KR101222907B1 - 여시니아 엔테로콜리티카 랜덤 지노믹 ｄｎａ 단편을 이용한 유전자 칩 - Google Patents

여시니아 엔테로콜리티카 랜덤 지노믹 ｄｎａ 단편을 이용한 유전자 칩 Download PDF

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Abstract

본 발명은 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)의 랜덤 지노믹 DNA 단편을 이용한 유전자 칩에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 Y. enterocolitica의 지노믹 DNA로부터 유래된 랜덤 지노믹 DNA 프로브를 포함하는 Y. enterocolitica 검출용 DNA 칩에 관한 것이다.
본 발명은 특정 유전 표지자를 이용해서 제작한 기존의 Y. enterocolitica 검출용 칩과는 다르게, 특정 유전 정보 없이 단 하나의 Y. enterocolitica 균주에서 추출된 지노믹 DNA를 무작위로 절단하여 얻어진 69 개의 DNA 단편을 이용하여 Y. enterocolitica 검출용 DNA 칩을 제작하였다. 상기 DNA 칩은 여시니아(Yersinia) 속(genus)의 다른 종(species) 및 여시니아(Yersinia)와 다른 속(genus)의 미생물과 차별되면서 단지 Y. enterocolitica만 검출할 수 있다.

Description

여시니아 엔테로콜리티카 랜덤 지노믹 ＤＮＡ 단편을 이용한 유전자 칩 {DNA chip using random genomic DNA fragments of Yersinia enterocolitica}
본 발명은 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)의 랜덤 지노믹 DNA 단편을 이용한 유전자 칩에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 Y. enterocolitica의 지노믹 DNA로부터 유래된 랜덤 지노믹 DNA 프로브를 포함하는 Y. enterocolitica 검출용 DNA 칩에 관한 것이다.
Enterobacteriaceae과(family)에 속하는 통성혐기성, 그람음성간균인 여시니아(Yersinia) 속(Genus)은 11 개의 종(species)으로 분류된다. 11 개의 종(species) 중 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)는 사람과 동물에서 병원성을 나타내는 대표적인 식중독 균이다. 이 균은 주로 사람의 장내 질환, 열과 설사를 동반한 급성 위장염, 급성 충수염을 유발하며, 이밖에 림프절염, 관절염, 결절성 홍반 등을 일으킨다. Y. enterocolitica 감염은 주로 비 가공 유제품이나 덜 익힌 돼지고기와 같은 동물로부터 유래된 식품의 섭취에 의해 발생되지만, 이것 외에도 살균 처리되지 않은 물이나 하수에 의한 감염사례도 빈번하게 보고되고 있다. 또한 이 균은 대부분의 미생물이 증식하기 어려운 저온(약 0 ℃)에 저장된 식품이나 진공포장식품에서도 증식할 수 있는데, 이것이 소비자의 안전을 위해 식품산업에서 이 균에 대해 관심을 갖는 주요 원인 중 하나이다.
식품에 오염된 Y. enterocolitica를 검출하는 다양한 진단방법이 개발되었으며, 가장 일반적으로 사용하고 있는 전통적인 검출방법은 3 주 이상 4 ℃에서 한냉 증균(cold enrichment)과정을 포함하고 있기 때문에 시간이 오래 걸린다는 단점이 있으며, 증균(enrichment)에 의해 증식된 균을 선택 배양하기 위한 selective agar plate인 CIN(cefsulodin-irgasan-novobiocin) agar에서 Aeromonas spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp., Proteus spp.와 같은 다른 미생물이 성장한 연구 보고가 있고, CIN agar에서 성장한 콜로니(colony)가 Y. enterocolitica 임을 확인하기 위해 사용되는 API kit에서는 다른 여시니아(Yersinia) 종(species)들이 Y. enterocolitica로 잘못 판단되는 오류가 발생하기도 한다.
