CN102477172B - 壳聚糖-肝素纳米颗粒以及用该纳米颗粒处理的去细胞基质的生物材料 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种壳聚糖纳米材料，尤其是与肝素形成的纳米材料。本发明还涉及一种去细胞基质的生物材料。本发明的目的是提供一种适合细胞生长因子(VEGF)与肝素特异性结合，并能与去细胞基质后的生物材料进行结合的壳聚糖-肝素纳米颗粒。该材料是采用离子交联法制备的。本发明提供的用于肺动脉血管修复或重建的生物带瓣管道，其获得良好的内皮化性能，同时具备抗血栓，抑菌，并能达到长期持续性疗效，有利于人体对于生物带瓣管道的自身更替。

Description

壳聚糖-肝素纳米颗粒以及用该纳米颗粒处理的去细胞基质的生物材料

技术领域：

本发明涉及一种壳聚糖纳米材料，尤其是与肝素形成的纳米材料。

本发明还涉及一种去细胞基质的生物材料。

技术背景：

纳米技术在生物载药中应用取得良好的效果，但将纳米材料应用在局部发挥疗效十分少见。将纳米生物载药系统应用于去细胞基质材料的修饰，利用其载药量大、比表面积大及控释的特性，将有助于肝素、VEGF等生物活性物质的效能长期稳定发挥，加速体内组织更替的效果。通过纳米层层自组装(layer-by-layer)技术亦可使肝素，VEGF组装在血管表面。

壳聚糖是一种生物相容性优良的天然高分子可降解材料，由于其含有大量-OH，-NH2等活性基团，可以与肝素中的-COOH，-SO3-等基团通过共价结合及分子间的自组装与去细胞血管基质结合。因此，肝素-壳聚糖-VEGF复合纳米粒子以及肝素-壳聚糖-VEGF纳米层层自组装膜能够有效的对去细胞基质进行修饰。

现有技术中已经公开了壳聚糖-肝素纳米颗粒的制备方法。例如：ZonghuaLiu等在WileyinterScence2007上公开的壳聚糖-肝素纳米颗粒的制备方法，其中说明了是采用牛血清。牛血清在这篇文章中的作用是作为药物包裹，其实就是一种物理吸附。

心血管疾病是危害人类健康的主要疾病之一。随着外科技术的进步，不少心血管疾病必须通过心血管替代材料(如人工瓣膜、血管、带瓣管道等)的修复获得治疗。目前临床应用植入性材料均存在诸多缺陷，如血栓、钙化、感染及不可生长性等。因此，研究开发高性能的心血管替代材料一直是医学及材料科学的重要课题。

采用组织工程学技术构建心血管修复材料是当今医学及材料学领域的主要研究方向之一。本申请发明人前期采用曲那通、胰蛋白酶及核酸酶三种去细胞剂，以适当的浓度、温度及作用时间联合处理带瓣牛颈静脉(BovineJugularVeinConduit，BJVC)，进一步采用光氧化技术交联增强了组织的稳定性，具备良好的生物力学性能、优越的抗钙化性能，但目前该产品仍面临内皮细胞及组织更替速度及程度达不到理想要求。如何修饰材料表面，为内皮细胞及内皮祖细胞的附着、分化增殖提供一个良好微环境，加速内皮化及组织更替进程具有重要临床实用价值。

改进对牛颈静脉去细胞基质的修饰是提高牛颈静脉带瓣管道内皮化程度及组织再生的重要环节。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是一种高度特异性促内皮细胞增殖的活性因子。VEGF通过肝素紧密结合到细胞外基质，能够保持它的活性和稳定性。因此，采用与肝素结合的生长因子修饰去细胞基质有可能更好发挥生长因子促内皮细胞再生的功能。

本申请人曾提出中国专利申请200510032124.9。其中公开了一种对生物组织进行去细胞处理的方法，并获得去细胞生物材料，尤其是一种带瓣管道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种适合细胞生长因子(VEGF)与肝素特异性结合，并能与去细胞基质后的生物材料进行结合的壳聚糖-肝素纳米颗粒。该材料是采用离子交联法制备的。

