采血
采集兔全血样，对于ACT在非抗凝血1cc注射器中，对于细胞计数和聚集在具有3cc体积的3.2%柠檬酸钠真空容器(Becton, Dickinson, Franklin Lakes, NJ)中，对于血气分析在包含40U/mL肝素钠(APP Pharmaceuticals, LLC, Schaumburg, IL)的1cc注射器中。在开始ECC血流后，经4小时每1小时采集血样，用于这些体外检测。在采集2小时内使用样品，以避免任何血小板、单核细胞或血浆纤维蛋白原活化。
血小板聚集
使用Chrono-Log光学聚集仪，基于Born比浊法测定兔血小板聚集。简而言之，收集柠檬酸盐血(1:10血液:3.2%柠檬酸钠溶液)(6mL)，并通过在110 x g离心15分钟得到富血小板血浆(PRP)。通过在2730 x g 另外离心PRP去除血样15分钟得到贫血小板血浆(PPP)，并用其作为聚集的空白。
在37℃经10分钟培育PRP，然后加入25μg/mL胶原蛋白(Chrono-PAR #385Havertown, PA)。使用Chrono-Log Aggrolink软件，在加入胶原蛋白后3分钟测定聚集百分数。
制备SNAP掺杂E2As和E2As对照导管
通过在2mm直径的18cm长不锈钢模芯(购自McMaster Carr)上浸涂聚合物溶液制备导管。对于E2As对照导管，聚合物溶液由溶于THF的E2As组成(150mg/mL)。通过在各涂层之间以2min间隔浸涂，在模芯上涂敷35个E2As溶液的涂层。对于SNAP/E2As导管，制备两种不同的溶液，即面涂层/底涂层溶液和活性溶液，以制造三层导管(见图16)。面涂层/底涂层溶液由溶于THF的E2As组成(150mg/mL)。活性溶液由溶于THF的10%重量SNAP和90%重量E2As组成，总浓度150mg/mL。通过浸涂5个E2As溶液底涂层、25个活性溶液涂层和5个E2As溶液面涂层制备三层导管。用于绵羊研究的导管为15cm长。
导管在绵羊中长期(7天)植入
绵羊导管植入
所有动物受到的护理符合National Society for Medical Research(国家医学研究学会)制定的“Principles of Laboratory Animal Care”(实验室动物护理原则)和National Academy of Sciences(国家科学院)制定并由NIH公布的“Guideline for theCare of Use of Laboratory Animals”(实验室动物使用护理原则)。该研究得到密歇根大学动物使用及护理委员会(University of Michigan Committee on Use and Care ofAnimals)批准。
在大动物模型中使用5只成年绵羊。所有试验在无菌条件下进行。对于局部麻醉，用1%利多卡因皮下进行前3个绵羊步骤。在右和左颈静脉上产生小的(1cm至2cm)垂直和横向切口。然后，利用在右或左颈静脉放置的一个对照(E2As)或试验(SNAP/E2As)套管，用改进的Seldinger技术放置套管。然后，用缝皮钉重新使皮肤接近。
在全身麻醉下进行后2个绵羊试验。使用丙泊酚(1mg/kg)用于诱导，随后用异氟烷(0.1-4%)麻醉剂维持。在颈静脉上产生小的2-3cm切口。然后分离右和左颈静脉，在直接目视观察下放置对照(E2As)或试验(SNAP/E2As)套管。然后使绵羊恢复，并返回到动物室。
在整个试验其余部分，动物保持在动物室中。每日检验导管的开放性。最初尝试抽吸套管，然后用15mL盐水清洗。如果开始抽吸困难，则尝试灌注15mL生理盐水，并再次检验该过程以及抽吸和清洗。经7天每24小时记录开放性数据。
在第7天进行尸体剖检。用上述相同的麻醉规程使绵羊麻醉。沿着其长度解剖右和左颈静脉，并分离。用约100-150 IU/kg推注剂量使绵羊肝素化，并确定>200秒活化凝固时间。然后结扎颈静脉，并纵向打开。移出导管，并放入无菌盐水，用于进一步分析。