분자생물학적 진단방법 중에서는 정확한 검출능력을 가진 것으로 PCR machine을 이용하는 방법이 있으며, 이와 관련된 다양한 연구보고가 있다. 그러나, PCR을 이용한 검출 방법은 16S rRNA 또는 병원성 유전자와 같은 유전 표지자의 시퀀스(sequence) 정보가 요구되며, 결과 확인을 위한 겔 전기영동(gel electrophoresis) 역시 노동집약적이며 시간 소모적이다. 뿐만 아니라, 상기 검출방법은 때때로 부 정확한(non-specific band) 결과를 유도하기도 하는데, 특히 다양한 유전 표지자를 동시검출하기위한 multiple PCR(동시다중유전자증폭)의 경우 더 빈번하게 잘못된 결과를 유발한다.
DNA 칩(DNA chip)은 슬라이드 글라스(slide glass), 실리콘(silicon)과 같은 플랫폼(platform) 위에 DNA 프로브(DNA probe)로 알려진 유전자를 고정하여 제작하는 방법으로, 검출하고자 하는 미생물의 특정 유전자와 혼성화 방법을 통해 정확한 검출 결과를 얻을 수 있으며, 수천 개 이상의 DNA 프로브를 플랫폼 위에 고정화시킬 수 있는 장점 때문에, 신속하고 동시적인 미생물 검출을 위해 사용된다. 다양한 종류의 DNA 프로브를 이용하여 칩을 제작할 수 있는데, 그 프로브의 종류로는 PCR machine을 이용해서 기능성 유전자를 증폭하는 방법 또는 올리로뉴클레오티드(oligonucleotide)를 합성해서 제작하는 방법이 있다. 하지만 이 두 가지 방법은 특정 유전 표지자의 유전정보(sequence information)를 알고 있어야 제작이 가능하다. Whole genomic DNA를 사용하거나 랜덤 지노믹(random genomic) DNA를 사용하는 방법은 특정 유전표지자의 정보를 알지 못하더라도 DNA 프로브로 이용할 수 있는 방법이다. 하지만, whole genomic DNA를 사용해서 제작된 칩의 검출능력이 랜덤 지노믹 DNA를 사용해서 제작된 칩에 비해 떨어진다는 연구가 보고되어졌다. 랜덤 지노믹(Random genomic) DNA를 프로브로 사용하여 슬러지(sludge)에 존재하는 환경미생물을 검출했던 칩에 대한 연구 결과가 이미 보고되어 졌지만, 아직 Y. enterocolitica를 검출하기 위해 칩이 제작된 사례는 없었다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, Y. enterocolitica의 랜덤 지노믹 DNA 단편을 이용하여 Y. enterocolitica 진단용 DNA 칩을 개발하였으며, 제작된 칩이 여시니아(Yersinia) 속(genus)의 다른 종(species)의 미생물로부터 Y. enterocolitica를 선별적으로 진단할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 Y. enterocolitica만을 검출할 수 있는 Y. enterocolitica 검출용 DNA 칩 및 상기 DNA 칩의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 칩을 이용한 Y. enterocolitica 균의 탐지방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)의 지노믹 DNA로부터 유래된 랜덤 지노믹(random genomic) DNA 프로브를 포함하는 Y. enterocolitica 검출용 DNA 칩을 제공한다.
본 발명의 DNA 칩에 있어서, 상기 랜덤 지노믹 DNA 프로브는 상기 식중독 원인균인 여시니아 엔테로콜리티카로부터 추출한 지노믹 DNA를 서로 다른 종류의 제한효소 쌍으로 잘라내어 겔 추출법으로 추출한 100 내지 1500 bp의 DNA인 것을 특징으로 한다. 상기와 같은 크기를 갖는 DNA 단편은 종간의 중복 가능성이 매우 적으므로 Y. enterocolitica를 특이적으로 탐지할 수 있다.