本发明的另一目的是提供一种利用壳聚糖-肝素纳米颗粒进行处理后的生物材料，特别是生物管道材料。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：采用离子交联法制备的壳聚糖-肝素纳米颗粒，壳聚糖分子量控制在100kD——300kD之间，壳聚糖溶液浓度1-4mg/ml，肝素为低分子量肝素及普通肝素，浓度为0.5-4mg/ml，使壳聚糖-肝素纳米颗粒粒径控制在50nm-150nm之间，PDI范围：0.05-0.15之间，Zata电位：-30mv-+30mv。

上述反应体系的条件更优化为采用中速磁力搅拌的方式。本申请发明人发现在低速搅拌时，所形成的颗粒较大，而搅拌速度过快的话，搅拌时间要把握好，否则颗粒大小不均一。

通常，对于异种生物材料，需要进行去细胞基质表面修饰。去细胞的方法有多种。关于去细胞的方法，在中国专利ZL200510032124.9中有详细描述。

本发明利用上述获得的壳聚糖肝素纳米颗粒对去细胞处理后的生物材料进行处理获得新的去细胞基质的生物材料。该生物材料是采用上述的壳聚糖-肝素纳米颗粒处理该生物材料；将生物材料置于1-3mg/ml的所述壳聚糖-肝素纳米颗粒溶液中，进行自组装反应，然后再用EDC/NHS交联剂进行交联反应。EDC/NHS溶液配置为：EDC浓度为50-400mmol/L、NHS浓度为15-60mmol/L、缓冲溶液，例如MES，浓度为0.05mmol/L。

上述反应体系的条件更优化为自组装反应时间应大于4h。当反应时间更加充分后，纳米颗粒在材料表面分布更加均匀。

获得上述带有壳聚糖-肝素纳米颗粒的去细胞生物材料后，再用VEGF溶液浸泡。

根据本发明的实施例，优选的条件是，将载壳聚糖-肝素纳米颗粒去细胞生物材料于50-200ng/mlVEGFPBS溶液中，25℃以下反应。

通常，用生长因子处理上述壳聚糖-肝素纳米颗粒后，可以通过免疫组化法检测局部固定VEGF，或ELISA法检测溶液中剩余VEGF含量的办法了解到壳聚糖-肝素纳米颗粒去细胞生物材料对细胞生长因子，例如VEGF的固定情况。通常，前段所述条件下，反应4个小时即可。

本发明中涉及的名词的定义如下：

去细胞生物材料：将异种生物材料进行脱细胞处理，得到主体由细胞外基质构成的支架材料。

离子交联法：利用正负电荷相互吸引，互相交联而使两种物质组成纳米级别产品。

PDI：多分散指数，纳米颗粒检测指标之一。

Zata电位：纳米颗粒表面带点情况，纳米颗粒检测指标之一。

EDC/NHS：-一种催化-COOH及-NH2反应生成酯并从化合物中脱离的已知交联剂。

现有技术中，去细胞生物材料应用较为广泛的是去细胞基质的生物管道，广泛用于肺动脉血管、心脏血管的修复或重建；尤其是带瓣管道，其具有更加重要应用，同时，对于该带瓣管道的处理也比一般的生物管道难。

本申请人在中国专利ZL200510032124.9说明了如何处理带瓣生物管道材料的制备。

本发明的关键在于将纳米颗粒与生长因子VEGF在去细胞基质表面牢固结合并长期保持其生物活性。

采用纳米技术将肝素、壳聚糖及VEGF联合修饰去细胞-光氧化牛颈静脉带瓣管道，可以充分发挥肝素抗凝，壳聚糖提高生物相容性，VEGF促内皮细胞增殖及加速组织再生的优势。一方面装载大量的肝素、壳聚糖，在局部形成功能富集区，经交联后颗粒性能更加稳定，可长期存在，另一方面，VEGF可以通过该方法，在材料表面牢固结合并长期保持生物活性，促使内皮化形成，并使材料达到完全再生的组织工程学理念。