导管评价
在外植后，在PBS中清洗导管。用Nikon L24数字摄像机拍摄整个导管外部和纵向切割1cm片内部的相片。用得自NIH的Image J成像软件对血栓程度定量。为了将活菌定量，纵向切割1cm片，并在1mL PBS缓冲剂中均化。用单独试验发现最佳均化速度，其中比较不同均化速度和时间。所得均浆在无菌PBS中连续稀释。在琼脂平板上接种各稀释液的一式三份等分试样(10µL)。将琼脂平板在37℃培育24小时，随后计算每导管表面积的菌落形成单位(CFU/cm2)。
统计分析
在整个本公开中，将数据表示为平均值±SEM(平均值的标准差)。使用斯氏t试验，通过比较平均值分析不同SNAP/E2As和E2As对照聚合物组之间的比较。对于所有检验，认为p<0.05的值在统计上显著。
结论
本公开的实施例显示，疏水聚氨酯，例如，硅氧烷基聚氨酯弹性体(一个实例是Elast-EonTM E2As聚合物)，是作为用于SNAP的贮库的极佳基质，并且所得膜可用于控释NO和SNAP。在血液流动通过ECC回路时，SNAP从聚合物膜缓慢扩散，且可由光和/或热分解引发从膜/涂层释放NO。稳定性研究表明，SNAP在E2As基质内很稳定，甚至在37℃储存4个月期间。虽然E2As聚合物本身具有极佳的固有生物相容性，但SNAP加入E2As聚合物基质提供NO/SNAP的控制递送，以进一步提高聚合物血液相容性。在与相应的E2As涂覆对照回路比较时，在4小时ECC血流期间，SNAP/E2As涂覆ECC回路显著保持血小板计数和功能，同时也减少凝块面积。另外，在植入绵羊7天期间，从SNAP/E2As导管释放的NO能够显著减少血栓和细菌粘附，从而改善导管开放性。在Elast-EonTM E2As聚合物膜/涂层内加入SNAP提供局部递送NO/SNAP的简单方式，并有潜力提高多种血液接触医疗器件的血液相容性。
概括地讲，本文公开的实施例包括新的释放氧化氮(NO)的涂层，包括用S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺(SNAP)掺杂的硅氧烷基聚氨酯弹性体，以防止在例如体外循环(ECC)回路和导管中形成血栓。另外，从这些制剂的NO释放可能作为很有效的抗菌剂(bacterialagent)。
应了解，本文提供的范围包括所述范围和在所述范围内的任何值或子范围。例如，约0.2x10-10 mol cm-2 min-1至约20x10-10 mol cm-2 min-1的范围应解释为不仅包括0.2x10-10 mol cm-2 min-1至约20x10-10 mol cm-2 min-1的明确叙述限度，而且包括其间的单独值，例如1x10-10 mol cm-2 min-1、14.5x10-10 mol cm-2 min-1等，也包括其间的子范围，例如0.75x10-10 mol cm-2 min-1至约17x10-10 mol cm-2 min-1、约5x10-10 mol cm-2 min-1至约15x10-10 mol cm-2 min-1等。另外，在用“约”或“近似”等描述数值时，这意味包括从所述值的较小变化(最高+/-10%)。
在整个说明书中对“一个实例”、“另一个实例”、“实例”等的提及意味与实例相关描述的特定要素(例如特征、结构和/或特性)包括在本文所述的至少一个实例中，并且可存在或可不存在于其它实例中。另外应了解，关于任何实例描述的要素可以任何适合方式在不同的实例中组合，除非上下文另外清楚地规定。
另外，在描述和要求保护本文公开的实例中，除非上下文另外清楚地指明，否则单数形式“一个”和“该”包括复数指示物。
虽然已详细描述数个实施例，但对本领域的技术人员显而易见的是可修改公开的实施例。因此，前面描述应被认为是非限制性的。

Claims (14)

1.一种聚合物膜，所述聚合物膜包括：
聚合物基质；和
离散RSNO加合物或聚合性RSNO加合物中的至少一种，所述加合物通过溶剂蒸发引入到所述聚合物基质；