상기 게놈 DNA 추출을 위해 사용한 서로 다른 종류의 제한효소 쌍은 상기 균으로부터 DNA를 추출할 수 있는 어떠한 제한효소 쌍도 사용될 수 있으나, 바람직하게는 EcoRⅠ/BamHⅠ, HindⅢ/XhoⅠ및 HindⅢ/SacⅡ인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 랜덤 지노믹 DNA 프로브는 서열번호 1 내지 69의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 DNA 칩은 여시니아(Yersinia) 속(genus) 중에서 Y. enterocolitica 종(species)만을 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시예에서 살펴본 바와 같이, 상기 여시니아 엔테로콜리티카로부터 69개의 프로브를 얻어내었으며, 상기 프로브가 Y. enterocolitica만을 검출하는지를 확인하기 위해, 다수의 Y. enterocolitica strain, Yersinia 속(genus)이지만 다른 종(species), 및 여시니아(Yersinia)와 다른 속(genus)의 미생물을 상기 69개의 프로브와 함께 하이브리다이제이션(hybridization) 시킨 결과, Y. enterocolitica만을 선택적으로 검출하는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 Y. enterocolitica 검출용 DNA 칩의 제조방법을 제공한다:
a) Y. enterocolitica로부터 지노믹 DNA를 추출하는 단계;
b) 추출한 지노믹 DNA를 서로 다른 종류의 제한효소 쌍으로 잘라내어 겔 추출법으로 100 ~ 1500 bp를 분리하는 단계;
c) 상기 b) 단계에서 사용한 제한효소 쌍으로 처리된 라이브러리용 플라스미드와 상기 절단된 지노믹 DNA를 연결시켜 콜로니를 획득하는 단계;
d) 획득한 콜로니에서 플라스미드를 추출한 후, T3/T7 프라이머로 PCR을 수행한 후 프로브를 정제하는 단계; 및
e) 정제된 프로브를 슬라이드 글라스에 고정하는 단계.
본 발명을 보다 자세히 설명하면 다음과 같다.
상기 제조방법에 있어서, a) 단계의 지노믹 DNA의 추출은, Y. enterocolitica을 계대 배양시킨 후, 상기 계대 배양을 통해 얻어진 미생물로부터 지노믹 DNA를 DNA 검출 키트를 이용하여 추출한다.
상기 제조방법에 있어서, b) 단계의 각각의 제한효소 쌍으로 잘려진 지노믹 DNA는 아가로스 젤로 전기영동한 후, 겔 추출법으로 100 ~ 1500 bp의 사이즈를 갖는 부분을 분리한다. 이때 사용하는 제한효소는 서로 다른 종류의 제한효소 쌍을 이용하는 것을 기본으로 한다.
이후 랜덤 지노믹 DNA 라이브러리를 제작하기 위해, 동일한 제한효소 쌍으로 처리된 라이브러리용 플라스미드를 준비하여 상기 c) 단계를 수행한다. 상기 제한효소 쌍으로 잘려진 플라스미드와 상기 회수한 게놈 DNA 단편을 연결(ligation)시킨다. 이후 연결된 플라스미드 DNA들은 열 충격방법으로 형질전환시켜 콜로니를 획득한다. 이때, 대략 하나의 제한효소 쌍으로부터 잘라 구성된 랜덤 라이브러리에서는 수백 개의 콜로니가 얻어지며, 이들 중 각각의 플레이트에서 콜로니를 랜덤하게 선별하여 플라스미드를 추출한다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 d) 단계로부터 얻어진 PCR 산물은 본래의 순수 배양된 Y. enterocolitica만의 지노믹 DNA 단편들을 포함한다.