本专利纳米颗粒制备采用改进的离子交联法。该方法制备纳米颗粒最大优点为不需任何有机试剂加入，通过自组装形成。通过控制重要参数：壳聚糖分子量，壳聚糖溶液浓度，肝素分子量，肝素溶液浓度，溶液体系温度，纳米颗粒粒径可根据需要进行制备。

涉及到牛颈静脉去细胞及染料介导光氧化、纳米颗粒结合牛颈静脉、VEGF结合牛颈静脉反应时，生物带瓣管道处于无菌条件，不高于25℃温度条件下，例如可以用水浴的方法控制被处理的生物带瓣管道的温度不高于25℃。

本发明提供的用于肺动脉血管修复或重建的生物带瓣管道，其获得良好的内皮化性能，同时具备抗血栓，抑菌，并能达到长期持续性疗效，有利于人体对于生物带瓣管道的自身更替。

附图说明

图1：按本发明方法制备的壳聚糖-肝素纳米颗粒的粒径、PDI及TEM；

图2：甲苯胺蓝染色标记肝素

图3：SEM(*30000倍)示纳米颗粒结合至牛颈静脉

图4：原子力显微镜(AFM)示纳米颗粒结合牛颈静脉后，表面地貌图；

图5：扫描电子显微镜(SEM)及活细胞荧光染色示EA.HY926细胞在纳米技术修饰去细胞血管基质种植14天后结果；

图6：HE染色示6周后载VEGF纳米颗粒牛颈静脉血管血管发生。

实施例1

制备壳聚糖-肝素纳米颗粒：改进离子交联法，壳聚糖分子量控制在100kD-300kD之间，壳聚糖溶液浓度1-4mg/ml，肝素为低分子量肝素及普通肝素，浓度为0.5-2mg/ml，溶液体系温度为：37℃，采用中速磁力搅拌方式，时间为20分钟。

结果：通过控制制备纳米颗粒相关因素，壳聚糖-肝素纳米颗粒粒径控制在50nm-200nm之间，PDI范围：0.110-0.185之间，Zata电位：-20mv-+30mv。纳米颗粒可根据需要，形成最外层带负电荷的良好核壳结构，经EDC/NHS进一步加固后稳定释放时间可达60天以上。(见图1)

结论：壳聚糖-肝素纳米颗粒根据需要进行调整，适用于不同生物材料表面固定

实施例2

(1)牛颈静脉去细胞-染料介导光氧化处理：采用专利：用于肺动脉血管修复或中间的生物带瓣管道及制备方法(专利号：ZL200510032124.9)进行去细胞和染料介导的氧化反应两个步骤。

(2)纳米颗粒与牛颈静脉通过2步法进行结合，首先为纳米颗粒与牛颈静脉进行物理吸附自组装，再通过EDC/NHS进行化学交联：将牛颈静脉置于2mg/ml纳米颗粒溶液中，在摇速为80转/分条件下自组装反应时间6小时，再进行化学交联交联4小时，提高纳米颗粒与材料的结合牢固程度。EDC浓度为200mmol/L，NHS浓度为60mmol/L。

结果：纳米颗粒均匀，大量结合在牛颈静脉内膜面。

结论：物理，化学方法将纳米颗粒与生物材料相结合是种可行技术。(见图2)

实施例3

VEGF与实施例2中所获得的载纳米颗粒牛颈静脉结合。制备50-200ng/mlVEGFPBS溶液，将载纳米颗粒牛颈静脉置于VEGF溶液中，25℃以下反应4小时。通过免疫组化法检测局部固定VEGF，ELISA法检测溶液中剩余VEGF含量。

结果：VEGF可与载纳米颗粒牛颈静脉中肝素特异性结合。

结论：通过纳米载药方式，可将VEGF局部固定，并使之缓慢释放。

实施例4

载多功能纳米颗粒牛颈静脉溶血性试验

方法：受试材料为采用不同处理方法制备牛颈静脉带瓣管道血管片。实验共分7组：去细胞结合光氧化反应组、GA(戊二醛)组、阳性对照组(蒸馏水)、阴性对照组(生理盐水)，载纳米颗粒颗粒组。制备新鲜抗凝兔血。加0.9％氯化钠溶液10ml，置37℃水浴箱中水浴30分钟。各管加入新鲜抗凝兔血0.2ml，37℃水浴60分钟。离心5分钟。阳性对照用蒸馏水10ml加入新鲜抗凝兔血0.2ml，阴性对照用0.9％氯化钠溶液10ml加入新鲜抗凝兔血0.2ml，分别吸取上清液移入比色皿中，用分光光度计在545nm波长处测定吸光度。计算溶血率。以上操作均在室温15±2℃，相对湿度60％～70％的环境下进行。