其中所述离散RSNO加合物为S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺(SNAP)或SNAP衍生物，或者所述聚合性RSNO加合物为具有附加SNAP物类的聚合物；
其中所述离散RSNO加合物或聚合性RSNO加合物至少之一能够释放氧化氮(NO)，
其中该聚合物基质为聚氨酯聚合物基质、硅橡胶聚合物基质或聚氨酯和硅橡胶的共聚物基质；
该聚合物膜在干燥条件下在37℃显示稳定性，且在暴露于水分或能够使RSNO键光解的光经预定量时间时显示从离散RSNO加合物或聚合性RSNO加合物至少之一的长期且可控的NO释放速率。
2.权利要求1的聚合物膜，其中所述聚合物基质包括低吸水率的疏水聚合物。
3.权利要求1的聚合物膜，其中所述聚合物基质为硅氧烷基聚氨酯弹性体。
4.权利要求1的聚合物膜，其中所述离散RSNO加合物为SNAP衍生物，其中SNAP的羧基、SNAP的胺基或二者用烷基改性。
5.权利要求3的聚合物膜，其中所述离散RSNO加合物为SNAP衍生物，其中i)包括4个碳原子至10个碳原子的烷基结合到SNAP的胺氮，ii)在烷基和SNAP的羧基之间存在酯键，或i和ii二者。
6.权利要求1的聚合物膜，其中所述离散RSNO加合物或所述聚合性RSNO加合物分散于聚合物基质内，且其中离散RSNO加合物或聚合性RSNO加合物以约5％重量的量存在。
7.权利要求1的聚合物膜，其中所述离散RSNO加合物或所述聚合性RSNO加合物分散于聚合物基质内，且其中离散RSNO加合物或聚合性RSNO加合物以约10％重量的量存在。
8.一种聚合组合物，所述聚合组合物包含：
聚合物底层；
在所述聚合物底层上布置的聚合物面层；和
位于所述聚合物底层和所述聚合物面层中间的至少一个活性层，该至少一个活性中间层包括权利要求3限定的聚合物膜。
9.权利要求8的聚合组合物，其中：
所述聚合物底层选自硅氧烷基聚氨酯弹性体、聚(氯乙烯)、交联聚氨酯、交联硅橡胶和聚四氟乙烯；且
所述聚合物面层为硅氧烷基聚氨酯弹性体、聚(氯乙烯)，交联聚氨酯、交联硅橡胶和聚四氟乙烯。
10.权利要求8的聚合组合物，其中所述离散RSNO加合物或所述聚合性RSNO加合物分散于所述聚合物基质内，且其中离散RSNO加合物或聚合性RSNO加合物以5％重量至10％重量的量存在。
11.一种制备NO释放聚合组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
选择聚合物基质，以实现以下至少之一：增加、延长和控制从离散RSNO加合物和聚合性RSNO加合物至少之一的NO释放速率，选择的聚合物基质用于使所述离散RSNO加合物和聚合性RSNO加合物至少之一稳定化；并且
通过溶剂蒸发使所述离散RSNO加合物和聚合性RSNO加合物至少之一分散于所述聚合物基质内，所述溶剂蒸发包括：
使选择的聚合物基质溶于溶剂，以形成溶液；
将所述离散RSNO加合物和聚合性RSNO加合物至少之一加到所述溶液；并且
搅拌所述溶液预定时间；
该离散RSNO加合物和聚合性RSNO加合物至少之一能够释放氧化氮(NO)。
12.权利要求11的方法，其中所述聚合物基质为硅氧烷基聚氨酯弹性体，其中所述离散RSNO加合物为S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺(SNAP)，或者具有附加SNAP物类的聚合物。
13.权利要求11的方法，所述方法进一步包括：
在聚合物底层上流延该溶液；并且
使流延的溶液干燥，以在所述聚合物底层上形成释放NO的聚合组合物层。
14.权利要求13的方法，所述方法进一步包括在释放NO的聚合组合物层上涂覆其它聚合物，以形成聚合物面层，其中所述其它聚合物在其中不包括所述离散RSNO加合物和聚合性RSNO加合物至少之一。
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