상기 e) 단계에서 정제된 프로브를 슬라이드 글라스에 집적시킬 때, 프로브의 수의 개수는 제한되지 않으나 60 ~ 70 개로 한정하여 DNA가 잘 붙는 케미칼로 코팅 처리된 유리 슬라이드 글라스 위에 집적시키는 것이 좋다. 상기 DNA가 잘 붙는 케미칼로는 일반적으로 사용되는 실란(silane), 아민(amine), 알데히드(aldehyde) 또는 폴리-엘-라이신(Poly-L-lysine) 등이 있으며, 본 발명에서는 아민(amine)을 사용하였다.
본 발명의 Y. enterocolitica 검출용 DNA 칩 제조방법에 있어서, 하기의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다:
a) 고정된 랜덤 지노믹 DNA 프로브를 다른 비교 미생물로부터 랜덤 프라이밍(random priming)된 DNA와 하이브리다이제이션(hybridization)시켜 상호중복 하이브리다이제이션을 제외시키는 단계; 및
b) Y. enterocolitica에만 하이브리다이제이션하는 랜덤 지노믹 DNA 프로브만을 선택하여 슬라이드 글라스에 고정화하는 단계.
상기 a) 단계의 상호중복 프로브의 제외는 Y. enterocolitica와 유전 정보가 비슷한 다른 Yersinia spp.로부터 랜덤 프라이밍된 DNA 프로브와 상기 고정된 랜덤 DNA 프로브를 하이브리다이제이션 시킴으로써 상호중복 하이브리다이제이션 랜덤 DNA 프로브를 제거함으로써 수행되며, 이후 Y. enterocolitica에만 하이브리다이제이션하는 랜덤 지노믹 DNA 프로브를 선별하여 슬라이드 글라스에 고정화시킨다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Y. enterocolitica로부터 유래된 지노믹 DNA 프로브를 이용하여 DNA 칩을 준비하는 단계; 시료 미생물로부터 지노믹 DNA를 추출하고 랜덤 프라이밍(random priming)을 통해 시료 DNA를 제조하는 단계; 상기 시료 DNA를 상기 DNA 칩 상의 지노믹 DNA 프로브와 하이브리다이제이션(hybridization)시켜 Y. enterocolitica의 존재 유무를 판별하는 단계를 포함하는 Y. enterocolitica 균의 탐지방법을 제공한다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 특정 유전 표지자를 이용해서 제작한 기존의 Y. enterocolitica 검출용 칩과는 다르게, 특정 유전 정보 없이 단 하나의 Y. enterocolitica 균주에서 추출된 지노믹 DNA를 무작위로 절단하여 얻어진 69 개의 DNA 단편을 이용하여 Y. enterocolitica 검출용 DNA 칩을 제작하였다. 상기 DNA 칩은 여시니아(Yersinia) 속(genus)의 다른 종(species) 및 여시니아(Yersinia)와 다른 속(genus)의 미생물과 차별되면서 단지 Y. enterocolitica만 검출할 수 있다.
도 1은 Y. enterocolitica의 랜덤 지노믹 DNA 프로브에 대한 전기영동이미지를 나타낸다.
도 2는 칩에 부탁된 Y. enterocolitica의 랜덤 지노믹 DNA 프로브의 배열과 Y. enterocolitica의 지노믹 DNA와 칩에 부탁된 DNA 프로브의 탐지 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 다수의 Y. enterocolitica, 여시니아(Yersinia) 속(genus)의 다른 종(species), 여시니아(Yersinia)와 다른 속(genus)에 속하는 미생물의 지노믹 DNA와 칩에 부착된 DNA 프로브와의 탐지 결과를 Mev v4.6으로 표현한 이미지 이다.
도 4는 PCA 분석에 의해 Y. enterocolitica와 여시니아(Yersinia) 속(genus)의 다른 미생물 종(species)이 차별되는 결과를 보여주는 이미지이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 랜덤 지노믹 ( genomic ) DNA 의 분리
먼저, 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica; strain number ATCC 23715)는 TSB(tryptic soy broth; BBL/Difco, Sparks, MD, USA)에 접종하여 37 ℃에서 24 시간 간격으로 10 μl inoculation loop를 사용하여 3일 동안 계대배양 하였다. 배양 3일째에 Y. enterocolitica 배양액 3 ml을 14,000×g으로 2 분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 남은 펠렛(pellet)을 DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen instrument AG, Homberchtikon, Switzerland)를 이용하여 지노믹 DNA를 추출하였다.