结果：各组材料的溶血率均≤5％，其中载纳米颗粒组牛颈静脉结果最佳。

结论：载纳米颗粒牛颈静脉具备优异的血液相容性，符合生物材料溶血试验要求。

实施例5

人脐静脉内皮细胞在载多功能纳米颗粒牛颈静脉上种植

方法：受试材料为去细胞光氧化牛颈静脉，载纳米颗粒牛颈静脉，载VEGF纳米颗粒牛颈静脉。所有血管片均为灭菌处理。人脐静脉内皮细胞取材为EA.HY926细胞株，在各组静脉表面进行种植培养。

结果：内皮细胞在载VEGF纳米颗粒组表秒可长期存活，细胞密集生长，排列有序，贴壁牢靠。

结论：载VEGF纳米颗粒牛颈静脉提高细胞贴壁，增殖，分化能力，适合人内皮细胞生长。(见图5)

实施例6

载VEGF纳米颗粒牛颈静脉老鼠皮下包埋组织再生实验

方法：无菌操作取去细胞光氧化牛颈静脉，载纳米颗粒牛颈静脉，载VEGF纳米颗粒牛颈静脉血管片。每组8只雄性8周龄的Wistar大鼠腹腔麻醉，于大鼠背部正中作一纵形切口，分别将两组血管片展平植入同一动物背部两侧。4-0prolene线做连续缝合。术后常规肌注青霉素2天，1500u/只，1次/天。在通风良好，恒温环境下笼中等级饲料喂养60天。

结果：60天进行HE染色显示载VEGF纳米颗粒牛颈静脉微血管形成最为明显，并有大量成纤维细胞浸润。

结论：体内试验证明，载VEGF纳米颗粒牛颈静脉具备优异的血管发生能力，加速组织更替进程。

Claims (6)

1.去细胞生物材料，其特征在于具有其上结合有壳聚糖-肝素纳米颗粒，并且其制备条件是：去细胞生物材料置于1-3mg/mL的壳聚糖-肝素纳米颗粒溶液中，进行自组装反应，然后再用EDC/NHS交联剂进行交联反应；EDC/NHS溶液配置为：EDC浓度为50-400mmol/L、NHS浓度为15-60mmol/L、缓冲溶液；所述壳聚糖-肝素纳米颗粒的制备方法是：采用离子交联法，并且壳聚糖分子量控制在100kD-300kD之间，壳聚糖溶液浓度1-4mg/mL，肝素为低分子量肝素及普通肝素，浓度为0.5-4mg/mL，使壳聚糖-肝素纳米颗粒粒径控制在50nm-150nm之间，PDI范围：0.05-0.15之间，Zata电位：-30mV-+30mV。

2.根据权利要求1所述的去细胞生物材料，其特征在于反应体系中采用中速磁力搅拌的方式，所述反应体系是指采用离子交联法制备壳聚糖-肝素纳米颗粒。

3.根据权利要求1所述的去细胞生物材料，其特征在于壳聚糖溶液及肝素溶液体积配比为2:5。

4.根据权利要求1所述的去细胞生物材料，其特征在于自组装反应时间大于12h。

5.根据权利要求4所述的去细胞生物材料，其特征在于对权利要求4所获得的去细胞生物材料，再用VEGF溶液浸泡；具体是将载壳聚糖-肝素纳米颗粒去细胞生物材料于50-200ng/mLVEGFPBS溶液中，25℃以下反应。

6.根据权利要求5所述的去细胞生物材料，其特征在于去细胞生物材料于VEGFPBS溶液中反应时间大于4h。