추출된 상기 Y. enterocolitica의 지노믹 DNA는 서로 다른 제한효소 쌍 즉, EcoRⅠ/BamHⅠ, HindⅢ/XhoⅠ, HindⅢ/SacⅡ을 이용하여 절단하였다. 이는 다양한 크기의 DNA를 얻기 위한 것으로, 세 개의 튜브(tube) 속 지노믹 DNA를 각각의 제한효소 쌍으로 절단하였다. 이후, 각각의 제한효소 쌍으로 절단된 지노믹 DNA를 아가로스 겔(agarose gel)을 이용하여 전기영동 한 후, gel electrophoresis를 사용하여 100 ~ 1500 bp의 사이즈로 겔(gel)을 잘라내고, QIAquick 겔 추출키트(QIAquick gel extraction kit; Qiagen)를 사용하여 DNA를 추출하였으며, phenol-chloroform extraction 기술을 이용하여 추출한 DNA를 정제하였다.
실시예 2. 랜덤 지노믹 ( random genomic ) DNA 라이브러리 및 DNA 칩 제조
랜덤 지노믹 DNA 라이브러리를 제작하기 위해, 라이브러리용 pPCR-Script Amp vector(Invitrogen, Carlbad, CA, USA)를 상기와 동일한 제한효소 쌍(EcoRⅠ/BamHⅠ, HindⅢ/XhoⅠ, HindⅢ/SacⅡ)으로 처리하였다. 즉, 상기 실시예 1에서 각각의 제한효소 쌍으로 절단된 지노믹 DNA를 상기 벡터에 삽입하기 위해 동일한 제한효소 쌍으로 벡터를 절단하였다. 이후, 상기 각각의 제한효소 쌍으로 절단된 지노믹 DNA 단편을 3 개의 동일한 제한효소 쌍으로 잘려진 각각의 플라스미드 벡터(plasmid vector)와 서로 연결(ligation) 시키고, 연결된 플라스미드 벡터들을 열 충격(heat shock)방법으로 Escherichia coli DH5α(E. coli DH5α; Real Biotech Corp., Banqiao, Taipei, Taiwan)에 형질전환 시킨 후, LB amp agar에 도말하여 37 ℃에서 16 시간 동안 배양하여 콜로니(colony)를 얻어내었다. 따라서 EcoRⅠ/BamHⅠ, HindⅢ/XhoⅠ, HindⅢ/SacⅡ 제한효소 쌍으로 절단된 100 ~ 1500 bp의 DNA 단편이 연결된 플라스미드가 E. coli DH5α에 삽입되었으며, 각각의 플레이트 위에 수백 개의 콜로니가 형성되었다.
각각의 플레이트에서 랜덤하게 콜로니를 선별하여, 3 ml의 LB-amp broth에서 37 ℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 원심분리하여 얻은 펠렛을 miniprep kit(Qiagen)를 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 추출된 플라스미드는 DNA 단편의 사이즈와 연결(ligation) 여부를 확인하기 위해, 플라스미드를 제작하기 위해 사용했던 동일한 제한효소 쌍으로 절단하였으며, 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 확인하였다. 상기 과정을 반복하여 서로 다른 크기의 DNA를 확보하였으며, 플라스미드의 T3와 T7의 프로모터(promotor)를 인식하는 프라이머(primer)를 이용하여 PCR을 수행함으로써 DNA 단편을 증폭시켰다. PCR의 조건은 94℃에서 5분간 predenature 이후 58℃, 1분간 annealing, 72℃, 1 분간 elongation을 1 사이클 (cycle) 수행하고 94℃, 30초간 denature, 58℃, 30초간 annealing, 72℃, 30초 동안 elongation을 40 사이클 수행한 후 72℃에서 10 분간 post elongation을 수행하였다. 이후 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 positive DNA(69 개)를 선정하였으며, QIAquick 정제 키트(QIAquick purification kit; Qiagen)를 이용하여 정제하였다. PCR 이후 선정된 프로브에 대한 전기영동이미지를 도 1에 나타내었다. 이후 상기 69개의 여시니아 랜덤 지노믹 DNA는 시컨스(sequence)분석 및 칩 제작에 사용되었다. 시컨스 분석은 바이오닉스사(www.bionicsro.co.kr)에 T7, T3 프라이머를 이용한 양방향 분석을 의뢰하였으며, 이때 Applied Biosystems사의 3730XL DNA Analyzer를 이용하여 분석되었다. T7 프라이머를 이용하여 정방향(5'→3')으로 분석한 결과는 서열번호 1 내지 69에 나타내었다.
칩에 사용되는 양성 대조군(positive control)으로 박테리오파지(bacteriophage) ΦFC1의 MJ1 유전자를 선정하였으며, 프라이머, MJ1 probe F(GGA ACT GGC ATT GTT CCC TT) 및 MJ1 probe R(TTC AGC TCC GCA TTT ACC AC)을 이용하여 PCR로 증폭하였다. 상기 69 개의 게놈 DNA 프로브 및 양성대조군을 아민(amine)으로 코딩된 유리 슬라이드 글라스 위에 집적시켰다.
실시예 3. DNA 칩의 탐지능력 확인
3-1. 랜덤 프라이밍
상기로부터 얻은 Y. enterocolitica의 69 개 프로브가 Y. enterocolitica만을 검출하고, 여시니아(Yersinia)와 같은 속(genus)이지만 다른 종(species) 및 다른 속(genus)에 속하는 미생물과 차별될 수 있는지를 확인하기 위해, 7 개의 Y. enterocolitica의 다른 strain(ATCC 23715; 칩제작에 사용한 균주, ATCC 9610, ATCC 55075, WI001, WIO15, WI021, WI030) 및 여시니아(Yersinia) 속(genus)의 다른 종(Y. bercovieri ATCC 43970, Y. mollaretii ATCC 43969, Y. rohdei ATCC 43380, Y. frederiksenii ATCC 33641, Y. intermedia ATCC 29909, Y. ruckeri ATCC 29473, Y. aldovae ATCC 35236, Y. kristensenii ATCC 33638, Y. pseudotuberculosis ATCC 6902) 및 여시니아(Yersinia)와 다른 속(genus)의 미생물(L. monocytogenes ATCC19111, L. monocytogenes F8369, L. innocua ATCC 33090, E. sakazakii 3270, E. sakazakii 3437, E. cloacae ATCC 13047, E. cloacae ATCC 11439)이 사용되었다.
상기 각 균주의 지노믹 DNA를 추출하고, 200 ng/μl의 농도로 멸균수를 이용해서 희석한 후, nanodrop spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 측정하였다. 이후, 각 DNA에 형광표지물(Cy5, Cy3)을 라벨링(labeling)하기 위해, 본 발명을 위해 사용되었던 Y. enterocolitica ATCC 23715 strain 으로부터 추출된 지노믹 DNA는 Cy5-dCTP와 함께 랜덤 프라이밍 방법을 이용해서 라벨링 하였고, 7 개의 Y. enterocolitica strain, 9 개의 여시니아와 같은 속(genus)이지만 다른 종(species)의 미생물, 7개의 여시니아 속(genus)과 다른 속(genus)인 미생물으로부터 추출된 각 균주의 지노믹 DNA는 Cy3-dCTP와 함께 랜덤 프라이밍 방법을 이용해서 라벨링 하였다. 랜덤 프라이밍은 로슈사(Roche)의 High prime DNA labeling kit를 사용하였으며, 랜덤 프라이밍 반응 용액에는 랜덤 헥사머, dNTPs, Klenow 단편들 및 버퍼가 포함되어 있으며, 총 20 μl 반응에 25 nM의 Cy5-dCTP 및 Cy3-dCTP를 각각 1 μl씩 포함하였다. 양성 대조군은 본 발명의 Y. enterocolitica DNA와 test DNA를 Cy5-dCTP 및 Cy3-dCTP와 함께 랜덤 프라이밍으로 라벨링 하기 전, 각각의 튜브에 10 ng/μl씩 첨가하였다. 즉, 2 개의 튜브를 준비하고, 1번 튜브에 200 ng/μl의 Y. enterocolitica ATCC 23715, 랜덤 프라이밍 키트의 조성물, 1 μl의 Cy5 및 10 ng 양성 대조군을 첨가하고(총 부피 20 μl), 2번 튜브에는 테스트 하기 위한 7개의 Y. enterocolitica strain, 9 개의 여시니아 속(genus)에 속하는 다른 종(species)인 미생물, 및 7개의 여시니아와 다른 속(genus)에 속하는 미생물의 지노믹 DNA 200 ng/μl를 각각 첨가하고, 1 μl Cy3 및 10 ng 양성 대조군을 첨가하였다(총 부피 20 μl). 이후 Cy5 및 Cy3 dye를 각각의 지노믹 DNA에 라벨링시키기 위해, 2 시간 동안 37 ℃에서, 10 분 동안 65 ℃에서 인큐베이션 시켰다. 이후, Cy5가 라벨링된 Y. enterocolitica DNA와 Cy3가 라벨링된 테스트 DNA 혼합물을 섞은 후, MinElute PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 10 μl를 추출하였다.
3-2. 하이브리다이제이션(hybridization)
상기 추출된 DNA 혼합물에 2 μl의 하이브리다이제이션 용액(6×saline-sodium citrate(SSC), 0.2% sodium dodecyl sulfate(SDS), 5×Denhardt's solution, 0.1 mg/ml의 denatured salmon sperm DNA)을 첨가하여 98 ℃에서 2 분 동안 가열하였다. 이는 DNA 칩의 프로브와 함께 하이브리다이제이션을 시키기 위해, 2중 결합을 단일 결합으로 분리하기 위함이다.
이후, 칩에 집적된 Y. enterocolitica 프로브와 상기 얻어낸 DNA 혼합물의 하이브리다이제이션을 수행하기 전, 먼저 칩의 pre-하이브리다이제이션을 수행하였다. 제조한 DNA 칩을 1.75×SSC, 0.1% SDS, 10 mg/ml의 BSA(bovin serum albumin)으로 제조된 용액에 30분간 담근 후, 증류수로 1 분간, 100% 이소프로판 용액으로 30초간 세척하였다. 세척 후 DNA 칩을 50 ml의 튜브에 넣고, 4000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 건조하였다. 이후, 상기 건조시킨 칩의 DNA 프로브 부분에 98 ℃에서 2 분 동안 가열시켜 놓은 DNA 혼합물을 주입하고, 커버글라스를 덮었다. 그리고 챔버에 넣어 65 ℃ 항온조(water bath)에서 14 ~ 15 시간 동안 하이브리다이제이션을 진행하였다. 하이브리다이제이션이 완료된 DNA 칩을 준비해 놓은 버퍼 1용액(2×SSC)에 넣어 커버글라스를 제거하고, 65 ℃로 미리 가열시킨 버퍼 2용액(2×SSC, 0.2% SDS)으로 10 분간 세척하고, 버퍼 3용액(0.05×SSC)으로 5 분간 2번 세척하였다. 세척이 완료되면, 4000 rpm으로 5 분간 원심분리하여 DNA 칩을 건조시켰다.
상기 건조된 칩은 GenePix 4000B 레이져 스캐너(Axon, Union, CA, USA)를 이용하여 스캔하였으며, 도 2는 본 발명의 DNA 프로브(Y. enterocolitica ATCC 23715)의 검증을 위해 같은 균주의 지노믹 DNA를 칩과 테스트한 스캔 이미지 결과이다. 스캔이미지를 통해 측정되는 수치는 GenePix Pro 6.0 software(Axon, Union, CA, USA)를 이용해서 분석 하였다. 이 소프트웨어에 의해 분석된 결과 중 69 개의 프로브의 635nm(Cy5)로 측정 후 나타난 median 값과 532nm(Cy3)로 측정 후 나타난 median 값을 선택하여, 532nm로 측정 후 나타난 median 값을 635nm로 측정 후 나타난 median 값으로 나누어 나온 수치를 log2 값으로 환산하였다. 이 환산된 수치를 다시 Mev v4.6 software(http://www.tm4.org/mev/)로 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 그리고, 도 3의 결과를 표로 작성하여 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표 1을 상세하게 설명하면, 제조된 칩의 Y. enterocolitica의 전체 프로브의 수(69 개)와 이 프로브에 혼성화 반응이 나타난 프로브의 수를 %로 환산해서 수치로 표기한 것이다. 이 log2 값은 제조된 칩의 Y. enterocolitica 프로브가 Y. enterocolitica 와 여시니아(Yersinia)와 같은 속(genus)이지만 다른 종(species)의 미생물이 차별되는 지를 확인하기 위해 principal components analysis (PCA; SIMCA-P version 12.0, Umetrics, Ume, Sweden)에 사용되었으며, PCA 결과는 도 4에 나타내었다.
[표 1. 혼성화 결과]
Figure 112010058517900-pat00001

먼저, 도 3의 이미지(Mev v4.6 software는 log 2 값이 -3.0~3.0일 때 혼성화 반응된 프로브로 분석하며, 검은색으로 표시된다)를 통해 분석된 표 1의 혼성화 결과를 보면, 칩의 Y. enterocolitica 프로브와 Y. enterocolitica의 7 개의 strain의 지노믹 DNA를 각각 테스트한 결과, 88 ~ 100% 혼성화된 결과를 나타내고 있으며, 다른 여시니아(Yersinia)와 같은 속(genus)이지만 다른 종(species)인 미생물의 지노믹 DNA를 각각 테스트한 결과는 26 ~ 70%의 혼성화 결과를 보였다. 그리고 여시니아(Yersinia) 속(genus)과 다른 속(genus)에 속하는 미생물은 1.4 ~ 10%의 혼성화 결과를 보였다. 상기의 결과는 제조된 칩이 여시니아 속(genus)의 다른 종(species) 및 여시니아 속(genus)과 다른 속(genus)에 속하는 미생물에 비해 다수의 Y. enterocolitica의 strain으로부터 추출된 지노믹 DNA와 높은 혼성화 비율을 보임을 나타낸다.
또한, 도 4에 나타낸 바와 같이 PCA 측정 결과, PC1에 의해서 Y. enterocolitica와 여시니아(Yersinia) 속(genus)의 다른 미생물의 종(species)과 분명하게 차별되어 측정되었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)의 지노믹 DNA로부터 유래되고, 서열번호 1 내지 69의 염기서열을 갖는 랜덤 지노믹 DNA 프로브를 포함하는 Y. enterocolitica 검출용 DNA 칩.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 랜덤 지노믹 DNA 프로브는 상기 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)로부터 추출한 지노믹 DNA를 서로 다른 종류의 제한효소 쌍으로 잘라내어 겔 추출법으로 추출한 100 내지 1500 bp의 DNA인 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 서로 다른 종류의 제한효소 쌍은 EcoRⅠ/BamHⅠ, HindⅢ/XhoⅠ 및 HindⅢ/SacⅡ인 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
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